Vyhláška, kterou se mění vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

Čl. I

Vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby, se mění takto:

• 1. § 1 včetně poznámky pod čarou č. 1 zní:

㤠1

Předmět úpravy

Tato vyhláška zapracovává příslušné předpisy Evropských společenství^1) a upravuje opatření, která se uplatňují na území České republiky proti šíření Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., původci bakteriální kroužkovitosti bramboru, a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., původci bakteriální hnědé hniloby, aby se

• a) zabránilo výskytu a šíření,

• b) zjistilo místo výskytu a rozsah rozšíření a

• c) při zjištění výskytu se zabránilo jejich šíření a prováděla se ochranná opatření s cílem jejich eradikace.

^1) Směrnice Rady 93/85/EHS ze dne 4. října 1985 o ochraně proti bakteriální kroužkovitosti bramboru. Směrnice Rady 98/57/ES ze dne 20. července 1998 o ochraně proti Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Směrnice Komise 2006/56/ES ze dne 12. června 2006, kterou se mění přílohy směrnice Rady 93/85/EHS. Směrnice Komise 2006/63/ES ze dne 14. července 2006, kterou se mění přílohy II až VII směrnice Rady 98/57/ES.“.

• 1. V § 2 písm. k) bodu 1 se na konci textu bodu 1 doplňují slova „v případě rajčete rostliny, které vyrostly ze stejné partie osiva,“.

• 1. V § 3 odst. 2 písm. a) poznámka pod čarou č. 2 zní:

„^2) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.

• 1. V § 3 odst. 4 písm. a) se slovo „bramboru“ nahrazuje slovem „bramboru^2)“.

• 1. V § 4 odst. 2 poznámka pod čarou č. 3 zní:

„^3) § 31 odst. 2 vyhlášky č. 215/2008 Sb., o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů.“.

• 1. V § 6 odst. 1 se slovo „materiálu“ nahrazuje slovem „materiálu^2),“.

• 1. V § 7 odst. 1 písmeno b) zní:

• „b) partie hostitelských rostlin označená jako pravděpodobně zamořená podle § 5 odst. 1 písm. b) smí být použita pod dohledem rostlinolékařské správy způsobem uvedeným v bodě 2, popřípadě 3 přílohy č. 4, pokud rostlinolékařská správa předem ověří, že neexistuje rozpoznatelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby a že jsou splněny požadavky na zneškodňování odpadů, stanovené v příloze č. 5, v případě průmyslového zpracování této partie, a pokud není tato partie na základě výsledku testování klonově příbuzných partií hostitelských rostlin podle § 6 označena jako zamořená podle § 5 odst. 1 písm. a),“.

• 1. V § 8 odst. 2 písm. a) poznámka pod čarou č. 4 zní:

„^4) § 2 odst. 1 písm. o) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.

• 1. V § 8 odst. 2 písm. c) se za slova „nebo předstupňů,“ vkládají slova „nebo všech partií rozmnožovacího materiálu bramboru určených k množení v následujícím roce,“.

• 1. Příloha č. 1 zní:

„Příloha č. 1 k vyhlášce č. 331/2004 Sb.

A. METODY DIAGNÓZY, DETEKCE A IDENTIFIKACE PŮVODCE KROUŽKOVITOSTI

Předložené postupové diagramy popisují různé postupy, které jsou součástí:

ii) detekce Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vzorcích hlíz bramboru a rostlin bramboru,

iii) identifikace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

OBECNÉ ZÁSADY

Optimalizované protokoly pro různé metody, validovaná činidla a podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku č. 1.

Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a zahrnují použití životaschopných kultur Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jako kontrolních materiálů, je nutné pracovat za vhodných karanténních podmínek s odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek příslušných povolení vydaných rostlinolékařskou správou.

Testovací parametry musí zajistit stálé a reprodukovatelné zjištění úrovní Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jako stanovené prahy vybraných metod.

Zcela nezbytná je příprava pozitivních kontrol.

Testování podle požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení, údržbu a kalibraci zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich uchovávání a všechna opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky, např. oddělení pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být uplatněno standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním a jiným chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.

Podezření z výskytu, jak je uvedeno v § 4 odst. 1, naznačuje pozitivní výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech.

Pokud je první screeningový test (IF nebo PCR/FISH) pozitivní, existuje podezření na infekci původcem kroužkovitosti a musí být proveden druhý screeningový test. Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je podezření z výskytu potvrzeno a musí se pokračovat v testování podle daného schématu. Pokud je druhý screeningový test negativní, pak vzorek není považován za infikovaný původcem kroužkovitosti.

