Vyhláška o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

• 7.9. Jakmile se na lilku vejcoplodém objeví příznaky, měla by být provedena izolace za použití částí pletiva zvadlých listů nebo stonků rostlin. Povrch listů a stonků lilku vejcoplodého se vydezinfikuje otřením 70 % etanolem. Provede se test IF nebo PCR na šťávě z lilku a izoluje se na vhodném (selektivním) médiu (viz oddíl 8). Může se také připravit Gramovo barvení (dodatek 9). Čisté kultury podezřelé z přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují a potvrdí se patogenita (viz oddíl 9 a 10).

• 7.10. Za určitých okolností, zejména pokud nejsou růstové podmínky optimální, se může stát, že Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus zůstává v rostlinách lilku vejcoplodého jako latentní infekce dokonce i po uplynutí inkubační doby až 4 týdnů. Pokud nejsou po 4 týdnech pozorovány žádné příznaky, provede se test IF/PCR na složeném vzorku částí stonků o délce 1 cm z každé testované rostliny odebraných nad místem inokulace. Pokud je test pozitivní, měla by být provedena izolace na vhodných (selektivních) médiích postupem podle oddílu 8. Čisté kultury podezřelé z přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují a potvrdí se patogenita (viz oddíl 9 a 10).

• 1. Izolace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

Diagnóza může být potvrzena pouze tehdy, je-li původce kroužkovitosti izolován a takto identifikován. Ačkoliv je původce kroužkovitosti náročným organismem, je možno ho izolovat z pletiv projevujících příznaky napadení.

Mohou jej však přerůst rychle rostoucí saprofytické bakterie, a proto se nedoporučuje provádět izolaci přímo z pelety pletiva hlízy (3.1.5) nebo stonku (3.2). Přímá izolace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus je možná za použití selektivního média a vhodného ředění resuspendované pelety z pupkové části hlízy nebo ze stonků rostliny.

Izolace se provádí ze všech hlíz bramboru nebo částí stonku a z rostlin lilku vejcoplodého, které nevykazují příznaky napadení, ale u nichž byl pozitivní výsledek v testu IF/PCR složených vzorků (viz oddíl 7.9). Pokud je třeba provést maceraci stonků lilku, měla by být provedena podle oddílu 3.1.2.

Jako pozitivní kontroly se připraví desetinná ředění suspenze 10^6 cfu na ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (např. NCPPB 4053 nebo PD 406). Aby se vyloučilo nebezpečí kontaminace, připraví se pozitivní kontroly odděleně od vzorků, které mají být testovány.

Pro každou nově připravenou dávku selektivního média by se měla před použitím k testování obvyklých vzorků přezkoušet jeho vhodnost pro růst patogenu.

Kontrolní materiál se testuje stejným způsobem jako vzorky.

• 8.1. Roztěr na selektivní médium

• 8.1.1. Ze 100 µl alikvotní části ze vzorku resuspendované bramborové pelety nebo šťávy z lilku vejcoplodého se připraví desetinásobné ředění v peletovém pufru (dodatek 3).

• 8.1.2. Izolace z neředěné bramborové pelety se obvykle nepodaří kvůli náročným růstovým podmínkám Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a konkurenci saprofytů. Vzhledem k tomu, že bakterie je obvykle v infikovaných pletivech přítomná ve vysokých koncentracích, lze saprofyty obvykle vypláchnout ředěním, zatímco patogen zůstává. Proto se doporučuje rozetřít 100 µl z každého vzorku, v ředění1/100 až 1/10 000 na MTNA médium nebo NCP-88 médium (dodatek 5), za použití pomůcek určených k roztěrům (hokejek) a techniky roztěrů.

• 8.1.3. Desky se inkubují v temnu při teplotě 21-23°C.

• 8.1.4. Počáteční kontrola misek zahrnuje porovnání s kontrolními miskami a počítání všech kolonií podobných Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se provádějí po třech dnech, s dalším počítáním po 5,7 a 10 dnech.

• 8.2. Čištění podezřelých kolonií

Poznámka:

Subkultury kolonií podobných Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus pro inokulaci lilku vejcoplodého a/nebo následnou identifikaci by se měly pěstovat na YGM médiu; inokulace a identifikace by se měly provést dříve, než jsou média příliš přerostlá, tj. nejlépe po 3-5 dnech.

• 8.2.1. Kolonie podobné Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se rozetřou na jedno z následujících médií (složení uvedena v dodatku 5):

• živný dextrózový agar (pouze pro subkultury),

• kvasničný pepton glukosový agar,

• agar z kvasničného extraktu s minerálními solemi.

Inkubace probíhá při teplotě 21-24 °C po dobu maximálně 10 dní.

Původce kroužkovitosti roste pomalu a obvykle vytváří kolonie velikosti špendlíkové hlavičky, vyklenuté, smetanově zbarvené.

• 8.2.2. Opětovně se provede roztěr pro zaručení čistoty. U subkultur se rychlost růstu zlepšuje. Typické kolonie jsou smetanově bílé nebo barvy slonoviny, někdy žluté, okrouhlé, hladké, vyvýšené, konvexně vyklenuté, slizovitě tekuté, s rovnými okraji a obvykle mají v průměru 1 – 3 mm.

Jednoduché Gramovo barvení (dodatek 9) může pomoci vybrat kolonie pro další testování.

• 8.2.3 Podezřelé kultury se identifikují (viz oddíl 9) a provede se zkouška patogenity (viz oddíl 10).

• 1. Identifikace

Čisté kultury pravděpodobné izolované kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují za použití nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.

V případě potřeby se zahrne pro každý provedený test známý referenční kmen.

• 9.1. Nutriční a enzymatické identifikační testy

Zjišťují se následující fenotypické vlastnosti. Veškerá média by se měla inkubovat při 21 °C a po šesti dnech by měla být vyhodnocena. Pokud nedošlo k žádnému růstu, inkubuje se po dobu nejvýše 20 dní.

Všechny testy musí zahrnovat kontrolu se známým kmenem Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Nutriční a fyziologické testy se musí provádět za použití inokula ze subkultur živného agaru. Morfologická srovnání se musí provádět z kultur z živného dextrózového agaru.

Test	Očekávaný výsledek
Oxidačně-fermentační (O/F)	inertní nebo slabě oxidační
Aktivita oxidázy	-
Aktivita katalázy	+
Redukce nitrátů	-
Aktivita ureázy	-
Tvorba H2S	-
Tvorba indolu	-
Využívání citrátu	-
Hydrolýza škrobu	- nebo slabá
Růst při 37 °C	-
Růst v 7% NaCl	-
Hydrolýza želatiny	-
Hydrolýza eskulinu	+
Tvorba kyseliny z:
- glycerolu	-
- laktózy	- nebo slabá
- rhamnózy	-
- salicinu	-
Gramovo barvení (dodatek 9)

• 9.2. IF test

• a) Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk/ml v pufru na IF (dodatek 3).

• b) Připraví se série dvojnásobného ředění vhodného antiséra.

• c) Provede se IF postup (oddíl 4).

• d) Pozitivního výsledku IF testu je dosaženo, jestliže IF titr kultury odpovídá titru pozitivní kontroly.

• 9.3. PCR test

• a) Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na ml ve sterilní vodě (UPW)

• b) Zahřívá se 100 µl suspenze buněk v uzavřených mikrozkumavkách v ohřívacím bloku nebo vřící vodní lázni při teplotě 100 °C po dobu 4 minut. V případě potřeby se může lýza buněk podpořit přidáním čerstvě připraveného NaOH do konečné koncentrace 0,05 M. Vzorky lze potom uložit při teplotě -16 až -24 °C až do použití.

• c) Pro amplifikaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus specifických amplikonů se použijí vhodné postupy PCR (např. Pastrik, 2000; viz dodatek 4; Li a de Boer, 1995; Mills a kol., 1997; Pastrik a Rainey, 1999; Schaad a kol., 1999).

