Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

§ 1

Předmět úpravy

(1) Tato vyhláška zapracovává příslušné předpisy Evropských společenství^1)^,^2)^,^3)^,^4)^,^5)^,^6)^,^7)^,^7a) a stanoví základní metody pro zkoušení nebezpečných vlastností chemické látky nebo chemického přípravku, pro který jsou látka nebo přípravek klasifikovány jako vysoce toxické, toxické, zdraví škodlivé, žíravé, dráždivé, senzibilizující, karcinogenní, mutagenní nebo toxické pro reprodukci^8) (dále jen „toxicita chemických látek a přípravků“).

(2) Touto vyhláškou nejsou dotčena ustanovení zvláštních právních předpisů, která upravují ochranu zvířat^9),^10).

§ 2

Metody zkoušení

(1) Seznam základních metod pro zkoušení toxicity chemických látek nebo chemických přípravků je uveden v příloze č. 1.

(2) Základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek nebo chemických přípravků jsou upraveny v příloze č. 2.

§ 3

Zrušovací ustanovení

Zrušuje se:

• 1. Vyhláška č. 251/1998 Sb., kterou se stanoví metody zjišťování toxicity chemických látek a přípravků.

• 1. Vyhláška č. 208/2001 Sb., kterou se mění vyhláška č. 251/1998 Sb., kterou se stanoví metody zjišťování toxicity chemických látek a přípravků.

§ 4

Účinnost

Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem 1. srpna 2004.

Ministr:

MUDr. Kubinyi, Ph.D. v. r.

Příloha č. 1 k vyhlášce č. 443/2004 Sb.

Seznam základních metod pro zkoušení toxicity chemických látek nebo přípravků

B.1 bis	Akutní toxicita orální - metoda fixní dávky
B.1 tris	Akutní toxicita orální - metoda stanovení třídy akutní toxicity
B.2	Akutní toxicita inhalační
B.3	Akutní toxicita dermální
B.4	Akutní toxicita: dráždivé a leptavé účinky na kůži
B.5	Akutní toxicita: dráždivé a leptavé účinky na oči
B.6	Senzibilizace kůže
B.7	Subakutní toxicita orální (per os) (28 denní opakovaná aplikace)
B.8	Subakutní toxicita inhalační (28 denní opakovaná aplikace)
B.9	Subakutní toxicita dermální (28 denní opakovaná aplikace)
B.10	Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro
B.11	Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo
B.12	Mutagenita - in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech
B.13/14	Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií
B.15	Genové mutace - Saccharomyces cerevisiae
B.16	Mitotické rekombinace - Saccharomyces cerevisiae
B.17	Mutagenita - test genových mutací v savčích buňkách in vitro
B.18	Poškození DNA reparace - neplánovaná syntéza DNA - savčí buňka in vitro
B.19	SCE - výměna sesterských chromatid in vitro
B.20	Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophila melanogaster
B.21	Test transformace savčích buněk in vitro
B.22	Dominantní letální test u hlodavců
B.23	Analýza chromozómových aberací u savčích spermatogonií
B.24	Spot test u myší
B.25	Přenosné translokace u myší
B.26	Test subchronické orální toxicity (90 denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům)
B.27	Test subchronické orální toxicity (90 denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací nehlodavcům)
B.28	Subchronická toxicita dermální (90 denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích)
B.29	Subchronická toxicita inhalační (90 denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích)
B.30	Testování chronické toxicity
B.31	Studie prenatální vývojové toxicity
B.32	Test karcinogenity
B.33	Kombinovaný test chronické toxicity/karcinogenity
B.34	Reprodukční toxicita - jednogenerační test
B.35	Dvougenerační studie reprodukční toxicity
B.36	Toxikokinetika
B.37	Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu
B.38	Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu - 28 denní opakovaná expozice
B.39	Test neplánované syntézy DNA v savčích jaterních buňkách in vivo
B.40	Leptavé účinky na kůži
B.41	Fototoxicita - test fototoxicity 3T3 NRU - in vitro
B.42	Senzibilizace kůže: zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin
B.43	Zkouška neurotoxicity na hlodavcích“.

Příloha č. 2 k vyhlášce č. 443/2004 Sb.

Základní pojmy a metody pro zkoušení toxicity chemických látek nebo chemických přípravků

VŠEOBECNÝ ÚVOD

• 1 ZÁKLADNÍ POJMY

• 1.1 Akutní toxicita

zahrnuje nepříznivé účinky, které se objeví během určité doby (většinou 14 dní) po podání jedné dávky nějaké látky.