Z toho důvodu je pozitivní IF test podle § 4 odst. 1 definován jako pozitivní výsledek IF testu potvrzený druhým screeningovým testem (PCR/FISH).

Potvrzená přítomnost vyžaduje izolaci a identifikaci čisté kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s potvrzením patogenity.

• 1. Použití postupových diagramů

• 1.1. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti v hlízách bramboru a v rostlinách bramboru vykazujících příznaky bakteriální kroužkovitosti

Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z výskytu nebo typickými příznaky kroužkovitosti. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogenu z infikovaného vodivého pletiva na diagnostickém médiu a v případě pozitivního výsledku identifikaci kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

[image omitted]

(1) Popis příznaků je v oddíle 2.

(2) Vhodné testy jsou: - IF test (oddíl 4), - PCR test (oddíl 6), - FISH test (oddíl 5).

(3) Ačkoli izolace patogena z rostlinného materiálu s typickými příznaky roztíráním suspenzí na média není komplikovaná, kultivace v pokročilých stádiích infekce se nemusí podařit. Saprofytické bakterie, které rostou na infikovaném pletivu, mohou přerůst nebo potlačovat patogena na izolačním médiu. Proto se doporučuje používat neselektivní i selektivní média, nejlépe MTNA (oddíl 8) nebo biotest (oddíl 7).

(4) Popis typické morfologie kolonie je v oddíle 8.

(5) Pokud je izolační zkouška negativní, ale příznaky choroby jsou typické, musí být izolace provedena znovu.

(6) Spolehlivé identifikace čisté kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se dosáhne za použití testů uvedených v oddílu 9.

(7) Zkouška patogenity je popsána v oddíle 10.

• 1.2. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru

Postup testování je určen ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek z nejméně dvou screeningových testů, z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogena, a následně, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pozitivní výsledek pouze jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý.

Screeningové a izolační testy musí umožnit detekční práh 10^3 až 10^4 buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.

[image omitted]

(1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použít i na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.

(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.1.

(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní, je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek považován na negativní. Další testy nejsou nutné.

(4) Test imunofluorescence (IF). Pro vyšetření IF se vždy použije polyklonální protilátka, další monoklonální protilátky umožní větší přesnost (viz oddíl 4).

(5) PCR test. Použijí se vhodná validovaná PCR činidla a protokoly (viz oddíl 6).

(6) FISH test. Použijí se validovaná činidla a protokoly (viz oddíl 5).

(7) Selektivní izolace. Toto může být v mnoha případech vhodná metoda pro přímou izolaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus za použití MTNA média nebo NCP-88 média a ředění resuspendované pelety 1/100. Typické kolonie lze získat během 3-10 dní po rozetření na médium. Kulturu patogena lze následně vyčistit a identifikovat. Pro úplné využití potenciálu test vyžaduje opatrnou přípravu pletiva z pupkové části, aby se omezily sekundární bakterie, které jsou konkurencí Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na médiu a které mohou patogena přerůst. Pokud se kultivační metoda takto nepodaří, musí být izolace provedena z rostlin použitých pro biotest (viz oddíl 8).

(8) Biotest se používá k izolaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus z pelet bramborových extraktů pomocí selektivního obohacení v rostlinách lilku vejcoplodého (Solanum melongena). Test vyžaduje optimální inkubační podmínky stanovené pro tuto metodu. Bakteriální inhibitory Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na MTNA nebo NCP-88 médiu pravděpodobně tento test narušovat nebudou (viz oddíl 7).

(9) Typická morfologie kolonie je popsána v oddílu 8.

(10) Kultivace nebo biotesty mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových testů pozitivní, ale izolační testy negativní, opakují se izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku a v případě potřeby se provede test dalších vzorků.

(11) Spolehlivá identifikace čistých kultur podezřelých na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se dosáhne použitím testů popsaných v oddílu 9.

(12) Test patogenity je popsán v oddílu 10.

• 1.3. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve vzorcích bezpříznakových rostlin bramboru

[image omitted]

(1) Doporučené velikosti vzorků – viz oddíl 3.2.

(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.2.

(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní, je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytné provedení druhého nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek považován za negativní. Další testy nejsou nutné.

(4) Selektivní izolační test a typická morfologie kolonie jsou popsány v oddílu 8.

(5) IF test je popsán v oddílu 4.

(6) PCR test je popsán v oddílu 6.

(7) FISH test je popsán v oddílu 5.

(8) Biotest je popsán v oddílu 7.

(9) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových testů pozitivní, ale izolační testy jsou negativní, opakují se izolační testy a v případě potřeby se provede test dalších vzorků.

