Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Typ Vyhláška

Publikace 2004-04-29

Naposledy aktualizováno 2005-10-08

Stav Platný

Zdroj e-Sbírka

článků 4

Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l^–1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l^–1.

Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.

DODATEK 2

Druhy ryb doporučené pro zkoušení

Doporučený druh	Doporučený rozsah teplot při zkoušce (°C)	Doporučená celková délka ryb (cm)
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton - Buchanan), danio pruhované	20 až 24	3,0 ± 0,5
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque), střevle	20 až 24	5,0 ± 2,0
Cyprinus carpio (Teleostei Cyprinidae) (Linneanus 1758), kapr obecný	20 až 24	6,0 ± 2,0
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Tomminck a Schlegel 1850), halančík japonský	20 až 24	3,0 ± 1,0
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859), živorodka duhová	20 až 24	3,0 ± 1,0
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque, Linneanus 1758), slunečnice modrá	20 až 24	5,0 ± 2,0
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988), pstruh duhový	12 až 17	6,0 ± 2,0
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneanus 1758), jelec jesen	20 až 24	6,0 ± 2,0

Opatřování ryb

Ryby uvedené v seznamu se snadno chovají nebo jsou dobře dostupné po celý rok. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.

DODATEK 3

Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci

Příklad stanovení LC50 na pravděpodobnostním logaritmickém papíru

[image omitted]

II. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO DAFNIE – metoda C.2 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

II.1 METODA

II.1.1 ÚVOD

Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci látky pro imobilizaci (EC50) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před započetím zkoušky je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

II.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Požadavek směrnice stanovit LC50 pro dafnie se považuje za splněný stanovením EC50, jak je popsáno v této zkušební metodě.

Akutní toxicita se v této zkoušce vyjadřuje střední účinnou koncentrací látky pro imobilizaci (EC50) dafnií. Je to koncentrace (rozumí se výchozí koncentrace), která během nepřetržité expozice po určitou stanovenou dobu imobilizuje 50 % dafnií ve zkušební skupině během doby působení (doby expozice).

Imobilizace:

Dafnie, které nejsou schopné do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádrží začít plavat, se považují za imobilizované.

Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l^-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg^-1).

II.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím čtyř různých látek je uveden v doplňku 2.

II.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Dafnie se 48 h exponují zkušební látce přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se kratší doba, zdůvodní se ve zprávě.

Za jinak stejných experimentálních podmínek a v přiměřeném rozmezí koncentrací zkušební látky působí různé koncentrace zkušební látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Různé koncentrace mají za následek skutečnost, že na konci zkoušky ztrácí různý procentuální podíl dafnií schopnost plavat. Koncentrace, které nezpůsobují žádnou imobilizaci nebo způsobují 100% imobilizaci, se zjistí přímo pozorováním, zatímco hodnota 48hodinová EC50 se stanoví podle možnosti výpočtem.

Při této metodě se používá statický systém, zkušební roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.

II.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI

Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.

Imobilizace v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %.

Dafnie se v kontrolních zkouškách nesmí trvale zdržovat u hladiny.

Koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušební nádrži musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 3 mg·l^-1. Koncentrace kyslíku však nesmí v žádném případě klesnout pod 2 mg·l^-1.

Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.

U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

U látek, které

jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo

ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo

iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích organismů.

Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

pH by se nemělo změnit o více než 1.

II.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

II.1.6.1 Činidla

II.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.

Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní dafnie. Koncentrace pomocných látek by měly být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg/l zkušebního média.

Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají ve zprávě.

II.1.6.1.2 Zkušební voda

Pro tuto zkoušku se použije upravená voda (viz doplněk 1 a odkaz (2): ISO 6341).

Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie před zkouškou, doporučuje se, aby byla voda pro kultivaci podobné jakosti (pH, tvrdost), jako voda pro zkoušku.

II.1.6.2 Přístroje

Použijí se běžné laboratorní přístroje a zařízení. Zařízení, které přijde do styku se zkušebními roztoky, by mělo být nejlépe skleněné:

— přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),

— vhodný přístroj pro měření teploty,

— pH-metr,

— vybavení pro stanovení tvrdosti vody.

II.1.6.3 Testovací organismy

Přednost se dává druhu Daphnia magna, ačkoliv se připouští také druh Daphnia pulex. Testovací dafnie musí být na začátku zkoušky mladší než 24 h, musí být laboratorně odchované, bez zjevných nemocí a musí být známého původu (např. chov, předchozí ošetření, atd.).

II.1.6.4 Zkušební postup

Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.

Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.

Dafnie se exponují zkušební látce následujícím způsobem:

— délka expozice: 48 h,

— počet dafnií: nejméně 20 na každou zkušební koncentraci, nejlépe rozdělených na čtyři skupiny po pěti dafniích nebo na dvě skupiny po 10 dafniích,

— obsádka: na každou dafnii by měly připadat 2 ml zkušebního roztoku,

— zkušební koncentrace: zkušební roztok se připraví bezprostředně před nasazením dafnií, nejlépe bez použití jiného rozpouštědla než vody. Připraví se koncentrace tvořící geometrickou řadu, přičemž poměr mezi koncentracemi nesmí být vyšší než 2,2. Zároveň s kontrolami se zkoušejí koncentrace dostatečné pro to, aby po 48 h vyvolaly nulovou nebo a 100% imobilizaci, a dále mezilehlé koncentrace umožňující výpočet 48hodinové EC50,

— voda: viz 1.6.1.2,

— osvětlení: střídání světla a tmy je libovolné,

— teplota: zkušební teplota by měla být 18 až 22 °C, avšak v rámci dané zkoušky kolísající v tomto rozmezí maximálně o ±1 °C,

— provzdušňování: zkušební roztok nesmí být provzdušňován probubláváním,

— krmení: žádné.