• 1.2 Zřejmá toxicita

je všeobecný termín popisující jasné příznaky toxicity po aplikaci testované látky. Jsou to příznaky dostačující pro posouzení rizika a měly by být takové, že po zvýšení podávané dávky může být očekáván vznik těžkých toxických příznaků a pravděpodobně i úmrtí.

• 1.3 Dávka

je množství podané testované látky. Dávka je vyjádřena jako hmotnost látky (gramy nebo miligramy) nebo jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (např. miligramy na kilogram tělesné hmotnosti), nebo jako konstantní dietní koncentrace (díly na milión dílů - ppm, nebo miligramy na kilogram potravy).

• 1.4 Diskriminační dávka

je nejvyšší ze čtyř pevných dávkových hladin, kterou je možno podat, aniž by způsobila uhynutí (včetně humánního utracení) související s podanou látkou.

• 1.5 Dávkování

je všeobecný termín zahrnující dávku, frekvenci a celkovou dobu podávání.

• 1.6 LD50 (střední smrtná dávka)

je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která pravděpodobně způsobí za definovanou dobu smrt 50 % zvířat, kterým byla podána. Hodnota LD50 se udává jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (mg.kg^-1 tělesné hmotnosti).

• 1.7 LC50 (střední smrtná koncentrace)

je statisticky vypočtená koncentrace látky, která pravděpodobně způsobí smrt do určité doby po expozici u 50 % pokusných zvířat, exponovaných po definovanou dobu. Hodnota LC50 se udává jako hmotnost testované látky ve standardním objemu vzduchu (mg.l^-1).

• 1.8 NOAEL

je zkratka pro „No Observed Adverse Effect Level“ a je to nejvyšší dávka nebo expoziční koncentrace látky, při které není pozorován žádný statisticky významný nepříznivý účinek na organismus v porovnání s kontrolní skupinou.

• 1.9 LOAEL

je zkratka pro „Lowest Observed Adverse Effect Level“ a je to nejnižší dávka nebo expoziční koncentrace látky, při které je ještě pozorován statisticky významný nepříznivý účinek na organismus v porovnání s kontrolní skupinou.

• 1.10 Toxicita po opakované dávce/subchronická toxicita

zahrnuje nepříznivé účinky, které se objeví u pokusných zvířat v důsledku opakovaného denního podávání nebo expozice chemické látce, po dobu představující krátký úsek (desítky dnů) očekávané délky života příslušného živočišného druhu.

• 1.11 Nejvyšší tolerovaná dávka (MTD - maximum tolerated dose)

je nejvyšší dávka, která u zvířat vyvolává zřetelné projevy toxicity, avšak bez podstatného vlivu na přežití s ohledem na účinek, který je testován.

• 1.12 Kožní dráždivost

je vyvolání zánětlivých změn na kůži po aplikaci testované látky.

• 1.13 Oční dráždivost

je vyvolání změn na oku po aplikaci testované látky na povrch oka.

• 1.14 Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida)

je imunologicky vyvolaná reakce kůže na testovanou látku.

• 1.15 Poleptání kůže

je vyvolání nevratného tkáňového poškození kůže při působení testované látky po dobu od 3 minut do 4 hodin.

• 1.16 Toxikokinetika

je studium absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece testovaných látek.

• 1.17 Absorpce

označuje proces(y), kterým(i) aplikovaná látka vstupuje do těla.

• 1.18 Exkrece

označuje proces(y), kterým(i) je aplikovaná látka případně její metabolity odstraňovány z těla.

• 1.19 Distribuce

označuje proces(y), kterým(i) je absorbovaná látka případně její metabolity rozdělovány v těle.

• 1.20 Metabolismus

označuje proces(y), kterým(i) je chemická struktura aplikované látky měněna v těle enzymatickými nebo neenzymatickými reakcemi.

• 1.21 GHS

Globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodářkou spolupráci a rozvoj (lidské zdraví a životní prostředí), Odborného výboru OSN pro přepravu nebezpečného zboží (fyzikálně-chemické vlastnosti) a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpečnosti) koordinovaný Meziorganizačním programem pro řádné nakládání s chemikáliemi (IOMC).

• 1.22 Blížící se uhynutí

když je očekáván stav agónie nebo uhynutí před další plánovanou dobou pozorování. Příznaky svědčící o tomto stavu u hlodavců mohou zahrnovat křeče, polohu na boku, polohu vleže a třes.^7a)

• 1.23 Limitní dávka

označuje nejvyšší přípustnou dávku (2 000 nebo 5 000 mg/kg).

