Legalize
Legalize / Česká republika / Vyhláška

Vyhláška, kterou se stanoví analytické metody kontroly složení kosmetických prostředků

Typ Vyhláška
Publikace 2005-12-23
Naposledy aktualizováno 2006-01-01
Stav Platný
Zdroj e-Sbírka
článků 2
Historie novel JSON API

%m/m=c1000×p×MW1MW2

kde

p = hmotnost analyzovaného vzorku (7.2.1) v g,
c = koncentrace konzervantu v roztoku vzorku, odečtená z kalibrační křivky, v μg/ml,
MW1 = molekulová hmotnost základní formy přítomného konzervantu,
MW2 = molekulová hmotnost odpovídající soli (viz bod 10).

Pro výrobky obsahující asi 0,1 % (m/m) hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.

Hexamidin C20H26N4O2 354,45
Hexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) C20H26N4O2·2C2H6O4S 606,72
Hexamidin-di-p-hydroxybenzoát C20H26N4O2·2C7H6O3 630,71
Dibromhexamidin C20H24Br2N4O2 512,24
Dibromhexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) C20H24Br2N4O2·2C2H6O4S 764,51
Dibrompropamidin C17H18Br2N4O2 470,18
Dibrompropamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) C17H18Br2N4O2·2C2H6O4S 722,43
Chlorhexidin C22H30Cl2N10 505,45
Chlorhexidin-diacetát C22H30Cl2N10·2C2H4O2 625,56
Chlorhexidin-diglukonát C22H30Cl2N10·2C6H12O7 897,76
Chlorhexidin-dihydrochlorid C22H30Cl2N10·2HCl 578,37

Metoda je použitelná pro kvalitativní a kvantitativní stanovení kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny sorbové, kyseliny salicylové a kyseliny propionové v kosmetických prostředcích. Samostatně jsou popsány postupy kvalitativního stanovení těchto konzervantů, kvantitativního stanovení kyseliny propionové a kvantitativního stanovení kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny salicylové, kyseliny sorbové a kyseliny benzoové.

Množství kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny salicylové, kyseliny sorbové a kyseliny propionové stanovená touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech volných kyselin.

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

Po kyselé/zásadité extrakci konzervantů se extrakt analyzuje chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a reakční chromatografií („derivatizace na desce“). V závislosti na výsledcích se kvalitativní stanovení potvrdí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) nebo, v případě kyseliny propionové, plynovou chromatografií (GC).

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

Připraví se 0,1% (m/V) roztoky (100 mg/100 ml) každého z pěti konzervantů (2.13 až 2.17) v diethyletheru.

0,5% roztok 2-bromo-2'-acetonaftonu (2.12) v acetonitrilu (2.4) (50 mg/10 ml). Tento roztok by měl být připravován každý týden a uchováván v ledničce.

0,3% (m/V) roztok uhličitanu lithného (2.11) ve vodě (300 mg/100 ml). Tento roztok by měl být připravován vždy čerstvý.

Toluen (2.5)/aceton (2.2) (20:0,5, V/V)

Obvyklé laboratorní vybavení

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (3.8) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky 4 mol/l kyseliny chlorovodíkové (2.8) a 40 ml acetonu (2.2). U silně zásaditých prostředků, jako je toaletní mýdlo, by mělo být přidáno 20 kapek 4 mol/l kyseliny chlorovodíkové (2.8). Pomocí indikátorového papírku (3.10) se zkontroluje, zda je pH přibližně 2. Baňka se uzavře a po dobu 1 minuty se silně protřepává.

Je-li nezbytné usnadnit extrakci konzervantů do acetonové fáze, směs se opatrně zahřeje na asi 60 °C, aby se tekutá fáze rozpustila.

Roztok se zchladí na laboratorní teplotu a přefiltruje přes filtrační papír (3.9) do Erlenmeyerovy baňky.

20 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 20 ml vody a promíchá se. pH směsi se upraví přibližně na 10 pomocí 4 mol/l hydroxidu draselného (2.9) za použití indikátorového papírku (3.10).

Přidá se 1 g chloridu vápenatého (2.10) a silně se protřepe. Zfiltruje se přes filtrační papír (3.9) do dělicí nálevky na 250 ml obsahující 75 ml diethyletheru (2.3) a silně se třepe 1 minutu. Vrstvy se nechají oddělit a vodná vrstva se převede do Erlenmeyerovy baňky na 250 ml. Etherová vrstva se zlikviduje. Za použití indikátorového papírku (3.10) se pH vodného roztoku upraví na přibližně 2 okyselením 4 mol/l kyselinou chlorovodíkovou (2.8). Přidá se 10 ml diethyletheru (2.3), baňka se zazátkuje a silně protřepává 1 minutu; vrstvy se nechají oddělit a etherová vrstva se převede do rotační odparky (3.12). Vodná vrstva se zlikviduje.