• d) Identifikace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus je pozitivní, pokud jsou amplikony PCR stejné velikosti a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentu jako pozitivní kontrolní kmen.

• 9.4. FISH test

• a) Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na ml v UPW.

• b) Provede se postup FISH (oddíl 5)

• c) Test FISH je pozitivní, jsou-li dosaženy stejné reakce kultury a pozitivní kontroly.

• 9.5. Analýza mastných kyselin (FAP)

• a) Kultura se pěstuje na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) po dobu 72 hodin při teplotě 21 °C (+/- 1°C).

• b) Použije se vhodný postup FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

• c) Test FAP je pozitivní, pokud je profil podezřelé kultury identický s profilem pozitivní kontroly. Přítomnost charakteristických mastných kyselin 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 a 17:0 Anteiso jasně svědčí o přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Jiné rody jako Curtobacterium, Arthrobacter a Micrococcus také obsahují některé z těchto kyselin, ale 15:1 Anteiso A je pro tyto bakterie neobvyklá kyselina, která se však vyskytuje ve všech Clavibacter spp. v rozmezí 1-5 %. U Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se hodnota obvykle pohybuje kolem 5 %.

• 9.6. BOX-PCR

• a) Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na ml v UPW.

• b) Provede se test postupem podle Smith a kol., 2001.

• 1. Test patogenity

Pro konečné potvrzení původce kroužkovitosti a pro stanovení virulence kultur identifikovaných jako Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus musí být provedena zkouška patogenity.

• 10.1. Připraví se inokulum přibližně 10^6 buněk na ml z 3-denních kultur testované izolované látky a vhodného pozitivního kmene Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

• 10.2. Naočkuje se 5-10 stonků mladých semenáčků lilku vejcoplodého ve fázi 3 pravých listů.

• 10.3. Inkubuje se při teplotě 18-24 °C při dostatečném světle a vysoké relativní vlhkosti s přiměřeným zaléváním, aby nedošlo k přemokření nebo vyschnutí. U čistých kultur by mělo během 2 týdnů nastat typické vadnutí, avšak rostliny, které po uplynutí této doby nevykazují žádné příznaky infekce, by se měly inkubovat až 3 týdny při teplotách příznivých pro růst lilku vejcoplodého, ale nepřesahujících 25 °C. Jestliže se po 3 týdnech příznaky infekce nevyskytují, nemůže být kultura považována za patogenní formu Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

• 10.4. Izolace se provádí z rostlin s příznaky infekce odstraněním části stonku 2 cm nad místem inokulace. Pletiva se rozdrtí a suspendují v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fosfátového pufru. Izoluje se ze suspenze rozetřením nebo nanesením na MTNA a YPGA, inkubuje se po dobu 3-5 dní při teplotě 21-23°C a sleduje se vznik kolonií typických pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Dodatek 1

Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů

Laboratoř (1)	Místo	Země
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit	Vídeň a Linec	Rakousko
Departement Gewasbescherming	Merelbeke	Belgie
Plantedirektoratet	Lyngby	Dánsko
Central Science Laboratory	York	Anglie
Scottish Agricultural Science Agency	Edinburgh	Skotsko
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Unité de Bactériologie	Angers	Francie
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre	Le Rheu	Francie
Biologische Bundesanstalt	Kleinmachnow	Německo
Pflanzenschutzamt Hannover	Hannover	Německo
State Laboratory	Dublin	Irsko
Plantenziektenkundige Dienst	Wageningen	Nizozemsko
Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre	Aas	Norsko
Direcção-General de Protecção das Culturas	Lisabon	Portugalsko
Nacionalni institut za biologijo	Ljubljana	Slovinsko
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia	Salamanca	Španělsko
(1) Kontaktní osoby: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Dodatek 2

Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH

Vypěstuje se 72 hodinová kultura virulentního kmene C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 nebo PD 406) na základním médiu MTNA a suspenduje se v 10 mMfosfátového pufru pro získání hustoty přibližně 1 až 2 × 10^8 buněk schopných tvorby kolonií/ml. Toho se obvykle dosáhne prostřednictvím slabě zakalené suspenze odpovídající optické hustotě 0,20 – 600 nm.

Výkrojky pletiva se odeberou z pupkových konců 200 hlíz odebraných z produkce odrůdy s bílou slupkou, u které je jisté, že je prosta C. m. subsp. sepedonicus.

Pupkové výkrojky se zpracují obvyklým způsobem a resuspenduje se peleta v 10 ml.

Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 µl resuspendované pelety.

Přenese se 100 µl suspenze C. m. subsp. sepedonicus do první mikrozkumavky. Nechá se protřepat.

V následujících pěti mikrozkumavkách se provedou desetinná ředění.

Šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako pozitivní kontrola. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako negativní kontroly. Mikrozkumavky se opatří štítkem.

Připraví se alikvotní části z 100 µl ve sterilních mikrozkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Skladování probíhá při teplotě – 16 až – 24 °C až do doby použití.

Přítomnost a množství C. m. subsp. sepedonicus v kontrolních vzorcích by měla být nejprve potvrzena prostřednictvím imunofluorescence.

Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Pro IF a FISH testy se provedou kvantitativní rozbory pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být C. m. subsp. sepedonicus zjištěn v nejméně v 10^6 a 10^4 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

Dodatek 3

Pufry pro testovací postupy

OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

• 1. Pufry pro extrakci

• 1.1. Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)

Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.

Na2 HPO4 (bezvodý)	4,26 g
KH2PO4	2,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Užitečné mohou být následující složky:

	Účel	Množství (na litr)
Lubrolové vločky	Protisrážlivý prostředek (*)	0,5 g
DC silikonový odpěňovač	Odpěňovací činidlo (*)	1,0 ml
Tetrasodiumpyrofosfát	Antioxidační činidlo	1,0 g
Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP ‒ 40)	Vázání inhibitorů PCR	50 g
(*) pro použití při extrakci homogenizací

• 1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)

Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.

Na2HPO4 .12H2O	2,7 g
NaH2PO4 . 2H2O	0,4 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

• 1. Pufry pro IF test

• 2.1. Pufry pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)

Tento pufr se používá k ředění protilátek.

Na2HPO4 .12H2O	2,7 g
NaH2PO4 . 2H2O	0,4 g
NaCl	8,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min

• 2.2. IF-pufr-Tween

Tento pufr se používá k mytí sklíček.

Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.

• 2.3. Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6

Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.

Na2HPO4 .12H2O	3,2 g
NaH2PO4 . 2H2O	0.15 g
Glycerol	50 ml
Destilovaná voda	100 ml

Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield^® (Vector Laboratories) nebo Citifluor^® (Leica).

Dodatek 4

Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk

• 1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).

• 1. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku mikroskopického sklíčka (C).

C=c×S/s,

kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více jamkami a

s = plocha pole objektivu.

s=π2/4G2K2,

kde i = koeficient pole (v rozmezí od 8 ‒ 24 podle typu okuláru),

K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),

G = zvětšení objektivu (100 ×, 40 × atd.).

• 1. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).

N=C×1 000/y×F,

kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a

F = zřeďovací faktor resuspendované pelety

Dodatek 5

Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus

• 1. Obecná růstová média

Živný agar (Nutrient agar = NA)

Živný agar (Difco)	23 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Živný dextrózový agar (Nutrient dextrose agar = NDA)

Difco bakto živný agar obsahující 1 % D(+) glukózy (monohydrátu). Provede se sterilizace v autoklávu při 121 C po dobu 20 min.

