Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků

Údaje musí umožňovat smysluplnou analýzu vztahu koncentrace-odezva při aplikaci UVA/VIS záření a bez ní. Je-li zjištěna cytotoxicita, koncentrační rozsah a postup jednotlivých koncentrací se nastaví tak, aby se experimentální údaje daly vyjádřit křivkou. Jelikož testovaná látka může být až do definované limitní koncentrace 100 μg/ml v experimentu ve tmě (-UVA) necytotoxická, ale při ozařování (+UVA) vysoce cytotoxická, může dojít k tomu, že se koncentrační rozsahy v obou částech experimentu budou muset řádově lišit, aby byl splněn požadavek adekvátní kvality dat. Pokud není cytotoxicita zjištěna v žádné z obou částí experimentu (ani při -UVA, ani při +UVA), postačuje testování s velkým rozestupem mezi jednotlivými dávkami až do nejvyšší koncentrace.

Jsou-li výsledky hraniční – blízko dělicí čáry predikčního modelu – je třeba test pro ověření opakovat.

Považuje-li se opakování testu za potřebné, může být důležité pozměnit experimentální podmínky, aby se dosáhlo jasného výsledku. Klíčovou proměnnou v tomto testu je příprava roztoků testované látky, nejvhodnější při jeho opakování je variace těchto podmínek (spolurozpouštědlo, triturace, sonifikace). Lze také uvažovat o změnách inkubační doby před ozařováním. U látek, jež jsou ve vodě nestálé, může mít významný vliv zkrácení doby.

• 1.9 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Pokud je to možné, stanoví se koncentrace testované látky vedoucí k 50 % inhibici buněčného příjmu NR (EC50). To lze učinit tak, že se na data koncentrace-odezva použije jakákoliv vhodná metoda nelineární regrese (nejlépe Hillova funkce nebo logistická regrese) nebo se použije jiná vhodná metoda proložení (14). Než se hodnota EC50 použije pro další výpočty, je třeba zkontrolovat kvalitu proložení. K výpočtu hodnoty EC50 je také možno použít grafické metody. V tomto případě se doporučuje použít pravděpodobnostní papír (osa x: log, osa y: probit), protože po této transformaci bývá křivka koncentrace-odezva mnohdy téměř lineární.

• 1.10 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ (PREDIKČNÍ MODELY)

• 1.10.1 Predikční model, verze 1: fotoiritační faktor (PIF)

Pokud se získají úplné křivky koncentrace-odezva jak za přítomnosti (+UVA), tak za nepřítomnosti (-UVA) světla, se fotoiritační faktor (PIF) vypočítá podle vzorce

a PIF=EC50(-UV)EC50(+UV)

PIF < 5, nepředpovídá žádný fototoxický potenciál, kdežto PIF ≥ 5 fototoxický potenciál předpovídá.

Je-li látka cytotoxická pouze při +UVA, kdežto při -UVA je necytotoxická, nedá se PIF vypočítat, i když se jedná o výsledek, který indikuje, že látka má fototoxický potenciál. V takovém případě se dá vypočítat tzv. „> PIF“, když se test cytotoxicity (-UV) provede až po maximální zkušební koncentraci (Cmax) a tato hodnota se dosadí do vzorce:

b>PIF=Cmax(-UV)EC50(+UV)

Pokud se dá vypočítat pouze „>PIF“, pak každá hodnota > 1 předpovídá fototoxický potenciál.

Jestliže se nedá vypočítat ani EC50 (-UV), ani EC50 (+UV), protože látka nevykazuje cytotoxicitu až do nejvyšší zkušební koncentrace, je to indikací toho, že látka nemá žádný fototoxický potenciál. V takovém případě se používá formální „PIF = *1“, čímž se charakterizuje výsledek

c PIF=*1=Cmax(-UV)Cmax(+UV)

Pokud se dá získat pouze hodnota „PIF = *1“, předpovídá to, že není přítomen žádný fototoxický potenciál.

V případech (b) a (c) je třeba při predikci fototoxického potenciálu vzít bedlivě v úvahu koncentrace, jichž se při testu dosáhlo.

• 1.10.2 Predikční model, verze 2: střední fotoefekt (MPE)

Je možno také použít novější verze modelu pro predikci fototoxického potenciálu, vypracovaného za použití dat z validační studie EU/COLIPA (15) a odzkoušeného za podmínek slepé studie stanovení fototoxicity in vitro u látek UV filtrů (13). V tomto modelu jsou překonána omezení modelu PIF v těch případech, kde nelze získat hodnotu EC50. V tomto modelu se používá veličina „střední fotoefekt“ (MPE) založená na porovnání celého průběhu křivek koncentrace-odezva. Pro aplikaci modelu MPE byl na Humboldtově univerzitě v Berlíně vyvinut speciální počítačový software, který lze obdržet zdarma.

