LegalizeVyhláška, kterou se mění vyhláška č. 443/2004 Sb., kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků
Čl. I
Vyhláška č. 443/2004 Sb., kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků, se mění takto:
-
- V § 1 odst. 1 se slova „stanoví v souladu s právem Evropských společenství^1)^,^2)^,^3)^,^4)^,^5)^,^6)^,^7)“ nahrazují slovy „zapracovává příslušné předpisy Evropských společenství^1)^,^2)^,^3)^,^4)^,^5)^,^6)^,^7)^,^7a) a stanoví“.
Poznámka pod čarou č. 7a) zní:
„^7a) Směrnice Komise 2004/73/ES, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 152 2004).“.
-
- Seznam základních metod pro zkoušení toxicity chemických látek nebo chemických přípravků se zrušuje.
-
- Vkládá se nová příloha č. 1, která zní:
„Příloha č. 1 k vyhlášce č. 443/2004 Sb.
Seznam základních metod pro zkoušení toxicity chemických látek nebo přípravků
| B.1 bis | Akutní toxicita orální - metoda fixní dávky |
|---|---|
| B.1 tris | Akutní toxicita orální - metoda stanovení třídy akutní toxicity |
| B.2 | Akutní toxicita inhalační |
| B.3 | Akutní toxicita dermální |
| B.4 | Akutní toxicita: dráždivé a leptavé účinky na kůži |
| B.5 | Akutní toxicita: dráždivé a leptavé účinky na oči |
| B.6 | Senzibilizace kůže |
| B.7 | Subakutní toxicita orální (per os) (28 denní opakovaná aplikace) |
| B.8 | Subakutní toxicita inhalační (28 denní opakovaná aplikace) |
| B.9 | Subakutní toxicita dermální (28 denní opakovaná aplikace) |
| B.10 | Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro |
| B.11 | Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo |
| B.12 | Mutagenita - in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech |
| B.13/14 | Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií |
| B.15 | Genové mutace - Saccharomyces cerevisiae |
| B.16 | Mitotické rekombinace - Saccharomyces cerevisiae |
| B.17 | Mutagenita - test genových mutací v savčích buňkách in vitro |
| B.18 | Poškození DNA reparace - neplánovaná syntéza DNA - savčí buňka in vitro |
| B.19 | SCE - výměna sesterských chromatid in vitro |
| B.20 | Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophila melanogaster |
| B.21 | Test transformace savčích buněk in vitro |
| B.22 | Dominantní letální test u hlodavců |
| B.23 | Analýza chromozómových aberací u savčích spermatogonií |
| B.24 | Spot test u myší |
| B.25 | Přenosné translokace u myší |
| B.26 | Test subchronické orální toxicity (90 denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům) |
| B.27 | Test subchronické orální toxicity (90 denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací nehlodavcům) |
| B.28 | Subchronická toxicita dermální (90 denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích) |
| B.29 | Subchronická toxicita inhalační (90 denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích) |
| B.30 | Testování chronické toxicity |
| B.31 | Studie prenatální vývojové toxicity |
| B.32 | Test karcinogenity |
| B.33 | Kombinovaný test chronické toxicity/karcinogenity |
| B.34 | Reprodukční toxicita - jednogenerační test |
| B.35 | Dvougenerační studie reprodukční toxicity |
| B.36 | Toxikokinetika |
| B.37 | Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu |
| B.38 | Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu - 28 denní opakovaná expozice |
| B.39 | Test neplánované syntézy DNA v savčích jaterních buňkách in vivo |
| B.40 | Leptavé účinky na kůži |
| B.41 | Fototoxicita - test fototoxicity 3T3 NRU - in vitro |
| B.42 | Senzibilizace kůže: zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin |
| B.43 | Zkouška neurotoxicity na hlodavcích“. |
Dosavadní příloha č. 1 se označuje jako příloha č. 2.
-
- V příloze č. 2 části Všeobecný úvod se za bod 1.20 vkládají body 1.21 až 1.26, které znějí:
| „1.21 | GHS |
|---|---|
| Globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodářkou spolupráci a rozvoj (lidské zdraví a životní prostředí), Odborného výboru OSN pro přepravu nebezpečného zboží (fyzikálně-chemické vlastnosti) a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpečnosti) koordinovaný Meziorganizačním programem pro řádné nakládání s chemikáliemi (IOMC). | |
| 1.22 | Blížící se uhynutí |
| když je očekáván stav agónie nebo uhynutí před další plánovanou dobou pozorování. Příznaky svědčící o tomto stavu u hlodavců mohou zahrnovat křeče, polohu na boku, polohu vleže a třes7a). | |
| 1.23 | Limitní dávka |
| označuje nejvyšší přípustnou dávku (2 000 nebo 5 000 mg/kg). | |
| 1.24 | Stav agónie |
| označuje stav před úhynem nebo neschopnost přežít, ani když je pokusné zvíře léčeno7a). | |
| 1.25 | Předvídatelný úhyn |
| přítomnost klinických příznaků svědčících o blížící se smrti, přičemž čas, kdy k úhynu dojde lze předvídat a bude kratší než je doba předpokládaného ukončení pokusu7a). | |
| 1.26 | Opožděný úhyn |
| znamená, že pokusné zvíře během 48 h neuhyne ani nejeví známky umírání, ale uhyne později během čtrnáctidenní doby pozorování.“. |
-
- V příloze č. 2 metoda B.1 bis AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ (PER OS) METODA FIXNÍ DÁVKY zní:
„B.1 bis AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ - METODA FIXNÍ DÁVKY
| 1 | METODA je v souladu s právem Evropských společenství7a) |
|---|---|
| 1.1 | ÚVOD |
| Podstatou metody je použití pouze středně toxických dávek v hlavní studii a dávky, u nichž se očekává, že budou letální, by neměly být podávány. Také není nutné podávat dávky, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazně dráždivých účinků vyvolávají značnou bolest a utrpení. Umírající pokusná zvířata nebo pokusná zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, se humánně utratí a při interpretaci výsledků jsou hodnocena jako pokusná zvířata uhynulá při zkoušce7a). | |
| Metoda poskytuje informace o nebezpečných vlastnostech a umožňuje zařazení a klasifikaci látky podle globálně harmonizovaného systému (GHS) klasifikace chemických látek, které způsobují akutní toxicitu7a). | |
| Zkušební laboratoř by před provedením studie měla vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Součástí těchto informací je totožnost a chemická struktura látky, její fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledky jiných zkoušek toxicity dané látky in vitro nebo in vivo, toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru vhodné výchozí dávky. | |
| 1.2 | DEFINICE |
| Akutní orální toxicita: vztahuje se na nepříznivé účinky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 h. | |
| 1.3 | PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY |
| Skupině pokusných zvířat stejného pohlaví se postupně podá fixní dávka 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg (výjimečně lze uvažovat o další fixní dávce 5 000 mg/kg, viz část 1.6.2). Výchozí úroveň dávky se zvolí na základě orientační studie jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá některé příznaky toxicity, aniž způsobí závažné toxické účinky nebo úhyn7a). Dalším skupinám pokusných zvířat může být podána vyšší nebo nižší dávka podle přítomnosti nebo nepřítomnosti příznaků toxicity nebo uhynutí. Podle tohoto postupu se pokračuje, dokud dávka nevyvolá zřejmou toxicitu nebo není pozorováno více než jedno uhynutí, anebo pokud nejsou při nejvyšší dávce zjištěny žádné účinky nebo pokud dochází k úhynům při nejnižší dávce. | |
| 1.4 | POPIS ZKUŠEBNÍ METODY |
| 1.4.1 | Výběr druhu pokusných zvířat |
| Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít i jiné druhy hlodavců. Obvykle se používají samice7a). Je to proto, že přehled literatury o konvenčních zkouškách LD50 ukazuje, že mezi pohlavími je obvykle malý rozdíl, pokud jde o citlivost, ale v případech, v nichž jsou rozdíly pozorovány, jsou samice obecně nepatrně citlivější7a). Pokud však poznatky o toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturně příbuzných chemických látek naznačují, že citlivější jsou pravděpodobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat náležité odůvodnění. | |
| Použijí se mladá zdravá dospělá pokusná zvířata běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Každé pokusné zvíře musí být na začátku podávání látky 8 až 12 týdnů staré a jeho hmotnost by se měla pohybovat v intervalu ± 20 % střední hmotnosti pokusných zvířat, kterým byla podána předchozí dávka. | |
| 1.4.2 | Podmínky chovu a krmení |
| Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být (22 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky v souladu s příslušným právním předpisem10), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete. | |
| 1.4.3 | Příprava pokusných zvířat |
| Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu10). | |
| 1.4.4 | Příprava dávek |
| Zkoušená látka by obecně měla být při všech úrovních zkoušených dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného přípravku. V případech, kdy má být zkoušen kapalný konečný produkt nebo směs, může však mít použití nezředěné zkoušené látky, tj. s konstantní koncentrací, větší závažnost pro hodnocení následného rizika této látky. Ani v jednom případě nesmí být překročen maximální objem dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml/100 g tělesné hmotnosti: avšak u vodných roztoků připadá v úvahu dávka 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. S ohledem na složení dávkovaného přípravku se ve všech případech, kde je to možné, doporučuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v pořadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec případně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných než voda musí být známy jejich toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce před podáním, pokud není stálost přípravku během doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako přijatelná. | |
| 1.5 | POSTUP |
| 1.5.1 | Podávání dávek |
| Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žaludeční sondy nebo vhodné intubační rourky. Pokud výjimečně není možné podat dávku najednou, lze dávku podat po menších množstvích během nejvýše 24 h. | |
| Před podáním zkoušené látky nemají pokusná zvířata dostávat krmivo (např. potkanům by se nemělo podávat přes noc, myším 3 - 4 h), voda se však ponechává. Po uplynutí doby hladovění se pokusná zvířata zváží a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí přístupu ke krmivu na další 3 - 4 h u potkanů nebo 1 - 2 h u myší. Podává-li se látka po částech v průběhu určité doby, může být podle délky období nezbytné poskytnout pokusným zvířatům krmivo a vodu. | |
| 1.5.2 | Orientační studie |
| Cílem orientační studie je umožnit výběr vhodné výchozí dávky pro hlavní studii. Zkoušená látka se podává jednotlivým zvířatům postupně podle vývojového diagramu v tabulce 1. Orientační studie je ukončena, jakmile lze stanovit výchozí dávku pro hlavní studii (nebo pokud je při nejnižší fixní dávce pozorován úhyn). | |
| Výchozí dávka orientační studie se zvolí z fixních úrovní dávek 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá zřejmou toxicitu, přičemž toto očekávání je pokud možno založeno na důkazech z údajů získaných in vivo a in vitro ze stejné chemické látky a ze strukturně příbuzných látek. Pokud takové informace neexistují, výchozí dávka činí 300 mg/kg. | |