Kvasnično-pepton-glukózový agar (Yeast peptone glucose agar = YPGA)

Kvasnicový extrakt (Difco)	5,0 g
Baktopepton (Difco)	5,0 g
D(+) glukóza (monohydrát)	10,0 g
Baktoagar (Difco)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Médium s kvasnicovým extraktem a minerálními solemi (Yeast extract mineral salts medium = YGM)

Kvasnicový extrakt (Difco)	2,0 g
D(+) glukóza (monohydrát)	2,5 g
K2HPO4	0,25 g
KH2PO4	0,25 g
MgSO4 . 7H2O	0,1 g
MnSO4 . H2O	0,015 g
NaCl	0,05 g
FeSO4 . 7H2O	0,005 g
Baktoagar (Difco)	18,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí a provede se sterilizace 0,5 l média v autoklávu při 115 °C po dobu 20 min.

• b) Validovaná selektivní růstová média

Médium MTNA

Pokud není uvedeno jinak, pocházejí všechny složky médií z BDH.

Kvasnicový extrakt (Difco)	2,0 g
Manit	2,5 g
K2HPO4	0,25 g
KH2PO4	0,25 g
MgSO4 . 7H2O	0,1 g
MnSO4 . H2O	0,015 g
NaCl	0,05 g
FeSO4 . 7H2O	0,005 g
Agar (Oxoid č. 1)	16,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí, pH se upraví na 7,2. Po autoklávování (při 121 °C po dobu 15 min.) a ochlazení na 50 C se přidají antibiotika: trimethoprim 0,06 g, nalidixic acid 0,002 g, amphotericin B 0,01 g.

V zásobě se nechají roztoky antibiotik: trimethoprim (Sigma) a nalidixic acid (Sigma) (obě 5 mg/ml) v 96 % metanolu, amphotericin B (Sigma) (1 mg/ml) v dimethyl sulfoxidu. Zásobní roztoky jsou sterilizované filtrací.

Poznámka:

Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 °C.

Médium NCP-88

Živný agar (Difco)	23,0 g
Kvasnicový extrakt (Difco)	2,0 g
D-manit	5,0 g
K2HPO4	2,0 g
KH2PO4	0,5 g
MgSO4 . 7H2O	0,25 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí,upraví se pH na 7,2. Po autoklávování a ochlazení na 50 °C se přidají následující antibiotika: polymyxin B sulphate (Sigma) 0,003g, nalidixic acid (Sigma) 0,008 g, cycloheximide (Sigma) 0,2 g.

Antibiotika se rozpustí pro přípravu zásobních roztoků následovně: nalidixic acid v 0,01 M NaOH, cykloheximid v 50% etanolu, polymyxin B sulphate v destilované vodě. Zásobní roztoky se sterilizují filtrací.

Poznámka:

Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 °C.

Dodatek 6

Validované protokoly a činidla pro PCR

Poznámka:

Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 10^3 až 10^4 buněk C. m. subsp. sepedonicus na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií.

• 1. Vícenásobný PCR protokol s interní PCR kontrolou (Pastrik, 2000)

• 1.1. Oligonukleotidní primery

primer PSA-1	5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'
primer PSA-R	5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'
primer NS-7-F	5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'
primer NS-8-R	5'- tcc gca ggt tca cct acg ga -3'

Předpokládaná velikost amplikonu z DNA C. m. subsp. sepedonicus šablony = 502 bp (sada PSA-primerů).

Předpokládaná velikost amplikonu z interní PCR kontroly 18S rRNA = 377 bp (sada NS- primerů).

• 1.2. Reakční směs PCR

Činidlo	Množství na reakci	Konečná koncentrace
Sterilní voda (UPW)	15,725 µl
10× PCR pufr (1) (15 mM MgCl2)	2,5 µl	1×(1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs d-nTP (20 mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer PSA-1 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Primer PSA-R (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Primer NS-7-F(10 µM) (2)	0,1 µl	0,04 µM
Primer NS-8-R (10 µM) (2)	0,1 µl	0,04 µM
Taq polymeráza (5 U/µl) (1)	0,2 µl	1,0 U
Vzorkové množství	5,0 µl
Celkový objem	25,0 µl

(^1) Metody byly validovány za použití Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq nebo Gold) a Gibco BRL.

(^2) Koncentrace primerů NS-7 F a NS-8-R byla optimalizována pro extrakci pupkové části bramboru za použití homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz oddíl 6.1 písm. a) a 6.2). Při použití extrakce třepáním nebo jinými metodami izolace DNA je nutná nová optimalizace koncentrací činidla.

• 1.3. Reakční podmínky pro PCR

Postupuje se podle následujícího programu:

1 cyklus:	i)	3 minuty při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
10 cyklů	ii)	1 minuta při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
	iii)	1 minuta při teplotě 64 °C (připojení primerů)
	iv)	1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie)
25 cyklů	v)	30 sekund při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
	vi)	30 sekund při teplotě 62 °C (připojení primerů)
	vii)	1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie)
1 cyklus	viii)	5 minut při teplotě 72 °C (závěrečná prodlužování)
	ix)	Udržuje se při teplotě 4 °C

Poznámka:

Tento program je optimalizován pro použití s tepelným cyklerem MJ Research PTC 200. Při použití jiných modelů může být nutná modifikace kroků cyklů ii), iii) iv), v), vi) a vii).

• 1.4. Analýzy ampliconu restriktivním enzymem

Produkty PCR amplifikované z DNA C. m. subsp. sepedonicus produkují charakteristickou mnohotvárnost délky fragmentu s enzymem Bgl II po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Fragmenty získané z fragmentu specifického pro C. m. subsp. sepedonicus mají rozměry 282 bp a 220 bp.

• 1. Příprava nanášecího pufru

• 2.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)

Bromfenolová modř	5g
Destilovaná voda	50 ml

Nanášecí pufr

Glycerol (86 %)	3,5 ml
Bromfenolová modř	300 µl
Destilovaná voda	6,2 ml

• 1. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0

TRIS	48,4 g
Ledová kyselina octová	11,42 ml
EDTA (sodná sůl)	3,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Před použitím se zředí na 1x.

Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).

Dodatek 7

Validovaná činidla pro FISH test

• 1. Oligosondy

Sonda specifická pro Cms CMS-CY3-01: 5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'

Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5'- gct gcc tcc cgt agg agt-3'

• 1. Fixační roztok

[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ! POUŽÍVAT RUKAVICE A NEVDECHOVAT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]

ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Indikačním proužkem se zkontroluje pH a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH.

[UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ pH!]

iii) Roztok se přefiltrujte přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.

iv) Poznámka:

Alternativní fixační roztok: 96 % etanol.

• 1. 3x Hybmix

NaCl	2,7 M
Tris-HCl	60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)	15 mM

Zředí se až 1x, podle potřeby.

• 1. Hybridizační roztok

1x Hybmix
Sodium dodecyl sulfát (SDS)	0,01 %
Sonda EUB 338	5 ng/µl
Sonda CMSCY301	5 ng/µl

Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 µl hybridizačního roztoku.

Tabulka: Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

	2 sklíčka	8 sklíček
Sterilní ultra čistá voda	50,1	200,4
3x hybmix	30,0	120,0
1 % SDS	0,9	3,6
sonda EUB 338 (100 ng/µl)	4,5	18,0
sonda CMSCY301 (100 ng/µl)	4,5	18,0
Celkový objem (µl)	90,0	360,0

Poznámka.:

Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití je nutné je ochraňovat před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.

• 1. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0

Na2HPO4	8,52 g
KH2PO4	5,44 g
Destilovaná voda	1,001

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a sterilizuje se autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Dodatek 8

Pěstování lilku vejcoplodého

Semena lilku vejcoplodého (Solanum melongena) se vysejí do pasterizovaného výsevního substrátu. Semenáčky s plně rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přepichují do pasterizovaného pěstebního substrátu.

Lilek by se měl pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

Délka dne:	14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;
Teplota:	den:	21 až 24 °C,
	noc:	15 °C.
Vhodné odrůdy lilku vejcoplodého	„Black Beauty“,
---	---
„Long Tom“,
„Rima“,
„Balsas“.