Etherová vrstva se odpaří téměř do sucha a zbytek se znovu rozpustí v 1 ml diethyletheru (2.3). Roztok se převede do vzorkovací lahvičky (3.11).

Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky (3.4) se do bodů, jejichž počet odpovídá počtu referenčních roztoků a roztoků vzorků, které mají být analyzovány, nanese stříkačkou (3.5) ve stejných odstupech vždy po 3 μl uhličitanu lithného (2.20) a vysuší se v proudu studeného vzduchu.

Chromatografická deska se přenese na topnou desku (3.13) zahřátou na 40 °C, aby se skvrny udržely co nejmenší. Mikrostříkačkou (3.5) se na startovní linii desky nanese vždy 10 μl každého standardního roztoku (2.18) a roztoku vzorku (4.1) přesně do bodů, kam byl nanesen uhličitan lithný.

Nakonec se opět přesně do bodů, kam byly naneseny referenční roztoky/roztoky vzorku a roztok uhličitanu lithného, nanese přibližně 15 μl derivatizačního činidla (2.19) (roztok 2-bromo-2'-acetonaftonu).

Chromatografická deska se zahřívá v sušárně (3.7) 45 minut při 80 °C. Po vychladnutí se deska vyvíjí v komoře (3.2), která byla 15 minut (bez vyložení filtračním papírem) sycena mobilní fází 2.21 (toluen/aceton), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 15 cm (doba vyvíjení je přibližně 80 minut).

Deska se vysuší v proudu studeného vzduchu a získané skvrny se vyhodnotí pod UV světlem (3.3). Pro zesílení fluorescence slabých skvrn může být chromatografická deska ponořena do tekutého parafinu/n-hexanu (2.22).

Pro každou skvrnu se vypočte hodnota Rf.

Hodnoty Rf a chování vzorku pod UV světlem se porovnají s hodnotami a chováním referenčních vzorků.

Učiní se předběžné závěry o přítomnosti a kvalitativním stanovení konzervantů. Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v oddílu B, nebo ukazuje-li se, že je přítomna kyselina propionová, provede se plynová chromatografie popsaná v oddílu C. Získané retenční časy se porovnají s retenčními časy referenčních vzorků.

Výsledky TLC a HPLC nebo GC se zkombinují a konečný důkaz konzervantů vychází z kombinace výsledků.

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY BENZOOVÉ, KYSELINY 4-HYDROXYBENZOOVÉ, KYSELINY SORBOVÉ A KYSELINY SALICYLOVÉ

Vzorek se po okyselení extrahuje směsí ethanolu a vody. Po filtraci se konzervanty stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

Devět dílů ethanolu (2.2) se smíchá s jedním dílem vody (2:1)

Připraví se roztok obsahující 1 g kyseliny 2-methoxybenzoové (2.12) v 500 ml směsi ethanol/voda (2.13).

Do odměrné baňky na 50 ml se naváží asi 0,05 g kyseliny 4-hydroxybenzoové (2.3), 0,2 g kyseliny salicylové (2.4), 0,2 g kyseliny benzoové (2.5) a 0,05 g kyseliny sorbové (2,6) přesně a objem se doplní směsí ethanol/voda (2.13). Roztok se uchovává v ledničce. Roztok je stabilní jeden týden.

Do odměrných baněk na 20 ml se odměří 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 a 0,50 ml zásobního roztoku (2.16). Do každé baňky se přidá 10,00 ml roztoku vnitřního standardu (2.14) a 0,5 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10). Objem se doplní směsí ethanol/voda (2.13). Tyto roztoky musí být připravovány čerstvé.

Obvyklé laboratorní vybavení, které není nijak specifikováno a

Nerezová ocel, délka 12,5 až 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm, plněná Nucleosilem 5C18 nebo ekvivalentní náplní

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml (3.5) se naváží 1 g vzorku. Do baňky se odpipetuje 1,00 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (2.13). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (3.7), zkumavka se uzavře a silně se alespoň 1 minutu protřepává, dokud nevznikne homogenní suspenze. Pro usnadnění extrakce konzervantů do ethanolové fáze se baňka zahřívá přesně 5 minut na vodní lázni (3.1) při 60 °C.