(10) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že se jedná o Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, se dosáhne pomocí testů popsaných v oddílu 9.

(11) Test patogenity je popsán v oddílu 10.

• 1. Vizuální vyšetření na přítomnost příznaků kroužkovitosti

• 2.1. Rostliny bramboru

V evropských klimatických podmínkách se příznaky na poli zjistí jen zřídkakdy a často pak až na konci sezóny. Kromě toho jsou příznaky skryté nebo se zamění s příznaky jiných chorob, stáří nebo mechanických poškození. Proto mohou být příznaky při kontrole na poli snadno přehlédnuty. Příznaky vadnutí jsou velmi odlišné od příznaků hnědé hniloby; vadnutí je obvykle pomalé a zpočátku omezené na okraje listů. Mladé infikované listy často i přes infekci nadále rostou, i když růst v infikovaných místech je omezený. Tím vznikají neobvykle tvarované listy. Listy postižené ucpáním vodivých pletiv na spodní části stonku často mají chlorotické, žluté až oranžové mezižeberní partie. Infikované děložní lístky, listy a dokonce stonky mohou eventuálně odumřít. Často jsou listy a hlízy pouze menší. Příležitostně jsou rostliny zakrnělé. Barevné snímky řady příznaků jsou na internetové stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

• 2.2. Hlízy bramboru

Nejranějšími příznaky jsou slabá sklovitost nebo průsvitnost pletiva bez měknutí v okolí cévního systému, zejména blízko pupku. Prstenec svazků cévních na pupkovém konci hlízy může mít nepatrně tmavší zbarvení než obvykle. Prvním dobře identifikovaným příznakem je žlutavé zabarvení prstence cévních svazků a stav, kdy při jemném zmáčknutí hlízy vystupují z cév sloupky sýrovité hmoty. Tento exsudát obsahuje miliony bakterií. Vodivá pletiva mohou zhnědnout a příznaky na hlízách jsou v tomto stádiu podobné příznakům hnědé hniloby způsobené Ralstonia solanacearum. Zpočátku mohou být tyto příznaky omezeny na jednu část prstence, nemusí se vyskytovat jen blízko pupkové části a mohou se postupně šířit na celý prstenec. S postupem infekce dochází k destrukci vodivých pletiv: vnější korová část se může oddělit od vnitřní korové části. V pokročilých stadiích infekce se objevují na povrchu hlízy praskliny, často s červenohnědými okraji. V poslední době se v Evropě objevilo několik případů, kdy střední kůra hnije s prstencem svazků cévních, čímž dochází k druhotnému poškození se vznikem vnitřních dutin a nekrózy. Druhotná houbová nebo bakteriální infekce může příznaky maskovat a může být obtížné, ne-li nemožné, rozlišit pokročilé příznaky kroužkovitosti od jiných hnilob bramboru. Možné jsou i atypické příznaky. Barevné snímky řady příznaků jsou na internetové stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

• 1. Příprava vzorků

• 3.1. Hlízy bramboru

Poznámka:

• Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na 1 test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup však lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dispozici menší množství hlíz.

• Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.

• Níže popsaný bramborový extrakt lze použít také pro zjištění původce hnědé hniloby, Ralstonia solanacearum.

Nepovinné ošetření před přípravou vzorku:

Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné dezinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění možné patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je obzvlášť užitečný v případě, že je ve vzorku příliš zeminy a jestliže se má provádět PCR test nebo přímá izolace.

• 3.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nožem či škrabkou na brambory se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy. Opatrně se vyříznou konické výkrojky vodivého pletiva z pupkových konců brambor. Na minimum se omezí nadbytečná část pletiva nezahrnující cévní svazky. Po odebrání musí být výkrojky z pupkových konců zpracovány do 24 hodin nebo konzervovány při -20 °C po dobu nejdéle dvou týdnů.

Všechny hlízy s podezřelými příznaky bakteriální kroužkovitosti se dají stranou a testují se odděleně.

Pokud jsou při vyříznutí výkrojku z pupkového konce zjištěny příznaky kroužkovitosti, provede se vizuální vyšetření této hlízy po naříznutí hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se nechají korkovatět po dobu 2 dnů při pokojové teplotě a uchovávají se v karanténě při teplotě 4 – 10 °C až do ukončení všech testů. Všechny hlízy ve vzorku se uchovávají podle přílohy č.2.