Dodavatel: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Dodatek 9

Gramovo barvení v Huckerově modifikaci (Doetsch, 1981) (^1)

Roztok krystalové violeti

Rozpustí se 2 g krystalové violeti v 20 ml 95 % etanolu.

Rozpustí se 0,8 g šťavelanu amonného v 80 ml destilované vody.

Oba roztoky se smíchají.

Lugolův jódový roztok

Jód	1 g
Jodid draselný	2 g
Destilovaná voda	300 ml

Pevné látky se společně rozetřou pomocí tloučku v misce. Nasypou se do vody a míchají se v uzavřené nádobě do rozpuštění.

Safraninový roztok kontrastního barviva

Zásobní roztok:

Safranin O	2,5 g
95 % etanol	100 ml

Zamíchá se a uloží se.

Ředění: 1:10 pro přípravu pracovního roztoku.

Postup barvení

• 1. Připraví se roztěry, vysuší se na vzduchu a fixují se zahřátím.

• 1. Sklíčko se zalije roztokem krystalové violeti a nechá se působit 1 minutu.

• 1. Krátce se omyje pod tekoucí vodou.

• 1. Zalije se Lugolovým jódovým roztokem a nechá se působit po dobu jedné minuty.

• 1. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.

• 1. Odbarvuje se pomocí po kapkách přidávaného 95 % etanolu tak dlouho, pokud se vyplavuje barvivo, nebo ponořením za jemného pohybování do etanolu na dobu 30 sekund.

• 1. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.

• 1. Zalije se safraninovým roztokem a nechá se působit 10 s.

• 1. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.

Grampozitivní bakterie se zbarví fialově modře, gramnegativní bakterie se zbarví růžovočerveně.

(^1) Mohou se také použít komerčně dostupné roztoky nebo barvicí soupravy.

LITERATURA

• 1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers. Commission of the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11 288 EN, 21 pp.

• 1. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213‒218.

• 1. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147‒152.

• 1. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. V: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21‒23.

• 1. Hugh, R a Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24‒26.

• 1. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fattyacid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335‒345.

• 1. Janse, J. D. a J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., č. 17, 1987, pp. 1‒10.

• 1. Jansing, H. a K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590‒601.

• 1. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.

• 1. Klement Z.; Rudolph, K a D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

• 1. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114‒118.

• 1. Lelliott, R. A., E. Billing a A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470‒489.

• 1. Lelliott, R. A. a P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101‒106.

• 1. Li, X. a S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837-842.

• 1. Mills, D., Russell, B., W. a J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phytopathology, 87, 8, 853‒861.

• 1. Pastrik, K. -H. a R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687‒693.

• 1. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155‒165.

• 1. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

• 1. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. a Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095‒1100.

• 1. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. ‒ 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp.

• 1. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.

• 1. Smith, N. C; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739‒748.

• 1. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481‒527.

• 1. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281‒295.

• 1. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. a A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546‒4554.

B. METODY DIAGNÓZY, DETEKCE A IDENTIFIKACE PŮVODCE HNĚDÉ HNILOBY

Předložené postupové diagramy popisují různé postupy, které jsou součástí:

ii) detekce Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru, rostlin bramboru, rostlin rajčete a jiných hostitelských rostlin, a ve vzorcích vody a půdy,

iii) identifikace Ralstonia solanacearum (R. solanacearum)

OBECNÉ ZÁSADY

Optimalizované protokoly pro různé metody, schválená činidla a podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku 1.

Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a zahrnují použití životaschopných kultur R. solanacearum jako kontrolních materiálů, je nutné pracovat za vhodných karanténních podmínek s odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek stanovených příslušným povolením rostlinolékařské správy.

Testovací parametry musí zajišťovat stálé a reprodukovatelné zjištění úrovní R. solanacearum jako stanovené prahy vybraných metod.

Zcela nezbytná je přesná příprava pozitivních kontrol.

Testování podle požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení, údržbu a kalibraci zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich uchovávání a všechna opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky, např. oddělení pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být uplatněno standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním a jiným chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.

Podezření z výskytu, jak je uvedeno v § 4 odst. 1, naznačuje pozitivní výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech. První pozitivní screeningový test ( test IF, PCR/FISH, selektivní izolace) musí být potvrzen druhým screeningovým testem založeném na jiném biologickém principu.

Pokud je první screeningový test pozitivní, existuje podezření na infekci R. solanacearum a musí být proveden druhý screeningový test. Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je podezření potvrzeno a musí se pokračovat v testování podle daného schématu. Jestliže je druhý screeningový test negativní, pak vzorek není považován za infikovaný R. solanacearum.

Potvrzená přítomnost podle § 5 odst. 1 vyžaduje izolaci a identifikaci čisté kultury R. solanacearum s potvrzením patogenity.

• 1. Použití postupových diagramů

• 1.1. Postupový diagram pro diagnózu hnědé hniloby a bakteriálního vadnutí (Ralstonia solanacearum) hlíz bramboru a rostlin bramboru, rajčete a jiných hostitelských rostlin vykazujících příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního vadnutí

Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z výskytu nebo typickými příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního vadnutí. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogena z infikovaného vodivého pletiva na selektivní živné půdě a v případě pozitivního výsledku identifikaci kultury Ralstonia solanacearum.

[image omitted]

1) Popis příznaků se nachází v oddíle 2.1.

2) Rychlé diagnostické testy usnadňují předběžnou diagnózu, ale nejsou dokonalé. Negativní výsledek naznačuje vždy nepřítomnost patogenu.

3) Test na výtok slizu ze svazků cévních stonku je popsán v oddíle 6.1.1.

4) Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu je popsán v oddíle 6.1.2.

5) Sérologické aglutinační testy bakteriálního slizu nebo extraktů z pletiva vykazujícího příznaky jsou popsány v oddíle 6.1.3.

6) Test IF bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.5.

7) Test FISH bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.7.

8) Test ELISA bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.8.

9) Test PCR bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.6.

10) Patogen je obvykle snadno izolovatelný z rostlinného materiálu vykazujícího příznaky metodou zřeďovacích roztěrů (postupným ředěním) (viz. v oddíle 2.3.).

11) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

12) Kultivace může selhat při pokročilých fázích infekce z důvodů konkurence nebo bujného růstu saprofytických bakterií. Jestliže jsou příznaky infekce typické, ale izolační test je negativní, musí se izolace opakovat, nejlépe kultivací na selektivních živných půdách.

13) Spolehlivá identifikace čistých kultur R. solanacearum se provede pomocí testů popsaných v bodu 6.2. Dílčí specifická charakteristika je nepovinná, ale doporučuje se pro každý nový případ.

14) Test patogenity je popsán v bodu 6.3.

• 1.2. Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru nevykazujících příznaky

Testování je určeno ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek alespoň ze dvou screeningových testů (viz poznámka v diagramu 3), z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogenu a dále, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je R. solanacearum. Pozitivní výsledek pouze z jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý. Screeningové testy a izolační testy musí umožnit detekční práh 10^3 až 10^4 buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.

[image omitted]

1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použit i na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.

2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.1.1.

3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, je pro validaci prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Je-li druhý nebo další test negativní, je vzorek považován za negativní. Další testy nejsou nutné.

4) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.

5) Test selektivní izolace je popsán v oddíle 6.1.4.

6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.

7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.

8) Testy ELISA jsou posány v oddíle 6.1.8.

9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, je třeba opakovat izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku, případně provést test s dalšími vzorky.

12) Spolehlivé identifikace čistých kultur podezřelých na R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích rostlin bramboru nevykazujících příznaky, rostlin rajčete nevykazujících příznaky nebo rostlin jiných hostitelských rostlin nevykazujících příznaky

[image omitted]

1) Viz. oddíl 3.2.1., kde jsou uvedeny doporučené velikosti vzorků.