Měření pH a obsahu rozpuštěného kyslíku v kontrolních skupinách a u všech zkušebních koncentrací se provede na konci zkoušky; pH zkušebního roztoku nesmí být měněno.

Těkavé sloučeniny se zkoušejí v hermeticky uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby nedošlo k nedostatku kyslíku.

Prohlídka dafnií se provede nejpozději po 24 h a znovu po 48 h.

Limitní zkouška

S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1 s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l^-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).

Limitní zkouška se provede s 20 dafniemi rozdělenými do dvou nebo čtyř skupin a se stejným počtem v kontrolní skupině (v kontrolních skupinách). Dojde-li k imobilizaci, musí se provést celá studie.

II.2 DATA A HODNOCENÍ

Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24 a 48 h), vynese mortalita v procentech proti koncentraci.

Pokud je to možné, odhadnou se pro každé pozorovací období EC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).

V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty EC50, postačuje grafický odhad této hodnoty.

Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají nulovou a 100% imobilizaci, jsou dostatečnou informací o rozpětí, ve kterém EC50 leží.

Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.

II.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

— údaje o testovacím organismu (vědecký název, kmen, dodavatel nebo původ, veškerá předchozí ošetření, metoda chovu – včetně původu, druhu a množství potravy, frekvence krmení);

— zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, teplota, tvrdost);

— u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;

— koncentrace všech pomocných látek;

— přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;

— jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;

— výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;

— popis zkušebního zařízení;

— světelný režim;

— koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků;

— důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;

— tabulka kumulativních hodnot imobility při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování (24 a 48 h);

— graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;

— podle možnosti hodnoty EC50 při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti)

— použité statistické metody stanovení hodnot EC50;

— při použití referenční látky údaj o získaných výsledcích;

— nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky imobilizaci;

— nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100% imobilizaci.

II.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crustacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).

(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

(7) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 1949, 96, 99-113.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

DODATEK 1

Upravená voda

Příklad vhodné ředicí vody (podle ISO 6341)

Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm^-1.

Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Zásobní roztoky:

CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.	11,76 g
MgSO4·7H2O (síran hořečnatý heptahydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.	4,93 g
NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.	2,59 g
KCl (chlorid draselný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.	0,23 g

Upravená ředicí voda

Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.

Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

pH musí být 7,8 ± 0,2.

Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).

Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nemusí být dále provzdušňována.

Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l^-1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l^-1.

Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.

DODATEK 2

Souhrn výsledků kruhového testu EHS provedeného v roce 1978 (citovaného také v (2)).

Upozornění: účelem tohoto kruhového testu bylo stanovení 24hodinové hodnoty EC50.

Použité látky:

1) Dichroman draselný

2) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová

3) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová, sodná sůl

4) Kyselina 2,4,5-trichlorfenoxyoctová, draselná sůl

Látka	Počet zúčastněných laboratoří	Počet výsledků pro výpočet	Střední hodnota 24hodinové EC50 mg/l
1	46	129	1,5
2	36	108	27
3	31	84	27
4	32	72	770

DODATEK 3

Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci

Příklad stanovení EC50 s použitím pravděpodobnostního logaritmického papíru

[image omitted]

III. METODA PRO STANOVENÍ INHIBICE RŮSTU ŘAS – metoda C.3 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

III.1 METODA

III.1.1 ÚVOD

Účelem této zkoušky je stanovit účinky látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobými zkouškami (72 h) lze posoudit účinky na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití s několika druhy řas, přičemž musí být v protokolu o zkoušce uveden popis metody.

Použití metody je nejsnadnější v případě látek rozpustných ve vodě, které za podmínek zkoušky pravděpodobně zůstávají ve vodě.

Metodu lze použít pro látky, které přímo neovlivňují měření růstu řas.

Je žádoucí mít před započetím zkoušky k dispozici co nejúplnější údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

III.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Hustota buněk: počet buněk na jeden mililitr.

Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.

Růstová rychlost: nárůst hustoty buněk za jednotku času.

EC50: v této metodě jde o koncentraci zkušební látky, která má za následek 50% snížení růstu (EbC50) nebo růstové rychlosti (ErC50) vzhledem ke kontrole.

NOEC (no observed effect concentration): v této metodě jde o je nejvyšší zkoušenou koncentraci, při níž není pozorováno žádné významné snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.

Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l^-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg^-1).

III.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

Při použití referenční látky musí být výsledky uvedeny do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření, pokud se použijí. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních testech (viz (3) a doplněk 2).

III.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Exponenciálně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou po několik generací vystaveny za definovaných podmínek různým koncentracím zkušební látky.

Zkušební roztoky se kultivují 72 h, během nichž se alespoň každých 24 h měří hustota buněk v každém roztoku. Stanoví se snížení růstu ve srovnání s kontrolní kulturou.

III.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI

Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na celý zkušební postup.

Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla za 3 dny zvýšit alespoň šestnáctkrát.

Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.

U látek, které

jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo

ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo

iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení.

Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

Je známo, že podstatná část zkušební látky může být během zkoušky zabudována do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií jakosti mělo brát v úvahu jak množství látky zabudované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, může být dodržení kritérií jakosti prokázáno zkouškou s nejvyšší koncentrací látky, ale bez řas, a měřením koncentrací v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky.

III.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU

III.1.6.1 Činidla

III.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

Zvolené zkušební koncentrace se připraví přidáním vhodného alikvotního podílu k předkulturám řas (viz doplněk 1).

Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontroly. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.