• 3.1.2. Výkrojky z pupkové části se shromáždí v nepoužitých nádobách na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že jsou nádoby znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě, pokud to není možné, uchovávají se v nádobě bez přidání pufru, v chladu po dobu maximálně 72 hodin nebo při pokojové teplotě maximálně 24 hodin. Schnutí a suberizace výkrojků a růst saprofytů v průběhu skladování může bránit zjištění přítomnosti bakterie způsobující kroužkovitost.

• 3.1.3. Výkrojky z pupkového konce se zpracují jedním z následujících postupů:

• a) výkrojky se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3) a třepají se v rotační třepačce (50-100 ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16-24 hodin chlazené;

nebo

• b) výkrojky se homogenizují s dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3), buď v mixéru nebo rozdrcením v utěsněném jednorázovém maceračním sáčku za použití gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení.

Poznámka:

Při homogenizaci vzorků za použití mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutno učinit bezpečnostní opatření pro zamezení vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakce. Pro každý vzorek musí být použita čerstvě sterilizovaná ostří (nože) a nádoby. Pokud má být použit PCR test, je nutno zamezit přenosu DNA na nádoby nebo mlecí zařízení, doporučuje se drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavky na jedno použití.

• 3.1.4. Dekantuje se supernatant. Pokud je nadměrně zakalený, pročistí se buď pomalým odstředěním (při maximálně 180 g po dobu 10 minut při teplotě 4-10°C) nebo vakuovou filtrací (40-100μm), filtr se omyje přídavkem (10 ml) extrakčního pufru (dodatek 3).

• 3.1.5. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním při 7000 g po dobu 15 minut (nebo 10 000 g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10°C a odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.

• 3.1.6. Resuspenduje se peleta v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 3). Použije se 500 μl pro test na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, 500 μl pro Ralstonia solanacearum a 500 μl pro referenční účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10-25 % (v/v) k 500 μl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se vířením a uloží při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo při teplotě -68 až -86°C (měsíce). Extrakty se během testování uchovávají při teplotě 4-10°C.

Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.

Pokud je nutný transport extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu do 24 až 48 hodin.

• 3.1.7. Je nezbytně nutné, aby se se všemi pozitivními kontrolami a vzorky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus zacházelo odděleně, aby se předešlo kontaminaci. To platí i pro sklíčka na IF testy a všechny testy.

• 3.2. Rostliny bramboru

Poznámka:

Pro zjištění latentních populací Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se doporučuje kontrola kombinovaných vzorků. Postup je vhodný pro kombinované vzorky až 200 částí stonků. (Pokud se provádí podrobné průzkumy, měly by být založeny na statisticky reprezentativním vzorku rostlinné populace, která je předmětem vyšetřování.)

• 3.2.1 Pomocí čistého dezinfikovaného nože nebo zahradnických nůžek se odstraní část o velikosti 1-2 cm ze spodní strany každého stonku přímo nad povrchem země.

Části stonků se krátce dezinfikují etanolem 70 %, okamžitě osuší savým papírem a shromažďují v uzavřené sterilní nádobě.

• 3.2.2. Části stonků se zpracují jedním z následujících postupů:

• a) části se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3) a třepají v rotační třepačce (50-100 ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16-24 hodin chlazené,

nebo

• b) části se okamžitě rozdrtí v pevném maceračním sáčku s přiměřeným množstvím extrakčního pufru (dodatek 3) za použití gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení. Pokud to není možné, skladují se části stonků v chladu maximálně 72 hodin nebo maximálně 24 hodin při pokojové teplotě.

• 3.2.3. Po usazení, které má trvat 15 minut, se dekantuje supernatant.

• 3.2.4 Další purifikace extraktu nebo koncentrace bakteriální frakce obvykle není nutná, ale lze ji dosáhnout filtrací a/nebo odstředěním podle popisu v oddílu 3.1.3.-3.1.6.

• 3.2.5 Čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt se rozdělí na 2 stejné části, Jedna polovina se udržuje během testování při teplotě 4-10 °C a druhá polovina se skladuje s 10-25 % (v/v) sterilního glycerolu při teplotě -16 až -24 °C (týdny) nebo při teplotě -68 až -86 °C (měsíce), pokud je nutné další testování.

• 1. IF test

PRINCIP

Doporučuje se použít IF test jako hlavní screeningový test, protože byla prokázána jeho schopnost dosáhnout požadovaných prahů.

Použije-li se jako hlavní screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, musí být jako druhý screeningový test proveden test PCR nebo FISH. Jestliže se test IF použije jako druhý screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, je pro dokončení analýzy nutné další testování podle postupového diagramu.

Poznámka:

Pokud je IF test používán jako hlavní vyšetřovací test, používá se vždy polyklonální protilátka. V případě pozitivního výsledku IF testu s polyklonální protilátkou může být další vyšetření vzorku s monoklonální protilátkou přesnější, ale méně citlivé.