2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.2.1.

3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se alespoň jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, vyžaduje se pro validaci prvního pozitivního výsledku provedení druhého nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Jsou-li druhý nebo další testy negativní, považuje se vzorek za negativní. Další testy nejsou nutné.

4) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

5) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.

6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.

7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.

8) Testy ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.8.

9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, opakují se izolační testy.

12) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že se jedná o R. solanacearum, se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

• 1. Diagnóza původce hnědé hniloby

• 2.1. Příznaky

• 2.1.1. Příznaky u bramboru

Rostlina bramboru. Raná fáze infekce v polních podmínkách se rozpozná vadnutím listů směrem k vrcholu rostliny při vysokých teplotách během dne, přičemž v noci dochází k zotavení. V raných fázích vadnutí zůstávají listy zelené, ale později žloutnou a objevují se hnědé nekrózy. Dochází také k ohýbání listů dolů. Vadnutí jednoho výhonku nebo celé rostliny se rychle stává nevratným a končí kolapsem a uhynutím rostliny. Z cévních svazků napříč uříznutých stonků zvadlých rostlin obvykle vytéká hnědý a mléčný bakteriální sliz nebo je možné sliz vymáčknout. Při ponoření uříznutého stonku svisle do vody se z cévních svazků táhnou vlákna slizu.

Hlíza bramboru. Hlízy bramboru je třeba překrojit napříč u pupkového konce a podélně přes pupkový konec. V rané fázi se infekce pozná podle láhvově žlutého až světle hnědého zabarvení cévního prstence, ze kterého po několika minutách začne prýštit bledý krémový bakteriální sliz. Později se cévní zbarvení stává výrazněji hnědým a odumření se může rozšířit do parenchymatického pletiva. V pokročilejších fázích se infekce rozšíří vně od pupkového konce hlízy a z oček může vytékat bakteriální sliz, na který se přilepují částice půdy. Na slupce se mohou objevit červenohnědá, lehce propadlá místa jako důsledek vnitřního kolapsu cévního pletiva. V pokročilejších fázích infekce je obvyklý sekundární rozvoj měkkých hnilob bakteriálního a houbového původu.

• 2.1.2. Příznaky u rajčete

Rostlina rajčete. Prvním viditelným příznakem je povadlý vzhled nejmladších listů. Za příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy kolem 25°C, při nasycené vzdušné vlhkosti) se během několika málo dní rozvine kroucení listů směrem dolů a vadnutí na jedné straně rostliny nebo celé rostliny, které končí jejím úplným odumřením. Za méně příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy méně než 21°C) rostlina tolik nevadne, ale na stonku se může tvořit větší počet postranních výhonů. Je možné pozorovat vodou nasáklé pruhy od spodu stonku, které jsou dokladem odumírání cévního systému. Při příčném řezu stonkem vylučují hnědě zbarvená vodivá pletiva bílý nebo nažloutlý bakteriální sliz.

• 2.1.3. Příznaky u jiných hostitelů

Rostliny Solanum dulcamara a S. nigrum. Za normálních podmínek jsou u těchto plevelných hostitelských rostlin zřídkakdy pozorovány příznaky vadnutí, pokud teploty půdy nepřevyšují 25°C nebo není extrémně vysoká koncentrace inokula (např. u rostliny S. nigrum rostoucí u nemocné rostliny bramboru nebo rajčete). Při vadnutí jsou příznaky stejné jako u rostliny rajčete. Nevadnoucí rostliny S. dulcamara, která má stonky a kořeny ve vodě, mohou vykazovat vnitřní světle hnědé zbarvení vodivých pletiv na příčném řezu spodní části stonku nebo částí stonku pod vodou. Z řezu cévních svazků mohou vytékat bakterie nebo mohou tvořit vlákna slizu, jestliže je řez stonku ponořen svisle do vody, a to i při absenci příznaků vadnutí.

• 2.2. Rychlé screeningové testy

Rychlé screeningové testy mohou napomoci předběžné diagnóze, ale nejsou dostačující. Použije se jeden nebo více následujících testů:

• 2.2.1. Test na výtok slizu ze stonku

(Viz. 6.1.1.)

• 2.2.2. Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu (PHB)

Charakteristické granule PHB v buňkách R. solanacearum jsou zviditelněny obarvením tepelně fixovaných skvrn bakteriálního slizu z infikovaného pletiva na mikroskopickém sklíčku nilskou modří A nebo súdánskou černí (viz. oddíl 6.1.2.).

• 2.2.3. Sérologické aglutinační testy

(Viz. oddíl 6.1.3.)

• 2.2.4. Jiné testy

Dalšími vhodnými rychlými screeningovými testy jsou test IF (viz.oddíl 6.1.5.), test FISH (viz.oddíl 6.1.7.), testy ELISA (viz.oddíl 6.1.8.) a testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.).

• 2.3. Postup při izolaci

• a) Odebere se sliz nebo vrstva zbarveného pletiva z cévního prstence hlízy bramboru nebo z cévních vláken stonku rostliny bramboru, rajčete nebo jiné vadnoucí hostitelské rostliny. Suspenduje se v malém množství sterilní destilované vody nebo 50mM fosfátového pufru (dodatek 4) a nechá se 5-10 minut stát.

• b) Připraví se řada desetinásobných ředění suspenze.

• c) Přenese se 50-100 μl suspenze a roztoku na universální živnou půdu (NA, YPGA neboSPA; viz. dodatek 2) a/nebo Kelmanovo tetrazolové médium (dodatek 2) a/nebo validované selektivní médium (např. SMSA, viz. dodatek 2). Rozetře se metodou zřeďovacích roztěrů. Připraví se případně samostatné misky s rozředěnou buněčnou suspenzí R. solanacearum biovar 2 k pozitivní kontrole.

• d) Inkubuje se 2-6 dní při teplotě 28°C.

• Na universální živné půdě vytvářejí virulentní izoláty R. solanacearum perlově krémově bílé, ploché, nepravidelné a fluidní kolonie, často s charakteristickými spirálkami ve středu. Aviruletní formy R. solanacearum tvoří malé kruhové nefluidní máslovité kolonie, které jsou zcela krémově bílé.

• U Kelmanova tetrazolového média a média SMSA jsou spirálky krvavě červeně zbarvené. Aviruletní formy R. solanacearum tvoří malé kruhové nefluidní máslovité kolonie, které jsou zcela temně červené.

• 2.4 Identifikační testy Ralstonia solanacearum

Testy potvrzující výskyt R. solanacearum v podezřelých izolátech jsou popsány v bodu 6.2.

• 1. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby ve vzorcích hlíz bramboru

• 3.1. Podrobné metody pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru

• 3.1.1. Příprava vzorků

Poznámka:

• Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na jeden test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dipozici menší množství hlíz.

• Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.

• Extrakt bramboru popsaný níže může být rovněž použit pro zjištění původce bakteriální kroužkovitosti bramboru. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Nepovinné ošetření před přípravou vzorku

• a) Inkubace vzorků při teplotě 2-30°C po dobu až 2 týdnů před testováním na podporu množení všech populací R. solanacearum.

• b) Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné desinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je vhodný zvláště v případě, když je ve vzorcích příliš zeminy nebo jestliže má být proveden test PCR nebo přímá izolace.

• 3.1.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nože na zeleninu se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy, tak aby bylo viditelné vodivé pletivo. Opatrně se vyříznou malé výkrojky vodivých pletiv na pupkovém konci. Množství pletiva nezahrnující cévní svazky se omezí na minimum.

Poznámka:

Všechny (hnijící) hlízy s podezřelými příznaky hnědé hniloby se dají stranou a testují se odděleně.