• 1.11 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pozitivní výsledek testu (PIF ≥ 5 nebo MPE ≥ 0,1) ukazuje, že daná látka má fototoxický potenciál. Pokud se k tomuto výsledku dojde při koncentracích nižších než 10 μg/ml, je pravděpodobné, že látka bude působit jako fototoxin také za různých expozičních podmínek in vivo. Získá-li se pozitivní výsledek pouze při nejvyšší zkušební koncentraci (100 μg/ml), bude pro posouzení nebezpečnosti nebo fototoxické schopnosti dané látky nejspíše zapotřebí dalších informací. Sem mohou spadat informace o penetraci, absorpci a možné akumulaci látky v kůži, nebo údaje z testování dané látky v jiném potvrzujícím alternativním testu, například za použití modelu lidské kůže in vitro.

Negativní výsledek testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro (PIF < 5 nebo MPE < 0,1) ukazuje, že testovaná látka není fototoxická pro použité savčí buňky v daných podmínkách. V případech, kdy by se látka dala testovat i při nejvyšší koncentraci 100 μg/ml, negativní výsledek znamená, že látka nemá žádný fototoxický potenciál a fototoxicita in vivo se dá považovat za nepravděpodobnou. V případech, kdy byly při nižších koncentracích získány identické koncentrační závislosti toxické reakce (EC50 +UV a EC50 -UV), je interpretace dat stejná. Naproti tomu pokud nebyla prokázána žádná toxicita (+UV ani -UV) a pro omezenou rozpustnost látky se nedalo dosáhnout koncentrace 100 μg/ml, je možno považovat tento test pro danou látku za ne zcela vhodný a mělo by se uvažovat o jiném, potvrzujícím testu (například s použitím modelu kůže in vitro nebo modelu kůže ex vivo nebo test in vivo).

• 1. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU

Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:

Testovaná látka:

– identifikační údaje a číslo CAS, je-li známo,

– fyzikální povaha a čistota,

– fyzikálně-chemické vlastnosti, jež jsou k provedení testu důležité,

– stabilita a fotostabilita, jsou-li známy.

Rozpouštědlo:

– zdůvodnění volby daného rozpouštědla,

– rozpustnost testované látky v tomto rozpouštědle,

– procentický podíl rozpouštědla v působícím médiu (EBSS nebo PBS).

Buňky:

– typ a zdroj buněk,

– nepřítomnost mykoplazmat,

– číslo buněčné pasáže, je-li známo,

– citlivost buněk vůči záření UVA stanovená pomocí ozařovacího zařízení, jež se v testu na fototoxicitu 3T NRU in vitro používá.

Podmínky pokusu (a) – inkubace před ovlivněním a po něm:

– typ a složení kultivačního média,

– podmínky inkubace (koncentrace CO2, teplota, vlhkost),

– doba inkubace (zpracování před ni a po ní).,

Podmínky pokusu (b) – ovlivnění látkou:

– zdůvodnění volby koncentrací testované látky, které se použijí v přítomnosti ozařování UV/VIS zářením a bez něj,

– v případě omezené rozpustnosti testované látky a absence cytotoxicity zdůvodnění nejvyšší testované koncentrace,

– typ a složení působícího média (pufrovaný solný roztok),

– doba ovlivňování látkou.

Podmínky pokusu (c) – ozařování:

– zdůvodnění volby daného světleného zdroje,

– spektrální charakteristika záření světelného zdroje,

– charakteristiky propustnosti/absorpce použitého filtru (filtrů),

– charakteristika radiometru a podrobnosti o jeho kalibraci,

– vzdálenost světelného zdroje od testovaného systému,

– iradiance UVA (v mW/cm^2) při této vzdálenosti,

– doba expozice UV/VIS záření,

– dávka záření UVA (iradiance × čas) v J/cm^2,

– teplota buněčných kultur během ozařování a kultur souběžně uchovávaných v temnu.

Podmínky pokusu (d) – test NRU:

– složení média s NR,

– doba inkubace s NR,

– inkubační podmínky (koncentrace CO2, teplota, vlhkost),

– podmínky extrakce NR (extrakční činidlo, doba extrakce),

– vlnová délka, při které se spektrofotometricky odečítala optická hustota NR,

– druhá vlnová délka (referenční), byla-li použita,

– složení srovnávacího roztoku pro spektrofotometrii (blanku), pokud byl použit.

Výsledky:

– životaschopnost buněk při jednotlivých koncentracích testované látky, vyjádřená v procentech vůči průměrné životaschopnosti kontrol,

– křivky koncentrace-odezva (koncentrace testované látky vs relativní životaschopnost buněk) získané souběžnými experimenty +UVA a -UVA,

– analýza křivek koncentrace-odezva: podle možnosti výpočet hodnot EC50 (+UVA) a EC50 (-UVA),

– porovnání obou křivek koncentrace-odezva získaných za použití ozařování UV/VIS světlem – výpočtem buď fotoiritačního faktoru (PIF) nebo středního fotoefektu (MPE),

– klasifikace fototoxického potenciálu,

– kritéria akceptovatelnosti testu (a) – souběžná negativní kontrola:

• absolutní životaschopnost (optická denzita extraktu NR) ozářených a neozářených buněk,

• historické údaje negativních kontrol, průměr a směrodatná odchylka,

– kritéria akceptovatelnosti testu (b) – souběžná pozitivní kontrola:

• hodnoty EC50 (+UVA), EC50 (-UVA) a PIF látky použité pro pozitivní kontrolu,

• historické údaje látky použité pro pozitivní kontrolu: hodnoty EC50(+UVA), EC50 (-UVA) a PIF, průměry a směrodatné odchylky.