Baňka se ihned ochladí v proudu studené vody a extrakt se na hodinu uloží při 5 °C.

Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (3.4). Asi 2 ml extraktu se převedou do vzorkovací lahvičky (3.6). Extrakt se uchovává při 5 °C a stanovení pomocí HPLC se provede do 24 hodin.

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml (3.5) se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g vzorku (a gramů). Pipetou se přidá 1,00 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10) a 30,0 ml směsi ethanol/voda (2.13). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (3.7) a 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se alespoň 1 minutu protřepává, dokud nevznikne homogenní suspenze. Pro usnadnění extrakce konzervantů do ethanolové fáze se baňka zahřívá přesně 5 minut na vodní lázni (3.1) při 60 °C.

Zkumavka se ihned ochladí v proudu studené vody a extrakt se uloží na hodinu při 5 °C.

Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (3.4). Asi 2 ml extraktu se převedou do vzorkovací lahvičky (3.6). Extrakt se uchovává při 5 °C a stanovení pomocí HPLC se provede do 24 hodin.

Mobilní fáze: acetonitril/acetátový tlumivý roztok (2.15).

Průtok mobilní fáze kolonou se nastaví na 2,0 ± 0,5 ml/min. Vlnová délka detektoru se nastaví na 240 nm.

Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne po 10 μl standardních roztoků konzervantů (2.17). Pro každý roztok se ze získaných chromatogramů stanoví poměr výšky píku vyšetřovaného konzervantu k výšce píku vnitřního standardu získaného z chromatogramů. Sestrojí se graf závislosti poměru výšek píků na koncentraci každého standardního roztoku.

Přesvědčte se, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.

Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne 10 μl extraktu vzorku (4.1.1) a zaznamená se chromatogram. Nastříkne se 10 μl standardního roztoku konzervantu (2.17) a zaznamená se chromatogram. Obdržené chromatogramy se porovnají. Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) žádný pík s přibližně stejným retenčním časem jako pík kyseliny 2-methoxybenzoové (doporučený vnitřní standard), nastříkne se do kapalinového chromatografu 10 μl extraktu vzorku s přidaným vnitřním standardem (4.1.2) a zaznamená se chromatogram.

Je-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) rušivý pík se stejným retenčním časem jako kyselina 2-methoxybenzoová, měl by být vybrán jiný vnitřní standard. (Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.)

Je třeba se ujistit, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.

Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 12);

[image omitted]

Obrázek 12: Rozlišení píků

Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;

— faktor asymetrie As všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 13) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost papíru 2 cm/min.

[image omitted]

Obrázek 13: Faktor asymetrie píku

— Základna musí být stabilní.

Pro výpočet koncentrace konzervantů v roztoku vzorku se použijí poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů a výšky píku kyseliny 2-methoxybenzoové (vnitřní standard) a dále kalibrační graf. Obsah kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny sorbové nebo kyseliny salicylové ve vzorku v hmotnostních procentech (xi) se vypočte pomocí vzorce

xi % m/m = 100·20·b106·a=b500·a

kde

a = hmotnost zkušebního vzorku (4.1.2) (g),
b = koncentrace konzervantu v extraktu vzorku (4.1.2) (μl/ml) odečtená z kalibračního grafu.

Pro výrobky obsahující asi 0,4 % (m/m) kyseliny 4-hydroxybenzoové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,035 %.

Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) kyseliny benzoové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,050 %.

Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) kyseliny salicylové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,045 %.

Pro výrobky obsahující asi 0,6 % (m/m) kyseliny sorbové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,035 %.

C. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY PROPIONOVÉ

Tato metoda je vhodná pro stanovení kyseliny propionové v kosmetických prostředcích až do maximální koncentrace 2 % (m/m).

Koncentrace kyseliny propionové stanovená touto metodou se vyjádří v procentech hmotnosti (% m/m) prostředku.

Po extrakci kyseliny propionové z prostředku se kvantitativní stanovení provede plynovou chromatografií za použití kyseliny 2-methylpropionové jako vnitřního standardu.

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

Do odměrné baňky na 50 ml se naváží 1,00 g (p gramů) kyseliny propionové přesně a doplní se na objem ethanolem (4.1).

Do odměrné baňky na 50 ml se přesně naváží 1,00 g (e gramů) kyseliny 2-methylpropionové a doplní se na objem ethanolem (4.1).

Do skleněné zkumavky (5.3) se naváží asi 1 g vzorku přesně. Přidá se 0,5 ml kyseliny trihydrogenfosforečné(4.4) a 9,5 ml ethanolu (4.1).

Zkumavka se uzavře a silně protřepe. Je-li to nezbytné, umístí se zkumavka na 5 minut na vodní lázeň zahřátou na 60 °C (5.4), aby se zcela rozpustila tuková fáze. Zkumavka se rychle zchladí pod tekoucí vodou. Část roztoku se zfiltruje přes membránový filtr (5.5). Chromatografie filtrátu se provede tentýž den.

Do skleněné zkumavky (5.3) se s přesností na 3 desetinná místa naváží 1 ±0,1 g vzorku. Přidá se 0,5 ml kyseliny trihydrogenfosforečné (4.4), 0,50 ml roztoku vnitřního standardu a 9 ml ethanolu (4.1).

Zkumavka se uzavře a silně protřepe. Je-li to nezbytné, umístí se zkumavka na 5 minut na vodní lázeň zahřátou na 60 °C (5.4), aby se zcela rozpustila tuková fáze. Zkumavka se rychle zchladí pod tekoucí vodou. Část roztoku se zfiltruje přes membránový filtr (5.5). Chromatografie filtrátu se provede tentýž den.

Doporučují se následující provozní podmínky

Kolona
Typ nerezová ocel
Délka 2 m
Průměr 3 mm
Náplň 10% SP™ 1000 (nebo ekvivalentní) + 1% H3PO4 na Chromosorbu WAW 100 - 120 mesh
Teplota
--- ---
Nástřik 200 °C
Kolona 120 °C
Detektor 200 °C
Nosný plyn dusík
Průtoková rychlost 25 ml/min

Do řady odměrných baněk na 20 ml se odpipetuje 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 a 4,00 ml roztoku kyseliny propionové (4.5). Do každé odměrné baňky se odpipetuje 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (4.6); doplní se na objem ethanolem a zamíchá. Takto připravené roztoky obsahují kyselinu 2-methylpropionovou jako vnitřní standard v koncentraci e mg/ml (to znamená 1 mg/ml, je-li e= 1,000) a kyselinu propionovou v koncentraci p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml (to znamená 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 mg/ml, je-li p = 1,000).

Nastříkne se 1 μl těchto roztoků a kalibrační křivka se sestrojí vynesením poměru hmotností kyseliny propionové a kyseliny 2-methylpropionové na osu x a poměru odpovídajících ploch píků na osu y.

Nastříknou se 3 dávky z každého roztoku a vypočte se průměr poměrů ploch píku.

Nastříkne se 1 μl filtrátu vzorku 6.1.1. Chromatogram se porovná s chromatogramem jednoho ze standardních roztoků (6.3.1). Má-li pík přibližně stejný retenční čas jako pík kyseliny 2-methylpropionové, změní se vnitřní standard. Není-li pozorován žádný rušivý vliv, nastříkne se 1 μl filtrátu vzorku 6.1.2 a změří se plochy píku kyseliny propionové a píku vnitřního standardu.

Nastříknou se 3 dávky z každého roztoku a vypočte se průměr poměrů ploch píku.

x%m/m=K0,5·100·e50·a=Kea

kde

K = poměr vypočtený v bodě 7.1,
e = hmotnost vnitřního standardu v g podle bodu 4.6,
a = hmotnost vzorku v g podle bodu 6.1.2.

Výsledky se zaokrouhlí na jedno desetinné místo.

Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) kyseliny propionové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,12 %.

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

V metodě je popsána detekce a kvalitativní stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru (monobenzonu) v kosmetických prostředcích pro zesvětlení kůže.

Kvalitativní stanovení hydrochinonu a jeho etherů se provede chromatografií na tenké vrstvě (TLC).

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

Chloroform/diethylether, 66:33 (V/V)

Následující standardní roztoky se připravují čerstvé a jsou stabilní jeden den.

Upozornění:

Při delším stání se v roztoku tvoří výbušné sloučeniny a měl by být po použití zlikvidován.

Obvyklé laboratorní vybavení, a

Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 3,0 g vzorku. Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). pH roztoku se upraví amoniakem (3.5) na 10. Objem se doplní ethanolem (3.1) na 10 ml. Zkumavka se uzavře zátkou a homogenizuje se 10 minut v ultrazvukové lázni. Zfiltruje se přes filtrační papír nebo se odstředí při 3 000 ot./min.

— dusičnanem stříbrným (3.16.1), nebo

— kyselinou 12-molybdofosforečnou (3.16.2); zahřeje se na asi 120 °C; nebo

— roztokem kyanoželezitanu draselného a roztokem chloridu železitého (3.16.3).

Spočítá se hodnota Rf každé skvrny.

Skvrny získané pro roztok vzorku se porovnají se skvrnami získanými pro standardní roztoky, pokud jde o jejich hodnoty Rf, barvu skvrn v UV světle a barvu skvrn po zviditelnění detekčním činidlem.

Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v následujícím oddílu (B) a porovnají se retenční časy získané pro pík (píky) vzorku s retenčními časy píků referenčních roztoků.

Výsledky z TLC a HPLC se zkombinují s cílem dokázat přítomnost hydrochinonu a/nebo jeho etherů.

Za uvedených podmínek byly pozorovány následující hodnoty Rf:

hydrochinon: 0,32
hydrochinon-monomethylether: 0,53
hydrochinon-monoethylether: 0,55
hydrochinon-monobenzylether: 0,58

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

V metodě je specifikován postup pro stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru v kosmetických prostředcích pro zesvětlení pleti.

Vzorek je extrahován směsí voda/methanol za mírného zahřátí, kterým se rozpustí tukový materiál. Kvantitativní stanovení analytů ve výsledném roztoku se provede kapalinovou chromatografií s obrácenou fází s UV detekcí.

Do odměrné baňky na 50 ml se naváží 0,06 g hydrochinonu (3.3), 0,08 g hydrochinon-monomethyletheru (3.4), 0,10 g hydrochinon-monoethyletheru (3.5) a 0,12 g hydrochinon-monobenzyletheru (3.6). Rozpustí se a doplní se na objem methanolem (3.2). Standardní roztok se připraví zředěním 10,00 ml tohoto roztoku na 50,00 ml směsí voda/methanol (3.8). Tyto roztoky se připravují čerstvé.

Obvyklé laboratorní vybavení

Chromatografická kolona z nerezové oceli, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm, plněná Zorbax fenylem (chemicky vázaným fenethylsilanem na Zorbaxu SIL, uzavřená trimethylchlorsilanem), velikost částic 6 μm, nebo ekvivalentní náplní. Nepoužívá se ochranná kolona, s výjimkou fenylové kolony nebo kolony s ekvivalentní náplní.

Do odměrné baňky na 50 ml se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g (a gramů) vzorku. Vzorek se rozptýlí ve 25 ml směsi voda/methanol (3.8). Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud se nevytvoří homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se umístí do vodní lázně (4.1) nastavené na 60 °C, aby se usnadnila extrakce. Baňka se ochladí a doplní se na objem směsí voda/methanol (3.8). Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (4.4). Kvalitativní stanovení HPLC se provede do 24 hodin od přípravy extraktu.

Nastříkne se 10 μl standardního roztoku (3.10) a zaznamená se chromatogram. Nástřik se provede několikrát, dokud není plocha píku konstantní.

Stanoví se faktor odezvy RFi:

RFi = Pici

kde

pi = plocha píku pro hydrochinon, hydrochinon-monomethylether, hydrochinon- monoethylether nebo hydrochinon- monobenzylether
ci = koncentrace hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon- monoethyletheru nebo hydrochinon-monobenzyletheru v standardním roztoku (3.10) (g/50 ml).

Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 14);

[image omitted]

Obrázek 14: Rozlišení píků

Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;

— faktor asymetrie As všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 15) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.

[image omitted]

Obrázek 15: Faktor asymetrie píku

— Základna musí být stabilní.

Pro výpočet koncentrace analytu (koncentrací analytů) ve vzorku se použijí plochy píků analytů. Koncentrace analytu ve vzorku vyjádřená v hmotnostních procentech (xi) se vypočte pomocí vzorce

xi % m/m = bi·100RFi·a

kde

a = hmotnost vzorku v g,
bi = plocha píku analytu i ve vzorku.

(U některých přístrojů může při vysokých koncentracích hydrochinonu ležet hodnota absorbance mimo lineární rozsah detektoru.)

Výše popsaná metoda umožňuje stanovení hydrochinonu a jeho etherů v jednom izokratickém průběhu. Použití fenylové kolony zajistí dostatečnou retenci hydrochinonu, kterou nelze zajistit při použití kolony C18 s uvedenou mobilní fází.

U této metody však snadno dochází k rušivému vlivu celé řady parabenů. V takovém případě by stanovení mělo být zopakováno s jiným systémem mobilní fáze/stacionární fáze. Vhodné metody lze najít v odkazech:

„Magnesium as modifier for the determination of baryum by flame atomic emission spectrometry“. Jerrow M. et al., Analytical proceedings, 1991, 28, 40.

M. Herpol-Borremans et. M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydro-quinone et de ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986).

Kolona:Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 mm nebo ekvivalentní:

teplota: 36 °C

průtok: 1,5 ml/min

mobilní fáze:

pro hydrochinon: methanol/voda 5/95 (V/V)

pro hydrochinon-monomethylether: methanol/voda 30/70 (V/V)

pro hydrochinon-monobenzylether: methanol/voda 80/20(V/V).

Kolona: Spherisorb S5-ODS nebo ekvivalentní:

mobilní fáze: voda/methanol 90/10 (V/V)

průtok: 1,5 ml/min

Tyto podmínky jsou vhodné pro hydrochinon (J. Firth and I. Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129).

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

V této metodě je specifikován postup chromatografie na tenké vrstvě, který v kombinaci s metodou kvantitativního stanovení, popsanou v oddílu B, umožní identifikaci 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.

Konzervační přísady se extrahují z okyselených vzorků kosmetických prostředků acetonem. Po filtraci se acetonový roztok smíchá s vodou a mastné kyseliny se v alkalickém prostředí vysrážejí jako vápenaté soli. Alkalická směs aceton/voda je extrahována diethyletherem, čímž se odstraní lipofilní látky. Po okyselení se konzervační přísady extrahují diethyletherem. Alikvotní část diethyletherového extraktu se nanese na desku pokrytou tenkou vrstvou silikagelu. Po vyvíjení se získaný chromatogram pozoruje v UV světle a zviditelní se za použití Millonova činidla.

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.

Millonovo činidlo (dusičnan rtuťnatý) je komerčně dostupný roztok (Fluka 69820).

Připraví se 0,1% (m/V) roztoky každé z referenčních látek 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 a 3.17 v methanolu.

Smíchá se 88 dílů n-pentanu (3.4) s 12 díly ledové kyseliny octové (3.6).

Běžné laboratorní vybavení a

Viz poznámka v bodě 5.2.

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (4.8.) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.7) a 40 ml acetonu.

V případě silně zásaditých kosmetických přípravků, jako je toaletní mýdlo, se přidá 20 kapek roztoku kyseliny chlorovodíkové. Baňka se uzavře, směs se zlehka zahřeje na asi 60 °C, aby se usnadnila extrakce konzervačních látek do acetonové fáze, a 1 minutu se silně třepe.

Indikátorovým papírkem se změří pH roztoku a upraví se na hodnotu ≤3 roztokem kyseliny chlorovodíkové. Znovu se 1 minutu silně třepe.

Roztok se ochladí na laboratorní teplotu a zfiltruje se přes filtrační papír do Erlenmeyerovy baňky. 20 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 60 ml vody a promíchá. Hodnota pH směsi se upraví hydroxidem draselným (3.8.) přibližně na 10 za použití indikátorového papírku.

Přidá se 1 g chloridu vápenatého dihydrátu (3.9) a silně se protřepe.

Roztok se zfiltruje přes filtrační papír do dělicí nálevky na 250 ml, která obsahuje 75 ml diethyletheru, a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a vodná fáze se vypustí do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml. Hodnota pH roztoku se upraví roztokem kyseliny chlorovodíkové na přibližně 2 za použití indikátorového papírku. Poté se přidá 10 ml diethyletheru a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a asi 2 ml fáze diethyletheru se převede do vzorkovací lahvičky na 5 ml.

TLC deska se umístí na zahřátou hliníkovou desku (4.9.) Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky se nanese 10 μl každého z referenčních roztoků a 100 μl roztoku vzorku (vzorků) (5.1).

Podle potřeby lze podpořit odpaření rozpouštědla proudem vzduchu. TLC deska se odstraní z topné desky a nechá se vychladnout na laboratorní teplotu. Vyvíjecí komora (4.2) se naplní 100 ml mobilní fází (3.19).

TLC deska se ihned vloží do nenasycené komory a vyvíjí se při laboratorní teplotě, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí asi 15 cm od základní linie. Deska se z vyvíjecí komory vyjme a vysuší v proudu horkého vzduchu pomocí horkovzdušného fénu.

Deska se prohlédne v UV světle (4.3) a pozice skvrn se vyznačí. Deska se zahřívá 30 minut v sušárně (4.5) při 100 °C, aby se odstranila nadbytečná kyselina octová. Konzervační přísady v chromatogramu se zviditelní Millonovým činidlem (3.10) tak, že válečkem (4.7) namočeným do činidla se TLC deska přejede tak, aby byla rovnoměrně navlhčená.