| Před podáním dávky každému dalšímu pokusnému zvířeti se ponechá doba minimálně 24 h. Všechna pokusná zvířata se pozorují minimálně 14 dnů. | |
| Ve výjimečných případech a pouze je-li to odůvodněno specifickými regulačními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně dávky 5 000 mg/kg (viz tabulka 3). S ohledem na dobré zacházení s pokusnými zvířaty se pokusy na pokusných zvířatech v rámci kategorie 5 GHS (2 000 - 5 000 mg/kg) nedoporučují a měly by se zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takového pokusu mají přímý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví pokusných zvířat nebo životního prostředí. | |
| V případech, kdy pokusné zvíře, u něhož je látka zkoušena v nejnižší fixní úrovni dávky (5 mg/kg), v orientační studii uhyne, obvykle se studie ukončí a látka přiřadí do kategorie 1 GHS (jak je uvedeno v tabulce 1). Pokud je však vyžadováno další potvrzení klasifikace, může být proveden tento volitelný doplňkový postup: druhému pokusnému zvířeti se podá dávka 5 mg/kg. Pokud toto druhé pokusné zvíře uhyne, bude kategorie 1 GHS potvrzena a studie okamžitě ukončena. Pokud druhé pokusné zvíře přežije, dávka 5 mg/kg se podá maximálně třem dalším pokusným zvířatům. Jelikož riziko úhynu bude vysoké, měla by být látka pokusným zvířatům podávána postupně, aby bylo zajištěno dobré zacházení s pokusnými zvířaty. Časový interval mezi dávkami podanými jednotlivým pokusným zvířatům by měl být dostatečný na to, aby bylo možné stanovit, zda pokusné zvíře, jemuž byla látka podána dříve, pravděpodobně přežije. Pokud dojde k úhynu druhého pokusného zvířete, posloupnost podávání se okamžitě ukončí a látka nebude podána žádnému dalšímu pokusnému zvířeti. Vzhledem k tomu, že výskyt druhého úhynu (bez ohledu na počet pokusných zvířat, na nichž byla látka v době ukončení zkoušena) spadá do výsledku A (2 anebo více úhynů), postupuje se podle pravidla klasifikace v tabulce 2 s fixní dávkou 5 mg/kg (kategorie 1, pokud se vyskytnou dva a více úhynů nebo kategorie 2, pokud se nevyskytne více než 1 úhyn). Navíc je v tabulce 4 uvedeno poučení týkající se klasifikace v rámci systému EU, dokud nebude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS). | |
| 1.5.3 | Hlavní studie |
| 1.5.3.1 | Počet pokusných zvířat a úrovně dávek |
| Kroky, podle kterých se má postupovat po provedení zkoušek s výchozí úrovní dávky, jsou uvedeny ve vývojovém diagramu v tabulce 2. Bude nutné zvolit jeden ze tří postupů: buď zkoušení ukončit a stanovit odpovídající klasifikační třídu nebezpečnosti, provést zkoušky s vyšší fixní dávkou nebo zkoušky s nižší fixní dávkou. Avšak s ohledem na ochranu pokusných zvířat se v hlavní studii znovu nepoužije úroveň dávky, která v orientační studii vedla k uhynutí (viz tabulka 2). Zkušenosti ukázaly, že nejpravděpodobnějším výsledkem u výchozí úrovně dávky bude, že látku lze klasifikovat bez nutnosti dalších zkoušek. | |
| Obvykle se pro každou vyšetřovanou úroveň dávky použije celkem pět pokusných zvířat stejného pohlaví. Mezi těmito pěti pokusnými zvířaty bude jedno pokusné zvíře z orientační studie, jemuž byla podána zvolená úroveň dávky, a další čtyři pokusná zvířata (kromě výjimečných případů, kdy úroveň dávky použité v hlavní studii nebyla součástí orientační studie). | |
| Časový interval mezi podáváním každé úrovně dávky závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. Expozice pokusných zvířat další dávce by měla být odložena, dokud nebude jisté, že pokusná zvířata, jimž byla podána předchozí dávka, přežila. Mezi jednotlivými úrovněmi dávky se v případě potřeby doporučuje ponechat dobu 3 nebo 4 dnů, aby bylo umožněno pozorování zpožděné toxicity. Časový interval lze podle potřeby upravit, např. v případě neprůkazné reakce. | |
| Při zvažování použití nejvyšší fixní dávky 5 000 mg/kg se postupuje podle metody popsané v tabulce 3 (viz také část 1.6.2). | |
| 1.5.3.2 | Limitní zkouška |
| Limitní zkouška se používá především tehdy, má-li osoba provádějící zkoušku informace svědčící o tom, že zkoušený materiál je pravděpodobně netoxický, tj. je toxický pouze nad rámec regulačních limitních dávek. Informace o toxicitě zkoušeného materiálu lze získat ze znalostí o podobných zkoušených sloučeninách, směsích nebo prostředcích s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušený materiál bude toxický, by měla být provedena hlavní zkouška. | |
| Podle obvyklého postupu slouží jako limitní zkouška pro tyto pokyny výchozí dávka orientační studie 2 000 mg/kg (nebo výjimečně 5 000 mg/kg), po níž následuje podání této úrovně dávky dalším čtyřem pokusným zvířatům. | |
| 1.6 | POZOROVÁNÍ |
| Po podání dávky se pokusná zvířata pozorují individuálně minimálně jednou během prvních 30 minut, pravidelně během prvních 24 h, přičemž zvláštní pozornost se věnuje prvním 4 h, a poté denně po dobu 14 dnů kromě případů, kdy je nutné pokusná zvířata ze studie vyjmout a humánně utratit kvůli dodržování pravidla dobrého zacházení s pokusnými zvířaty, nebo je zjištěn jejich úhyn. Doba pozorování by však neměla být stanovena pevně. Měla by být stanovena podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a může tedy být podle potřeby prodloužena. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity7a). Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé pokusné zvíře jednotlivě. | |
| Další pozorování budou nutná, jestliže pokusná zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnují změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je třeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu7a). Pokusná zvířata ve stavu agónie a pokusná zvířata se známkami prudkých bolestí nebo s přetrvávajícími příznaky značného utrpení se humánně utratí. Pokud jsou pokusná zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji. | |
| 1.6.1 | Tělesná hmotnost |
| Hmotnosti jednotlivých pokusných zvířat se stanoví krátce před podáním zkoušené látky a nejméně jednou týdně poté. Vypočítají se změny hmotnosti. Na konci zkoušky se pokusná zvířata, která přežila, zváží a poté humánně utratí. | |
| 1.6.2 | Patologie |
| Všechna pokusná zvířata se pitvají. U každého pokusného zvířete se zaznamenají všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikroskopické vyšetření orgánů, u nichž jsou patrné makroskopické změny. | |
| 2 | DATA |
| Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé pokusné zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých pokusných zvířat, počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet pokusných zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých pokusných zvířat, popis a časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy. | |
| 3 | PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA |
| --- | --- |
| V souladu s příslušnými právními předpisy9), 10) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol. | |
| 3.1 | Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace: |
| Zkoušená látka: | |
| - fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace), | |
| - identifikační údaje, včetně čísla CAS. | |
| Vehikulum (v případě potřeby): | |
| - zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda. | |
| Pokusná zvířata: | |
| - použitý druh/kmen, | |
| - mikrobiologický stav pokusných zvířat, je-li znám, | |
| - počet, stáří a pohlaví pokusných zvířat (případně včetně zdůvodnění použití samců místo samic), | |
| - původ, podmínky chovu, krmivo atd. | |
| Zkušební podmínky: | |
| - podrobné údaje o složení zkoušené látky, včetně podrobností o fyzikální formě podávaného materiálu, | |
| - podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky, včetně podávaných objemů a době podávání, | |
| - podrobné údaje o krmivu a kvalitě vody (včetně druhu/zdroje krmiva, zdroje vody), | |
| - zdůvodnění výběru výchozí dávky. | |
| Výsledky: | |
| - tabulky údajů o reakcích každého pokusného zvířete a o jeho úrovni dávky (tj. počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, včetně uhynutí, povahy, závažnosti a trvání účinků), | |
| - tabulky údajů o tělesné hmotnosti a jejích změnách, | |
| - individuální hmotnosti pokusných zvířat v den podání dávky, poté v týdenních intervalech a v čase úhynu nebo utracení, | |
| - datum a doba úhynu, pokud předchází plánovanému usmrcení, | |
| - časový průběh nástupu příznaků toxicity u každého pokusného zvířete a zda byly vratné, | |
| - pitevní a histopatologické nálezy pro každé pokusné zvíře, pokud jsou k dispozici. | |
| Diskuse a interpretace výsledků. | |
| Závěry. |
Tabulka 1: VÝVOJOVÝ DIAGRAM PRO ORIENTAČNÍ STUDII
[image omitted] [image omitted]
Tabulka 2: VÝVOJOVÝ DIAGRAM PRO HLAVNÍ STUDII
[image omitted] [image omitted]
Tabulka 3
KRITÉRIA KLASIFIKACE ZKOUŠENÝCH LÁTEK S OČEKÁVANÝMI HODNOTAMI LD50 PŘESAHUJÍCÍMI 2 000 mg/kg BEZ NUTNOSTI ZKOUŠENÍ
Kritéria pro kategorii nebezpečnosti 5 mají umožnit identifikaci zkoušených látek, u nichž je nebezpečí akutní toxicity nízké, avšak které mohou za určitých okolností pro citlivé jedince představovat nebezpečí. U těchto látek se předpokládá, že se jejich orální nebo dermální LD50 nebo LD50 ekvivalentních dávek podávaných jinými cestami pohybuje v rozmezí od 2 000 do 5 000 mg/kg. Zkoušené látky lze klasifikovat v kategorii nebezpečnosti definované jako 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (v GHS kategorie 5) v těchto případech:
- a) pokud je do této kategorie zařazena podle některého ze systémů zkoušení uvedeného v tabulce 2, v závislosti na výskytech uhynutí,
- b) pokud jsou již k dispozici spolehlivé důkazy naznačující, že LD50 se pohybuje v rozmezí hodnot kategorie 5, nebo pokud z jiných studií na pokusných zvířatech nebo z toxických účinků na člověka vyplývají akutní obavy o lidské zdraví,
- c) pokud extrapolací, odhadem nebo měřením údajů není přiřazení do vyšší třídy nebezpečnosti odůvodněno, a
- pokud jsou k dispozici spolehlivé informace naznačující významné toxické účinky na člověka, nebo
- pokud je během zkoušení orální cestou do hodnot kategorie 4 pozorováno uhynutí, nebo
- v případech, kdy odborný posudek potvrdí závažné klinické příznaky toxicity při testování do hodnot kategorie 4 s výjimkou průjmu, piloerekce nebo rozcuchané srsti, nebo
- v případech, kdy odborný posudek potvrdí spolehlivé informace, které naznačují potenciál pro významné akutní účinky vyplývající z jiných studií na pokusných zvířatech.
ZKOUŠENÍ V DÁVKÁCH PŘESAHUJÍCÍCH 2 000 mg/kg
Ve výjimečných případech, a pouze je-li to odůvodněno specifickými regulačními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně fixní dávky 5 000 mg/kg. S ohledem na potřebu ochrany dobrého zacházení s pokusnými zvířaty se zkoušení v dávkách 5 000 mg/kg nedoporučuje a mělo by se zvažovat pouze v případě, že existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky by měly přímý význam pro ochranu pokusných zvířat nebo lidského zdraví^7a).