Pokud jsou při vyříznutí výkrojku zjištěny příznaky podezření na hnědou hnilobu, provede se vizuální vyšetření takové hlízy na řezu hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se uchovávají po dobu nejméně 2 dnů při pokojové teplotě, aby mohlo dojít ke zkorkovatění (suberizaci) a potom se uchovávají v chladu (4-10°C) za řádných karanténních podmínek. Všechny hlízy včetně hlíz s podezřelými příznaky by měly být uchovány podle přílohy III.

• 3.1.1.2. Výkrojky z pupkové části se uloží do nepoužitých nádob na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že nádoby jsou znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě. Není-li to možné, uchovávají se v nádobě bez přidání pufru; v chladu nejdéle 72 hodin nebo při pokojové teplotě (18 -25 °C) nejdéle 24 hodin.

Výkrojky z pupkových konců se zpracují jedním z následujících postupů:

• a) Zalijí se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) a třepou se v rotační třepačce (50-100 ot./min) 4 hodiny při teplotě nižší než 24 °C nebo 16-24 hodin chlazené,

nebo

• b) homogenizují se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) buď v mixéru (např. Waring nebo Ultra Thurax) nebo drcením v utěsněném maceračním sáčku na jedno použití (např. silný polyethylenový sáček Stomacher nebo Bioreba, 150mm × 250mm, sterilovaný zářením) pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex).

Poznámka:

Při homogenizaci vzorků pomocí mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutné zamezit vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakčního procesu. Pro každý vzorek se použijí čerstvě sterilované nože (ostří) a nádoby. Při testu PCR je nutno zabránit přenosu DNA na nádobách nebo v mlecím přístroji. U testu PCR se doporučuje použít drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavek na jedno použití.

• 3.1.1.3. Supernatant se dekantuje. Je-li příliš zakalený, pročistí se buď pomalým odstřeďováním (nejvýš 180 g po dobu 10 minut při teplotě 4-10°C) nebo vakuovou filtrací (40-100µm), filtr se omyje přídavkem (10ml) extrakčního pufru.

• 3.1.1.4. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním, 7 000g po dobu 15 minut (nebo 10 000g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10°C a odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.

• 3.1.1.5. Peleta se resuspenduje v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 4). Použije se 500 µl pro R. solanacearum, 500 µl pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a 500 µl pro referenční účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10 - 25% (v/v) k 500 µl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se vířením a uloží se při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo -68 až -86°C (měsíce). Extrakty se uchovávají během testování při teplotě 4-10°C.

Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.

Je-li nutná přeprava extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu s doručením do 24 až 48 hodin.

• 3.1.1.6. Je nezbytně nutné, aby všechny pozitivní kontroly a vzorky R. solanacearum byly uchovány a zpracovány odděleně, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci. To platí pro sklíčka IF a všechny testy.

• 3.1.2. Testování

Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:

Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)

IF test (viz.oddíl 6.1.5.)

Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)

Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)

Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)

Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)

• 3.2. Podrobné metody pro detekci a identifikaci R. solanacearum ve vzorcích bezpříznakových rostlin bramboru, rajčete nebo jiných hostitelských rostlin

• 3.2.1. Příprava vzorků

Poznámka:

Pro účely detekce latentních populací R. solanacearum se doporučuje testovat smíšené vzorky. Postup lze vhodně použít na smíšené vzorky o počtu až 200 stonkových částí. Provádí-li se průzkum, měl by být založen na statisticky reprezentativním vzorku zkoumané rostlinné populace.

• 3.2.1.1. Do uzavřené sterilní nádoby se uloží 1-2 cm dlouhé kousky stonků podle následujícího postupu vzorkování:

Rajčatové sazenice z předpěstírny: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere kousek dlouhý 1 cm z paty každého stonku hned nad úrovní země.

Rostliny z pole nebo skleníku: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere nejspodnější postranní výhonek z každé rostliny uříznutý hned nad spojením s hlavním stonkem. Odebere se nejspodnější, 1 cm dlouhý díl z každého výhonku.

Jiné hostitelské rostliny: Čistým dezinfikovaným nožem nebo zahradnickými nůžkami se odebere 1 cm dlouhý díl z paty každého stonku hned nad úrovní země. U lilku potměchuti (S. dulcamara) nebo jiných hostitelských rostlin rostoucích ve vodě se odeberou 1-2 cm díly ze stonku pod vodou nebo oddenků s vodními kořeny.

Při vzorkování určité oblasti se doporučuje testovat statisticky representativní vzorek o počtu nejméně 10 rostlin na 1 vzorkovací místo pro každou potenciální plevelnou hostitelskou rostlinu. Detekce patogenu bude nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu, ačkoli přirozenou infekci je možné zjistit po celý rok u víceleté Solanum dulcamara rostoucí ve vodních tocích. Mezi známé hostitelské rostliny patří plevelné rostliny bramboru, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium a další zástupci čeledi Solanaceae. Dalšími hostitelskými rostlinami jsou rostliny rodu Pelargonium spp. a Portulaca oleracea. Některé evropské plevelné druhy, které mohou hostit populace R. solanacearum biovar 2/Race 3 v kořenech a/nebo oddencích za specifických podmínek, zahrnují Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra a Urtica dioica.

Poznámka:

V této fázi je možné provést vizuální šetření vnitřních příznaků (zbarvení cév nebo bakteriální sliz). Jakýkoli díl stonku s příznaky se dá stranou a testuje se odděleně (viz. oddíl 2.).

• 3.2.1.2. Části stonku se krátce dezinfikují 70% etanolem a ihned vysuší savým papírem. Potom se zpracují části stonku jedním z následujících postupů:

• a) zalijí se části dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) a třepou na rotační třepačce (50-100 ot./min) 4 hodiny při teplotě do 24°C nebo 16-24 hodin chlazené,

nebo

• b) se ihned zpracují drcením v pevném maceračním sáčku (např. Stomacher nebo Bioreba) s přiměřeným množstvím extrakčního pufru (dodatek 4) pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex). Není-li to možné, uloží se části stonků v chladu nejdéle na 72 hodin nebo při pokojové teplotě (18 – 25°C) na 24 hodin.

• 3.2.1.3. Po usazení, které má trvat 15 minut, se dekantuje supernatant.

• 3.2.1.4. Další pročišťování extraktu nebo zahušťování bakteriální frakce obvykle není třeba, ale lze je provést filtrací a/nebo odstřeďováním popsaným v oddíle 3.1.1.3. až 3.1.1.5.

• 3.2.1.5. Čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt se rozdělí na dva stejné díly. Jeden díl se testuje při teplotě 4-10°C a druhý díl se skladuje v 10-25% (v/v) sterilním glycerolu při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo -68 až -86°C (měsíce) pro případné další testování.

• 3.2.2. Testování

Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:

Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)

Test IF (viz. oddíl 6.1.5.)

Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)

Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)

Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)

Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)

• 1. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby ve vodě

• 4.1 Postupový diagram pro detekci a identifikaci R. solanacearum ve vodě

[image omitted]

(1) Viz. oddíl 4.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování.

(2) Metody koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 4.2.1. Koncentrace zvětšuje populaci jak patogenu, tak konkurenčních saprofytických bakterií a doporučuje se jen tehdy, jestliže nebrání izolačnímu testu.

(3) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

(5) Metody obohacovacího testu PCR jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.

(6) Metody obohacovacího testu ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.8.

(7) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

(8) Kultivace může selhat z důvodu konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření, že velká saprofytická populace ovlivní spolehlivost izolace, opakují se izolační testy po zředění vzorku sterilní vodou.