Poznámka: Skvrny lze rovněž zviditelnit opatrným nanesením kapky Millonova činidla na každou skvrnu označenou pod UV světlem.

Estery kyseliny 4-hydroxybenzoové se projeví jako červené skvrny, 2-fenoxyethanol a 1-fenoxypropan-2-ol jako žluté skvrny. Je však třeba dávat pozor na to, že kyselina 4-hydroxybenzoová, která může být přítomná ve vzorcích jako konzervační látka nebo produkt rozkladu parabenů, se sama o sobě projeví jako červená skvrna. Viz 7.3 a 7.4.

Pro každou skvrnu se vypočte hodnota Rf. Skvrny získané z roztoku vzorku se porovnají se skvrnami získanými z referenčních roztoků, pokud jde o jejich hodnoty Rf, jejich chování v UV světle a barvu po zviditelnění. Učiní se předběžné závěry o identitě konzervantů.

Pokud se zdá, že jsou přítomny parabeny, provede se analýza vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) popsanou v oddílu B. Výsledky chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) se zkombinují, aby se potvrdila přítomnost 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu a parabenů.

Sloučenina hRf Barva
Kyselina 4-hydroxybenzoová 11 červená
Methylparaben 12 červená
Ethylparaben 17 červená
Propylparaben 21 červená
Butylparaben 26 červená
Benzylparaben 16 červená
2-fenoxyethanol 29 žlutá
1-fenoxypropan-2-ol 50 žlutá

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

V této metodě je specifikován postup pro stanovení 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.

Množství konzervačních přísad stanovená touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.

Vzorek se okyselí přidáním kyseliny sírové a poté se suspenduje ve směsi ethanolu a vody. Směs se opatrně zahřeje do rozpuštění tukové fáze, aby se zajistila kvantitativní extrakce, a poté se zfiltruje.

Konzervační látky ve filtrátu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s obrácenou fází za použití isopropyl-4-hydroxybenzoátu jako vnitřního standardu.

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.

Smíchá se devět dílů ethanolu (4.2) a jeden díl vody.

Naváží se přibližně 0,25 g isopropylparabenu (4.8) přesně, převede se do odměrné baňky na 500 ml, rozpustí se a doplní se na objem směsí ethanol/voda (4.15).

Smíchá se 5 dílů tetrahydrofuranu, 60 dílů vody, 10 dílů methanolu a 25 dílů acetonitrilu.

Do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží přibližně 0,2 g 2-fenoxyethanolu, 0,2 g 1-fenoxypropan-2-olu, 0,05 g methylparabenu, 0,05 g ethylparabenu, 0,05 g propylparabenu, 0,05 g butylparabenu a 0,025 g benzylparabenu, rozpustí se a doplní se na objem směsí ethanol/voda.

Roztok se uchovává v ledničce a je stabilní 1 týden.

Do odměrných baněk na 50 ml se ze zásobního roztoku (4.18) převede 20,00 ml, 10,00 ml, 5,00 ml, 2,00 ml a 1,00 ml. Do každé baňky se přidá 10,00 ml roztoku vnitřního standardu (4.16) a 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a doplní se na objem směsí ethanol/voda. Tyto roztoky se připravují vždy čerstvé.

Obvyklé laboratorní vybavení a

Nerezová ocel, délka 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm, (nebo délka 12,5 cm a vnitřní průměr 4,6 mm), naplněná Nucleosilem 5C18 nebo ekvivalentním (viz 10.1).

Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se odváží asi 1,0 g vzorku přesně. Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 50,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5), baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1°C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.

Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do ledničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.

Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky. Extrakty se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.

Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se s přesností na tři desetinná místa odváží 1,0 g ± 0,1 g vzorku.

Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5) a přesně 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1°C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.

Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do chladničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.

Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky (zkušební roztok). Extrakt se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.

— Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril (4.17)

— Průtoková rychlost: 1,5 ml/min

— Detekční vlnová délka: 280 nm

Nastříkne se 10 μl každého ze standardních roztoků konzervantů (4.19). Ze získaných chromatogramů se stanoví poměr výšek píků standardních roztoků konzervantů k píku vnitřního standardu. Pro každý konzervant se sestrojí křivka závislosti těchto poměrů na koncentraci standardních roztoků.

Do chromatogafu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku bez vnitřního standardu (6.1.1) a zaznamená se chromatogram.