Orientační studie
Pravidla pro rozhodování, jimiž se řídí metoda postupného podávání dávek uvedená v tabulce 1, se rozšíří tak, aby zahrnovala úroveň dávky 5 000 mg/kg. Pokud se v orientační studii použije výchozí dávka 5 000 mg/kg, výsledek A (úhyn) povede k nutnosti zkoušet na druhém pokusném zvířeti dávku 2 000 mg/kg. Výsledky B a C (zřejmá toxicita nebo žádná toxicita) umožní zvolit dávku 5 000 mg/kg za výchozí dávku hlavní studie. Podobně pokud se použije výchozí dávka jiná než 5 000 mg/kg, zkoušení pokračuje na úroveň 5 000 mg/kg v případě, že se při 2 000 mg/kg zjistí výsledky B nebo C. Následný výsledek A při 5 000 mg/kg bude vyžadovat výchozí dávku hlavní studie 2 000 mg/kg a výsledky B a C budou vyžadovat výchozí dávku v hlavní studii 5 000 mg/kg.
Hlavní studie
Pravidla pro rozhodování, jimiž se řídí metoda postupného podávání dávek uvedená v tabulce 2, se rozšíří tak, aby zahrnovala úroveň dávky 5 000 mg/kg. Pokud se tedy v hlavní studii použije výchozí dávka 5 000 mg/kg, bude výsledek A (≥ 2 úhyny) vyžadovat zkoušení dávky 2 000 mg/kg na druhé skupině. Výsledek B (zřejmá toxicita nebo ≤1 úhyn) nebo C (žádná toxicita) povedou k tomu, že látka nebude podle GHS klasifikována. Podobně pokud se použije výchozí dávka jiná než 5 000 mg/kg, zkoušení pokračuje na úroveň 5 000 mg/kg v případě, že se při 2 000 mg/kg zjistí výsledek C. Následný výsledek A při 5 000 mg/kg povede k tomu, že se látka přiřadí do kategorie 5 GHS a na základě výsledku B nebo C látka nebude klasifikována.
Tabulka 4 ZKUŠEBNÍ METODA B.1 bis - Pokyny ke klasifikaci podle systému EU pro přechodné období do plného zavedení globálně harmonizovaného systému klasifikace (GHS) (převzato z literatury^7a))
[image omitted] [image omitted]
-
- V příloze č. 2 metoda B.1 tris AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ (PER OS) METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY zní:
„B.1 tris AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ - METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY
| 1 | METODA je v souladu s právem Evropských společenství7a). |
|---|---|
| 1.1 | ÚVOD |
| Metoda stanovení třídy akutní toxicity7a) stanovená v této zkoušce je metodou po krocích, přičemž u každého kroku se používají 3 pokusná zvířata stejného pohlaví. V závislosti na mortalitě nebo stavu agónie pokusných zvířat lze o akutní toxicitě zkoušené látky rozhodnout průměrně na základě 2 až 4 kroků. Tato metoda je reprodukovatelná, vyžaduje méně pokusných zvířat a dokáže látky zařadit podobně jako jiné metody zkoušení akutní toxicity. Metoda stanovení třídy akutní toxicity je založena na biometrickém hodnocení7a) s fixními dávkami, přiměřeně oddělenými tak, aby umožnila zařazení látky pro účely klasifikace a posouzení nebezpečnosti. Na metodu přijatou v roce 1996 byly provedeny rozsáhlé národní7a) i mezinárodní7a) validační studie in vivo pro srovnání s hodnotami LD50 získanými z literatury. | |
| Není nutné podávat zkoušené látky v dávkách, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazně dráždivých účinků vyvolávají značnou bolest a utrpení. Umírající pokusná zvířata nebo pokusná zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, se humánně utratí a při interpretaci výsledků jsou hodnocena jako pokusná zvířata uhynulá při zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících pokusných zvířat a poučení týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí lze nalézt v literatuře7a). | |
| Metoda využívá předem stanovených dávek a její výsledky umožňují látku zařadit a klasifikovat podle globálně harmonizovaného systému klasifikace chemických látek, které způsobují akutní toxicitu7a). | |
| V zásadě tato metoda neslouží k vypočtení přesné hodnoty LD50, ale umožňuje určit definované rozpětí expozice, při které se předpokládá letalita, neboť hlavním koncovým vyhodnocením této zkoušky zůstává uhynutí části pokusných zvířat. Metoda umožňuje stanovit hodnotu LD50, pouze pokud alespoň dvě dávky vedou k mortalitě vyšší než 0 % a nižší než 100 %. Použití výběru předem stanovených dávek bez ohledu na zkoušenou látku, u něhož se klasifikace explicitně váže k počtu pokusných zvířat pozorovaných v různých stavech, zvyšuje možnost konzistentního a opakovaného předávání zpráv mezi laboratořemi. | |
| Zkušební laboratoř by před provedením studie měla vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Součástí těchto informací je totožnost a chemická struktura látky, její fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledek jiných zkoušek toxicity dané látky in vivo nebo in vitro, toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru nejvhodnější výchozí dávky. | |
| 1.2 | DEFINICE |
| Akutní orální toxicita: vztahuje se na nepříznivé účinky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 h. | |
| 1.3 | PODSTATA ZKOUŠKY |
| Podstatou zkoušky je to, že se pomocí metody po krocích využívající minimálního počtu pokusných zvířat u každého kroku získají informace o akutní toxicitě zkoušené látky, které umožní její klasifikaci. Látka se skupině pokusných zvířat podává orálně v jedné ze stanovených dávek. Látka se zkouší metodou po krocích, přičemž u každého kroku se používají tři pokusná zvířata stejného pohlaví (obvykle samice). Přítomnost nebo nepřítomnost mortality vyvolané látkou u pokusných zvířat, jimž byla látka podána v jednom kroku, rozhodne o dalším kroku, tj.: | |
| - není třeba žádné další zkoušení, | |
| - podá se stejná dávka dalším třem pokusným zvířatům, | |
| - látka se podá dalším třem pokusným zvířatům v nejbližší vyšší nebo | |
| nejbližší nižší úrovni dávky. | |
| Podrobnosti postupu zkoušení jsou uvedeny v tabulce 5. Metoda umožní rozhodnout s ohledem na zařazení zkoušené látky do jedné zrady tříd toxicity definovaných fixními hraničními hodnotami LD50. | |
| 1.4 | POPIS METODY |
| 1.4.1 | Výběr druhu pokusných zvířat |
| Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít i jiné druhy hlodavců. Obvykle se používají samice7a). Je to proto, že přehled literatury 0 konvenčních zkouškách LD50 ukazuje, že ačkoliv je mezi pohlavími obvykle malý rozdíl, pokud jde 0 citlivost, jsou samice v případech, ve kterých jsou rozdíly pozorovány, obecně nepatrně citlivější7a). Pokud však poznatky 0 toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturně příbuzných chemických látek naznačují, že citlivější jsou pravděpodobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat náležité odůvodnění. Použijí se mladá zdravá dospělá pokusná zvířata běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Každé pokusné zvíře musí být na začátku podávání látky 8 až 12 týdnů staré a jeho hmotnost by se měla pohybovat v intervalu ± 20 % střední hmotnosti pokusných zvířat, kterým byla podána předchozí dávka. | |
| 1.4.2 | Podmínky chovu a krmení |
| Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být (22 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky v souladu s příslušným právním předpisem10), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete. | |
| 1.4.3 | Příprava pokusných zvířat |
| Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu10). | |
| 1.4.4 | Příprava dávek |
| Zkoušená látka by obecně měla být při všech úrovních zkoušených dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného přípravku. V případech, kdy má být zkoušen kapalný konečný produkt nebo směs, může však mít použití nezředěné zkoušené látky, tj. s konstantní koncentrací, větší závažnost pro hodnocení následného rizika této látky. Ani v jednom případě nesmí být překročen maximální objem dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml/100 g tělesné hmotnosti: avšak u vodných roztoků připadá v úvahu i dávka 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. S ohledem na složení dávkovaného přípravku se ve všech případech, kde je to možné, doporučuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v pořadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec případně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných než voda musí být známy jejich toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce před podáním, pokud není stálost přípravku během doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako přijatelná. | |
| 1.5 | POSTUP |
| 1.5.1 | Podávání dávek |
| Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žaludeční sondy nebo vhodné intubační rourky. Pokud výjimečně není možné podat dávku najednou, lze dávku podat po menších množstvích během nejvýše 24 h. | |
| Před podáním zkoušené látky nemají pokusná zvířata dostávat krmivo (např. potkanům by se nemělo podávat přes noc, myším 3 - 4 h), voda se však ponechává. Po uplynutí doby hladovění se pokusná zvířata zváží a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí přístupu ke krmivu na další 3 - 4 h u potkanů nebo 1 - 2 h u myší. Podává-li se látka po částech v průběhu určité doby, může být podle délky období nezbytné poskytnout pokusným zvířatům krmivo a vodu. | |
| 1.5.2 | Počet pokusných zvířat a úrovně dávek |
| V každém kroku se používají tři pokusná zvířata. Dávka, která bude použita jako výchozí, se zvolí z jedné ze čtyř fixních úrovní: 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti. Výchozí dávka by měla být taková, která nejpravděpodobněji vyvolá uhynutí některých pokusných zvířat, jimž byla podána. Postup, který je nutno u každé výchozí dávky dodržet, je popsán ve vývojových diagramech v tabulce 5. Navíc je v tabulce 7 uvedeno poučení týkající se klasifikace v rámci systému EU, dokud nebude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS). | |