Diskuse výsledků.

Závěry.

Dodatek

Úloha testu fototoxicity 3T3 NRU v sekvenčním přístupu k testování fototoxicity látek

[image omitted]

Obsah přílohy

B. Metody stanovení toxicity – Všeobecný úvod

B.1. Akutní toxicita orální (per os)

B.1.bis Akutní toxicita orální (per os) - metoda fixní dávky

B.1.tris Akutní toxicita (orální) - metoda stanovení třídy akutní toxicity

B.2. Akutní toxicita (inhalační)

B.3 Akutní toxicita (dermální)

B.4. Akutní toxicita (kožní dráždivost)

B.5. Akutní toxicita (oční dráždivost)

B.6. Senzibilizace kůže

B.7. Subakutní toxicita orální (per os) (28denní opakovaná aplikace)

B.8. Subakutní toxicita inhalační (28denní opakovaná aplikace)

B.9. Subakutní toxicita dermální (28denní opakovaná dávka)

B.10. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro

B.11. Mutagenita - test chromozomových aberací v kostní dřeni savců in vivo

B.12. Mutagenita - in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech

B.13/14 Mutagenita - test reverzních mutací u bakterií

B.15. Genové mutace-Saccharomyces cerevisiae

B.16 Mitotická rekombinace - Sacchoromyces cerevisiae

B.17. Mutagenita - test genových mutací v savčích buňkách in vitro

B.18. Poškození DNA reparace - neplánovaná syntéza DNA - savčí buňky in vitro

B.19. SCE - výměna sesterských chromatid in vitro

B.20. Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophila melanogaster

B.21. Test transformace savčích buněk in vitro

B.22. Dominantní letální test u hlodavců

B.23. Analýza chromosómových aberací v savčích spermatogoniích

B.24. Spot test u myší

B.25. Přenosné translokace u myší

B.26. Subchronická toxicita orální (90 denní opakované podávání per os, studie na hlodavcích)

B.27. Subchronická toxicita orální (90 denní opakované podávání per os, studie na nehlodavcích)

B.28. Subchronická toxicita dermální (90denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích)

B.29. Subchronická toxicita inhalační (90denní opakovaná inhalační expozice, studie na hlodavcích)

B.30. Testování chronické toxicity

B.31. Studie teratogenity - hlodavci a nehlodavci

B.32. Test karcinogenity

B.33 Kombinovaný test chronické toxicity/karcinogenity

B.34. Reprodukční toxicita - jednogenerační test

B.35. Reprodukční toxicita - dvougenerační test

B.36 Toxikokinetika

B.37. Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu - akutní expozice

B.38. Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu - 28denní opakovaná expozice

B.39. Test neplánované syntézy dna v savčích jaterních buňkách in vivo

B.40. Leptavé účinky na kůži

B.41. Fototoxicita - test fototoxicity 3t3 nru in vitro.

^1) § 2 odst. 8 písm. f) až n) zákona č. 157/1998 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých dalších zákonů.

^2) Zákon č. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání, ve znění zákonů č. 162/1993 Sb., č. 193/1994 Sb., č. 243/1997 Sb. a č. 30/1998 Sb.

^3) Směrnice Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj pro zkoušení chemikálií. Oddíl 4 – vliv na zdraví (OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4 – Health Effects).

^1) Vyšetření na lačno je žádoucí pro řadu měření v séru a plazmě, zvláště pro glukózu. Hlavní důvod pro toto doporučení je to, že u nehladovějících zvířat je vyšší variabilita výsledků, která by mohla maskovat jemné změny a ztížit interpretaci. Na druhé straně, hladovění přes noc by mohlo mít vliv na celkový metabolismus a u aplikace v potravě by zasáhla do pravidelnosti expozice testované látce. Pokud se odebírá krev na lačno, je třeba biochemické vyšetření provést až po pozorování funkčních poruch ve 4. týdnu testu.

^1 nyní známá jako sérová alanin aminotransferasa

^2 nyní známá jako sérová aspartát aminotransferasa

^3 tyto orgány z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců a ze všech nehlodavců, a dále štítná žláza (s přištítnými tělísky) ze všech nehlodavců, mají být zváženy

^3 tyto orgány z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců mají být zváženy.

^1 V této metodě se referenční skupinou rozumí ta, ve které je testovaná látka podávána takovým způsobem, který zajišťuje úplnou biologickou dostupnost dávky