Nastříkne se 10 μl jednoho ze standardních roztoků konzervantů (4.19) a zaznamená se chromatogram. Získané chromatogramy se porovnají.

Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (6.1.1) přítomen pík s přibližně stejným retenčním časem, jako je retenční čas píku isopropylparabenu (doporučený vnitřní standard), pokračuje se nastříknutím 10 μl roztoku vzorku s vnitřním standardem (6.1.2). Chromatogram se zaznamená a změří se výšky píků.

Je-li v chromatogramu roztoku vzorku rušivý pík s retenčním časem přibližně stejným jako retenční čas isopropylparabenu, měl by být vybrán jiný vnitřní standard.

Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu vzorku přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.

Vypočítají se poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.

Je třeba ověřit, že kalibrační křivka použitého standardu je lineární.

Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

— separace píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice separace píků je uveden na obrázku 16.)

[image omitted]

Obrázek 16: Separace píků

Není-li požadované separace dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona, nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn.

— faktor asymetrie (As) všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 17.) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.

[image omitted]

17: Faktor asymetrie píku

— Základna by měla být stabilní.

Pro výpočet koncentrace konzervantů v roztoku vzorku se použije kalibrační křivka (6.2.2) a hodnoty poměrů výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.

Obsah (wi) 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v hmotnostních procentech (% m/m) se vypočte pomocí vzorce:

% wim/m = bi200×a

kde

bi = koncentrace konzervantu i ve zkušebním roztoku (μg/ml) odečtená z kalibrační křivky, a
a = hmotnost zkušebního vzorku (g).

Viz poznámka v bodě 10.5.

Viz poznámka v bodě 10.5.

Retenční chování rozpouštěných látek při stanoveních HPLC výrazně závisí na typu, značce a historii stacionární fáze. Zda lze kolonu použít pro oddělení vyšetřovaných konzervantů, lze usoudit z výsledků získaných pro standardní roztoky (viz poznámky v bodě 6.2.3). Kromě navrhovaného materiálu náplně kolony byly shledány vhodnými také materiály Hypersil ODS a Zorbax ODS.

Za účelem dosažení požadovaného oddělení lze popřípadě optimalizovat složení mobilní fáze.

Testování robustnosti popisované metody ukázalo, že nepatrná změna detekční vlnové délky může mít významný vliv na výsledky stanovení.

Tento parametr musí být proto během analýzy pečlivě kontrolován.

Za podmínek popsaných v této metodě je eluováno mnoho dalších sloučenin, jako jsou konzervanty a kosmetické přísady. Retenční časy velkého množství konzervantů uvedených v příloze VI směrnice Rady týkající se kosmetických prostředků jsou uvedeny v práci N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schoulen, (1989). Determination of preservatives in cosmetic products II. High-performance liquid chromatographic identification (J, Chromatography 469, 317-398).

Vzorek 2-Fenoxy-ethanol 1-Fenoxy-propan-2-ol Methylparaben Ethylparaben Propylparaben Butylparaben Benzylparaben
Vitaminový krém m 1,124 0,250 0,0628 0,031 0,0906
r 0,016 0,018 0,0035 0,0280 0,0044
R 0,176 0,030 0,0068 0,0111 0,0034
Základní pleťový krém m 1,196 0,266 0,076
r 0,040 0,003 0,002
R 0,147 0,022 0,004
Masážní krém m 0,806 0,180 0,148 0,152
r 0,067 0,034 0,013 0,015
R 0,112 0,078 0,012 0,016

^1) Je vydána na základě a v mezích zákona, jehož obsah umožňuje zapracovat příslušné předpisy Evropských společenství vyhláškou.

^2) První směrnice komise ze dne 22. prosince 1980 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (80/1335/EHS). Druhá směrnice komise ze dne 14. května 1982 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (82/434/EHS). Třetí směrnice komise ze dne 27. září 1983 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (83/514/EHS). Čtvrtá směrnice komise ze dne 11. října 1985 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (85/490/EHS). Směrnice komise ze dne 10. února 1987, kterou se mění první směrnice 80/1335/EHS o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (87/143/EHS). Směrnice komise ze dne 4. dubna 1990, kterou se mění druhá směrnice 82/434/EHS o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (90/207/EHS). Pátá směrnice komise 93/73/EHS ze dne 9. září 1993 o metodách analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků. Šestá směrnice komise 95/32/ES ze dne 7. července 1995 o metodách analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků. Sedmá směrnice komise 96/45/ES ze dne 2. července 1996 o metodách analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků.

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)