III.1.6.1.2 Zkušební médium

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm^-1. Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Je doporučeno následující médium:

Podle následující tabulky se připraví čtyři zásobní roztoky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo v autoklávu a skladují se v temnu při 4 °C. Zásobní roztok č. 4 by se měl sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním těchto roztoků se získají konečné živné koncentrace zkušebních roztoků.

Živina	Koncentrace v zásobním roztoku	Konečná koncentrace ve zkušebním roztoku
Zásobní roztok č. 1: makroživiny
NH4Cl	1,5	15 mg·l-1
MgCl2·6H2O	1,2	12 mg·l-1
CaCl2·2H2O	1,8	18 mg·l-1
MgSO4·7H2O	1,5	15 mg·l-1
KH2PO4	0,16	1,6 mg·l-1
Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA
FeCl3·6H2O	80	0,08 mg·l-1
Na2EDTA·2H2O	100	0,1 mg·l-1
Zásobní roztok č. 3: stopové prvky
H3BO3	185	0,18 mg·l-1
MnCl2·4H2O	415	0,415 mg·l-1
ZnCl2	3	3×10-3 mg·l-1
CoCl2·6H2O	1,5	1,5×10-3 mg·l-1
CuCl2·2H2O	0,01	1×10-5 mg·l-1
Na2MoO4·2H2O	7	7×10-3 mg·l-1
Zásobní roztok č. 4: NaHCO3
NaHCO3	50	50 mg·l-1

Po ustálení a po provzdušnění by mělo mít médium hodnotu pH přibližně 8.

III.1.6.2 Přístroje a pomůcky

— Běžné laboratorní vybavení.

— Kultivační baňky o vhodném objemu (např. Erlenmeyerovy baňky na 250 ml jsou vhodné v případě zkušebního roztoku o objemu 100 ml). Všechny zkušební baňky by měly být identické, pokud jde o materiál a rozměry.

— Kultivační zařízení: místnost nebo komora, v nichž lze udržovat teplotu 21 – 25 °C ± 2 °C a stálé rovnoměrné osvětlení v rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm. Jestliže všechny řasy v kontrolních kulturách dosáhly doporučené růstové rychlosti, lze předpokládat, že podmínky pro jejich růst, včetně intenzity světla, jsou vyhovující.

U zkušebních roztoků s průměrnými koncentracemi se doporučuje použít světelnou intenzitu od 60 do 120 μE·m^-2·s^-1 (35 – 70·10^18 fotonů m^-2·s^-1) při měření v rozsahu 400 – 700 nm vhodným detektorem. Při měření intenzity luxmetry je přijatelný rozsah odpovídající 6000 – 10 000 lx.

Této světelné intenzity lze dosáhnout umístěním čtyř až sedmi univerzálních bílých 30W zářivek (teplota chromatičnosti přibližně 4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury řas.

— Měření hustoty buněk by se mělo provádět přímým počítáním živých buněk, např. pod mikroskopem s počítacími komůrkami. Za předpokladu dostatečné citlivosti a prokázané dobré korelace s buněčnou hustotou mohou být použity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie,...).

III.1.6.3 Testovací organismy

Je doporučeno použít rychle rostoucí druhy zelených řas vhodné pro kultivaci a zkoušení. Dává se přednost následujícím druhům:

— * Selenastrum capricornutum*, např. ATCC 22662 nebo CCAP 278/4,

— Scenedesmus subspicatus, např. 86.81 SAG.

Poznámka:

ATCC = American Type Culture Collection (USA)

CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (VB)

SAG = Collection of algal culture (Göttingen, SRN)

Použití jiného druhu řas musí být uvedeno ve zprávě.

III.1.6.4 Zkušební postup

Koncentrační rozmezí, ve kterém lze očekávat účinky, se určí na základě výsledků orientačních zkoušek.

Dva parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost), mohou poskytovat zcela rozdílné hodnoty snížení růstu; v orientační zkoušce by měly být použity oba parametry, aby mohlo zajištěno, že geometrická řada koncentrací umožní odhadnout jak EbC50, tak ErC50.

Počáteční hustota buněk

Doporučuje se, aby byla počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích přibližně 10^4 buněk na ml. Použije-li se jiný druh řasy, měla by být biomasa srovnatelná.

Koncentrace zkušební látky

Pro zkoušku se připraví geometrická řada nejméně pěti koncentrací lišících se od sebe vždy faktorem nepřekračujícím 2,2. Nejnižší zkoušená koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe by měla růst zcela zastavit.

Opakování a kontroly

Plán zkoušky by měl zahrnovat tři opakování s každou zkušební koncentrací. Dále se provedou tři kontroly bez zkušební látky, a je-li použita pomocná látka, též tři kontroly s touto látkou. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky s každou koncentrací.

Provedení zkoušky

Zkušební roztoky o požadované koncentraci zkušební látky a požadovaném množství inokula řas se připraví přidáním alikvotních podílů zásobního roztoku zkušební látky k vhodnému množství prekultury řas (viz doplněk 1).

Kultivační baňky se protřepou a umístí se do kultivačního zařízení. Buňky řas se udržují v suspensi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, aby se zlepšila výměna plynů a zmenšilo se kolísání pH ve zkušebních roztocích. Kultury se udržují při teplotě 21 – 25 °C udržované s přesností na ± 2 °C.

Hustota buněk v každé baňce se stanoví nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se měření hustoty buněk jiná metoda, než je jejich přímé počítání, použije se ke stanovení pozadí filtrované médium pro kultivaci řas obsahující odpovídající koncentraci zkušební chemické látky.

pH se měří na začátku zkoušky a po 72 h.

Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc než o 1,5.