| Pokud dostupné informace naznačují, že mortalita nebude pravděpodobně při nejvyšší výchozí úrovni dávky (2 000 mg/kg tělesné hmotnosti) vyvolána, je nutné provést limitní zkoušku. Pokud nejsou o látce, která má být testována, k dispozici žádné informace, doporučuje se kvůli dodržování pravidla dobrého zacházení s pokusnými zvířaty použít výchozí dávku 300 mg/kg tělesné hmotnosti. | |
| Časový interval mezi experimentálními skupinami závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. Expozice pokusných zvířat další dávce by měla být odložena, dokud nebude jisté, že pokusná zvířata, jimž byla podána předchozí dávka, přežila. | |
| Ve výjimečných případech a pouze je-li to odůvodněno specifickými regulačními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně dávky 5 000 mg/kg tělesné hmotnosti (viz tabulka 6). S ohledem na dobré zacházení s pokusnými zvířaty se pokusy na pokusných zvířatech v rámci kategorie 5 GHS (2 000 - 5 000 mg/kg) nedoporučují a měly by se zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky budou mít přímý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví pokusných zvířat nebo životního prostředí. | |
| 1.5.3 | Limitní zkouška |
| Limitní zkouška se používá především tehdy, má-li osoba provádějící zkoušku informace svědčící o tom, že zkoušený materiál je pravděpodobně netoxický, tj.je toxický pouze nad rámec regulačních limitních dávek. Informace o toxicitě zkoušeného materiálu lze získat ze znalostí o podobných zkoušených sloučeninách, směsích nebo prostředcích s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušený materiál bude toxický, by měla být provedena hlavní zkouška. | |
| Limitní zkoušku s jednou úrovní dávky 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti lze provést na šesti pokusných zvířatech (tři pokusná zvířata najeden krok). Výjimečně lze na třech pokusných zvířatech provést limitní zkoušku s jednou úrovní dávky 5 000 mg/kg (viz tabulka 6). Projeví-li se mortalita vyvolaná zkoušenou látkou, může být nutné provést další zkoušky s nejbližší nižší úrovní dávky. | |
| 1.6 | POZOROVÁNÍ |
| Po podání dávky se pokusná zvířata pozorují individuálně minimálně jednou během prvních 30 minut, pravidelně během prvních 24 h, přičemž zvláštní pozornost se věnuje prvním 4 h, a poté denně po dobu 14 dnů kromě případů, kdy je nutné pokusná zvířata ze studie vyjmout a humánně utratit kvůli dodržování pravidla dobrého zacházení s pokusnými zvířaty, nebo je zjištěn jejich úhyn. Doba pozorování by však neměla být stanovena pevně. Měla by být stanovena podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a může tedy být podle potřeby prodloužena. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity7a). Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé pokusné zvíře jednotlivě. | |
| Další pozorování bude nutné, jestliže pokusná zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnují změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je třeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmů, letargii, spánku a kómatu7a). Pokusná zvířata ve stavu agónie a pokusná zvířata se známkami prudkých bolestí nebo přetrvávajícími příznaky značného utrpení se humánně utratí. Pokud jsou pokusná zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji. | |
| 1.6.1 | Tělesná hmotnost |
| Hmotnosti jednotlivých pokusných zvířat se stanoví krátce před podáním zkoušené látky a nejméně jednou týdně poté. Vypočítají se změny hmotnosti a zaznamenají se. Na konci zkoušky se pokusná zvířata, která přežila, zváží a humánně utratí. | |
| 1.6.2 | Patologie |
| Všechna pokusná zvířata (včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena kvůli dodržování pravidla dobrého zacházení s pokusnými zvířaty) se pitvají. U každého pokusného zvířete se zaznamenají všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikroskopické vyšetření orgánů, u nichž jsou patrné makroskopické patologie, u pokusných zvířat, která přežila 24 nebo více hodin, protože mohou poskytnout užitečné informace. | |
| 2 | DATA |
| Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé pokusné zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých pokusných zvířat, počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet pokusných zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých pokusných zvířat, popis a časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy. | |
| 3 | PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA |
| V souladu s příslušnými právními předpisy9), 10) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusuje nutno vést protokol. | |
| 3.1 | Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace: |
| Zkoušená látka: | |
| - fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace), | |
| - identifikační údaje, včetně čísla CAS. | |
| Vehikulum (v případě potřeby): | |
| - zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda. | |
| Pokusná zvířata: | |
| - použitý druh/kmen, | |
| - mikrobiologický stav pokusných zvířat, je-li znám, | |
| - počet, stáří a pohlaví pokusných zvířat (případně včetně zdůvodnění použití samců místo samic), | |
| - původ, podmínky chovu, krmivo atd. | |
| Zkušební podmínky: | |
| - podrobné údaje o složení zkoušené látky, včetně podrobností o fyzikální formě podávaného materiálu, | |
| - podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky, včetně podávaných objemů a době podávání, | |
| - podrobné údaje o krmivu a kvalitě vody (včetně druhu/zdroje krmiva, zdroje vody), | |
| - zdůvodnění výběru výchozí dávky. | |
| Výsledky: | |
| - tabulky údajů o reakcích každého pokusného zvířete a o úrovni jeho dávky (tj. počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, včetně uhynutí, povahy, závažnosti a trvání účinků), | |
| - tabulky údajů o tělesné hmotnosti a jejích změnách, | |
| - individuální hmotnosti pokusných zvířat v den podání dávky, poté v týdenních intervalech a v čase úhynu nebo utracení, | |
| - datum a doba úhynu, pokud předchází plánovanému usmrcení, | |
| - časový průběh nástupu příznaků toxicity u každého pokusného zvířete a zda byly vratné, | |
| - pitevní a histopatologické nálezy pro každé pokusné zvíře, pokud jsou k dispozici. | |
| Diskuse a interpretace výsledků. | |
| Závěry. |
Tabulka 5
POSTUP, KTERÝ MÁ BÝT U KAŽDÉ Z VÝCHOZÍCH DÁVEK DODRŽEN
OBECNÉ POZNÁMKY
Systém zkoušení u každé výchozí dávky obsažený v této tabulce nastiňuje postup, podle kterého je třeba postupovat.
- Tabulka 5 a: výchozí dávka je 5 mg /kg tělesné hmotnosti
- Tabulka 5 b: výchozí dávka je 50 mg /kg tělesné hmotnosti
- Tabulka 5 c: výchozí dávka je 300 mg/kg tělesné hmotnosti
- Tabulka 5 d: výchozí dávka je 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti
Postup zkoušení se řídí naznačenými šipkami v závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých pokusných zvířat.
Tabulka 5a POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 5 mg/kg TĚLESNÉ HMOTNOSTI
[image omitted]
Tabulka 5b POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 50 mg/kg TĚLESNÉ HMOTNOSTI
[image omitted]
TABULKA 5c POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 300 mg/kg TĚLESNÉ HMOTNOSTI
[image omitted]
TABULKA 5d POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 2000 mg/kg TĚLESNÉ HMOTNOSTI
[image omitted]
Tabulka 6
KRITÉRIA KLASIFIKACE ZKOUŠENÝCH LÁTEK S OČEKÁVANÝMI HODNOTAMI LD50 PŘESAHUJÍCÍMI 2 000 mg/kg BEZ NUTNOSTI ZKOUŠENÍ
Kritéria pro kategorii nebezpečnosti 5 mají umožnit identifikaci zkoušených látek, u nichž je nebezpečí akutní toxicity relativně nízké, avšak které mohou za určitých okolností pro citlivé jedince představovat nebezpečí. U těchto látek se předpokládá, že se jejich orální nebo dermální LD50 nebo LD50 ekvivalentních dávek podávaných jinými cestami pohybuje v rozmezí od 2 000 do 5 000 mg/kg. Zkoušenou látku lze klasifikovat v kategorii nebezpečnosti definované jako 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (v GHS kategorie 5) v těchto případech:
- a) pokud je do této kategorie zařazena podle některého ze systémů zkoušení uvedeného v tabulce 5a - 5d, v závislosti na výskytech uhynutí,
- b) pokud jsou již k dispozici spolehlivé důkazy naznačující, že LD50 se pohybuje v rozmezí hodnot kategorie 5, nebo pokud z jiných studií na pokusných zvířatech nebo toxických účinků na člověka vyplývají akutní obavy o lidské zdraví,
- c) pokud extrapolací, odhadem nebo měřením údajů není přiřazení do vyšší třídy nebezpečnosti odůvodněno a
- pokud jsou k dispozici spolehlivé informace naznačující významné toxické účinky na člověka, nebo
- pokud je během zkoušení orální cestou do hodnot kategorie 4 pozorováno uhynutí, nebo
- v případech, kdy odborný posudek potvrdí závažné klinické příznaky toxicity při testování do hodnot kategorie 4 s výjimkou průjmu, piloerekce nebo rozcuchané srsti, nebo
- v případech, kdy odborný posudek potvrdí spolehlivé informace, které naznačují potenciál pro významné akutní účinky vyplývající z jiných studií na pokusných zvířatech.
ZKOUŠENÍ V DÁVKÁCH PŘESAHUJÍCÍCH 2 000 mg/kg
S ohledem na potřebu ochrany dobrého zacházení s pokusnými zvířaty se zkoušení na pokusných zvířatech v kategorii 5 (5 000 mg/kg) nedoporučuje a mělo by se zvažovat pouze v případě, že existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky mají přímý význam pro ochranu lidského zdraví nebo zdraví pokusných zvířat^7a). S vyššími úrovněmi dávek se žádné další zkoušky neprovedou.
Pokud je vyžadováno zkoušení s dávkou 5 000 mg/kg, vyžaduje se pouze jeden krok (tj. tři pokusná zvířata). Pokud pokusné zvíře, jemuž byla podána dávka jako prvnímu, uhyne, pokračuje podávání s úrovní 2 000 mg/kg podle vývojového diagramu v tabulce 5. Pokud první pokusné zvíře přežije, podá se dávka dalším dvěma pokusným zvířatům. Pokud uhyne pouze jedno pokusné zvíře ze tří pokusných zvířat, očekává se, že hodnota LD50 přesáhne 5 000 mg/kg. Pokud uhynou obě pokusná zvířata, pokračuje se podáním dávky 2 000 mg/kg.