(9) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

(10) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

• 4.2. Metody detekce a identifikace R. solanacearum ve vodě

Princip

Validované schéma detekce popsané v tomto oddíle je použitelné k detekci patogenu ve vzorcích povrchové vody a rovněž může být použito k testování vzorků odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody. Očekávaná citlivost detekce se však liší v závislosti na substrátu. Citlivost testu selektivní izolace je ovlivňována populacemi konkurenčních saprofytických bakterií, kterých je obecně mnohem více v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě než v povrchové vodě. Zatímco níže uvedené schéma předpokládá detekci asi 10^3 buněk/litr povrchové vody, citlivost detekce v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě bude pravděpodobně podstatně nižší. Z tohoto důvodu se doporučuje testovat odpadní vodu po provedení nějakého čistícího postupu (např. sedimentace nebo filtrace), při nichž dojde ke snížení saprofytických bakteriálních populací. Omezení citlivosti testovacího schématu by mělo být bráno v úvahu při hodnocení spolehlivosti v případě získání negativních výsledků.Vzhledem k tomu, že se toto schéma používá úspěšně k mapování výskytu nebo nepřítomnosti patogenu v povrchové vodě, je třeba si uvědomit jeho omezení při použití k podobnému mapování v odpadní vodě ze zpracování brambor a v odpadní vodě.

• 4.2.1. Příprava vzorků

Poznámka:

• Zjištění R. solanacearum v povrchové vodě je nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu, kdy teplota vody překračuje 15°C.

• Opakované vzorkování v různé době během výše uvedených období na určených vzorkovacích místech zvýší spolehlivost zjištění snížením vlivů výkyvů povětrnostních podmínek.

• Vlivem silných dešťů a geografie vodního toku může dojít ke značnému zředění a tím i zastření výskytu patogenu.

• Vzorky vody se odebírají v blízkosti hostitelských rostlin, pokud jsou přítomny.

• 4.2.1.1. Na vybraných vzorkovacích místech se odeberou vzorky vody do sterilních zkumavek nebo lahviček na jedno použití, pokud možno 30 cm pod hladinou a 2 m od břehu. Při vzorkování odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody se odeberou vzorky z místa výtoku odpadní vody. Doporučená velikost vzorku je 500 ml. Je-li upřednostňována menší velikost, doporučuje se odebrat vzorky nejméně 3krát pro každé vzorkovací místo, z nichž každý bude obsahovat 2 opakované dílčí vzorky o velikosti nejméně 30 ml. Při intenzivním mapování se vyberou nejméně 3 vzorkovací místa na každé 3 km vodního toku a vzorkují se rovněž přítoky.

• 4.2.1.2. Vzorky se přepravují v chladu a temnu (4-10°C) a testují do 24 hodin.

• 4.2.1.3. Je-li potřeba, může být provedena koncentrace bakteriální frakce pomocí následujících metod:

• a) Odstřeďují se 30-50 ml dílčí vzorky při 10 000 g po dobu 10 minut (nebo 7000 g po dobu 15 minut), pokud možno při teplotě 4-10°C, slije se kapalina nad usazeninou a resuspenduje se peleta v 1 ml pufru (dodatek 4).

• b) Provede se filtrace přes membránu (minimální velikost pórů 0,45 µm) s následným promytím filtru v 5-10 ml peletového pufru a zachycením filtrátu. Tato metoda je vhodná pro velké objemy vody, které obsahují malý počet saprofytů.

Koncentrace se obvykle nedoporučuje u vzorků vody ze zpracování brambor nebo u vzorků odpadní vody, protože zvýšená populace konkurenčních saprofytických bakterií inhibuje detekci Ralstonia solanacearum.

• 4.2.2. Testování

Viz. postupový diagram a popis testů v příslušných dodatcích.

• 1. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby v půdě

• 5.1. Postupový diagram pro detekci a identifikaci R. solanacearum v půdě

[image omitted]

(1) Viz. oddíl 5.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování

(2) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

(3) Obohacovací PCR testy jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.

(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

(5) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

(6) Kultivace může selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření na vliv saprofytické populace na spolehlivost izolace, opakují se testy selektivní izolace po dalším zředění vzorku.

(7) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

(8) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

• 5.2. Metody pro detekci a identifikaci R. solanacearum v půdě

Principy

Platné detekční schéma popsané v tomto oddíle je použitelné pro detekci patogenu ve vzorcích půdy, ale může být rovněž použito k testování vzorků pevného odpadu při zpracování brambor nebo kalu z odpadní vody. Je však nutné poznamenat, že tyto metody nejsou dostatečně citlivé, aby zaručovaly detekci nízkých nebo nepravidelně rozptýlených populací Ralstonia solanacearum, které se mohou vyskytovat v přirozeně infikovaných vzorcích těchto substrátů.

Při hodnocení spolehlivosti všech získaných negativních výsledků a také při sestavování přehledů určujících přítomnost patogenu v půdě nebo kalu je třeba vzít v úvahu omezenou citlivost tohoto testovacího schématu. Nejspolehlivějším testem přítomnosti patogenu v polní půdě je vypěstování náchylné hostitelské rostliny a její sledování, zda není infikována, ale i při použití této metody unikne nízký stupeň zamoření pozornosti.

• 5.2.1. Příprava vzorků

• 5.2.1.1. Vzorkování polní půdy by se mělo řídit standardními principy používanými pro vzorkování hlístů. Na jeden vzorek se shromáždí 0,5 až 1 kg půdy ze 60 míst na ploše 0,3 ha z hloubky 10-20 cm. Je-li podezření na výskyt patogenu, zvyší se počet sběrných míst na 120 z plochy 0,3 ha. Před testováním se uchovávají vzorky při teplotě 12-15°C. Kal ze zpracování brambor a kanalizace se navzorkuje shromážděním celkem 1 kg z míst reprezentujících celkový objem testovaného kalu. Před testováním se každý vzorek dobře promíchá.

• 5.2.1.2. Dílčí vzorky 10-25 g půdy nebo kalu se rozptýlí rotační třepačkou (250 ot./min) v 60-150 ml extrakčního pufru (dodatek 4) po dobu 2 hodin. Je-li třeba, přidání 0,02% sterilního Tween-20 a 10-20 g sterilních kamínků může napomoci disperzi.

• 5.2.1.3. Během testování se udržuje suspenze v teplotě 4°C.

• 5.2.2. Testování

Postupový diagram a popis testů jsou v příslušném dodatku.

• 1. Optimalizované protokoly pro detekci a identifikaci R. solanacearum

• 6.1. Diagnostické a detekční testy

• 6.1.1. Test na výtok slizu ze stonku

Přítomnost R. solanacearum ve stoncích vadnoucích rostlin bramboru, rajčete nebo jiných hostitelských rostlin může ukázat následující jednoduchý test pravděpodobného výskytu: uřízne se stonek právě nad úrovní země. Řez stonku se ponoří do zkumavky s čistou vodou. Sleduje,se, zda se po několika minutách objeví charakteristická samovolně proudící vlákna bakteriálního slizu z přeříznutých cévních svazků.

• 6.1.2. Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu

• 1. Připraví se roztěr bakteriálního slizu z infikovaného pletiva nebo ze 48 hodinové kultury na živné půdě YPGA nebo SPA (dodatek 2) na mikroskopické sklíčko.

• 1. Připraví se pozitivní kontrolní roztěr kmenu biovaru 2 R. solanacearum a případně negativní kontrolní roztěr o známém PHB negativním sp.

• 1. Roztěry se nechají uschnout a spodní povrch každého sklíčka se rychle protáhne nad plamenem, aby se roztěry fixovaly.

• 1. Preparáty se obarví buď nilskou modří nebo súdánskou černí a provede se mikroskopické pozorování podle níže uvedeného popisu:

Test nilskou modří:

• a) Obě sklíčka se zakápnou 1% vodným roztokem nilské modři a nechají se inkubovat 10 minut při teplotě 55°C.

• b) Odstraní se barvící roztok. Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.