Zkoušení těkavých látek

V současné době neexistuje obecně přijatý způsob zkoušení těkavých látek. Je-li o látce známo, že se snadno vypařuje, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným mrtvým objemem. Při plánování objemu horní části kultivačních baněk se musí zohlednit eventuální nedostatek CO2. Byly navrženy varianty této metody (4).

Měl by být učiněn pokus stanovit množství zkušební látky, které v roztoku zůstalo; při interpretaci výsledků zkoušek s těkavými látkami v uzavřených systémech je doporučeno postupovat mimořádně opatrně.

Limitní zkouška

S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1 s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Je-li povaha zkušební látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg·l^-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).

Limitní zkouška se provede alespoň třikrát, se stejným počtem kontrol. V limitní zkoušce se stanoví oba parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost).

Zjistí-li se v limitní zkoušce pokles růstu biomasy nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolami o 25 % nebo více, provede se úplná zkouška.

III.2 DATA A HODNOCENÍ

Naměřené hustoty buněk ve zkušební kultuře a v kontrolách se spolu s koncentracemi zkušební látky a dobami měření shrnou do tabulky. Střední hodnota hustoty buněk pro každou zkušební koncentraci a pro kontroly se vynese proti času (0 – 72 h) a sestrojí se růstová křivka.

Vztah koncentrace/účinek se stanoví dvěma následujícími postupy. Některé látky mohou růst při nízkých koncentracích stimulovat. V úvahu by měla být vzata pouze data udávající potlačení růstu mezi 0 a 100 %.

III.2.1 POROVNÁNÍ PLOCH POD RŮSTOVÝMI KŘIVKAMI

Plocha mezi růstovou křivkou a vodorovnou linií N = N0 se vypočte podle následujícího vzorce:

A=N1-N22.t1+N1+N2-2N02.t2-t1+…+Nn-1+Nn-2N02.tn-tn-1

kde

A = plocha,

N0 = počet buněk v ml v čase t0 (na počátku zkoušky),

N1 = naměřený počet buněk v 1 ml v čase t1,

Nn = naměřený počet buněk v 1 ml v čase tn,

t1 = doba prvního měření od počátku zkoušky,

tn = doba n-tého měření od počátku zkoušky,

n = počet měření od počátku zkoušky.

Potlačení růstu vyjádřené v % (IA) se pro každou koncentraci zkušební látky vypočte podle vzorce:

IA=Ac-AtAc×100

kde

Ac = plocha mezi růstovou křivkou kontrolní zkoušky a horizontální linií N = N0,

At = plocha mezi růstovou křivkou při koncentraci t a horizontální linií N = N0.

Hodnoty IA se nanesou na semilogaritmický nebo na pravděpodobnostní semilogaritmický papír proti odpovídajícím koncentracím. Vynesou-li se body na pravděpodobnostní papír, proloží se body přímka, a to ručně nebo regresním výpočtem.

Hodnota EC50 se odhadne odečtením z regresní přímky jako koncentrace odpovídající 50% snížení růstu (IA ^= 50 %). Pro jednoznačné označení této hodnoty v rámci této metody výpočtu se doporučuje použít symbol EbC50. Je důležité, aby byla s hodnotou EbC50 uvedena příslušná expoziční doba, např. EbC50 (0 − 72 h).

III.2.2 POROVNÁNÍ RŮSTOVÝCH RYCHLOSTÍ

Průměrnou specifickou růstovou rychlost (μ) pro exponenciálně rostoucí kultury lze vypočítat jako:

μ=ln⁡Nn-ln⁡N0tn-t0

kde t0 je čas začátku zkoušky.

Průměrnou specifickou růstovou rychlost lze také odvodit ze sklonu regresní přímky v závislosti ln N na čase.

Snížení specifické růstové rychlosti vyjádřené v procentech pro každou koncentraci zkušební látky (Iμt) se vypočte podle vzorce:

Iμt=μc-μtμc×100

kde

μc = střední specifická růstová rychlost v kontrole,

μt = střední specifická růstová rychlost pro zkušební koncentraci t.

Snížení střední specifické růstové rychlosti v procentech při všech koncentracích zkušební látky ve srovnání s kontrolní hodnotou se vynese proti logaritmu koncentrace. Hodnotu EC50 lze odečíst z výsledného grafu. Pro jednoznačné označení EC50 odvozené touto metodou se doporučuje použít symbol ErC50. Musí být uvedeny okamžiky měření, např. vztahuje-li se hodnota k času 0 a k 72 h, označí se symbolem ErC50 (0 – 72 h):

Poznámka: Ve výrazu pro specifickou růstovou rychlost vystupují logaritmy, tzn. malé změny růstové rychlosti mohou odpovídat velkým změnám biomasy. Hodnoty EbC a ErC tedy nejsou číselně srovnatelné.

III.2.3 VÝPOČET NOEC

Hodnota koncentrace nezpůsobující žádné pozorovatelné účinky (NOEC) se stanoví vhodnou statistickou metodou pro srovnávání více vzorků (např. analýza rozptylu a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch pod růstovými křivkami A (viz bod 2.1) nebo specifických růstových rychlostí μ (viz bod 2.2).

III.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

— zkušební látka: údaje o chemické identitě;

— testovací organismus: původ, laboratorní kultura, číslo kmene, metoda kultivace;

— zkušební podmínky:

— datum zahájení a ukončení zkoušky a délka zkoušení,

— teplota,

— složení média,

— kultivační zařízení,

— hodnoty pH roztoku na počátku a na konci zkoušky (je-li pozorováno kolísání pH o více než 1,5, uvede se vysvětlení),

— nosič a metoda použitá pro rozpouštění zkušební látky, koncentrace nosiče ve zkušebních roztocích,

— intenzita a kvalita světla,

— zkoušené koncentrace (naměřené nebo nominální);

— výsledky:

— koncentrace buněk v jednotlivých baňkách v každé době měření a metoda měření koncentrace buněk,

— průměrné hodnoty koncentrace buněk,

— růstové křivky,

— grafické znázornění vztahu koncentrace – účinek,

— hodnoty EC a metoda výpočtu,

— NOEC,

— další pozorované účinky.

III.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus“, In: Rudolph / Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg,1986.

(3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S. Galassi, M. Vighi. Chemosphere, 1981, 10, 1123-1126.

DODATEK 1

Příklad postupu kultivace řas

Obecné poznámky

Účelem kultivace následujícím postupem je získání kultur řas pro zkoušky toxicity.

Měly by být použity vhodné metody k tomu, aby bylo zajištěno, že kultury řas nebudou infikovány bakteriemi (ISO 4833). Vhodné mohou být axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.

Všechny operace se provádějí za sterilních podmínek, aby nedošlo ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami. Kontaminované kultury se vyřadí.

Postupy při získání kultur řas

Příprava živných roztoků (média):

Médium lze připravit zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilizace v autoklávu může vést ke ztrátě NH3.

Kmenová kultura:

Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se pravidelně přenášejí do čerstvého média, kde slouží jako výchozí testovací materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar. Poté se nejméně jednou za dva měsíce přenášejí do čerstvého média.

Kmenové kultury se pěstují v Erlenmeyerových baňkách obsahujících vhodné medium (objem přibližně 100 ml). Jsou-li řasy kultivovány při teplotě 20 °C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.

Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství „staré“ kultury, aby byla výchozí koncentrace u rychle rostoucího druhu řas asi stokrát menší než koncentrace kultury staré.

Růstovou rychlost druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Je-li známa, lze z ní odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.

Předkultura:

Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování testovacích kultur. Předkultura se kultivuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se odstranit.

DODATEK 2

V normě ISO 8692 - Jakost vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus a Selenastrum capricornutum jsou uvedeny výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.

	Střední hodnota (mg·l-1)	Rozpětí (mg·l-1)
ErC50 (0 - 72 h)	0,84	0,60 až 1,03
EbC50 (0 - 72 h)	0,53	0,20 až 0,75

IV. METODY PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – metody C.4 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IV.I.1 ÚVOD

Je popsáno šest metod, které umožňují screeningové posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:

a) Zkouška na úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC) (metoda C.4-A)

b) Modifikovaná screeningová zkouška OECD - na úbytek DOC (metoda C.4-B)

c) Zkouška na uvolňování oxidu uhličitého (CO2) (modifikovaná Sturmova zkouška) (metoda C.4-C)

d) Zkouška manometrickou respirometrií (metoda C.4-D)

e) Zkouška v uzavřených lahvičkách (metoda C.4-E)

f) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu – Japonsko) (metoda C.4-F)

Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a návody.

Mezilaboratorní srovnávací test OECD provedený v roce 1988 ukázal, že metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru látky, která má být zkoušena, se však může dávat přednost určité metodě.

IV.I.2 VÝBĚR VHODNÉ METODY

Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, tenzi par a o adsorpčních vlastnostech chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a/nebo ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO2, DOC, TOC, CHSK (viz přílohy I a II) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.

Zkušební chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě je alespoň 100 mg·l^-1, lze zkoušet všemi metodami za předpokladu, že netěkají a neadsorbují se. Pro látky špatně rozpustné ve vodě, které těkají nebo se adsorbují, jsou vhodné metody uvedené v tabulce 1. Způsob, jakým je třeba zacházet s látkami špatně rozpustnými ve vodě a s látkami těkavými, je popsán v příloze III. Mírně těkavé látky je možno zkoušet metodou úbytku DOC, pokud je ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro zohlednění případné fyzikální ztráty.

Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

| Zkouška | Analytická metoda | Vhodnost pro látky | | | | | | špatně r ozpustné | těkavé | adsorbující se | | --- | --- | --- | --- | --- | | na úbytek DOC | rozpuštěný organický uhlík | — | — | + /− | | modif. zkouška OECD – na úbytek DOC | rozpuštěný organický uhlík | — | — | + /− | | na uvolňování CO2 | respirometrie: uvolňování CO2 | + | — | + | | manometrická respirometrie | manometrická respirometrie: spotřeba kyslíku | + | + /− | + | | zkouška v uzavřených lahvičkách | respirometrie: rozpuštěný kyslík | + /− | + | + | | MITI | respirometrie: spotřeba kyslíku | + | +/− | + |

Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkušebního materiálu.

Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkušební chemické látky pro bakterie (příloha IV); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.

IV.I.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Pro ověření postupu se souběžně se zkouškou a ve vlastní baňce zkoušejí referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.

Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), natrium-acetát, natrium-benzoát. Všechny tyto referenční chemické látky se za podmínek v uvedených metodách rozkládají, i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.

Byl podán návrh hledat referenční chemickou látku, která by byla snadno rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Navržen byl kalium-hydrogen-ftalát. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.

V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).

IV.I.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD

Roztok nebo suspense zkušební látky v minerálním prostředí se inokuluje a kultivuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difuzním světle. Množství DOC ve zkušebním roztoku pocházející z inokula se musí udržovat ve srovnání s DOC pocházejícího ze zkušební látky co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě souběžné slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky, třebaže endogenní aktivita buněk v přítomnosti látky přesně neodpovídá aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se souběžně provádí zkouška s referenční látkou.

Obecně se rozklad sleduje stanovením parametrů jako DOC, tvorba CO2 nebo spotřeba kyslíku a měření se provádějí v dostatečně krátkých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se doplňkově k jinému parametru měří DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Lze rovněž použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkušební látky nebo kterou se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).

Zkouška obvykle trvá 28 dnů. Je však možné ukončit měření před uplynutím 28 dní, tj. jakmile vykazuje křivka biologického rozkladu plató po tři po sobě následující měření. Je také možné měření po 28 dnech prodloužit, jestliže z křivky vyplývá, že biologický rozklad začal, avšak 28. dne ještě nebylo ještě dosaženo plató.

IV.I.5 KRITÉRIA JAKOSTI

IV.I.5.1 Reprodukovatelnost

Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula se stanovení provádějí nejméně duplicitně.

Je obecně známo, že čím vyšší je koncentrace mikroorganismů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi vícenásobnými měřeními. Okružní testy rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.

IV.I.5.2 Platnost zkoušky

Zkouška se považuje za platnou, je-li na konci zkoušky nebo popřípadě na konci 10denního období rozkladu rozdíl hodnot krajních výsledků vícenásobných měření rozkladu zkušební chemické látky v oblasti plató křivky menší než 20 % a dosáhl-li stupeň rozkladu referenční látky vyjádřený v procentech úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, měření se opakuje. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně skutečnost, že zkušební látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale znamenají, že k prokázání biologické rozložitelnosti jsou třeba další studie.

Jestliže ve zkoušce toxicity zahrnující jak zkušební látku, tak referenční chemickou látku došlo během 14 dnů k méně než 35% rozkladu (stanoveného podle DOC) nebo k méně než 25% rozkladu (stanoveného podle TSK nebo TCO2), lze zkušební chemické látky považovat za inhibující (viz také příloha IV). Série zkoušek by měla být opakována, pokud možno s nižší koncentrací zkušební chemické látky a/nebo s vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.

IV.I.6 OBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVA

Obecné podmínky pro zkoušky jsou shrnuty v tabulce 2. Přístroje a další experimentální podmínky specifické pro jednotlivé metody jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.

Tabulka 2: Zkušební podmínky

Zkouška	Zkouška na úbytek DOC	Zkouška na uvolňování CO2	Manometrická respirometrie	Modif. screeningová zkouška OECD	Zkouška v uzavřených lahvičkách	Zkouška MITI (I)
Koncentrace zkušební látky
mg·l-1			100		2 - 10	100
mg DOG/1	10-40	10 - 20		10 - 40
mg TSK/l			50 - 100		5 - 10
Koncentrace inokula (buňky/l, přibližně)	≤ 30 mg/l SL nebo ≤ 100 ml odpadní vody/l (107-108)	0,5 ml sekundární odpadní vody/l (105)	≤ 5 ml odpadní vody/l (104-106)	30 mg/l SL (107-108)
Koncentrace prvků v minerálním médiu (v mg·l-1)
P	116	11,6	29
N	1,3	0,13	1,3
Na	86	8,6	17,2
K	122	12,2	36,5
Mg	2,2	2,2	6,6
Ca	9,9	9,9	29,7
Fe	0,05 – 0,1	0,05 - 0,1	0,15
pH	7,4 ± 0,2	nejlépe 7,0
Teplota	22 ± 2 °C	25 ± 1 °C
DOC = rozpuštěný organický uhlík, TSK = teoretická spotřeba kyslíku, SL = suspendované látky

IV.I.6.1 Ředicí voda

Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek (např. ionty Cu^2+). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku vneseného zkušebním materiálem. Vysoká čistota vody pro zkoušky je nezbytná pro to, aby se nevyskytovaly vysoké hodnoty slepého pokusu. Kontaminace může pocházet z vlastních přítomných nečistot, z materiálu měniče iontů, z rozkladných látek z bakterií a řas. Pro každou sérii měření se použije pouze jedna šarže vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.

IV.I.6.2 Zásobní roztoky minerálních složek

Pro přípravu zkušebních roztoků se připraví zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metodu s úbytkem DOC, modifikovanou screeningovou metodu OECD, metodu s uvolňováním CO2, pro manometrickou respirometrii a pro metodu s uzavřenými lahvičkami.

Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v oddílech pro jednotlivé zkoušky.

Zásobní roztoky:

Za použití reakčních činidel čistoty p.a. se připraví následující zásobní roztoky:

a)	Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4	8,50 g
	Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO4	21,75 g
	Hydrogenfosforečnan disodný dihydrát, Na2HPO4·2H2O	33,40 g
	Chlorid amonný, NH4Cl	0,50 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.

b)	Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl2	27,50 g
	nebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl2·2H2O	36,40 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

c)	Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O	22,50 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

d)	Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O	0,25 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.

IV.I.6.3 Zásobní roztoky chemických látek

Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g·l^-1, rozpustí se například 1 – 10 g (podle potřeby) zkušební nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se zásobní roztoky připravují v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud jde o postup s méně rozpustnými chemickými látkami, viz příloha III; ve zkoušce MITI (metoda C.4-F) se nepoužívají ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.

IV.I.6.4 Inokula

Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd nebo z jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce na úbytek DOC, na uvolňování CO2 a ve zkoušce manometrickou respirometrií, měl by být odebrán z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované screeningové zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je potřebné zředěnější inokulum bez vloček kalu a nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v oddílu věnovaném této zkoušce.

IV.I.6.4.1 Inokulum z aktivovaných kalů

Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Podle potřeby se filtrací přes jemné síto odstraní hrubé částice a kal se udržuje v aerobních podmínkách.

Jinou možností je usazení nebo odstředění (např. 10 min při 1 100 g) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se odstraní. Kal se promyje minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 – 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a až do použití se provzdušňuje.