Tabulka 7
METODA ZKOUŠENÍ B.1 tris: Pokyny ke klasifikaci podle systému EU pro přechodné období do plného zavedení globálně harmonizovaného systému klasifikace (GHS) (převzato z literatury^7a))
[image omitted] [image omitted] [image omitted] [image omitted]
-
- V příloze č. 2 metoda B.4 KOŽNÍ DRÁŽDIVOST zní:
„B.4 AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI
| 1 | METODA je v souladu s právem Evropských společenství7a). |
|---|---|
| 1.1 | ÚVOD |
| Při přípravě této aktualizované metody byla zvláštní pozornost věnována možným zlepšením v oblasti dobrého zacházení s pokusnými zvířaty a hodnocení veškerých existujících informací o zkoušené látce s cílem vyhnout se nadbytečným zkouškám na pokusných zvířatech. Součástí této metody je doporučení, aby před provedením popsané zkoušky dráždivých a leptavých účinků látky na kůži in vivo byla vypracována analýza průkaznosti stávajících relevantních údajů. Pokud jsou k dispozici nedostatečné údaje, lze je rozpracovat využitím metody postupného zkoušení7a). Strategie zkoušení zahrnuje provedení validovaných a uznaných zkoušek in vitro a je popsána v tabulce 8 k této metodě. Navíc se v případě potřeby v počáteční zkoušce in vivo doporučuje namísto současného aplikování postupná aplikace tří testovacích náplastí. | |
| V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení s pokusnými zvířaty by se zkoušky in vivo neměly provádět, dokud nebyly všechny dostupné údaje významné pro potenciální leptavé nebo dráždivé účinky látky vyhodnoceny na základě analýzy průkaznosti výsledků. Takové údaje budou zahrnovat důkazy ze stávajících studií na lidech nebo pokusných zvířatech, důkazy leptavých nebo dráždivých účinků jedné nebo více strukturně příbuzných látek nebo směsí takových látek, údaje dokládající silnou kyselost nebo zásaditost látky7a) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek in vitro nebo ex vivo. Tato analýza by měla snížit potřebu zkoušek leptavých nebo dráždivých účinků na kůži metodou in vivo u látek, u nichž již existují důkazy z jiných studiích, pokud jde o tyto dva ukazatele. | |
| V tabulce 8 k této metodě je uvedena upřednostňovaná strategie postupného zkoušení, jejíž součástí je provedení validovaných a uznaných zkoušek leptavých/dráždivých účinků in vitro nebo ex vivo. Tato strategie byla vypracována na semináři OECD7a), jeho účastníky jednohlasně doporučena a přijata jako doporučená strategie zkoušení v globálně harmonizovaném systému klasifikace chemických látek (GHS)7a). Doporučuje se, aby se podle této strategie zkoušení postupovalo před provádění zkoušek in vivo. U nových látek se doporučuje metoda zkoušení po krocích, díky níž lze dosáhnout vědecky spolehlivých údajů o leptavých/dráždivých účincích látky. U existujících látek, o jejichž leptavých/dráždivých účincích na kůži není k dispozici dostatek údajů, by se měla tato strategie využít pro doplnění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu po krocích musí být odůvodněno. | |
| Pokud pomocí analýzy průkaznosti výsledků nelze o leptavých nebo dráždivých účincích rozhodnout, měla by se v souladu se strategií postupného zkoušení uvážit zkouška in vivo (viz tabulka 8). | |
| 1.2 | DEFINICE |
| Dráždivé účinky na kůži: vyvolání vratných změn na kůži do 4 h po aplikaci zkoušené látky. | |
| Leptavé účinky na kůži: vyvolání nevratného poškození kůže, zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky, do čtyř hodin po aplikaci zkoušené látky. Reakce po poleptání se projevují vředy, krvácením, krvavými strupy a v závěru čtrnáctidenního pozorování ztrátou barvy v důsledku vyblednutí kůže, úplnými ložisky alopecie a jizvami. K vyhodnocení sporných lézí by se měla uvážit histopatologie. | |
| 1.3 | PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY |
| Látka, která má být zkoušena, se v jedné dávce nanese na kůži pokusného zvířete, přičemž oblasti neexponované kůže pokusného zvířete slouží jako kontrola. Ve stanovených intervalech se určí, vyhodnotí a následně popíše stupeň dráždivých/leptavých účinků, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba studie by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků. | |
| Pokusná zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují přetrvávající příznaky značného utrpení nebo bolesti, se humánně utratí a látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Kritéria rozhodování o utracení umírajících a závažně trpících pokusných zvířat lze nalézt v literatuře7a). | |
| 1.4 | POPIS ZKUŠEBNÍ METODY |
| 1.4.1 | Příprava na zkoušku in vivo |
| 1.4.1.1 | Výběr druhu pokusných zvířat |
| Upřednostňovaným pokusným zvířetem je albín králíka a používají se mladá dospělá pokusná zvířata. Při použití jiného druhu by se mělo podat zdůvodnění. | |
| 1.4.1.2 | Příprava pokusných zvířat |
| Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu10). | |
| Asi 24 h před zahájením zkoušky se pokusným zvířatům ostříhá srst na zádech. Je třeba dbát na to, aby se kůže neporanila. Smějí se použít pouze pokusná zvířata se zdravou, neporaněnou kůží. | |
| Některé kmeny králíka mají plošky husté srsti, které jsou v některých obdobích roku výraznější. Na takových oblastech husté srsti by se zkouška provádět neměla. | |
| 1.4.1.3 | Podmínky chovu a krmení |
| Pokusná zvířata by měla být chována samostatně. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla u králíků být (20 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla činit minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách v souladu s příslušným právním předpisem10), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete. | |
| 1.4.2 | Postup zkoušky |
| 1.4.2.1 | Aplikace zkoušené látky |
| Zkoušená látka se nanese na malou plochu kůže (asi 6 cm2) a pokryje se plátkem mulu s nedráždivou náplastí. V případech, kdy přímá aplikace není možná (např. kapaliny nebo některé pasty), by se měla zkoušená látka nejprve nanést na plátek mulu, který se následně přiloží na kůži. Po dobu trvání expozice je třeba přidržovat plátek volně na kůži vhodným semiokluzivním obvazem. Pokud se zkoušená látka nanáší na mul, měl by být na kůži připevněn tak, aby se zajistil dobrý styk s kůží a rovnoměrné rozložení látky na kůži. Je třeba zabránit tomu, aby se pokusné zvíře dostalo k mulu a zkoušenou látku požilo nebo vdechlo. | |
| Kapalné zkoušené látky se zpravidla aplikují neředěné. Při zkouškách pevných látek (které mohou být podle potřeby rozetřeny na prach) se zkoušená látka navlhčí nejmenším množstvím vody (nebo podle potřeby jiným vhodným vehikulem) dostatečným k zajištění dobrého styku s kůží. Pokud se používají jiná vehikula než voda, měl by být potenciální vliv vehikula na dráždivé účinky zkoušené látky na kůži pouze minimální. | |
| Po uplynutí doby expozice, která je obvykle 4 h, se odstraní zbytky zkoušené látky, pokud možno vodou nebo vhodným rozpouštědlem, aniž by došlo k ovlivnění odezvy nebo celistvosti kůže. | |
| 1.4.2.2 | Úroveň dávek |
| Na testovací místo se nanese 0,5 ml kapaliny nebo 0,5 g tuhé látky nebo pasty. | |
| 1.4.2.3 | Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo s použitím jednoho pokusného zvířete) |
| Důrazně se doporučuje, aby byla zkouška in vivo provedena nejprve na jednom pokusném zvířeti, zejména pokud existuje podezření, že látka má potenciální leptavé účinky. Tento postup je v souladu se strategií postupného zkoušení (viz tabulka 8). | |
| Pokud byla na základě analýzy průkaznosti výsledků látka posouzena jako žíravá, není žádné další zkoušení na pokusných zvířatech nutné. U většiny látek, u nichž je podezření, že jsou žíravé, nejsou obvykle další zkoušky in vivo nezbytné. Avšak v těch případech, kde je kvůli nedostatku důkazů považováno za nezbytné zjistit další údaje, mohou být v omezené míře provedeny zkoušky na pokusných zvířatech podle tohoto postupu: pokusnému zvířeti se postupně přiloží nejvýše tři testovací náplasti. První náplast se odstraní po třech minutách. Pokud není pozorována závažná kožní reakce, odstraní se druhá náplast po jedné hodině. Pokud pozorování v této fázi naznačují, že expozici lze bez porušení zásady humánního zacházení prodloužit na čtyři hodiny, přiloží se třetí náplast, která se po čtyřech hodinách odstraní, a vyhodnotí se odezva. | |
| Pokud je po některé ze tří následných expozic pozorován leptavý účinek, zkouška se okamžitě ukončí. Pokud po odstranění třetí náplasti není leptavý účinek pozorován, pokusné zvíře se pozoruje podobu 14 dnů, pokud se u něj poleptání kůže neprojeví dříve. | |
| V takových případech, kdy se u zkoušené látky nepředpokládá, že vyvolá leptavé účinky, ale může být dráždivá, by se měla jednomu pokusnému zvířeti přiložit jedna náplast na čtyři hodiny. | |
| 1.4.2.4 | Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých účinků na kůži in vivo s dalšími pokusnými zvířaty) |
| Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na dvou dalších pokusných zvířatech, u každého s jednou náplastí s dobou expozice 4 h. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován dráždivý účinek, lze potvrzující zkoušku provést postupně, nebo exponováním dvou dalších pokusných zvířat současně. Ve výjimečném případě, kdy se počáteční zkouška neprovádí, lze dvěma nebo třem pokusným zvířatům přiložit jednu náplast, která se po čtyřech hodinách odstraní. Jestliže se použijí dvě pokusná zvířata a u obou se projeví stejná reakce, není žádné další zkoušení nutné. Jinak se zkouší také třetí pokusné zvíře. Sporné reakce může být nutné zhodnotit na dalších pokusných zvířatech. | |
| 1.4.2.5 | Doba pozorování |
| Doba pozorování by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit vratnost pozorovaných účinků. Zkouška by však měla být ukončena kdykoliv v okamžiku, kdy pokusné zvíře vykazuje přetrvávající příznaky značné bolesti nebo utrpení. Za účelem určení vratnosti účinků by se pokusná zvířata měla pozorovat 14 dnů po odstranění náplastí. Pokud je vratnost pozorována před uplynutím 14 dnů, zkouška by se měla v tomto okamžiku ukončit. | |
| 1.4.2.6 | Klinická pozorování a hodnocení reakcí kůže |
| Všechna pokusná zvířata se pozorují na příznaky erytému a edému a reakce kůže se hodnotí po 60 min a dále po 24, 48 a 72 h po odstranění náplasti se zkoušenou látkou. V počáteční zkoušce na jednom pokusném zvířeti se po odstranění náplasti okamžitě vyšetří také testovací místo. Kožní reakce se vyhodnotí a zaznamenají podle stupnice v níže uvedené tabulce 9. Pokud se objeví poškození kůže, které po 72 h nelze označit za dráždivé nebo leptavé účinky, může být nezbytné pozorování až do 14. dne kvůli stanovení vratnosti účinků. Vedle pozorování dráždivých účinků by měly být důkladně popsány a zaznamenány veškeré místní toxické účinky, jako je odtučnění kůže a jakékoli systémové nežádoucí účinky (např. vliv na klinické příznaky toxicity a tělesnou hmotnost). Pro objasnění sporných reakcí by se mělo uvážit histopatologické vyšetření. | |
| Hodnocení reakcí kůže je nevyhnutelně subjektivní. S cílem podporovat harmonizaci hodnocení reakcí kůže a napomáhat zkušebním laboratořím a těm, kdo provádějí a interpretují pozorování, musí být zaměstnanci provádějící pozorování odpovídajícím způsobem kvalifikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování (viz níže uvedená tabulka 9). Jako pomůcku lze použít ilustrované pokyny pro hodnocení dráždivých účinků na kůži a jiných lézí. | |
| 2 | DATA |
| 2.1 | PŘEDKLÁDÁNÍ VÝSLEDKŮ |
| Výsledky studie se shrnou do tabulky uvedené v závěrečném protokolu o zkoušce. Měly by zpracovávat všechny položky uvedené v části 3.1. | |
| 2.2 | HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ |
| Stupně dráždivých účinků na kůži se zhodnotí ve spojení s povahou a stupněm závažnosti lézí a jejich vratností nebo nevratností. Jednotlivé stupně nepředstavují absolutní měřítko dráždivých vlastností látky, neboť se hodnotí také jiné účinky zkoušené látky. Jednotlivé stupně by spíše měly být považovány za referenční hodnoty, které je nutno zhodnotit společně s dalšími pozorováními vyplývajícími ze studie. | |
| Při hodnocení dráždivých reakcí se zohlední vratnost kožních lézí. Pokud do ukončení čtrnáctidenní doby pozorování přetrvávají reakce jako alopecie (na omezené ploše), hyperkeratóza, hyperplazie a šupinatění, považuje se zkoušená látka za dráždivou. | |
| 3 | PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA |
| --- | --- |
| V souladu s příslušnými právními předpisy9),10) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusuje nutno vést protokol. | |
| 3.1 | Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace: |
| Zdůvodnění zkoušení in vivo: analýza průkaznosti výsledků předchozích pokusů, včetně výsledků strategie postupného zkoušení: | |
| - popis relevantních údajů z předchozích zkoušek, | |
| - údaje získaná v každé fázi strategie zkoušení, | |
| - popis provedených zkoušek in vitro, včetně podrobných údajů o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referenčními látkami, | |
| - analýza průkaznosti výsledků odůvodňující provedení studie in vivo. | |
| Zkoušená látka: | |
| - identifikační údaje (např. číslo CAS, zdroj, čistota, známé | |
| nečistoty, šarže), | |
| - fyzikální povaha a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. pH, těkavost, rozpustnost, stabilita), | |
| - pokud jde o směs, její složení a relativní podíl složek vyjádřený v procentech. | |
| Vehikulum: | |
| - identifikace, koncentrace (podle potřeby), použitý objem, | |
| - zdůvodnění výběru vehikula. | |
| Pokusná zvířata: | |
| - použitý druh/kmen, zdůvodnění použití jiných pokusných zvířat, není-li použit albín králíka, | |
| - počet pokusných zvířat každého pohlaví, | |
| - hmotnosti jednotlivých pokusných zvířat na začátku a v závěru zkoušky, | |
| - stáří na začátku studie, | |
| - původ pokusných zvířat, podmínky chovu, krmivo atd. | |
| Zkušební podmínky: | |
| - technika přípravy oblasti kůže, na níž se nanese náplast, | |
| - podrobné údaje o materiálech použitých na náplasti a technice aplikování náplastí, | |
| - podrobné údaje o přípravě zkoušené látky, jejím nanesení a odstranění. | |
| Výsledky: | |
| - údaje o stupni odezvy na dráždivé nebo leptavé účinky u každého pokusného zvířete ve všech okamžicích měření, | |
| - popis všech pozorovaných lézí, | |
| - podrobný popis povahy a stupně pozorovaných dráždivých nebo leptavých účinků a případné histopatologické nálezy, | |
| - popis jiných místních (např. odtučnění kůže) a systémových účinků vedle dráždivých nebo leptavých účinků na kůži. | |
| Diskuse a interpretace výsledků. | |
| Závěry. |
TABULKA 9: HODNOCENÍ KOŽNÍCH REAKCÍ
Tvorba erytému a příškvaru
| Žádný erytém | 0 |
|---|---|
| Velmi slabý erytém (sotva patrný) | 1 |
| Zřetelně viditelný erytém | 2 |
| Mírný až výrazný erytém | 3 |
| Těžký erytém (silné zrudnutí) nebo tvorba příškvaru znemožňující posouzení erytému | 4 |
Maximálně možné: 4
Tvorba edému
| Žádný edém | 0 |
|---|---|
| Velmi lehký edém (sotva patrný) | 1 |
| Lehký edém (okraje jsou patrné, plocha je ohraničena zřetelným vyvýšením) | 2 |
| Mírný edém (okraje vyvýšeny asi o 1 mm) | 3 |
| Výrazný edém (zduření více než 1 mm a otok přesahující hranice exponované plochy) | 4 |
Maximálně možné: 4
Pro objasnění sporných reakcí lze provést histopatologické vyšetření.