• 1.24 Stav agónie

označuje stav před úhynem nebo neschopnost přežít, ani když je pokusné zvíře léčeno.^7a)

• 1.25 Předvídatelný úhyn

přítomnost klinických příznaků svědčících o blížící se smrti, přičemž čas, kdy k úhynu dojde lze předvídat a bude kratší než je doba předpokládaného ukončení pokusu.^7a)

• 1.26 Opožděný úhyn

znamená, že pokusné zvíře během 48 h neuhyne ani nejeví známky umírání, ale uhyne později během čtrnáctidenní doby pozorování.

• 2 AKUTNÍ - OPAKOVANÁ APLIKACE/ SUBCHRONICKÁ A CHRONICKÁ TOXICITA

Akutní toxické účinky a orgánová nebo systémová toxicita mohou být vyhodnoceny za použití velkého počtu různých testů toxicity (metody B.1 - B.5^2)^,^3)^,^4)), ze kterých může být po jediné aplikaci získán předběžný odhad toxicity.

V závislosti na toxicitě látky lze zvolit různé postupy od limitního testu až po kompletní stanovení LD50. Pro inhalační studie není limitní test navržen, protože nebylo možné definovat limitní hodnotu jednorázové inhalační expozice.

Pozornost se věnuje metodám, které využívají co nejmenší počet zvířat a minimalizují utrpení zvířete, například metoda fixní dávky (metoda B.1 bis)^2) a metoda stanovení třídy akutní toxicity (metoda B.1 tris)^4). Při testování na jednom druhu může studie na druhém druhu doplnit závěry vyvozené z první studie. V tomto případě se použije standardní testovací metoda nebo může být použito menšího počtu zvířat.

Testem toxicity s opakovanou aplikací (metody B.7,^4) B.8^2) a B.9^2)) se posuzují toxické účinky vznikající v důsledku opakované expozice. Důležité je klinické pozorování zvířat tak, aby se získalo co nejvíce informací. Tyto testy pomohou zjistit cílové orgány toxicity a toxické a netoxické dávky. Od dlouhodobých studií se vyžaduje zkoumání těchto aspektů do větší hloubky (metody B.26,^7) B.27,^7) B.28,^1) B.29,^1) B.30^1) a B.33^1)).

• 3 MUTAGENITA - GENOTOXICITA

Mutagenita se vztahuje k indukci trvalých přenosných změn v množství nebo struktuře genetického materiálu buněk nebo organismů. Tyto změny („mutace“) mohou postihnout jediný gen nebo segmenty genů, blok genů nebo celé chromozómy. Účinky na celé chromozómy se mohou projevovat změnou jejich struktury a/nebo počtu.

Mutagenní aktivita látky se stanoví testy in vitro na genové (bodové) mutace v baktériích (metoda B.13/14)^5) anebo na strukturální chromozómové aberace v savčích buňkách (metoda B.10)^5).

Přijatelné jsou také postupy in vivo, např. micronucleus test (metoda B.12)^5) nebo analýza metafáze chromozomů kostní dřeně (metoda B.11)^5). Je však třeba dávat jednoznačně přednost in vitro metodám, pokud nejsou kontraindikovány.

Pro látky vyráběné ve velkém množství nebo pro stanovení a kontrolu rizika mohou být vyžadovány ještě další studie ke zjištění mutagenity nebo k předběžnému vyšetření na karcinogenitu. Tyto studie lze využít k několika účelům: potvrzení výsledků získaných základním souborem testů; zkoumání účinků nezachycených základním souborem metod; zahájení nebo rozšíření studií in vivo.

Pro tyto účely zahrnují metody B.15,^1) B.16,^1) B.17,^5) B.18,^1) B.19,^1) B.20,^1) B.21,^1) B.22,^1) B.23,^5) B.24^1) a B.25^1) jak eukaryontní systémy in vivo a in vitro, tak rozšiřují rozsah biologických účinků. Tyto testy poskytují informace o bodových mutacích a jiných účincích v organismech složitějších než baktérie používané v základním souboru testů.

Obecně platí, že další uvažované studie mutagenity je třeba naplánovat tak, aby poskytly relevantní doplňující informace o mutagenním, případně karcinogenním potenciálu testované látky.

Konkrétní studie, vhodná pro daný případ, bude záviset na četných faktorech, včetně chemické a fyzikální charakteristiky látky, výsledků základních bakteriálních a cytogenetických testů, metabolického profilu látky, výsledků dalších testů toxicity a známých způsobů použití látky.

Některé všeobecné zásady pro strategii testování jsou stanoveny směrnicí 93/67/EHS.