Používají se protilátky proti známému kmenu původce kroužkovitosti - ATCC33113 (NCPPB 2137) nebo NCPPB 2140. Doporučuje se určovat titr pro každou novou řadu protilátek. Titr je stanoven jako nejvyšší ředění, při kterém dochází k optimální reakci při testování suspenze obsahující 105 až 106 buněk na 1 ml homologického kmene původce kroužkovitosti a při použití vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Nezpracované polyklonální nebo monoklonální protilátky by měly mít IF titr alespoň 1:2000. Během testu by se měly protilátky používat v pracovním ředění (WD) v blízkosti titru nebo na titru. Používají se validované protilátky (viz internetovou stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Test se provádí na čerstvě připravených vzorkových extraktech. V případě potřeby může být úspěšně proveden na extraktech skladovaných při - 68 až - 86 °C v glycerolu. Glycerol lze ze vzorku odstranit přidáním 1 ml peletového pufru (dodatek 4), opětovným odstředěním po dobu 15 minut při 7 000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. To často není nutné, zejména pokud jsou sklíčka se vzorky fixována plamenem (viz 4.2).

Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo s jiným srovnávacím kmenem původce kroužkovitosti, suspendovaným ve výluhu z brambor podle dodatku 2 a nepovinně v pufru.

Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě -16 až -24 °C) by se mělo podle možnosti použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.

Jako negativní kontroly se použijí alikvotní části vzorkových extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, nejlépe s 10 okénky o průměru nejméně 6 mm.

Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako test vzorků.

• 4.1. Sklíčka na test se připraví jedním z následujících postupů:

• a) Pro pelety s relativně nízkým množstvím škrobového sedimentu:

Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 μl – pro větší okénka objem vyšší) roztoku resuspendované bramborové pelety 1/100 do prvního okénka. Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 1.

• b) Pro jiné pelety:

Připraví se desetinná ředění (1/10 a 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 μl – pro větší okénka objem vyšší) resuspendované pelety 1/100 a každého roztoku do řady okének. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 2.

• 4.2. Vysuší se kapky při pokojové teplotě nebo zahřátím na teplotu 40 až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15 minut při teplotě 60 °C), nad plamenem nebo pomocí 95 % etanolu nebo podle zvláštních pokynů dodavatelů protilátek.

V případě potřeby lze potom fixovaná sklíčka před dalším použitím skladovat zmrazená v suchém boxu po co možná nejkratší dobu (maximálně 3 měsíce).

• 4.3. Postup IF testu:

• a) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. a):

Připraví se sada dvojnásobných roztoků protilátky v IF pufru. V první jamce by měl být titr ½ (T/2), v ostatních titr ¼ (T/4), titr ½ (T/2), titr (T) a dvojnásobný titr (2T).

• b) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. b):

Připraví se pracovní ředění (WD) protilátky v IF pufru. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.

Obrázek 1: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1. písm. a) a oddílu 4.3. písm. a)

[image omitted]

Obrázek 2: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1. písm. b) a oddílu 4.3 b)

[image omitted]

• 4.3.1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený papír. Každé testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.

Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:

• 4.3.2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).

• 4.3.3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 3) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci, a pečlivě odstranit přebytečnou vlhkost jemným osušením.

• 4.3.4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.

• 4.3.5. Zakrytá sklíčka se inkubují na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).

• 4.3.6. Kapky konjugátu se setřesou ze sklíček a tato se opláchnou a umyjí jako předtím (4.3.3.).

Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.

• 4.3.7. Napipetuje se 5-10 μl 0,1M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 3) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží krycí sklíčko.

• 4.4. Vyhodnocení IF testu

• 4.4.1. Testovací sklíčka se prohlížejí epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při zvětšení 500x až 1000x. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu.

Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (oddíl 4).

• 4.4.2. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v testovacích okénkách sklíčka (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. Intenzita fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu.

Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

• 4.4.3. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

• 4.4.4. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 4.3.

• 4.4.5. Interpretace výsledku IF testu:

• a) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopickém poli a vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4).

Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně 5x10^3. Vzorek je považován na potenciálně infikovaný a je povinné další testování.

• b) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než 5x10^3 buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.

• 1. Test FISH

PRINCIP

Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Když se FISH test provede jako druhý screeningový test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.

Poznámka:

Používají se validované oligosondy specifické pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 10^3-10^4 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě -16 až -24 nebo -68 až -86 °C.

Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s negativním výsledkem.

Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 10^5 až 10^6 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na ml (např. kmen NCPPB 4053 nebo PD 406) v 0,01 M fosfátového pufru (PB) z 3-5 denní kultury (příprava viz dodatek 2). Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmene nebo jiného referenčního kmene Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus suspendovaného v bramborovém extraktu podle dodatku 2.

Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.

Test kontrolního materiálu se provádí stejným způsobem jako u vzorků.

• 5.1. Fixace bramborového extraktu

• 5.1.1. Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7)

• 5.1.2. Napipetuje se 100 μl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďujte po dobu 8 minut na 7 000 g.

• 5.1.3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta v 500 μl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje se přes noc při teplotě 4 °C.

Alternativním fixačním činidlem je 96 % etanol. Pro jeho použití se rozpustí peleta z kroku 5.1.2. v 50 μl 0,01 M PB a 50 μl 96 % etanolu. Promíchá se protřepáním a inkubuje se při teplotě 4 °C po dobu 30-60 minut.

• 5.1.4. Odstřeďuje se po dobu 8 minut na 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 μl 0,01 M PB (viz dodatek 3).

• 5.1.5. Kápne se 16 μl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 3, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 μl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49μl) může být uložen při teplotě -20 °C po přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním, přidá se stejné množství 0,01 M PB a zamíchá se protřepáním.

Obrázek 3. Rozmístění na sklíčku FISH

[image omitted]

• 5.1.6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo sušičkou sklíček při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.

V této fázi je možnost postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.

• 5.2. Předhybridizace a hybridizace

• 5.2.1. Připraví se roztok lyzozymu obsahující 10 mg lyzozymu (Sigma L-6876) v 10 ml pufru (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Tento roztok lze skladovat, ale měl by se pouze jednou zmrazit a nechat roztát. Každý vzorek se dobře pokryje přibližně 50 μl roztoku lyzozymu a inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Potom se ponoří sklíčka do demineralizované vody, pouze jednou, a osuší filtračním papírem.

Alternativně se přidá místo lyzozymu 50 μl proteinázy K 40-400 μg.ml^-1 v pufru (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) do každé jamky a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

• 5.2.2. Buňky se suší ve stupňovaných sériích 50 %, 80 % a 96 % etanolu pokaždé po dobu 1 minuty. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu v držáku sklíček.

• 5.2.3. Připraví se vlhká inkubační komora zakrytím dna vzduchotěsné krabice tkaninou nebo filtračním papírem namočeným v 1x hybmixu (dodatek 7). Krabice se přeinkubuje v hybridizační peci při teplotě 55 °C po dobu alespoň 10 minut.

• 5.2.4. Připraví se hybridizační roztok (dodatek 7) s 45 μl na 1 sklíčko a předinkubuje se po dobu 5 minut při teplotě 55 °C.

• 5.2.5. Sklíčka se umístí na horkou plotnu při teplotě 45 °C a do každého ze 4 okének na sklíčku / sklíčcích se přidá 10 μl hybridizačního roztoku.

• 5.2.6. Každé sklíčko se přikryje 2 krycími sklíčky (24 x 24 mm) tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předehřáté vlhké komory a hybridizuje se 14 – 18 h v peci při teplotě 55 °C v temnu.

• 5.2.7. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l sterilní vody (Ultra pure water = UPW), 1 l 1x hybmixu (334 ml 3x hybmix a 666 ml UPW) a 1 l ½ x hybmixu (167 ml 3x hybmix a 833 ml UPW). Každá z nich se přeinkubuje ve vodní lázni při teplotě 55 °C.

• 5.2.8. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku sklíček.

• 5.2.9. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1x hybmixem při teplotě 55 °C.

• 5.2.10. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku ½ hybmix a nechá se inkubovat dalších 15 minut.

• 5.2.11. Sklíčka se ponoří krátce do UPW a položí na filtrační papír. Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním papírem. Napipetuje se 5-10 μl krycího roztoku (např. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každé jamky a celé sklíčko se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 x 60 mm).

• 5.3. Hodnocení FISH testu

• 5.3.1. Sklíčka se prohlížejí ihned s mikroskopem vhodným pro epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630x nebo 1 000x pod olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou eubakteriální buňky (včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává se buněčná morfologie s morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (oddíl 9.4) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlíží se okénka napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí mikroskopu.

• 5.3.2. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v okénkách testovacích sklíček (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. Intenzita fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.

• 5.3.3. Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

• 5.3.4. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost FISH testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ačkoli mnohem méně často než u IF testu.

• 5.3.5. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií, viz 5.3.2.

• 5.3.6. Interpretace výsledku testu FISH:

• a) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a při použití rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadne se průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopickém poli a vypočítá počet typických buněk v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň 5 x 10^3 typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za pravděpodobně infikované Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než 5 x 10^3 typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za negativní.

• b) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.

• 1. PCR test

PRINCIP

Použije-li se PCR test jako hlavní screeningový test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Pokud se PCR test používá jako druhý screeningový test a je pozitivní, je pro dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.

Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.

Poznámka:

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10^3 až 10^4 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na 1 ml přidaných do vzorku extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem. Pro dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích mohou být vyžadovány optimalizační pokusy.

Používají se validovaná PCR činidla a protokoly. Přednostně se používá metoda s interní kontrolou.

Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření, aby se zabránilo kontaminaci vzorku cílovou DNA. PCR test by měli provádět zkušení laboranti v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.

S negativními kontrolami (u průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.

PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:

• extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s negativním výsledkem,

• kontroly pufru používaného pro extrakci bakterie a DNA ze vzorku,

• reakční směs PCR.

Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:

• alikvotní části resuspendovaných pelet, k nimž byl přidán Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (příprava viz dodatek 2),

• suspenze 10^6 buněk na 1 ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 2140 nebo NCPPB 4053),

• pokud možno použít při provádění PCR testu také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.

Aby se zabránilo možné kontaminaci, připraví se pozitivní kontroly v odděleném prostředí od vzorků, které budou testovány.

Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.

• 6.1 Metody purifikace DNA

Použijí se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky.

Připraví se kontrolní materiál stejným způsobem jako vzorky.

K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymatických reakcí a koncentrující cílovou DNA v extraktu vzorku.

Následující metoda byla optimalizována pro použití s validovanou metodou PCR, uvedenou v dodatku 6.

• 6.1.a) Metoda podle Pastrika (2000)

• 1. Napipetuje se 220 μl lýzového pufru (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do mikrozkumavky o objemu 1,5 ml.

• 1. Přidá se 100 μl extraktu ze vzorku a umístí se do termobloku nebo vodní lázně o teplotě 95 °C na dobu 10 minut.

• 1. Mikrozkumavka se vloží na 5 minut do ledu.

• 1. Přidá se 80 μl zásobního roztoku lyzozymu (50 mg lyzozymu na 1 ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

• 1. Přidá se 220 μl Easy DNA ^® roztok A (Invitrogen), dobře se promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.

• 1. Přidá se 100 μl Easy DNA ^® roztok B (Invitrogen)a silně se promíchá třepáním, až usazenina sama poteče do mikrozkumavky a vzorek začne být stejnoměrně viskózní.

• 1. Přidá se 500 μl chloroformu a míchá se třepáním, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.

• 1. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C pro oddělení fází a vytvoření mezifáze.

• 1. Přenese se horní fáze do čisté mikrozkumavky.

• 1. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (-20 °C), krátce se promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 minut.

• 1. Odstředí se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C a odstraní se z pelety etanol.

• 1. Přidá se 500 μl 80 % etanolu (-20 °C) a promíchá převracením mikrozkumavky.

• 1. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 10 minut při 4°C, peleta se zachová a odstraní etanol.

• 1. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA speed vac.

• 1. Peleta se resuspendujte v 100 μl sterilní vody (UPW) a nechá stát nejméně 20 minut při pokojové teplotě.

• 1. Skladuje se při teplotě -20 °C až do upotřebení při PCR.

• 1. Jakákoliv bílá usazenina se odstraní odstředěním a pro PCR se použije 5 μl supernatantu obsahujícího DNA.

• 6.1.b) Jiné metody

Jiné metody extrakce DNA by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10^3 až 10^4 patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.

• 6.2 PCR

• 6.2.1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle validovaného protokolu (dodatek 6). Připraví se jeden desetinný roztok vzorku DNA (1:10 ve sterilní vodě).

• 6.2.2. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, kde nehrozí kontaminace, podle zveřejněného protokolu (dodatek 6). Validovaný protokol PCR je multiplexová reakce, která zahrnuje také interní kontrolu PCR.

• 6.2.3. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 μl extraktu DNA na 25 μl PCR reakce.

• 6.2.4. Zahrne se negativní kontrolní vzorek obsahující pouze reakční směs PCR a přidá se stejná sterilní voda UPW, která byla použita do směsi PCR namísto vzorku.