• c) Roztěr se zakápne 8% vodním roztokem kyseliny octové a nechá se inkubovat 1 minutu při pokojové teplotě.

• d) Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.

• e) Znovu se navlhčí kapkou vody a přiloží se krycí sklíčko.

• f) Zkoumá se obarvený roztěr epifluorescenčním mikroskopem při 450 nm pod olejovou nebo vodní imersí se zvětšením 600× až 1000× s použitím objektivu pro olejovou nebo vodní imersi.

• g) Pozoruje se, zda se objeví na PHB granulích jasně oranžová fluorescence. Také se pozoruje v procházejícím normálním světle, zda jsou granule intracelulární a zda je morfologie buněk typická pro R. solanacearum.

Test súdánskou černí:

• a) Zakápnou se všechna sklíčka 0,3% roztokem súdánské černi B v 70% etanolu a inkubují se 10 minut při pokojové teplotě.

• b) Odstraní se barvící roztok a krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku a odsaje se přebytečná voda savým papírem.

• c) Sklíčka se ponoří krátce do xylolu a vysají se savým papírem. Upozornění: Xylol je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.

• d) Sklíčka se zakápnou 0,5% (w/v) vodným roztokem safraninu a nechají 10 vteřin inkubovat při pokojové teplotě. Upozornění: safranin je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.

• e) Sklíčka se opláchnou jemně tekoucí vodou z kohoutku, odsaje se přebytečná voda savým papírem a přiloží se krycí sklíčko.

• f) Zkoumá se obarvený roztěr mikroskopem s procházejícím světlem pod olejovou imersí a při zvětšení 1 000×.

• g) Hledá se modročerné zbarvení PHB granulí v buňkách R. solanacearum s růžově zbarvenými stěnami buněk.

• 6.1.3. Sérologické aglutinační testy

Aglutinace buněk R. solanacearum v bakteriálním slizu nebo v extraktech z pletiv s příznaky je nejlépe pozorovatelná pomocí validovaných protilátek (viz. dodatek 3) označených příslušnými obarvenými značkovači, např. červenými buňkami Staphylococcus aureus nebo obarvenými latexovými částicemi. Při použití komerčně dostupného vybavení (viz. dodatek 3) se postupuje podle instrukcí výrobce. Jinak je postup následující:

• a) Smíchají se kapky suspenze označené protilátky a bakteriálního slizu (přibližně 5 µl každé látky) na okénku testovacího víceokénkového sklíčka.

• b) Připraví se pozitivní a negativní kontrolní vzorky použitím suspenzí biovaru 2 R. solanacearum a heterologního kmenu.

• c) Pozoruje,se zda se v pozitivních vzorcích po jemném míchání po dobu 15 sekund objeví aglutinace.

• 6.1.4. Selektivní izolace

• 6.1.4.1. Očkování na živnou půdu

Poznámka:

Než se použije tato metoda poprvé, provede se předběžný test k zajištění reprodukovatelné detekce 10^3 až 10^4 jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaných do extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Použije se řádně validovaná selektivní živná půda, např. SMSA (ve znění Elphinstone et al., 1996; viz. dodatek 2).

Rozlišení R. solanacearum od jiných bakterií schopných na živné půdě růst vyžaduje velkou pozornost. Dále, kolonie R. solanacearum mohou mít atypickou morfologii, jestliže Petriho misky jsou přeplněny nebo jsou rovněž přítomny antagonistické bakterie. Je-li podezření na konkurenci nebo inhibici, měl by být vzorek otestován znovu pomocí jiného testu.

Při použití čerstvě připravených extraktů ze vzorků lez očekávat, že citlivost detekce touto metodou bude velmi vysoká. Metoda je však použitelná i pro extrakty, které byly uchovány v glycerolu při teplotě od -68 do -86°C.

Pozitivní kontroly se připraví jako desetinné ředění ze suspenze 10^6 cfu/ml virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762= CFBP 3857). K vyloučení možné kontaminace se připraví pozitivní kontrolní vzorky zcela odděleně od vzorků k testování.

U každé nově připravené šarže selektivní živné půdy by měla být před jejím použitím k rutinnímu testování vzorků nejdříve otestována její vhodnost pro kultivaci patogenu. Kontrolní materiál se testuje týmž způsobem jako vzorek (vzorky).

• 1. Provede se ředění s cílem zajistit, aby všechny populace saprofytických bakterií byly vyloučeny. Nanese se 50-100 µl extraktu vzorku na 1 misku pro každé ředění.

• 1. Misky se nechají inkubovat při teplotě 28°C. Po 48 hodinách se zkontroluje jejich stav a pak se provádí kontrola denně po 6 dní. Typické kolonie R. solanacearum na živné půdě SMSA jsou mléčně bílé, ploché, nepravidelné a fluidní a po 3 dnech inkubace se rozvine růžově až krvavě červené zbarvení ve středu s vnitřními pruhy nebo spirálami.

Poznámka:

Někdy se na tomto médiu tvoří atypické kolonie R. solanacearum. Mohou být malé, kruhové, zcela červené a nefluidní nebo jen částečně fluidní, a proto obtížně rozeznatelné od saprofytických bakterií tvořících kolonie.

• 1. Předpokládané kolonie R. solanacearum se rozetřou nebo očkují metodou zřeďování na universální živnou půdu, aby se získaly izolované kolonie (viz. dodatek 2).

• 1. Kultury se uchovávají krátkodobě ve sterilní vodě (pH 6-8, bez chlóru) při pokojové teplotě v temnu nebo dlouhodobě ve vhodném ochranném médiu při teplotě -68 až -86°C nebo lyofilizované.

• 1. Provede se identifikace podezřelých kultur (viz. oddíl 6.2.) a test patogenity (viz oddíl 6.3).

Interpretace výsledků testu očkováním na selektivní média.

Test očkování na selektivní média je negativní, jestliže po 6 dnech nejsou zpozorovány žádné bakterie nebo nejsou nalezeny žádné podezřelé kolonie typické pro R. solanacearum, za předpokladu, že nedošlo k inhibici jinými bakteriemi a v kontrolních vzorcích jsou nalezeny typické kolonie R. solanacearum.

Test očkování na selektivní média je pozitivní, jestliže jsou izolovány podezřelé kolonie R. solanacearum.

• 6.1.4.2. Obohacovací testy

Použije se validované médium pro obohacení, např. modifikovaný bujón Wilbrink (viz dodatek 2).

Tento postup lze použít pro selektivní zvětšení populací R. solanacearum v extraktech ze vzorků a zvýšení citlivosti detekce. Tímto způsobem dojde i ke zředění potenciálních inhibitorů PCR testu (1:100). Obohacení R. solanacearum však může být neúspěšné z důvodů konkurence nebo antagonismu saprofytických organismů, které bývají často současně také obohaceny. Z tohoto důvodu může být izolace R. solanacearum z obohacené kultury obtížná. Kromě toho, protože může dojít k rozvoji populací sérologicky příbuzných saprofytů, se pro test ELISA doporučuje použít místo polyklonálních protilátek specifické monoklonální protilátky.

• 1. U obohacovacího testu PCR se přenese 100 ul extraktu ze vzorku do 10 ml obohaceného bujónu (dodatek 2), který se předem připraví do sterilních zkumavek nebo baněk. U obohacovacího testu ELISA může být použit větší podíl extraktu ze vzorku do bujónu (např. 100 ul v 1,0 ml obohacené živné půdy).

• 1. Inkubuje se 72 hodin při teplotě 27 až 30 °C v třepané nebo statické kultuře s uvolněnými uzávěry, které umožní provzdušňování.

• 1. Před zahájením testů ELISA nebo PCR se obsah dobře promíchá.

• 1. S obohaceným bujónem se zachází týmž způsobem jako se vzorky ve výše uvedených testech.

Poznámka: