Legalize
Legalize / Česká republika / Vyhláška

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

Typ Vyhláška
Publikace 2004-07-30
Naposledy aktualizováno 2005-11-15
Stav Platný
Zdroj e-Sbírka
článků 4
Historie novel JSON API

Pokud orální studie s jednou úrovní dávky v množství alespoň 1 000 mg /kg tělesné hmotnosti na den, nebo rovnocenné procento látky v krmivu nebo pitné vodě při aplikaci dávky v krmivu nebo pitné vodě pomocí postupů předepsaných pro tuto studii nevyvolá žádnou zjistitelnou toxicitu ani u rodičovských pokusných zvířat, ani u jejich potomstva a pokud se neočekává ani toxicita na základě existujících údajů o strukturně/metabolicky příbuzných sloučeninách, pak není nutné uvažovat o kompletní studii využívající několika úrovní dávek. Limitní zkouška se použije, pokud expozice u člověka nevyžaduje použít vyšší úroveň orální dávky. U dalších způsobů podávání látky, jako je inhalační nebo kožní aplikace, může být maximální dosažitelná úroveň expozice dána fyzikálně-chemickými vlastnostmi zkoušené látky.

Zkoušená látka se podává pokusným zvířatům 7 dnů v týdnu. Upřednostňuje se orální způsob podávání (v krmivu, pitné vodě nebo žaludeční sondou). Pokud se používá jiný způsob podávání, je třeba podat zdůvodnění a provést odpovídající modifikace. Všem pokusným zvířatům by měla být látka během odpovídajícího experimentálního období podávána stejným způsobem. Objem jednorázově podávané tekutiny by neměl překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti (0,4 ml/100 g tělesné hmotnosti je maximum pro kukuřičný olej), výjimkou jsou vodné roztoky, kde lze použít 2 ml/100 g tělesné hmotnosti.

S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, u kterých vyšší koncentrace obvykle vedou ke zhoršení účinků, by měla být variabilita objemu podávané dávky minimalizována úpravou koncentrací tak, aby bylo zajištěno, že podávaný objem bude stejný pro všechny dávky.

Ve studiích zaměřených na podávání látky žaludeční sondou budou mláďata dostávat zkoušenou látku obvykle nepřímo prostřednictvím mléka, dokud nezačne přímé dávkování po jejich odstavení. Ve studiích zaměřených na podávání látky v krmivu nebo pitné vodě budou mláďata navíc dostávat zkoušenou látku přímo, jakmile začnou během posledního týdne laktačního období sama žrát.

U látky podávané krmivem nebo pitnou vodou je velmi důležité zajistit, aby množství použité zkoušené látky neovlivňovalo normální rovnováhu živin nebo vody, nebránilo vyváženosti běžného krmiva nebo vody. Je-li zkoušená látka podávána v krmivu, je třeba používat buď konstantní koncentrace (ppm) v krmivu, nebo konstantní úrovně dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti pokusného zvířete. Použití jiného způsobu je třeba zdůvodnit. Látka podávaná žaludeční sondou se podává každý den přibližně ve stejnou dobu a alespoň jednou týdně se přizpůsobí tak, aby se udržela konstantní úroveň dávky vzhledem k tělesné hmotnosti pokusného zvířete. Při přizpůsobování dávky podle hmotnosti u podávání látky sondou je třeba vzít v úvahu informace týkající se placentární distribuce.

S každodenním podáváním zkoušené látky se u rodičovské generace (P) samců a samic zahájí od 5. do 9. týdne věku. Denní podávání látky u samců a samic generace F1 je třeba zahájit po jejich odstavení; stále je třeba mít na paměti, že v případě, kdy se zkoušená látka podává prostřednictvím krmiva nebo pitné vody, může docházet k přímé expozici mláďat F1 zkoušené látce již během laktačního období. U obou pohlaví (P i F1) by se mělo s podáváním látky pokračovat alespoň 10 týdnů před obdobím páření. S dávkováním se u obou pohlaví pokračuje i během dvoutýdenního období páření. Nejsou-li samci již nezbytní k hodnocení reprodukčních účinků, měli by být humánním způsobem usmrceni a vyšetřeni. U rodičovské generace (P) samic dávkování pokračuje i během březosti a až do odstavení potomstva generace F1. Pozornost je nutno věnovat modifikacím dávkovacího programu na základě dostupných informací o zkoušené látce, včetně existujících údajů o toxicitě, indukci metabolismu nebo bioakumulaci. Obvykle by dávka pro jednotlivá pokusná zvířata měla vycházet z aktuální zjištěné tělesné hmotnosti. Velkou pozornost je však třeba věnovat úpravě dávek během posledního trimestru březosti.

Podávání látky samcům a samicím generací P a F1 pokračuje až do doby jejich utracení. Všichni dospělí samci a samice generace P a F1 se humánním způsobem utratí, pokud již nejsou nezbytní k hodnocení reprodukčních účinků. Potomstvo generace F1, které není vybráno k páření, a celé potomstvo generace F2 se po odstavení humánním způsobem utratí.

U každého páření se každá samice umístí s jedním samcem se stejnou úrovní dávek (párování 1:1), dokud nedojde ke spáření, nebo po dobu alespoň 2 týdnů. Každý den se samice vyšetří na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Nultým dnem březosti je den, kdy je pozorována vaginální zátka nebo spermie. V případě, že je spáření neúspěšné, se zváží spáření se samci s osvědčenou plodností ze stejné skupiny. Spářené páry se v záznamech jasně označí. Je třeba se vyvarovat páření sourozenců.

U páření pokusných zvířat generace F1 se za účelem produkce generace F2 po odstavení vybere z každého vrhu alespoň jeden samec a samice pro spáření s jinými pokusnými zvířaty ze stejné dávkové skupiny, ale z odlišného vrhu. Výběr pokusných zvířat z každého vrhu se provede náhodně, pokud nejsou mezi pokusnými zvířaty z daného vrhu pozorovány žádné výrazné odlišnosti v tělesné hmotnosti nebo vzhledu. V případě zjištěných odlišností se z každého vrhu vyberou nejkvalitnější jedinci. Logicky by bylo nejlepší tento výběr provádět na základě tělesné hmotnosti, ale vhodnější se může jevit výběr na základě vzhledu. Potomstvo generace F1 by se nemělo připouštět před dosažením plné pohlavní zralosti.

Páry, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit za účelem zjištění příčiny neplodnosti. Tento postup může zahrnovat umožnění další příležitosti k oplodnění s pokusným zvířetem s osvědčenou plodností, mikroskopické vyšetření reprodukčních orgánů anebo vyšetření estrálního cyklu a spermatogeneze.

V určitých případech, jako např. u odchylek velikosti vrhu spojených s aplikací nebo při zjištění nejednoznačného účinku po prvním páření, se doporučuje opětovné připuštění dospělých pokusných zvířat z generace P a F1 za účelem produkce druhého vrhu. Rovněž se doporučuje znovu připustit samice nebo samce, u kterých nedošlo k produkci mláďat s osvědčenými pokusnými zvířaty. Pokud je u jakékoliv generace nezbytná produkce druhého vrhu, měla by být pokusná zvířata opakovaně připuštěna přibližně jeden týden po odstavení posledního vrhu.

Pokusným zvířatům se ponechá možnost normálně vrhnout a pečovat o svoje potomstvo až do jeho odstavení. Standardizace velikosti vrhů je dobrovolná. Pokud se standardizace provádí, je nutné používanou metodu detailně popsat.

Všeobecné klinické pozorování se provádí denně a v případě podávání látky žaludeční sondou časový rozvrh zohlední očekávané doby nejvyšších účinků po podání látky. Zaznamenají se významné změny chování, známky ztíženého nebo prodlužovaného vrhu a všechny příznaky toxicity. Alespoň jednou týdně se u každého pokusného zvířete provede další podrobnější vyšetření, které je nejlepší provádět v době vážení pokusného zvířete. Je-li to možné, provádí se dvakrát denně, během víkendu případně jednou denně, u všech pokusných zvířat pozorování z důvodu morbidity a mortality.

Rodičovská pokusná zvířata (generace P a F1) se zváží v první den podávání látky a poté alespoň jednou týdně. Samice rodičovské generace (P a F1) se zváží 0., 7., 14. a 20. nebo 21. den gestace, během stejných dnů v průběhu laktace při vážení vrhů a poté v den utracení pokusných zvířat. Tato pozorování se zaznamenají individuálně u každého dospělého pokusného zvířete. V období před pářením a během gestačního období se spotřeba krmiva měří minimálně každý týden. Pokud se látka podává ve vodě, měří se spotřeba vody alespoň jednou týdně.

Před pářením a popřípadě i během páření se u samic generace P a F1 hodnotí délka a normálnost estrálního cyklu pomocí vaginálních stěrů, dokud se nezíská důkaz o zabřeznutí. Při získávání vaginálních/cervikálních buněk je třeba neporušit sliznice a následně také nevyvolat stav falešné březosti^7a).

U všech samců generace P a F1 se po utracení zaznamená hmotnost varlat a nadvarlat a jeden z každého orgánu se ponechá pro histopatologické vyšetření (viz část 1.5.7, 1.5.8.1). Zbylá varlata a nadvarlata z podskupiny alespoň deseti samců z každé generace P a F1 se použijí pro výpočet homogenizačně odolných spermatid a kaudálních epididymálních rezerv spermií. Od stejné podskupiny samců se shromáždí spermie z kaudálních částí nadvarlat nebo spermie z chámovodů za účelem vyhodnocení jejich motility a morfologie. Pokud se zjistí účinky spojené s aplikací látky anebo jsou z jiných studií k dispozici důkazy o možném účinku na spermatogenezi, provede se hodnocení spermatu u všech samců z každé skupiny podle dávky; jinak se výpočet omezí pouze na samce z kontrolní skupiny a ze skupiny generace P a F1 s vysokou dávkou.

Vypočítá se celkový počet homogenizačně odolných testikulárních spermatid a spermií z kaudální části nadvarlat^7a). Kaudální rezervy spermií lze odvodit z koncentrace a objemu spermií v suspenzi používané k doplnění kvalitativních hodnocení a počtu spermií získaných pomocí následného rozřezání nebo homogenizování zbylé kaudální tkáně. Pokud nejsou zhotoveny digitální záznamy nebo videozáznamy anebo nejsou-li vzorky zmraženy a analýza provedena později, je nutné výpočet u vybrané podskupiny samců ze všech dávkových skupin provést okamžitě po utracení pokusných zvířat. V těchto případech se nejprve provádí analýza u kontrolní skupiny a u skupiny s vysokou dávkou. Pokud se nezjistí žádné účinky spojené s aplikací (např. vliv na počet, motilitu nebo morfologii spermií), není nutné provádět analýzu u ostatních dávkových skupin. Pokud se zjistí účinky spojené s aplikací u skupiny s vysokou dávkou, je nutné zhodnotit i skupiny s nižšími dávkami.

Motilita epididymálních spermií (nebo spermií z chámovodů) se vyhodnotí nebo zaznamená na video okamžitě po utracení. Spermie se odeberou tak, aby došlo k minimálnímu poškození, a pomocí vhodných metod se zředí pro analýzu motility^7a). Procento progresivně pohyblivých spermií se stanoví subjektivně, nebo objektivně. Pokud se provádí počítačová analýza pohyblivosti^7a), spočívá odvození progresivní motility v mezních uživatelsky nastavených hodnotách průměrné rychlosti dráhy a přímosti nebo lineárního koeficientu. Pokud se pořídí videozáznam vzorků^7a) anebo jsou zobrazení během pitvy zaznamenána jiným způsobem, stačí provést následnou analýzu pouze u kontrolní skupiny a u skupiny s vysokou dávkou u samců z generací P a F1, pokud nedojde ke zjištění účinků spojených s aplikací. V takovém případě je nutné vyhodnotit rovněž skupiny s nižší úrovní dávek. Pokud nejsou k dispozici žádné digitální záznamy ani videozáznam, analyzují se pitvou všechny vzorky od všech experimentálních skupin.

Provede se morfologické hodnocení vzorků epididymálních spermií (nebo spermií z chámovodů). Spermie (minimálně 200 na vzorek) se vyšetří jako stabilní, mokré preparáty^7a) a klasifikují se jako normální nebo abnormální. Příklady morfologických odchylek spermií by měly zahrnovat syntézu, izolované a zdeformované hlavičky nebo ocásky. Hodnocení se provádí u vybraných podskupin samců ze všech skupin podle úrovní dávek bezprostředně po utracení pokusných zvířat, nebo později na základě digitálních záznamů nebo videozáznamů. Jsou-li stěry zakonzervované, lze je rovněž vyhodnotit později. V takovém případě se analyzuje nejprve kontrolní skupina a skupiny s vysokou dávkou. Pokud se nezjistí žádné účinky spojené s aplikací (např. účinek na morfologii spermií), není nutné analyzovat ostatní dávkové skupiny. Pokud se zjistí účinky spojené s aplikací u skupiny s vysokou dávkou, pak je nutné zhodnotit i skupiny s nižšími dávkami.

Pokud již byla kterákoliv výše zmíněná hodnocení parametrů spermií zkoumána v rámci nejméně 90 dnů trvající studie systémové toxicity, pak není nutné je v rámci dvougenerační studie opakovat. Doporučuje se však veškeré vzorky nebo digitální záznamy spermií z generace P uchovat pro pozdější hodnocení.

Všechny vrhy se vyšetří co nejdříve po vrhu (v nultý den laktace), aby bylo možné stanovit počet a pohlaví mláďat, počet mrtvě a živě narozených mláďat a přítomnost nápadných anomálií. Mláďata, která byla nalezena mrtvá v den 0, se vyšetří na možné defekty a příčinu smrti (nejsou-li rozložená) a posléze se uchovají. Živá mláďata se spočítají a individuálně zváží ihned po narození (v nultý den laktace) nebo během 1. dne a poté se váží v pravidelných intervalech, např. v 4., 7., 14., a 21. den laktace. Zaznamenají se fyzické nebo behaviorální abnormality zjištěné u samic nebo jejich potomstva.

Fyzický vývoj u potomstva se zaznamenává hlavně podle přírůstku tělesné hmotnosti. Další fyzické parametry (např. otevření uší a očí, prořezávání zubů, růst srsti) mohou poskytnout doplňkové informace, ale u těchto údajů se dává přednost hodnocení v rámci kontextu údajů o pohlavní zralosti (např. stáří a tělesná hmotnost při vaginálním otevření nebo odpojení předkožky)^7a). Doporučuje se provést funkční vyšetření (např. pohybová aktivita, smyslové funkce, reflexní ontogeneze) potomstva generace F1 před nebo po odstavení, a to zvláště vyšetření týkající se pohlavní zralosti, nejsou-li taková vyšetření součástí samostatných studií. U odstavených potomků generace F1 vybraných k připuštění je třeba stanovit stáří, ve kterém došlo k vaginálnímu otevření a odloučení předkožky. U mláďat generace F2 je třeba změřit anogenitální vzdálenost během postnatálního dne 0, je-li vyvolána změnami v poměru pohlaví u generace F1 nebo načasováním pohlavní zralosti.

Funkční sledování lze vynechat u skupin, které jinak vykazují jasné známky nepříznivých účinků (např. významné snížení přírůstku hmotnosti atd.). Pokud se provádí funkční vyšetření, nemělo by se provádět u mláďat vybraných k páření.

Po utracení nebo uhynutí během studie se všechna pokusná zvířata rodičovské generace (P a F1), všechna mláďata se zevními odchylkami nebo klinickými známkami a rovněž jedno náhodně vybrané mládě z každého pohlaví a vrhu z obou generací F1 a F2 makroskopicky vyšetří na jakékoliv strukturální abnormality anebo patologické změny. Speciální pozornost je třeba věnovat orgánům rozmnožovací soustavy. U mláďat, která jsou humánním způsobem utracena ve stavu agónie, a u mrtvých mláďat, která nejsou rozložena, se provede vyšetření za účelem zjištění možných defektů nebo příčiny uhynutí. Mláďata se uchovají.

Dělohy všech samic prvorodiček se vyšetří na přítomnost a počet zachycených vajíček v děloze.

V okamžiku utracení se u všech rodičovských pokusných zvířat generace P a F1 stanoví tělesná hmotnost a hmotnost těchto orgánů (párové orgány je třeba vážit jednotlivě):

— děloha, vaječníky,

— varlata, nadvarlata (celkem a kaudální),

— prostata,

— semenné váčky s koagulačními žlázami a jejich tekutinami a s prostatou (jako jedna jednotka),

— mozek, játra, ledviny, slezina, hypofýza, štítná žláza a nadledvinky a známé cílové orgány.

U mláďat generace F1 a F2 vybraných k pitvě se stanoví tělesná hmotnost v okamžiku utracení. U jednoho náhodně vybraného mláděte z každého pohlaví a vrhu (viz část 1.5.6) se zváží tyto orgány: mozek, slezina a brzlík.

Je-li to proveditelné, zhodnotí se výsledky celkové pitvy a hmotnosti orgánů v souvislost s výsledky zjištěnými v jiných studiích opakovaného dávkování.

Pro histopatologické vyšetření se připraví a ve vhodném prostředí uchovají tyto orgány a tkáně rodičovských pokusných zvířat (P a F1) nebo jejich reprezentativní vzorky:

— pochva, děloha s děložním hrdlem a vaječníky (uložené ve vhodném konzervačním prostředku),

— jedno varle (uložené v Bouinově roztoku nebo jiném srovnatelném prostředku), jedno nadvarle, semenné váčky, prostata a koagulační žláza,

— již dříve určený cílový orgán nebo orgány od všech pokusných zvířat generace P a F1 vybraných k páření.

U všech pokusných zvířat generace P a F1 ze skupiny s vysokou dávkou a z kontrolní skupiny vybraných k páření se provede kompletní histopatologické vyšetření všech výše vyjmenovaných uchovaných orgánů a tkání. Vyšetření vaječníků u pokusných zvířat generace P není povinné. Provede se rovněž vyšetření orgánů vykazujících změny spojené s aplikací látky u pokusných zvířat ze skupiny s nízkou a střední dávkou, které mohou napomoci stanovit dávku NOAEL. Histopatologické vyšetření se navíc provede u reprodukčních orgánů pokusných zvířat ze skupiny s nízkou a střední dávkou, u kterých je podezření na sníženou plodnost, např. u těch, u kterých nedošlo k páření, zabřeznutí, oplodnění nebo k vrhu zdravého potomstva nebo u kterých byl ovlivněn estrální cyklus nebo počet, motilita nebo morfologie spermií. Vyšetří se všechny makroskopické léze, jako např. atrofie nebo tumory.

Za účelem zjištění účinků spojených s aplikací, jako jsou např. nevyvinuté spermatidy, chybějící vrstva nebo typ zárodečných buněk, mnohojaderné obří buňky nebo rozrušení spermatických buněk v dutině, se provede podrobné histopatologické vyšetření varlat (např. pomocí Bouinova roztoku, zalití do parafínu a příčných řezů o tloušťce 4 – 5 μm)^7a). Vyšetření intaktního nadvarlete by mělo zahrnovat vyšetření hlavy, těla a kaudální části, čehož lze dosáhnout vyhodnocením podélného řezu. U nadvarlete se vyšetří leukocytová infiltrace, změna v prevalenci typů buněk, aberantní typy buněk a fagocytóza spermií. K vyšetření samčí rozmnožovací soustavy lze použít PAS a dobarvení hematoxylinem.

Postlaktační vaječník by měl obsahovat původní a rostoucí folikuly a rovněž zvětšená žlutá tělíska z období laktace. Histopatologické vyšetření by mělo odhalit kvalitativní snížení celkového počtu původních folikulů. U samic generace F1 se provede kvantitativní vyhodnocení původních folikulů. K vyhodnocení použitého postupu je nutné mít statisticky odpovídající počet pokusných zvířat, výběr řezů vaječníků a velikost vzorků řezů. S cílem umožnit srovnání vaječníků u testované a kontrolní skupiny by mělo vyšetření zahrnovat výpočet počtu původních folikulů, které lze zkombinovat s malými rostoucími folikuly^7a).

Pro histopatologické vyšetření se ve vhodném prostředí připraví a uchová makroskopicky abnormální tkáň a cílové orgány od všech mláďat se zevními odchylkami nebo klinickými příznaky a rovněž od jednoho náhodně vybraného mláděte z každého pohlaví a vrhu z obou generací F1 a F2, které nebyly vybrány k páření. Kompletní histopatologická charakterizace uchovaných tkání se provede se speciálním důrazem na orgány rozmnožovací soustavy.

Výsledky se zaznamenávají individuálně a shrnou se do tabulek tak, aby byl u každé experimentální skupiny a každé generace uveden počet pokusných zvířat na začátku zkoušky, počet pokusných zvířat uhynulých během zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba úhynu nebo humánního utracení, počet plodných samic, počet březích samic, počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis pozorovaných příznaků toxicity včetně doby nástupu, trvání a závažnosti veškerých toxických účinků, typy pozorování rodičovských pokusných zvířat a jejich potomstva a všechny důležité údaje o vrhu.

Numerické výsledky se vyhodnotí pomocí vhodné, všeobecně uznávané statistické metody; metody se zvolí jako součást návrhu studie a je třeba je zdůvodnit. Pro analýzu dat je vhodné použít statistické modely dávka-odezva. Protokol by měl obsahovat dostatečné informace o použité metodě analýzy a počítačovém programu, aby mohl tuto analýzu znovu vyhodnotit a rekonstruovat nezávislý recenzent/statistik.

Výsledky této dvougenerační studie reprodukční toxicity se vyhodnotí ve vztahu k pozorovaným účinkům včetně pitvy a mikroskopických nálezů. V hodnocení musí být uvedeno, zda existuje nebo neexistuje souvislost mezi dávkou zkoušené látky a přítomností nebo nepřítomností, výskytem a závažností abnormalit včetně makroskopických lézí stanovených cílových orgánů, vlivu na plodnost, klinických abnormalit, vlivu na reprodukční výkonnost a schopnost vrhu, změny tělesné hmotnosti, vlivu na mortalitu a další toxické účinky. Při hodnocení výsledků zkoušky se přihlédne k fyzikálně-chemickým vlastnostem zkoušené látky a toxikokinetickým údajům, jsou-li k dispozici.

Správně provedená zkouška reprodukční toxicity by měla zajistit dostačující odhad úrovně dávky bez účinku a vysvětlení nepříznivých účinků na reprodukci, vrh, laktaci, postnatální vývoj včetně růstu a pohlavního vývoje.

Dvougenerační studie reprodukční toxicity poskytne informace o účinku opakované expozice látce během všech fází reprodukčního cyklu. Studie zejména poskytne informace o reprodukčních parametrech a o vývoji, růstu, dozrávání a přežívání potomstva. Výsledky studie se interpretují v souvislosti s výsledky ze subchronických, reprodukčních, toxikokinetických a dalších studií. Výsledky této studie lze použít k posouzení potřeby dalšího zkoušení chemické látky. Extrapolace výsledků této studie na člověka platí pouze v omezené míře. Největší význam těchto výsledků spočívá v tom, že poskytují informace o úrovni dávky bez účinků a o přípustné expozici člověka.^7a)

V souladu s příslušnými právními předpisy^9),^10) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

Zkoušená látka:

— fyzikální vlastnosti a popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti,

— údaje o identitě,

— čistota.

Vehikulum (v případě potřeby):

— zdůvodnění výběru jiného vehikula, pokud není použita voda.

Pokusná zvířata:

— použitý druh a kmen,

— počet, stáří a pohlaví pokusných zvířat,

— původ, podmínky chovu, krmivo, materiál na výrobu hnízda atd.,

— hmotnost jednotlivých pokusných zvířat na začátku zkoušky.

Experimentální podmínky:

— zdůvodnění výběru úrovně látky,

— podrobné údaje o složení zkoušené látky/krmiva, o dosažené koncentraci,

— stálost a homogenita prostředku,

— podrobné údaje o podávání zkoušené látky,

— v případě potřeby přepočet koncentrace zkoušené látky (ppm) v krmivu/pitné vodě na skutečnou dávku (mg/kg tělesné hmotnosti na den), je-li to možné,

— podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody.

Výsledky:

— spotřeba krmiva a vody, jsou-li k dispozici, využití krmiva (přírůstek tělesné hmotnosti na gram spotřebovaného krmiva) a spotřeba zkoušené látky u pokusných zvířat generace P a F1 s výjimkou období kohabitace a minimálně poslední třetiny laktace,

— údaje o absorpci (jsou-li k dispozici),

— údaje o tělesné hmotnosti pokusných zvířat z generace P a F1 vybraných k páření,

— údaje o hmotnosti vrhu a mláďat,

— tělesná hmotnost při utracení a údaje o absolutní a relativní hmotnosti u rodičovských pokusných zvířat,

— povaha, závažnost a trvání (doba nástupu a následný průběh) podrobných klinických pozorování (vratných i nevratných změn),

— den úhynu během studie nebo údaj, že pokusná zvířata přežila až do dne utracení,

— údaje o toxické reakci podle pohlaví a dávky, včetně koeficientů páření, plodnosti, gestace, porodnosti, životaschopnosti a laktace; zpráva by měla uvádět údaje využité při výpočtu těchto koeficientů,

— toxické nebo jiné účinky na reprodukci, potomstvo, postnatální růst atd.,

— pitevní nálezy,

— podrobný popis všech histopatologických nálezů,

— počet samic s normálním cyklem z generace P a F1 a délka cyklu,

— celkový počet kaudálních epididymálních spermií, procento progresivně pohyblivých spermií, procento morfologicky normálních spermií a procento spermií se všemi identifikovanými abnormalitami,

— doba do páření včetně počtu dnů před pářením,

— délka gestace,

— počet implantátů, žlutých tělísek, velikost vrhu,

— počet živě narozených mláďat a postimplantačních ztrát,

— počet mláďat s makroskopicky viditelnými abnormalitami a počet zakrslých mláďat, pokud byl zjišťován,

— údaje o fyzických vývojových znacích u mláďat a další údaje o postnatálním vývoji; hodnocené fyzické vývojové znaky je nutno zdůvodnit,

— popřípadě údaje o funkčním pozorování mláďat a dospělých pokusných zvířat,

— statistické vyhodnocení výsledků, je-li to možné.

Diskuse a interpretace výsledků.

Závěry včetně hodnot NOAEL pro účinky na samice a potomstvo.

B.36 TOXIKOKINETIKA

Testovaná látka se podává vhodnou cestou. V závislosti na zaměření studie může být látka podávána jednorázově nebo opakovaně v průběhu stanovené doby jedné nebo několika skupinám experimentálních zvířat. Látka, respektive její metabolity, jsou pak podle účelu studie stanovovány v tělních tekutinách, tkáních anebo v exkretech.

Studie mohou být prováděny s „neznačenou“ či „značenou“ formou testované látky. Jestliže je použito značení, umístí se tak, aby poskytlo co nejvíce informací o osudu testované látky v organismu.

Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu^10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.^10) Před zahájením testování jsou zvířata náhodně rozdělena do skupin. Pro řešení specielních otázek se může použít velmi mladých, březích či premedikovaných zvířat.

Toxikokinetické studie se provádějí na jednom či více vhodných živočišných druzích, užívaných nebo uvažovaných pro užití v jiných toxikologických studiích zabývajících se testovanou látkou. Jestliže jsou pro testování používáni hlodavci, neměla by být variabilita hmotnosti vyšší než ± 20 % průměrné hodnoty.

Při studiu absorpce a vylučování se užije nejprve 4 zvířat pro každou jednotlivou dávku. Pro testování není dávána přednost určitému pohlaví, ale za určitých podmínek může vzniknout potřeba provádět studie na obou pohlavích. Jestliže jsou nalezeny rozdílné odpovědi u různých pohlaví, potom je třeba testovat 4 zvířata každého pohlaví. V případě ostatních druhů zvířat (jiných než hlodavců) je možné použít menší počet zvířat.

Je-li studována tkáňová distribuce, pak je při určení počáteční velikosti skupiny zvířat třeba brát v úvahu jak počet zvířat, která budou utracena v každém časovém bodu, tak počet časových bodů, v nichž bude testování prováděno.

Je-li studován metabolismus, pak je velikost skupiny zvířat úměrná potřebám studie.

Zahrnuje-li studie větší počet dávek a sledovaných časových intervalů, pak je potřeba, aby bylo ve skupině tolik zvířat, aby v každém časovém intervalu při plánovaném utrácení zvířat byla ve skupině minimálně 2 zvířata. Velikost skupiny musí být dostatečná, aby pro látku respektive její metabolity její metabolity poskytla přijatelné charakteristiky ve fázi retence, rovnovážného stavu a deplece.

V případě jednorázového podání se použijí nejméně 2 různé dávky testované látky, a to nízká dávka, po která nemá žádné toxické účinky a vysoká dávka, po které mohou být nalezeny změny v toxikokinetických parametrech nebo která vyvolává toxické účinky.

V případě opakovaného podávání je většinou dostatečné podání nízkých dávek látky. Za určitých podmínek může být nezbytné i podávání vysoké dávky.