Tabulka 8
Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých účinků na kůži
OBECNÉ ÚVAHY
V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení s pokusnými zvířaty je důležité vyhýbat se zbytečnému používání pokusných zvířat a minimalizovat jakékoli zkoušky, které u pokusných zvířat pravděpodobně vyvolají závažné reakce. Veškeré informace týkající se potenciálních leptavých/dráždivých účinků látky na kůži by se měly zhodnotit před zvažováním zkoušení in vivo. Může již existovat dostatek důkazů pro klasifikaci zkoušené látky podle jejího potenciálu vyvolávat leptavé nebo dráždivé účinky na kůži, aniž by bylo nutné provádět zkoušky na pokusných zvířatech. Proto využití analýzy průkaznosti výsledků a strategie postupného zkoušení sníží potřebu provádět zkoušení in vivo, zejména pokud látka pravděpodobně vyvolá závažné reakce.
Doporučuje se, aby se stávající informace týkající se dráždivých nebo leptavých účinků látky na kůži zhodnotily pomocí analýzy průkaznosti výsledků, na jejímž základě se rozhodne o tom, zda by se k lepší charakteristice tohoto potenciálu měly provést další studie jiné než kožní studie in vivo. Jsou-li nutné další studie, doporučuje se využít strategie postupného zkoušení a její pomocí získat relevantní experimentální údaje. U látek, které doposud nebyly zkoušeny, by měla být strategie postupného zkoušení využita k získání souboru údajů, které jsou nezbytné k vyhodnocení jejich potenciálních leptavých nebo dráždivých účinků. Strategie zkoušení popsaná v této tabulce 8 byla vypracována na semináři OECD^7a) a později potvrzena a rozpracována v Harmonizovaném integrovaném systému klasifikace nebezpečí chemických látek pro lidské zdraví a jejich vlivu na životní prostředí, který schválilo 28. společné zasedání Výboru pro chemické látky a Pracovní skupiny pro chemické látky v listopadu 1998^7a).
Ačkoliv tato strategie postupného zkoušení není nedílnou součástí zkušební metody B.4, vyjadřuje doporučovaný postup stanovení dráždivých/leptavých účinků na kůži. Tento postup představuje nejlepší praktický i etický standard pro zkoušení dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo. Metoda zkoušení poskytuje pokyny pro provádění zkoušky in vivo a shrnuje faktory, které by před zahájením takové zkoušky měly být zváženy. Tato strategie představuje přístup posuzování existujících údajů o dráždivých/leptavých účincích zkoušených látek a odstupňovaný přístup k vytváření relevantních údajů o látkách, u kterých je nutné provést další studie, nebo u nichž žádné studie nebyly doposud provedeny. Doporučuje se také za určitých okolností provést validované a uznané zkoušky in vitro nebo ex vivo na zjištění dráždivých/leptavých účinků na kůži.
POPIS STRATEGIE VYHODNOCOVÁNÍ A ZKOUŠENÍ
Před zahájením zkoušek v rámci strategie postupného zkoušení (tabulka 8 pokračování) se vyhodnotí veškeré dostupné informace, aby se mohlo rozhodnout o nutnosti provést zkoušení in vivo. Ačkoliv lze významné informace získat z vyhodnocení jednotlivých parametrů (např. extrémní hodnota pH), stávající informace by se měly vzít v úvahu jako celek. Všechny relevantní údaje o účincích dotyčné látky nebo jejích obdob se vyhodnotí na základě rozhodnutí založeném na průkaznosti výsledků. Mělo by se podat zdůvodnění tohoto rozhodnutí. Hlavní důraz by se měl klást na již existující údaje o účincích látky na člověka a zvířata a dále na výsledky zkoušení in vitro nebo ex vivo. Studie žíravých látek in vivo by se měly provádět co nejméně. Mezi faktory uvedené ve strategii zkoušení patří:
Hodnocení existujících údajů o účincích látky na člověka a zvířata (krok 1). Nejprve je nutné vzít v úvahu existující údaje o účincích na člověka, např. klinické studie nebo studie nemocí z povolání, záznamy subjektů hodnocení nebo údaje o zkouškách na pokusných zvířatech, např. z jednorázových nebo opakovaných studií dermální toxicity, protože z těchto údajů lze získat informace přímo se vztahující k účinkům na kůži. Látky, jejichž dráždivé nebo leptavé účinky jsou známy, a látky, o nichž existují jednoznačné důkazy, že leptavé nebo dráždivé účinky nemají, není nutné zkoušet ve studiích in vivo.
Analýza vztahů mezi strukturou a biologickou aktivitou (SAR) (krok 2). Vezmou se v úvahu výsledky zkoušek strukturně příbuzných látek, jsou-li k dispozici. Pokud jsou k dispozici dostatečné údaje o účincích strukturně příbuzných látek nebo jejich směsí na člověka nebo pokusná zvířata naznačující, že mají potenciál leptavých/dráždivých účinků, lze předpokládat, že hodnocená zkoušená látka vyvolá stejné reakce. V takových případech není nutné tuto látku zkoušet. Negativní údaje získané ze studií strukturně příbuzných látek nebo jejich směsí nezakládají podle strategie postupného zkoušení dostatečný důkaz o neexistenci leptavých/dráždivých účinků látky. Ke stanovení potenciálních leptavých a dráždivých účinků na kůži by měly být použity validované a uznané postupy vycházející z analýzy SAR.
Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (krok 3). Látky vykazující extrémní hodnoty pH jako ≤ 2,0 a ≥ 11,5 mohou mít silné místní účinky. Pokud se leptavé účinky látky na kůži stanoví na základě extrémních hodnot pH, lze také vzít v úvahu kyselou/alkalickou rezervu (pufrační kapacitu)^7a). Pokud lze podle pufrační kapacity soudit, že látka možná nemá leptavé účinky na kůži, musí tento předpoklad potvrdit další zkoušky, pokud možno s využitím validované a uznané zkoušky in vitro nebo ex vivo (viz kroky 5 a 6).
Dermální toxicita (krok 4). Pokud se ukáže, že chemická látka je při podání dermální cestou vysoce toxická, nemusí být studie dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo, neboť množství zkoušené látky, které se obvykle nanáší, by mohlo přesáhnout vysoce toxickou dávku a mít za následek uhynutí nebo závažné utrpení pokusných zvířat. Navíc pokud byly studie dermální toxicity využívající albíny králíka již provedeny do limitní úrovně dávky 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti nebo vyšší a nebyly zjištěny žádné dráždivé nebo leptavé účinky, nemusí být další zkoušky dráždivých/leptavých účinků na kůži nezbytné. Při hodnocení akutní dermální toxicity v předchozích studiích je nutné mít na paměti několik aspektů. Např. zaznamenané informace o dermálních lezích nemusí být úplné. Zkoušení a pozorování mohlo být prováděno na jiných druzích než králík a citlivost reakcí jednotlivých druhů se může do značné míry lišit. Také forma zkoušené látky, která byla pokusným zvířatům podávána, nemusela být vhodná pro hodnocení dráždivých/leptavých účinků na kůži (např. ředění látek určených ke zkoušení dermální toxicity)^7a). Avšak v takových případech, kdy byly na králících provedeny dobře navržené a realizované studie dermální toxicity, lze negativní nálezy považovat za dostatečné důkazy, že látka není žíravá nebo dráždivá.
Výsledky ze zkoušek in vitro nebo ex vivo (kroky 5 a 6). Látky, které vykazovaly leptavé nebo výrazně dráždivé účinky ve validované a uznané zkoušce in vitro nebo ex vivo^7a), jejímž cílem bylo hodnocení specifických účinků, není nutné zkoušet na pokusných zvířatech. Lze předpokládat, že takové látky vyvolají ve zkoušce in vivo podobné závažné účinky.
Zkouška in vivo na králících (kroky 7 a 8). Pokud je k provedení zkoušení in vivo nutné rozhodnutí založené na průkaznosti výsledku, mělo by toto zkoušení začínat s počáteční zkouškou na jednom pokusném zvířeti. Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že látka má leptavé účinky na kůži, nemělo by se další zkoušení provádět. Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit maximálně na dvou dalších pokusných zvířatech po dobu expozice 4 h. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován dráždivý účinek, lze potvrzující zkoušku provést postupně, nebo exponováním dvou dalších pokusných zvířat současně.
Tabulka č. 8 pokračování STRATEGIE ZKOUŠENÍ A HODNOCENÍ DRÁŽDIVÝCH/LEPTAVÝCH ÚČINKŮ NA KŮŽI
[image omitted] [image omitted]
-
- V příloze č. 2 metoda B.5 OČNÍ DRÁŽDIVOST zní:
„B.5 AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA OČI
| 1 | METODA je v souladu s právem Evropských společenství7a). |
|---|---|
| 1.1 | ÚVOD |
| Při přípravě této aktualizované metody byla zvláštní pozornost věnována možným zlepšením, jichž lze dosáhnout vyhodnocováním veškerých existujících informací o zkoušené látce s cílem vyhnout se nadbytečným zkouškám na pokusných zvířatech a brát tak ohled na dobré zacházení s pokusnými zvířaty. Součástí této metody je doporučení, aby před provedením popsané zkoušky akutních dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo byla vypracována analýza průkaznosti7a) stávajících relevantních údajů. Pokud jsou k dispozici nedostatečné údaje, doporučuje se je získat pomocí metody postupného zkoušení7a). Strategie zkoušení zahrnuje provedení validovaných a schválených zkoušek in vitro a je popsána v tabulce 10 k této metodě zkoušení. Navíc se před zvažováním očního testu in vivo doporučuje provést zkoušku dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo, na jejímž základě se předpoví možné leptavé účinky na oči. | |
| V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a rovněž dobrého zacházení s pokusnými zvířaty by se ke zkouškám in vivo nemělo přistupovat, dokud nebyly všechny dostupné údaje významné pro potenciální leptavé/dráždivé účinky látky na oči vyhodnoceny na základě analýzy průkaznosti výsledků. Takové údaje budou zahrnovat důkazy ze stávajících studií na lidech nebo pokusných zvířatech, důkazy leptavých/dráždivých účinků jedné nebo více strukturně příbuzných látek nebo směsí těchto látek, údaje dokládající vysokou kyselost nebo zásaditost látky7a) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek leptavých a dráždivých účinků na kůži in vitro nebo ex vivo7a). Tyto studie mohly být vypracovány před analýzou průkaznosti výsledků nebo na základě zjištění této analýzy. | |
| U některých látek může taková analýza naznačovat nutnost provedení studií potenciálních leptavých/dráždivých účinků látky na oči in vivo. Ve všech takových případech se před zvážením použití oční zkoušky in vivo nejprve provede studie účinků látky na kůži in vivo a zhodnotí se v souladu s metodou zkoušení B.47a). Použití analýzy průkaznosti výsledků a strategie postupného zkoušení by mělo omezit potřebu zkoušení leptavých/dráždivých účinků na oči těch látek, u nichž tyto účinky byly již dostatečně doloženy v jiných studiích. Pokud pomocí strategie postupného zkoušení nelze o možnosti leptavých nebo dráždivých účinků na oči rozhodnout ani po provedení studie leptavých a dráždivých účinků na kůži in vivo, lze provést zkoušku leptavých/dráždivých účinků na oči in vivo. | |
| Upřednostňovaná strategie postupného zkoušení, jejíž součástí je provedení validovaných zkoušek leptavých/dráždivých účinků in vitro nebo ex vivo, je uvedena v tabulce 10 k této metodě zkoušení. Tato strategie byla vypracována na semináři OECD7a), jeho účastníky jednohlasně doporučena a přijata jako doporučená strategie zkoušení v globálně harmonizovaném systému klasifikace chemických látek (GHS)7a). Doporučuje se, aby se podle této strategie zkoušení postupovalo před prováděním zkoušek in vivo. U nových látek se doporučuje metoda zkoušení po krocích, díky níž lze dosáhnout vědecky spolehlivých údajů o leptavých/dráždivých účincích látky. U existujících látek, o jejichž leptavých/dráždivých účincích na kůži a oči není k dispozici dostatek údajů, by se měla tato strategie využít pro doplnění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu po krocích musí být odůvodněno. | |
| 1.2 | DEFINICE |
| Dráždivé účinky na oči: vyvolání změn v oku po aplikaci zkoušené látky na přední povrch oka. Tyto změny jsou plně vratné do 21 dnů po aplikaci. | |
| Leptavé účinky na oči: vyvolání poškození oční tkáně nebo závažné fyzické zhoršení vidění po aplikaci zkoušené látky na přední povrch oka. Toto poškození není plně vratné do 21 dnů po aplikaci. | |
| 1.3 | PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY |
| Látka, která má být zkoušena, se nanese v jedné dávce na jedno oko pokusného zvířete, přičemž neexponované oko slouží jako kontrola. V určitých intervalech se na základě určení lézí spojivky, rohovky a duhovky vyhodnotí stupeň dráždivých/leptavých účinků na oči. Popíší se také jiné účinky na oko a nežádoucí systémové účinky, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba studie by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo nevratnost účinků. | |
| Pokusná zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují přetrvávající příznaky značného utrpení nebo bolesti, se humánně utratí a látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Kritéria rozhodování o utracení umírajících a závažně trpících pokusných zvířat lze nalézt v literatuře7a). | |
| 1.4 | POPIS ZKUŠEBNÍ METODY |
| 1.4.1 | Příprava na zkoušku in vivo |
| 1.4.1.1 | Výběr živočišných druhů |
| Upřednostňovaným pokusným zvířetem je albín králíka a používají se zdravá mladá dospělá pokusná zvířata. Při použití jiných kmenů nebo druhů by se mělo podat zdůvodnění. | |
| 1.4.1.2 | Příprava pokusných zvířat |
| Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu10). 24 h před zkouškou se u každého z předběžně vybraných pokusných zvířat provede vyšetření obou očí. Pokusná zvířata, u kterých se zjistí podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky, se nepoužijí. | |
| 1.4.1.3 | Podmínky chovu a krmení |
| Pokusná zvířata by měla být chována samostatně. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla u králíků činit (20 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla činit minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % během úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách v souladu s příslušným právním předpisem10), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete. | |
| 1.4.2 | Postup zkoušky |
| 1.4.2.1 | Aplikace zkoušené látky |
| Zkoušená látka se aplikuje každému pokusnému zvířeti do spojivkového vaku jednoho oka tak, že se spodní víčko lehce odchlípne od oční bulvy. Víčka se pak asi na jednu sekundu lehce přidrží u sebe, aby nedošlo ke ztrátě látky. Druhé oko, do kterého se látka neaplikuje, slouží jako kontrola. | |
| 1.4.2.2 | Výplach |
| Oči pokusných zvířat se do 24 h po instilaci zkoušené látky nevyplachují, s výjimkou pevných látek (viz část 1.4.2.3.2) a v případě okamžitých leptavých nebo dráždivých účinků. Použití satelitní skupiny pokusných zvířat k vyšetření vlivu výplachu očí se nedoporučuje, pokud to není vědecky odůvodněno. Je-li satelitní skupina nezbytná, použijí se dva králíci. Podmínky výplachu se podrobně zdokumentují, např. doba výplachu, složení a teplota promývacího roztoku, trvání, objem a rychlost aplikace. | |
| 1.4.2.3 | Úroveň dávek |
| 1.4.2.3.1 | Zkoušení kapalin |
| Při zkoušení kapalin se použije dávka 0,1 ml. K instilaci látky přímo do oka by se neměly používat aerosolové rozstřikovače s čerpadlem. Před instilací 0,1 ml do oka by se měla tekutina z rozstřikovače vypudit a shromáždit do nádobky. | |
| 1.4.2.3.2 | Zkoušení pevných látek |
| Při zkoušení pevných látek, past a zrnitých látek se použije objem 0,1 ml nebo hmotnost nejvýše 100 mg. Zkoušená látka se rozemele na jemný prášek. Objem pevného materiálu se stanoví až po opatrném zhutnění, např. poklepáním odměrnou nádobkou. Pokud se pevná zkoušená látka z oka pokusného zvířete neodstranila pomocí fyziologických mechanismů do doby prvního pozorování po 1 h po aplikaci, lze oko vypláchnout fyziologickým roztokem nebo destilovanou vodou. | |
| 1.4.2.3.3 | Zkoušení aerosolů |
| Před instilací látek do oka se doporučuje zachytit látky obsažené v rozstřikovačích nebo aerosolech do nádobky. Jedinou výjimkou jsou látky obsažené v aerosolové nádobce pod tlakem, které z důvodu odpařování zachytit nelze. V takových případech se oko podrží otevřené a látka se do oka aplikuje vstříknutím trvajícím jednu sekundu ze vzdálenosti 10 cm přímo před okem. Vzdálenost se může podle tlaku v rozprašovači a jeho obsahu lišit. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození oka tlakem z rozprašovače. V příslušných případech může být nutné vyhodnotit potenciál „mechanického“ poškození oka v důsledku rozprašovacího tlaku. | |
| Dávku aerosolu lze odhadnout na základě této simulované zkoušky: látka se nastříká na odvažovací papír skrz otvor o velikosti králičího oka, přičemž tento otvor se nachází bezprostředně před papírem. Na základě zvýšení hmotnosti papíru se odhadne množství látky, která se vstříkne do oka. U těkavých látek lze dávku odhadnout pomocí zvážení odběrové nádobky před odstraněním zkoušené látky a po jejím odstranění. | |
| 1.4.2.4 | Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo na jednom pokusném zvířeti) |
| Jak je uvedeno ve strategii postupného zkoušení (viz tabulka 10), důrazně se doporučuje, aby byla zkouška in vivo provedena nejprve na jednom pokusném zvířeti. | |
| Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že látka má leptavé nebo vysoce dráždivé účinky na oči při použití popsaného postupu, další zkoušení dráždivých účinků na oči se neprovede. | |
| 1.4.2.5 | Lokální anestetika |
| V jednotlivých případech lze použít lokální anestetika. Pokud analýza průkaznosti výsledků naznačuje, že látka může způsobit bolest, nebo pokud počáteční zkoušky ukazují, že se objeví bolestivá reakce, lze před instilací zkoušené látky použít lokální anestetika. Typ, koncentraci a dávku lokálního anestetika je třeba pečlivě zvolit, aby bylo zajištěno, že v důsledku jeho použití nedojde k odlišným reakcím na zkoušenou látku. Podobně se musí znecitlivit i kontrolní oko. | |
| 1.4.2.6 | Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých účinků na oči in vivo na dalších pokusných zvířatech) |
| Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na maximálně dalších dvou pokusných zvířatech. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován značný leptavý účinek, který naznačuje možný silný (nevratný) účinek v potvrzující zkoušce, doporučuje se provést potvrzující zkoušku metodou postupného zkoušení na jednom pokusném zvířeti spíše než exponováním dalších dvou pokusných zvířat současně. Pokud se u druhého pokusného zvířete projeví leptavé nebo vysoce dráždivé účinky, ve zkoušce se nepokračuje. K potvrzení slabých nebo mírných dráždivých reakcí může být nutné použít další pokusná zvířata. | |
| 1.4.2.7 | Doba pozorování |
| Doba pozorování by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit míru a vratnost pozorovaných účinků. Zkouška by však měla být ukončena kdykoliv v okamžiku, kdy pokusné zvíře vykazuje přetrvávající příznaky značné bolesti nebo utrpení7a). Za účelem určení vratnosti účinků by se pokusná zvířata měla obvykle pozorovat 21 dnů po podání zkoušené látky. Pokud je vratnost pozorována před uplynutím 21 dnů, zkouška by se měla v tomto okamžiku ukončit. | |
| 1.4.2.7.1 | Klinická pozorování a hodnocení očních reakcí |
| Oči se vyšetří po 1, 24, 48 a 72 h po podání zkoušené látky. Jakmile se získají konečné informace, nemělo by zkoušení na pokusných zvířatech probíhat déle, než je nezbytné. Pokusná zvířata se známkami přetrvávajících prudkých bolestí nebo utrpení se neprodleně humánně utratí a látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Humánně se utratí ta pokusná zvířata, u nichž došlo po instilaci k těmto očním lézím: perforace rohovky nebo výrazné zvředovatění rohovky včetně stafylomu; krev v přední komoře oční; zákal rohovky stupně 4 přetrvávající 48 h; absence reakce na osvit (reakce duhovky stupně 2) přetrvávající 72 h; zvředovatění spojivkové membrány; nekróza spojivek nebo slzné žlázy; nebo odlupování nekrotické hmoty. Tento postup je dán nevratností takových lézí. | |
| Pokusná zvířata, u nichž oční leze nevzniknou, nelze utratit dříve než 3 dny po instilaci. Pokusná zvířata s mírnými až středními lézemi se pozorují, dokud leze nevymizí, nebo po 21 dnů, po jejichž uplynutí se studie ukončí. Po 7, 14 a 21 dnech se provádí pozorování, aby se určil stav lézí a jejich vratnost nebo nevratnost. | |
| Stupeň reakce oka (spojivek, rohovky a duhovky) je třeba zaznamenat při každém vyšetření (tabulka 11). Uvedou se také jakékoli jiné oční leze (např. panus, zbarvení) nebo nežádoucí systémové účinky. | |
| Vyšetřování reakcí lze usnadnit použitím binokulární lupy, ruční štěrbinové lampy, očního mikroskopu nebo jiných vhodných zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 h mohou být oči pokusných zvířat dále vyšetřeny fluoresceinem. | |
| Hodnocení očních reakcí je nevyhnutelně subjektivní. S cílem podporovat harmonizaci hodnocení očních reakcí a napomáhat zkušebním laboratořím a těm, kdo provádějí a interpretují pozorování, musí být zaměstnanci provádějící pozorování odpovídajícím způsobem kvalifikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování. | |
| 2 | DATA |
| 2.1 | HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ |
| Stupně dráždivých účinků na oči se zhodnotí ve spojení s povahou a stupněm závažnosti lézí a jejich vratností nebo nevratností. Jednotlivé stupně nepředstavují absolutní měřítko dráždivých vlastností látky, neboť se hodnotí také jiné účinky zkoušené látky. Jednotlivé stupně by spíše měly být považovány za referenční hodnoty, které j sou smysluplné, pouze pokud se opírají o úplný popis a hodnocení veškerých pozorování. | |
| 3 | PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA |
| V souladu s příslušnými právními předpisy9),10) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusuje nutno vést protokol. | |
| 3.1 | Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace. |
| zdůvodnění zkoušení in vivo: analýza průkaznosti výsledků předchozích pokusů, včetně výsledků strategie postupného zkoušení: | |
| - popis relevantních údajů z předchozích zkoušek, | |
| - údaje získané v každém kroku strategie zkoušení, | |
| - popis provedených zkoušek in vitro, včetně podrobných údajů o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referenčními látkami, | |
| - popis provedené studie dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo, včetně získaných výsledků, | |
| - analýza průkaznosti výsledků odůvodňující provedení studie in vivo. | |
| Zkoušená látka: | |
| - identifikační údaje (např. číslo CAS, zdroj, čistota, známé nečistoty, šarže), | |
| - fyzikální povaha a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. hodnota pH, těkavost, rozpustnost, stabilita, reaktivita s vodou), | |
| - v případě směsi její složení a relativní podíl složek vyjádřený v procentech, | |
| - je-li použito lokální anestetikum, jeho identifikace, čistota, typ, dávka a potenciální interakce se zkoušenou látkou. | |
| Vehikulum: | |
| - identifikace, koncentrace (podle potřeby), použitý objem, | |
| - zdůvodnění výběru vehikula. | |
| Pokusná zvířata: | |
| - použitý druh/kmen, zdůvodnění použití jiných pokusných zvířat, není-li použit albín králíka, | |
| - stáří každého pokusného zvířete na začátku studie, | |
| - počet pokusných zvířat každého pohlaví ve zkušebních a kontrolních skupinách (je-li to nutné), | |
| - hmotnosti jednotlivých pokusných zvířat na začátku a na konci zkoušky, | |
| - původ, podmínky chovu, krmivo atd. | |
| Výsledky: | |
| - popis metody vyhodnocení dráždivosti při každém pozorování (např. ruční štěrbinová lampa, biomikroskop, fluorescein), | |
| - údaje ve formě tabulky o reakcích na dráždivé nebo leptavé účinky u jednotlivých pokusných zvířat při každém pozorování až do vyjmutí každého pokusného zvířete ze zkoušky, | |
| - podrobný popis stupně a charakteru pozorovaných dráždivých nebo leptavých účinků, | |
| - popis všech dalších pozorovaných očních lézí (např. vaskularizace, tvorba panu, srůst sousedních tkání, zbarvení), | |
| - popis místních a systémových nepříznivých účinků mimo oči a případné histopatologické nálezy. | |
| Diskuse a interpretace výsledků. | |
| Extrapolace výsledků studií dráždivých účinků na oči pokusných zvířat na člověka je platná jen v omezené míře. Albinotický králík je ve většině případů na dráždivé a žíravé látky pro oči citlivější než člověk. | |
| Je třeba dbát na to, aby byla při interpretaci údajů vyloučena dráždivost pramenící ze sekundární infekce. | |
| Závěry. |
TABULKA 11: STUPNICE OČNÍCH LÉZÍ
Rohovka
Zákal: stupeň hustoty (vyšetří se nejvíce zakalené oblasti)*
| Žádné zvředovatění ani zákal | 0 |
|---|---|
| Rozptýlené nebo difúzní oblasti zákalu (jiné než slabé zastření normálního lesku), detaily duhovky jasně viditelné | 1 |
| Snadno identifikovatelná průhledná oblast, detaily duhovky lehce zastřené | 2 |
| Přítomnost zóny opalescence, detaily duhovky nejsou viditelné, velikost zornice stěží rozeznatelná | 3 |
| Úplná neprůhlednost rohovky, duhovka je zcela neviditelná | 4 |
Maximálně možné: 4
- Zaznamená se oblast zákalu rohovky.
Duhovka
| Normální | 0 |
|---|---|
| Výrazně prohloubené řasy, městnání, otoky, střední překrvení kolem rohovky, nebo překrvení při zánětu; rohovka reaguje na světlo (zpožděná reakce je považována za účinek) | 1 |
| Krvácení, makroskopické poškození nebo bez reakce na světlo | 2 |
Maximálně možné: 2
Spojivky
Zčervenání (podle nejzávažnější změny pozorované na víčkové nebo bulbární spojivce, kromě rohovky a duhovky)
| Normální | 0 |
|---|---|
| Některé krevní cévy hyperemické (překrvené) | 1 |
| Difúzní, rudá barva, jednotlivé cévy nesnadno rozeznatelné | 2 |
| Difúzní temně rudá barva | 3 |
Maximálně možné: 3
Otoky (chemosis)
(týká se víček nebo slzných žláz)
| Normální | 0 |
|---|---|
| Slabě abnormální otok | 1 |
| Patrný otok, s částečným obrácením víček | 2 |
| Otok způsobující uzavření víček zhruba na polovinu | 3 |
| Otok způsobující uzavření víček více než na polovinu | 4 |
Maximálně možné: 4
Tabulka 10
Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých účinků na oči
OBECNÉ ÚVAHY
V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení s pokusnými zvířaty je důležité vyhýbat zbytečnému používání pokusných zvířat a minimalizovat jakékoli zkoušky, které u pokusných zvířat pravděpodobně vyvolají závažné reakce. Veškeré informace týkající se potenciálních leptavých/dráždivých účinků látky na oči by se měly zhodnotit před zvažováním zkoušení in vivo. Může již existovat dostatek důkazů pro klasifikaci zkoušené látky podle jejího potenciálu dráždivých nebo leptavých účinků na oči, aniž by bylo nutné provádět zkoušky na pokusných zvířatech. Proto využití analýzy průkaznosti výsledků a strategie postupného zkoušení sníží potřebu provádět zkoušení in vivo, zejména pokud látka pravděpodobně vyvolá závažné reakce.
Doporučuje se, aby se stávající informace týkající se dráždivých a leptavých účinků látky na oči zhodnotily pomocí analýzy průkaznosti výsledků, na jejímž základě se rozhodne o tom, zda by se k lepší charakteristice tohoto potenciálu měly provést další studie jiné než oční studie in vivo. Jsou-li nutné další studie, doporučuje se využít strategie postupného zkoušení a jejím prostřednictvím získat relevantní experimentální údaje. U látek, které doposud nebyly zkoušeny, by se měla strategie postupného zkoušení využít k získání údajů, které jsou nezbytné k vyhodnocení jejich leptavých nebo dráždivých účinků na oči. Strategie zkoušení popsaná v této tabulce 10 byla vypracována na semináři OECD^7a). Následně byla tato strategie potvrzena a rozpracována v Harmonizovaném integrovaném systému klasifikace nebezpečí chemických látek pro lidské zdraví a jejich vlivu na životní prostředí, který schválilo 28. společné zasedání Výboru pro chemické látky a Pracovní skupiny pro chemické látky v listopadu 1998^7a).
Ačkoliv tato strategie postupného zkoušení není nedílnou součástí zkušební metody B.5, vyjadřuje doporučovaný postup stanovení dráždivých/leptavých účinků na oči. Tento postup představuje nejlepší praktický i etický standard pro zkoušení dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo. Metoda zkoušení poskytuje pokyny pro provádění zkoušky in vivo a shrnuje faktory, kterým je nutno před zvažováním takové zkoušky věnovat pozornost. Strategie postupného zkoušení představuje přístup posuzování existujících údajů o dráždivých a leptavých účincích látek na oči a odstupňovaný přístup k získávání relevantních údajů o látkách, u kterých je nutné provést další studie, nebo u nichž žádné studie nebyly doposud provedeny. Součástí této strategie je provedení nejprve validovaných a uznaných zkoušek in vitro nebo ex vivo a poté za určitých okolností provedení studií dráždivých/leptavých účinků na kůži metodou zkoušení B.4^7a).
POPIS STRATEGIE ZKOUŠENÍ PO KROCÍCH
Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.
Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla.
e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)