Kal by měl být odebrán z dobře fungující konvenční čistírny. Je-li nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem nebo předpokládá-li se, že kal obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Po důkladném promíchání se kal nechá usadit nebo se odstředí, voda nad usazeninou se odstraní a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepovažuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.

Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se těsně před použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny suspendovaných tuhých látek.

Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3 – 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se 2 min zpracovává v mechanickém mísiči při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá 30 min, popřípadě déle, usazovat a kapalina se dekantuje pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml na litr minerálního média.

IV.I.6.4.2 Jiné zdroje inokula

Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se 1 h usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a dekantovaná kapalina nebo filtrát se až do použití udržuje v aerobních podmínkách. Na litr média lze použít až 100 ml tohoto typu inokula.

Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní vody, a uchovává se až do použití v aerobních podmínkách. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo odstředěním.

IV.I.6.5 Předběžná úprava inokulí

Inokula je možné předběžně upravit pro experimentální podmínky, ale nikoli předběžně adaptovat na zkušební látku. Předběžná úprava spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 – 7 dnů při zkušební teplotě. Předběžná úprava někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžná úprava inokula pro zkoušku MITI se nepovažuje za nutnou.

IV.I.6.6 Abiotické kontroly

V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkušební látky stanovením úbytku DOC, přijmu kyslíku nebo uvolňování oxidu uhličitého ve sterilních kontrolách bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací přes membránu (0,2 – 0,45 μm) nebo přidáním vhodné toxické látky v odpovídající koncentraci. Používá-li se membránová filtrace, odebírají se vzorky asepticky, aby byla zachována sterilita. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkušební látky, měly by zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotickou kontrolu, která je inokulována a intoxikována.

IV.I.6.7 Počet nasazených baněk

Počet nasazených baněk v typické zkoušce je uveden v oddílech věnovaných jednotlivým zkouškám.

Mohou být použity tyto baňky:

Zkušební suspense: obsahující zkušební látku a inokulum

Slepá zkouška s inokulem: obsahující pouze inokulum

Kontrolní zkouška postupu: obsahující referenční látku a inokulum

Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahující zkušební látku (viz I.6.6)

Kontrola adsorpce: obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo

Kontrola toxicity: obsahující zkušební látku, referenční látku a inokulum

Stanovení ve zkušební suspensi a slepý pokus s inokulem musí být prováděny souběžně. Doporučuje se, aby stanovení v ostatních baňkách bylo prováděno rovněž souběžně.

To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo aby se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10denním období rozkladu.

IV.I.7 DATA A HODNOCENÍ

Při výpočtu rozkladu v procentech Dt, se použijí střední hodnoty z měření parametru provedených duplicitně v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu s inokulem. Vzorce jsou uvedeny dále v oddílech pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a vyznačí se 10denní období rozkladu. Vypočte se a uvede úbytek v procentech dosažený na konci 10denního období rozkladu a hodnota pro plató křivky nebo popřípadě hodnota odpovídající konci zkoušky.

V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).

IV.I.7.1 Měření rozkladu prostřednictvím stanovení DOC

Za účelem posouzení platnosti zkoušky (viz I.5.2) by se měla hodnota rozkladu Dt v procentech v každém časovém okamžiku, ve kterém se odebral vzorek, vypočítat odděleně pro každou baňku obsahující zkušební látku, a to pomocí středních hodnot měření DOC provedených duplicitně. Vypočte se podle následující rovnice:

Dt=1-Ct-CbtC0-Cb0×100

kde

Dt = rozklad v procentech v čase t,

C0 = střední počáteční koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkušební látku (v mg DOC na litr),

Ct = střední koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkušební látku v čase t (v mg DOC na litr),

Cbo = střední počáteční koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu (v mg DOC na litr),

Cbt = střední koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu v čase t (v mg DOC na litr).

Všechny koncentrace se stanoví experimentálně.

IV.I.7.2 Rozklad měřený specifickou analýzou

Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypočte se primární biologický rozklad z rovnice:

Dt=Sb-SaSb×100

kde

Dt = rozklad v procentech v čase t, obvykle po 28 dnech,

Sa = zbylé množství zkušební látky v médiu s inokulem na konci zkoušky (mg),

Sb = zbylé množství zkušební látky ve slepém pokusu s vodou/médiem, do kterých byla přidána pouze zkušební látka (mg).

IV.I.7.3 Abiotický rozklad

Použije-li se abiotická sterilní kontrola, vypočte se abiotický rozklad v procentech podle rovnice:

abiotický rozklad v %=Cs(0)-Cs(t)Cs(0)×100

kde:

Cs(0) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den 0,

Cs(t) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den t.

IV.I.8 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

— zkušební a referenční chemické látky a jejich čistota;

— zkušební podmínky;

— inokulum: charakter a místo (místa) odběru, koncentrace a jakákoli předběžná úprava;

— podíl a charakter průmyslového odpadu obsaženého v odpadní vodě, jsou-li známy;

— délka zkoušky a teplota;

— v případě špatně rozpustných zkušebních látek použitý způsob zpracování;

— použitá zkušební metoda; měly by být uvedeny vědecké důvody a vysvětlení pro veškeré změny postupu;

— přehled dat;

— veškeré pozorované projevy inhibice;

— jakýkoli pozorovaný abiotický rozklad;

— specifická analytická data o chemické látce, pokud existují;

— analytická data o meziproduktech, pokud existují;

— graf závislosti rozkladu v procentech na čase pro zkušební a referenční látku; je třeba zřetelně označit fázi iniciace, fázi rozkladu, 10denní období rozkladu a směrnici (příloha I). Vyhovuje-li zkouška kritériím jakosti, je možné v grafu použít střední hodnotu rozkladu v procentech v baňkách obsahujících zkušební látku;

— rozklad v procentech po 10denním období rozkladu, v oblasti plató a na konci zkoušky.