Metody pro další výzkum jsou seřazeny níže podle jimi sledovaného hlavního genetického účinku:

Studie detekující genové (bodové) mutace

• a) Studie forward nebo reversních mutací s využitím eukaryotických mikroorganismů (Saccharomyces cerevisiae) (metoda B.15).^1)

• b) In vitro test forward mutací v savčích buňkách (metoda B.17).^5)

• c) Test na pohlaví vázané recesivní letální mutace u Drosophila melanogaster (metoda B.20).^1)

• d) In vivo test mutací na somatických buňkách, spot test na myších (metoda B.24).^1)

Studie detekující chromozómové aberace

• a) Cytogenetický test na savcích in vivo. Provedení in vivo analýzy metafáze chromózomů buněk kostní dřeně by mělo být zváženo, pokud nebylo zahrnuto do základního vyšetření (metoda B.11).^5) Další možnost je cytogenetická analýza zárodečných buněk in vivo (metoda B.23).^5)

• b) Cytogenetický test na savčích buňkách in vitro, pokud nebyl zařazen do základního vyšetření (B.10).^5)

• c) Dominantní letální test na hlodavcích (metoda B.22).^1)

• d) Test na dědičnou translokaci u myší (metoda B.25).^1)

Genotoxické účinky – účinky na DNA

Genotoxicita je obecný pojem pro potenciálně škodlivé účinky na genetický materiál, které nejsou nezbytně spojeny s mutagenitou. Indikátorem genotoxicity může být vyvolané poškození DNA bez přímého důkazu mutace.

Následující metody využívající eukaryotické mikroorganismy nebo savčí buňky jsou vhodné pro takové studie:

• a) Mitotická rekombinace u Saccharomyces cerevisiae (metoda B.16).^1)

• b) Poškození DNA reparace – neplánovaná syntéza DNA v savčích buňkách – in vitro (metoda B.18).^1)

• c) Výměna sesterských chromatid v savčích buňkách – in vitro (metoda B.19).^1)

Alternativní metody vyšetřování karcinogenního potenciálu

K dispozici jsou testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).^1) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.

Posuzování rizika dědičných účinků u savců

K dispozici jsou metody na detekci dědičných účinků v celém savčím organizmu, ať už vyvolaných genovými (bodovými) mutacemi, např. specifický locus test u myší detekující mutace zárodečné buňky v první generaci (nezahrnuto v této příloze), nebo chromozómovými aberacemi, např. test na přenosné translokace u myší (metoda B.25).^1) Těchto metod lze použít při odhadování možného genetického rizika látky pro člověka. Vzhledem ke složitosti těchto testů a velkému počtu potřebných zvířat, zvláště pro specifický locus test, je třeba se rozhodovat pro takovou studii jen na základě závažných důvodů.

Při stanovení genotoxicity se postupuje podle standardního metodického protokolu vypracovaného pro danou metodiku po projednání s Národní referenční laboratoří genetické toxikologie.

• 4 KARCINOGENITA

Chemické látky mohou být charakterizovány jako genotoxické nebo negenotoxické karcinogeny, v závislosti na předpokládaném mechanismu působení.

Předběžné informace o genotoxickém karcinogenním potenciálu látky se čerpají ze studií mutagenity/genotoxicity. Další informace poskytují testy toxicity při opakované aplikaci a testy subchronické nebo chronické toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci, metoda B.7,^4) a dlouhodobější studie s opakovaným podáváním zahrnují posouzení takových histopatologických změn, např. hyperplazie v určitých tkáních, které by mohly být také významné. Tyto studie a toxikokinetické informace mohou pomoci identifikovat chemické látky s karcinogenním potenciálem, které vyžadují další, podrobnější zkoumání tohoto aspektu pomocí testu karcinogenity (metoda B.32)^1) nebo často v kombinované studii chronické toxicity/karcinogenity (metoda B.33).^1)

K dispozici jsou rovněž testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).^1) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.

• 5 REPRODUKČNÍ TOXICITA

Reprodukční toxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle zhoršení reprodukčních funkcí nebo schopností samců a samic (vliv na plodnost) nebo podle nedědičných škodlivých účinků na potomstvo (vývojová toxicita) zahrnující také teratogenitu a účinky v průběhu laktace.

Testovací metoda (metoda B.31)^1) pro studie zaměřené na teratogenitu jako součást vývojové toxicity počítá hlavně s orálním podáváním. Alternativně mohou být použity jiné způsoby aplikace v závislosti na fyzikálních vlastnostech testované látky nebo podle pravděpodobného způsobu expozice člověka. V takových případech je třeba testovací metodu vhodně upravit s ohledem na příslušné body 28-denní testovací metody.

Pokud je vyžadován třígenerační reprodukční test je možno popisovanou metodu pro dvougenerační reprodukční test (metoda B.35)^1) rozšířit tak, aby pokryl třetí generaci.

• 6 NEUROTOXICITA