Toxikokinetické studie se provádí stejným způsobem aplikace a je-li to vhodné i se stejným vehikulem tak, jak jsou používány v ostatních toxikologických studiích. Testovaná látka je buď podávána orálně sondou nebo v potravě, nebo se aplikuje na kůži, nebo inhalačně vždy po určenou dobu skupině experimentálních zvířat. Intravenosní podání testované látky může být užitečné pro stanovení relativního vstřebávání při jiných způsobech aplikace. Navíc, krátce po intravenosní aplikaci látky mohou být získány důležité informace o distribuci látky v organismu.

Vždy je nutno pamatovat na možnou interferenci vehikula s testovanou látkou. Pozornost je potřeba věnovat i rozdílům ve vstřebávání v případě, je-li testovaná látka podána sondou nebo v potravě, a přesnému stanovení dávky, zvláště je-li testovaná látka podávána v potravě.

Všechna zvířata se sledují denně a zaznamenávají se příznaky toxicity i další významné klinické údaje spolu s údaji o jejich počátku, velikosti a trvání.

Po zvážení pokusných zvířat je testovaná látka podána způsobem přiměřeným účelu. Ve zdůvodněných případech je možno nechat zvířata před podáním testované látky vyhladovět.

Ke sledování rychlosti a rozsahu absorpce podávané látky mohou být použity různé metody s nebo bez referenční skupiny (referenční skupinou se rozumí ta skupina, ve které je testovaná látka podávána takovým způsobem, který zajišťuje úplnou biologickou dostupnost látky), a to např.:

V současné době jsou dostupné 2 přístupy, z nichž pro analýzu distribučního schématu mohou být použity jeden či oba:

Při studiu vylučování se sbírá moč, stolice, vydechovaný vzduch a v určitých případech žluč. Množství testované látky a jejích případných metabolitů se v těchto exkretech stanovuje několikrát po podání látky, a to buď do vyloučení 95 % z podaného množství nebo nejvýše 7 dnů od počátku vylučování.

Ve specielních případech se sleduje vylučování testované látky v mléce v době laktace testovaných zvířat.

K určení rozsahu a schématu metabolismu látky se biologické vzorky analyzují vhodnými technikami. Měla by být objasněna struktura metabolitů a navrženo odpovídající metabolické schéma tam, kde je třeba odpovědět na otázky z předcházejících toxikologických studií. Pro získání informací o metabolismu může být prospěšné provedení in vitro studií.

Další informace o vztahu mezi metabolismem a toxicitou látky lze získat z biochemických studií např. studiem účinků látky na enzymy metabolického systému, sledováním poklesu endogenních neproteinových sloučenin obsahujících - SH skupiny a nebo vazby látky na makromolekuly.

Získané údaje se podle typu prováděné studie sumarizují v tabulkách, pokud možno doplněných grafickým znázorněním.

Pro každou testovanou skupinu se uvedou průměry a charakteristiky variability ve vztahu k času, dávce, tkáni a orgánům (pokud je to důležité). Míra vstřebání i množství a rychlost vylučování se stanoví vhodnými metodami. V případě metabolických studií by měla být identifikována struktura metabolitů a navrženy metabolické cesty studované látky.

V souladu s příslušnými právními předpisy^9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

Podle typu prováděné studie obsahuje zpráva o testu následující údaje:

Diskuse výsledků.

Závěry.

B.37 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU - AKUTNÍ EXPOZICE

Při stanovení a vyhodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určité skupiny látek vyvolat specifický typ neurotoxicity, který nemůže být zjištěn v jiných studiích toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byly pozorovány zpožděné projevy neurotoxicity a mají být testovány touto metodou.

Vyšetřovací testy in vitro mohou být použity pro vyhledávání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii. Negativní nález z in vitro studií však není možno považovat za důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neurotoxicitu.

Do skupiny látek označených v názvu této metody jako „organické sloučeniny fosforu“ patří elektricky neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu, pozorovanou u některých látek této skupiny.

Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se ataxií, distální axonopatií, změnami v míše a periferním nervu s pozdním počátkem těchto příznaků, a dále inhibicí a stárnutím specifické esterázy - NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

Referenční látka může být testována na pozitivní kontrolní skupině k průkazu, že v laboratorních podmínkách se reakce testovaných druhů podstatně nezměnila.

Příkladem široce používané referenční látky s pozdním neurotoxickým účinkem je tri-o-tolylfosfát (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, chemický název:

tris(2-metylfenyl) ester kyseliny fosforečné, syn: tri-o-kresylfosfát (TOCP).

Testovaná látka se podává orálně v jediné dávce slepicím, chráněným před možnými akutními cholinergními účinky. Zvířata se pozorují po dobu 21 dnů, zaznamenává se jejich abnormální chování, ataxie a parézy. Biochemické vyšetření, zvláště inhibice NTE, se provádí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny, obvykle 24 a 48 hodin po podání látky. 21 dnů po podání látky jsou zbývající slepice utraceny a je provedeno histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

Mladé zdravé dospělé slepice bez interferujících virových onemocnění a farmakologické léčby a s normální chůzí se náhodně přiřadí do experimentální a kontrolní skupiny. Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu^10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.^10) Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

Testovaná látka se podává orálně sondou, želatinovými tobolkami nebo jinou srovnatelnou metodou. Tekutiny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu, jako je například kukuřičný olej. Pevné látky je vhodné rozpustit, neboť velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. U nevodných nosičů musí být známy nebo určeny před testem jejich toxikologické vlastnosti.

Doporučují se mladé nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus) ve věku 8 až 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a chovají se za podmínek, které dovolují volný pohyb.

Kromě testovací skupiny se použije jak kontrolní skupina s vehikulem, tak pozitivní kontrolní skupina. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými.

V každé skupině má být dostatečný počet slepic, aby alespoň 6 z nich mohlo být utraceno pro biochemické vyšetření (3 první a 3 druhý den po podání) a aby 6 z nich přežilo pozorování trvající 21 dnů.

Pozitivní kontrolní skupina se může testovat souběžně nebo se může použít kontrolní skupina z nedávné historie. Má mít alespoň 6 slepic, kterým se podává látka vyvolávající pozdní neurotoxicitu, 3 slepice jsou určeny pro biochemii a 3 slepice pro histologii. Doporučuje se periodicky doplňovat historické údaje, když se v provádějící laboratoři změní některý ze základních prvků testu (např. plemeno, potrava, podmínky chovu).

Má být provedena předběžná studie s využitím příslušného počtu slepic a skupin v různých úrovních dávek, aby se dala stanovit úroveň, která bude použita v hlavní studii. Určitá úmrtnost je v této předběžné studii nezbytná pro stanovení přiměřené dávky v hlavní studii. Aby se zabránilo úmrtí pro akutní cholinergní účinky, používá se atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že neinterferuje s pozdními neurotoxickými účinky. K odhadu maximální neletální dávky testovaných látek může být použito různých typů testovacích metod (viz metoda B.1 bis). Historické údaje pro slepice nebo jiné toxikologické informace mohou být také nápomocné při výběru dávky.

Úroveň dávky testované látky v hlavní studii by měla být co nejvyšší s přihlédnutím k výsledkům předběžné studie výběru dávky a hornímu limitu dávky 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti. Případné úhyny by neměly ovlivnit přežití dostatečného počtu zvířat, to je šesti pro biochemii a po 21 dnech šesti pro histologii. Atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že neinterferuje s pozdními neurotoxickými účinky, se má použit jako ochrana před akutními cholinergními účinky.

Jestliže test s dávkou nejméně 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti, za použití postupů popsaných pro tuto studii, nevyvolá žádné pozorované toxické účinky a jestliže podle údajů u látek s příbuznou strukturou není důvod toxicitu očekávat, pak není třeba uvažovat o studii s podáním vyšší dávky. Limitní test se neprovádí, pokud expozice, vyskytující se u lidí, naznačuje potřebu použití ještě vyšší úrovně dávky.

Doba pozorování je 21 dnů.

Po aplikaci prostředku, ochraňujícího před úmrtím na následky akutního cholinergního účinku, je testovaná látka podána v jediné dávce.

Pozorování má začít okamžitě po podání látky. Všechny slepice se pečlivě pozorují několikrát v průběhu prvních 2 dnů a pak aspoň jednou denně po dobu 21 dní nebo dokud nebudou utraceny podle plánu. Veškeré příznaky toxicity se zaznamenávají, včetně nástupu, typu, stupně a trvání abnormálního chování. Ataxie se hodnotí podle nejméně čtyřstupňové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice vykazující patologické změny vyjmou z klecí a vystaví nucené motorické aktivitě jako např. vystupování po žebříku, aby se usnadnilo posouzení minimálních toxických účinků. Umírající zvířata a zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba vyřadit, humánním způsobem utratit a pitvat.

Všechny slepice se zváží těsně před podáním testované látky a pak aspoň jednou týdně.

6 slepic náhodně vybraných z každé testované a kontrolní skupiny s vehikulem a 3 slepice z pozitivní kontrolní skupiny (je-li skupina použita) se usmrtí v prvních dnech po aplikaci látky. Pro analýzu inhibice NTE se vyjmou mozek a lumbální mícha. Je vhodné vypreparovat také nervus ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici NTE. Běžně se usmrcují 3 slepice z kontrolní a každé testované skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách, 3 slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrcují pouze po 24 hodinách. Jestliže pozorování klinických příznaků naznačuje, že toxická látka se v organismu pohybuje velmi pomalu (hodnotí se nástup cholinergních příznaků), pak je výhodnější odebrat vzorky tkáně dvakrát ze 3 zvířat, a to mezi 24 až 72 hodinami po podání látky.

U těchto vzorků tkáně se případně provede také analýza acetylcholinesterázy (AChE). In vivo může však nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

Pitva všech zvířat (plánovaně usmrcených i utracených pro špatný celkový stav) zahrnuje makroskopické posouzení stavu mozku a míchy.

Nervová tkáň z přeživších zvířat (nepoužitých pro biochemické studie) se histologicky vyšetří. Tkáně se fixují in situ za použití perfuzních technik. Odebírá se: mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha - řezy míchy se provádějí v horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální, z periferních nervů se odebírá distální část z n. tibialis (a jeho větve k m.gastrocnemius) a z n. ischiadicus. Řezy se barví specifickými barvivy na myelin a axony.

Negativní výsledky o účincích sledovaných touto metodou (biochemie, histopatologie a změny chování) běžně nevyžadují další testování na pozdní neurotoxicitu. Neprůkazné nebo neurčité výsledky mohou vyžadovat další sledování.

Uvádějí se údaje pro jednotlivá zvířata. Údaje se dále sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat jevících poškození, změny chování nebo biochemické účinky, typy a stupeň těchto poškození nebo účinků a procento zvířat vykazujících každý typ a stupeň poškození nebo účinku.

Výsledky studie se vyhodnotí z hlediska výskytu, závažnosti a korelace mezi změnami chování, biochemickými a histopatologickými nálezy a dalšími pozorovanými jevy u testovaných a kontrolních skupin.

Číselné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody se zvolí již v době plánování studie.

V souladu s příslušnými právními předpisy^9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

Testovaná zvířata:

Podmínky testování:

Výsledky:

Diskuse.

Závěry.

B.38 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU 28-DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE

Při stanovení a vyhodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určité skupiny látek vyvolat specifický typ neurotoxicity, který nemůže být zjištěn v jiných studiích toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byly pozorovány zpožděné projevy neurotoxicity a mají být testovány touto metodou.

Vyšetřovací testy in vitro mohou být použity pro vyhledávání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii. Negativní nález z in vitro studií však není možno považovat za důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neurotoxicitu.

Tento 28-denní test pozdní neurotoxicity poskytuje informace o možném zdravotním riziku vznikajícím z expozic opakovaných během určitého krátkého časového období. Poskytne informace o závislosti odpovědi na dávce a může poskytnout odhad rozpětí dávkových úrovní, ve kterém nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky. Tato úroveň se používá pro stanovení kritérií bezpečné expozice.

Do skupiny látek označených v názvu této metody jako „organické sloučeniny fosforu“ patří elektricky neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu, pozorovanou u některých látek této skupiny.

Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se ataxií, distální axonopatií, změnami v míše a periferním nervu s pozdním počátkem těchto příznaků a dále inhibicí a stárnutím specifické esterázy - NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

Testovaná látka se podává denně orálně slepicím po dobu 28 dnů. Zvířata jsou sledována nejméně jednou denně, zaznamenává se abnormální chování, ataxie a paréza ještě 14 dnů po poslední dávce. Biochemické vyšetření, zvláště inhibice NTE, se provádí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny 24 a 48 hodin po posledním podání látky. 2 týdny po poslední dávce jsou zbývající slepice utraceny a je provedeno histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu^10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.^10)

Mladé zdravé dospělé slepice bez interferujících virových onemocnění a farmakologické léčby a s normální chůzí se náhodně přiřadí do experimentální a kontrolní skupiny. Nejméně 5 dní před zahájením studie jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu.

Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

Testovaná látka se podává orálně, denně 7 dní v týdnu, buď sondou, želatinovými tobolkami nebo jinou srovnatelnou metodou. Tekutiny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu jako je například kukuřičný olej. Pevné látky je vhodné rozpustit, neboť velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. U nevodných nosičů musí být známy nebo určeny před testem jejich toxikologické vlastnosti.

Doporučují se mladé nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus) ve věku 8 až 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a chovají se za podmínek, které dovolují volný pohyb.

Je třeba použít nejméně 3 úrovně dávek a 1 kontrolní skupinu s vehikulem. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými.

V každé skupině má být dostatečný počet slepic, aby alespoň 6 z nich mohlo být utraceno pro biochemické vyšetření (3 v každém ze 2 časových bodů) a aby 6 z nich přežilo čtrnáctidenní pozorování po ukončení expozice.

Dávkové úrovně se zvolí s přihlédnutím ke 3 výsledkům z akutního testu na pozdní neurotoxicitu a k dalším údajům o toxicitě nebo kinetice testované látky. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, nejlépe příznaky pozdní neurotoxicity, nezpůsobit žádné uhynutí ani zřejmé utrpení. Dále se zvolí řada klesajících dávek způsobem, který umožní sledovat závislost účinku na dávce. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity.

Jestliže test s dávkou nejméně 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti a den, za použití postupů popsaných pro tuto studii, nevyvolá žádné pozorované toxické účinky a jestliže podle údajů u látek s příbuznou strukturou není důvod toxicitu očekávat, pak není třeba uvažovat o studii s podáním vyšší dávky. Limitní test se neprovádí, pokud expozice vyskytující se u lidí naznačuje potřebu použití ještě vyšší úrovně dávky.

Všechna zvířata se pozorují nejméně jednou denně po dobu expozice a 14 dnů po ní, nebo do utracení a do pitvy podle plánu.

Testovaná látka se podává 7 dnů v týdnu po 28 dnů.