IVA. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) – metoda C.4-A podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVA.1 PODSTATA METODY

Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako nominální jediný zdroj organického uhlíku se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 ± 2 °C.

Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace.

IVA 2 POPIS METODY

IVA 2.1 Aparatura

a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;

b) Třepačka upravená pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;

c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;

d) Analyzátor DOC;

e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;

f) Odstředivka;

IVA 2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsána v bodě I.6.2.

Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVA 2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

IVA 2.4 Příprava baněk

Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I.6.4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných látek na litr. Připraví se rovněž kontroly s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.

Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.

Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládá abioticky (viz I.6.6).

Existuje-li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.

Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

IVA 2.5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkušební suspense

Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem

Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu

Dále se doporučují nebo se podle potřeby použijí:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola adsorpce

Baňka 8: Kontrola toxicity

Viz také bod I.6.7.

IVA 2.6 Provedení zkoušky

Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.

Před každým odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, bod 4). Zfiltrované nebo odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.

IVA 3 DATA A ZPRÁVY

IVA 3.1 Zpracování výsledků

Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).

Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledu dat.

IVA 3.2 Platnost výsledků

Viz bod I.5.2.

IVA 3.3 Zprávy

Viz bod I.8.

IVA 4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat.

ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC

1. LABORATOŘ

1. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

1. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l^-1

Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t0: mg·l^-1

1. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l^-1

1. STANOVENÍ UHLÍKU

Analyzátor uhlíku:

| | Baňka č. | | DOC po n dnech (mg·l-1) | | | | | | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Zkušební látka a inokulum | 1 | a1 | | | | | | | a2 | | | | | | | | | a, střední hodnota Ca(t) | | | | | | | | | 2 | b1 | | | | | | | | b2 | | | | | | | | | b, střední hodnota Cb(t) | | | | | | | | | Slepá zkouška s inokulem bez zkušební látky | 3 | c1 | | | | | | | c2 | | | | | | | | | c, střední hodnota Cc(t) | | | | | | | | | 4 | d1 | | | | | | | | d2 | | | | | | | | | d, střední hodnota Cd(t) | | | | | | | | | Cb1(t)=Cc(t)+Cd(t)2 | | | | | | | |

1. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT

| Baňka č. | | Rozklad v % po n dnech | | | | | | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1 | D1=1-Ca(t)-Cbl(t)Ca(0)-Cbl(0)×100 | 0 | | | | | | 2 | D2=1-Cb(t)-Cbl(t)Cb(0)-Cbl(0)×100 | 0 | | | | | | Střední hodnota* | D=D1-D22 | 0 | | | | |

Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.

Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity.

1. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)

| | Čas (dny) | | | 0 | t | | | --- | --- | --- | | DOC (mg·l-1) ve sterilní kontrole | Cs(0) | Cs(t) |

abiotický rozklad v %=Cs(0)-Cs(t)Cs(0)×100

1. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)

	Zbylé množství zkušební chemické látky na konci zkoušky (mg·l-1)	Primární rozklad v procentech
Sterilní kontrola	Sb
Inokulované zkušební médium	Sa	Sb-SaSb×100

IVB. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) - MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD – metoda C.4-B podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVB.1 PODSTATA METODY

Odměřený objem minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako jediný zdroj organického uhlíku se inokuluje 0,5 ml odpadní vody na litr média. Směs se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 ± 2 °C.

IVB.2 POPIS METODY

IVB.2.1 Aparatura

a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;

b) Třepačka pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;

c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;

d) Analyzátor DOC;

e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;

f) Odstředivka.

IVB.2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsaná v bodě I.6.2.

Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

V této metodě se používá jako inokulum pouze 0,5 ml odpadní vody na litr, a proto je nutné do média dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků na jeden litr výsledného média:

Roztok stopových prvků:

Síran manganatý tetrahydrát, MnSO4·4H2O	39,9 mg
Kyselina boritá, H3BO3	57,2 mg
Síran zinečnatý heptahydrát, ZnSO4·7H2O	42,8 mg
Heptamolybdenan hexaamonný, (NH4)6Mo7O24	34,7 mg
Chelát Fe (FeCl3 s kyselinou ethylendiaminotetraoctovou)	100,0 mg

Rozpustí se v ředicí vodě a doplní se touto vodou na 1 000 ml.

Vitaminový roztok:

Kvasničný extrakt	15,0 mg

Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 μm, nebo se připraví čerstvě.

IVB.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

Inokulum se získá z výstupu druhého stupně čistírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody.

Viz I.6.4.2 a I.6.5.

Použije se 0,5 ml na litr minerálního média.

IVB.2.4 Příprava baněk

Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují odpadní vodou z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I.6.4.2) v objemu 0,5 ml na litr. Připraví se rovněž slepé zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.

Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládána abioticky (viz I.6.6).

IVB.2.5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkušební suspense

Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem

Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu

Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola adsorpce

Baňka 8: Kontrola toxicity

Viz také bod I.6.7.

IVB.2.6 Provedení zkoušky

Před odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, bod 4). Zfiltrované resp. odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.

IVB.3 DATA A ZPRÁVY

IVB.3.1 Zpracování výsledků

Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).

Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledů dat.

IVB.3.2 Platnost výsledků

Viz bod I.5.2.

IVB.3.3 Zprávy

Viz bod I.8.

IVB.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat.

MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD

1. LABORATOŘ

1. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

1. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l^-1

Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t0: mg·l^-1

1. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi; mg·l^-1

1. STANOVENÍ UHLÍKU

Analyzátor uhlíku:

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)