Pozorování má začít okamžitě po podání látky. Všechny slepice se pečlivě pozorují nejméně jednou denně po 28 dnů a dalších 14 dnů po ukončení aplikace, do utracení podle plánu. Veškeré příznaky toxicity se zaznamenávají, včetně nástupu, typu, stupně a trvání. Pozorování má zahrnovat abnormality chování, ale nemá se na ně omezovat. Ataxie se hodnotí podle nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice, zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice vyjmou z klecí a vystaví nucené motorické aktivitě, jako např. vystupování po žebříku, aby se usnadnilo posouzení minimálních toxických účinků. Umírající zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba vyloučit, humánním způsobem utratit a pitvat.

Všechny slepice se zváží těsně před prvním podáním testované látky a pak alespoň jednou týdně.

Šest slepic náhodně vybraných z každé testované a kontrolní skupiny s vehikulem se usmrtí v prvních dnech po aplikaci poslední dávky. Pro analýzu inhibice NTE se vyjmou mozek a lumbální mícha. Je vhodné vypreparovat také nervus ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici NTE. Obvykle se usmrcují tři slepice z kontrolní a každé testované skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách po posledním podání dávky. Jestliže údaje z akutní studie nebo jiných studií (např. toxikokinetických) naznačují, že je výhodnější jiná doba usmrcení po poslední aplikaci, pak se doporučuje použít tuto dobu a zdůvodnění uvést v dokumentaci.

U těchto vzorků tkáně se případně provede také analýza acetylcholinesterázy (AChE). In vivo může však nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

Pitva všech zvířat (plánovaně usmrcených i utracených pro špatný celková stav) zahrnuje makroskopické posouzení stavu mozku a míchy.

Nervová tkáň z přeživších zvířat (nepoužitých pro biochemické studie) se histologicky vyšetří. Tkáně se fixují in situ za použití perfuzních technik. Odebírá se: mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha (řezy míchy se provádí v horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální), z periferních nervů se odebírá distální část z nervus tibialis (a jeho větve k nervus gastrocnemius) a z nervus ischiadicus. Řezy se barví specifickými barvivy na myelin a axony.

Nejprve se vyšetří fixované tkáně všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny s nejvyšší dávkou. Pokud se najdou u zvířat skupiny s nejvyšší dávkou známky účinku, provede se histologické vyšetření i na slepicích ze skupin, které dostaly dávku střední a nízkou.

Pokud jsou výsledky získané touto metodou (biochemie, histopatologie a změny chování) negativní, běžně se neprovádí další testování na pozdní neurotoxicitu. Neprůkazné nebo neurčité výsledky mohou vyžadovat další sledování.

Uvádějí se údaje pro jednotlivá zvířata. Údaje se dále sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat jevících poškození, změny chování nebo biochemické účinky, typy a stupeň těchto poškození nebo účinků a procento zvířat vykazujících každý typ a stupeň poškození nebo účinku.

Výsledky studie se vyhodnotí z hlediska výskytu, závažnosti a korelaci mezi změnami chování, biochemickými a histopatologickými nálezy a dalšími pozorovanými jevy u testovaných a kontrolních skupin.

Číselné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody se zvolí již v době plánování studie.

V souladu s příslušnými právními předpisy^9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:

Testovaná zvířata:

Podmínky testování:

Výsledky:

Diskuse výsledků.

Závěry.

B.39 TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO

Účelem testu neplánované syntézy DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS) v savčích jaterních buňkách in vivo je určit látky, vyvolávající reparaci DNA v jaterních buňkách pokusných zvířat.^5)

Tento test in vivo představuje metodu pro zjišťování genotoxických účinků chemických látek v játrech. Výsledek testu indikuje poškození DNA v jaterních buňkách a její následnou reparaci. Játra jsou obvykle hlavním místem metabolismu absorbovaných sloučenin; jsou proto vhodným objektem pro detekci poškození DNA in vivo.

Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka do cílové tkáně nedostane, není tento test vhodný.

Výsledek neplánované syntézy DNA (UDS) se hodnotí tak, že se stanoví absorpce značených nukleosidů v buňkách, které neprocházejí plánovanou (S-fáze) syntézou DNA. Nejběžnější je metoda, při které se autoradiograficky stanoví thymidin značený tritiem (^3H-TdR). Pro testy UDS in vivo se nejčastěji používají potkaní játra. Jiné tkáně než játra se sice také mohou použít, nejsou však předmětem této metody.

Detekce odpovědi závisí na počtu bází DNA, jež jsou v místě poškození odstraněny a nahrazeny. Proto je metoda UDS zvláště vhodná k detekci látek indukujících „longpatch repair“ (20 – 30 bází), zatímco pro látky indukující „shortpatch repair“ (1 – 3 báze) je méně citlivá. Dále může docházet k mutacím v důsledku neopravení, chybného opravení nebo chybné replikace lézí DNA. Rozsah odpovědi UDS neříká nic o přesnosti procesu reparace. Mimoto je možné, že mutagen bude sice s DNA reagovat, ale poškození DNA není opraveno excizním reparačním procesem. To, že UDS test neposkytuje o mutagenní aktivitě specifické informace, je vyváženo jeho potenciální citlivostí, protože poskytuje výsledek v celém genomu.

Buňky v reparaci: net nuclear grain (NNG) vyšší než určitá, předem stanovená hodnota, kterou zdůvodní laboratoř provádějící test.

Net nuclear grains (NNG): kvantitativní míra UDS aktivity buněk při autoradiografických testech UDS, vypočtená jako rozdíl mezi počtem zrn v jádře (NG) a průměrným počtem zrn v cytoplasmě (CG): NNG = NG – CG. Počty NNG se vypočítávají pro jednotlivé buňky a následně přepočítány na buňky v kultuře, v paralelních kulturách apod.

Neplánovaná syntéza DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS): opravná syntéza DNA po excizi a odstranění úseku DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním činidlem.

Test UDS v savčích jaterních buňkách in vivo indikuje reparační syntézu DNA po excizi a odstranění segmentu DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním působením. Test vychází obvykle z inkorporace ^3H-TdR do DNA jaterních buněk, charakteristických nízkým počtem buněk v S-fázi buněčného cyklu. Inkorporace ^3H-TdR se obvykle stanoví autoradiograficky, protože tato technika není tak náchylná k interferenci s buňkami v S-fázi, jako je např. scintilační metoda.

Běžně se používají potkani, lze ovšem použít jakýkoliv vhodný savčí druh. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.

Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny v kapitole Všeobecný úvod.

Vlhkost by měla být 50 – 60 %.

Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu^10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.^10) Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.

Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

Rozpouštědlo / vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se ne příliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo / vehikulum.

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

Pozitivní kontroly by měly indukovat UDS při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Pozitivní kontroly vyžadující metabolickou aktivaci se používají v dávkách vedoucích ke středně vysoké odezvě. Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

Doba odběru vzorku Látka CAS EINECS
odběr v intervalu (2 - 4 hodiny) N-nitrosodimethylamin 62-75-9 200-249-8
odběr v intervalu (12 - 16 hodin) N-2-fluorenylacetamid (2-AAF) 53-96-3 200-188-6

Je možno použít i jiné vhodné látky. Je možná aplikace pozitivní kontroly jinou cestou, než je podávána testovaná látka.

V každé skupině musí být minimálně 3 analyzovatelní jedinci. Pokud existuje historická databáze, pak pro souběžné skupiny negativní a pozitivní kontroly postačují 1 nebo 2 jedinci.

Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje ze studií s týmž živočišným druhem využívajících týž expozičních cest, prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je možné provést testování pouze na jednom pohlaví, nejlépe na samcích. Tam, kde humánní expozice testovaným látkám může být pohlavně specifická, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.

Testovaná látka se obvykle podává jednorázově.

Obvykle se používají 2 různé dávky. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšší dávce ve stejném režimu by se očekával letální účinek. Nižší dávka představuje obecně 50–25 % dávky vyšší.

Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože potřebné údaje nejsou k dispozici, je třeba ji realizovat v téže laboratoři a za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se pak použijí v hlavní studii.

Jako nejvyšší dávku lze také definovat dávku vyvolávající určité známky toxicity v játrech (např. pyknotická jádra).

Jestliže test při dávce minimálně 2 000 mg/kg hmotnosti podané v 1 nebo 2 dávkách týž den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o strukturně příbuzných látkách neočekává genotoxicita, nemusí se provést úplná studie. Podle očekávané humánní expozice může být použita v limitním testu vyšší dávka.

Testovaná látka se obvykle vpravuje žaludeční sondou. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné expoziční cesty. Intraperitoneální aplikace se však nedoporučuje, protože by se tím mohla játra vystavit působení testované látky přímo, nikoli krevním oběhem. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti organismu; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

Jaterní buňky se z pokusných zvířat zpracovávají obvykle 12 – 16 hodin po podání testované látky. Obvykle je zapotřebí ještě další odběr (obvykle 2 – 4 hodiny po podání látky), ledaže je po 12 – 16 hodinách pozitivní reakce zjevná. Je ovšem možno použít i jiné časy odběru vzorků, je-li to odůvodněné na základě toxikokinetických údajů.

Krátkodobé kultury savčích jaterních buněk se obvykle zakládají perfuzí jater in situ kolagenázou. Je třeba zajistit, aby se čerstvě disociované jaterní buňky mohly přichytit ke vhodnému povrchu. Jaterní buňky ze zvířat z negativní kontroly mají mít minimálně 50 % životaschopnost.

Čerstvě izolované savčí jaterní buňky se po vhodnou dobu (např. 3 – 8 hodin) obvykle inkubují v médiu obsahujícím ^3H-TdR. Po inkubaci se médium odstraní; buňky se potom mohou inkubovat v médiu obsahujícím nadbytek neznačeného thymidinu, aby se snížila neinkorporovaná radioaktivita (tzv. „cold chase“). Buňky se pak promyjí, fixují a vysuší. Při delších inkubačních intervalech nemusí se „cold chase“ provádět. Sklíčka s preparáty se ponoří do autoradiografické emulze a exponují se exponují ve tmě (např. po dobu jednoho nebo dvou týdnů v chladničce), vyvolají, obarví a počítají se exponovaná stříbrná zrna. Z každého jedince se připraví 2 nebo 3 preparáty.

Mikroskopické preparáty musí obsahovat dostatečný počet buněk s normální morfologií, aby bylo možno UDS vyhodnotit. Mikroskopicky se hodnotí zjevné známky cytotoxicity (např. pyknóza, snížená úroveň radioaktivního značení).

Preparáty se před počítáním zrn zakódují. Vždy na minimálně 2 preparátech z každého jedince se obvykle hodnotí 100 buněk; pokud je buněk méně než 100 na jedince, musí to být zdůvodněné. Při počítání zrn se nevyhodnocují jádra v S-fázi, ale podíl buněk v S-fázi se registruje.

Vhodnou metodou se stanoví stupeň inkorporace ^3H-TdR do jader a cytoplazmy v morfologicky normálních buňkách, zjištěných podle depozice stříbrných zrnek.

Počet buněk se stanoví z počtu zrn odpovídajících buněčným jádrům (NG) a z průměrného počtu zrn v cytoplasmatických oblastech (CG) odpovídajících jádrům. Jako hodnota CG se použije buď počet buněk pro nejsilněji označenou oblast cytoplasmy, nebo průměrná hodnota dvou až tří náhodně vybraných oblastí v blízkosti dotyčných buněčných jader. Po odpovídajícím zdůvodnění mohou být použity i jiné postupy stanovení počtu buněk (např. počítání celých buněk).

Výsledky zahrnují údaje z jednotlivých preparátů a zvířat. Mimoto se všechna data shrnou v tabelární formě. Pro každou buňku, každého jedince a každou dávku a čas se stanoví čistý počet „nuclear grain“ (NNG) odečtením počtu CG od počtu NG. Počítají-li se „buňky v opravě“, musí být kritéria, kterými se tyto buňky určují, zdůvodněna a podložena daty z historických nebo souběžných negativních kontrol. Numerické výsledky se mohou vyhodnotit statistickými metodami; pokud se statistické testy použijí, je třeba je vybrat a zdůvodnit ještě před započetím studie.

Kritéria pro pozitivní / negativní reakci zahrnují:

Pozitivní (I) hodnoty NNG nad předem stanoveným prahem, zdůvodněným na základě historických dat dané laboratoře, nebo
(II) hodnoty NNG významně vyšší než u souběžné kontroly.
Negativní (I) hodnoty NNG na úrovni/pod úrovní historického prahu u kontrol, nebo
--- ---
(II) hodnoty NNG nejsou signifikantně vyšší než souběžná kontrola.

Je třeba uvážit biologickou významnost získaných dat, což znamená, že je třeba vzít v úvahu parametry, jako jsou variabilita mezi jednotlivými jedinci, vztah dávka-odpověď a cytotoxicita. Při vyhodnocování výsledků lze použít statistické metody; statistická významnost by však neměla být pro pozitivní reakci rozhodujícím faktorem.

Většina experimentů poskytuje jednoznačné pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

Pozitivní výsledek testu UDS se savčími jaterními buňkami in vivo ukazuje, že testovaná látka vyvolává v savčích jaterních buňkách in vivo poškození DNA, které lze opravit neplánovanou syntézou DNA in vitro. Negativní výsledek ukazuje, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka nevyvolává takové poškození DNA, jež je tímto testem zjistitelná.

Je třeba vzít v úvahu, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka dosáhne širokého použití nebo je specifická pro určitou cílovou tkáň (např. systémová toxicita).

V souladu se s příslušnými právními předpisy^9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:

Rozpouštědlo / vehikulum:

Pokusná zvířata:

Podmínky pokusu:

Výsledky:

Diskuse výsledků.

Závěry.

B.40 LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI

Evropské centrum pro validaci alternativních metod (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM, Joint Research Centre, European Commission) schválilo jakožto vědecky validní dva testy in vitro na leptavé účinky na kůži: test na principu měření transkutánního elektrického odporu kůže potkana (transcutaneous electrical resistance, TER) a test využívající modelu lidské kůže.^6) Validační studie ECVAM prokázala, že oba testy dokáží spolehlivě rozlišovat mezi známými látkami leptajícími a neleptajícími kůži. Mimoto test vycházející z modelu lidské kůže umožňuje správně rozlišovat jednotlivé stupně leptavých účinků (známé látky způsobující těžké poleptání kůže R35, a ostatní látky způsobující poleptání kůže, R34).^6) Je uveden popis a postupy obou testů; výběr mezi oběma testy závisí na konkrétních požadavcích a na preferencích uživatele.

Poleptání kůže: způsobení nevratného poškození tkáně kůže po aplikaci testované látky.

Žádná referenční látka není specifikována, viz však odst. 1.5.3.4 a 1.7.2.3.

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)