• 6.2.5. PCR mikrozkumavky se umístí do stejného termocykleru, který byl použit při počátečním testování a provede se vhodně optimalizovaný program PCR (dodatek 6)

• 6.3. Analýza produktu PCR

• 6.3.1. Rozdělí se amplikony PCR elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 μl amplifikované reakční směsi DNA z každého vzorku smíchané s 3 μl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Trisacetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V na cm. Použije se vhodný marker DNA, např. 100 bp ladder.

• 6.3.2. Detekují se proužky DNA barvením v ethidium bromidu (0,5 mg na l) po dobu 30-45 minut, za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.

• 6.3.3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky, např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.

• 6.3.4. U všech nových nálezů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a době s vhodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Rozdělí se naštěpené fragmenty elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčního fragmentu pod UV prosvícením po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.

Interpretace výsledku PCR testu:

PCR test je negativní, pokud amplikon typický pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti nebyl zjištěn v daném vzorku, ale byl zjištěn ve všech pozitivních kontrolních vzorcích (v případě vícenásobné PCR s rostlinnými interními kontrolními primery: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován s daným vzorkem).

PCR test je pozitivní, pokud byl zjištěn amplikon typický pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti a vzoru (pokud se požaduje), za předpokladu, že nebyl amplifikován žádným z negativních kontrolních vzorků. Spolehlivého potvrzení pozitivního výsledku lze dosáhnout také opakováním testu s druhou sadou PCR primerů (oddíl 9.3).

Poznámka:

Lze mít podezření na inhibici PCR, pokud byl očekávaný amplikon získán z pozitivního kontrolního vzorku obsahujícího Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vodě, ale z pozitivní kontroly s Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v bramborovém extraktu byly negativní. Ve vícenásobných protokolech PCR s interními kontrolami PCR i inhibici reakce došlo, pokud nebyl získán žádný z obou amplikonů.

Lze mít podezření na kontaminaci, pokud byl očekávaný amplikon získán z jedné nebo více negativních zkoušek.

• 1. Test na lilku vejcoplodém

Poznámka:

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10^3 až 10^4 jednotek Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus tvořících kolonie na 1 ml přidaný k extraktům ze vzorku, které byly testovány s negativním (příprava viz. dodatek 2)

Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a optimálních růstových podmínkách. Metodu však lze úspěšně použít i na extrakty, které byly uchovávány v glycerolu při teplotě -68 až -86 °C.

Některé odrůdy lilku vejcoplodého poskytují vynikající selektivní obohacující médium pro růst Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus dokonce v případě nepřítomnosti příznaků a poskytují také vynikající základní konfirmační test.

Pro omezení nebezpečí falešně negativních výsledků by měly být vytvořeny optimální růstové podmínky.

Podrobnosti o pěstování jsou uvedeny v Dodatku 8.

• 7.1. Peleta podle 3.1.5. se rozdělí mezi rostliny lilku jednou z níže uvedených metod (7.2, 7.3, 7.4). Používají se pouze rostliny ve fázi 2-3 listů do úplného rozvinutí třetího pravého listu. Aby se zajistilo úplné využití resuspendované pelety i efektivní inokulaci, bude pro níže uvedené postupy potřeba 15-25 lilků na vzorek.

• 7.2. Inokulace zářezem I

• 7.2.1. Každý květináč se horizontálně podepře (pro květináče o průměru 10 cm je vhodný blok pěnového polystyrénu s vyhloubenou částí o rozměrech 5 cm hloubky, 10 cm šířky a 15 cm délky). Pro každý testovaný vzorek se mezi stonek a blok umístí proužek sterilní hliníkové fólie. Rostlinu je možno fixovat na místě gumovým páskem kolem bloku.

• 7.2.2. Pomocí skalpelu se provede mezi děložními lístky a prvním pravým listem podélný nebo mírně úhlopříčný řez dlouhý 0,5 až 1,0 cm a hluboký přibližně jako tři čtvrtiny průměru stonku.

• 7.2.3. Zářez se přidrží otevřený pomocí špičky čepele skalpelu a nanese se do něj inokulum štětečkem na oční linky nebo jemným malířským štětečkem namočeným do pelety. Zbytek pelety se rozdělí mezi všechny testovací rostliny lilku.

• 7.2.4. Řez se překryje sterilní vazelínou aplikovanou injekční stříkačkou o objemu 2 ml.

• 7.3 Inokulace zářezem II

• 7.3.1. Na stonek rostliny držené dvěma prsty se napipetuje mezi děložní lístky a první pravý list kapka (přibližně 5 až 10 μl) suspendované pelety.

• 7.3.2. Pomocí sterilního skalpelu se udělá sešikmený zářez (v úhlu přibližně 5°), dlouhý 1,0 cm a hluboký přibližně jako 2/3 tloušťky stonku, přičemž s řezem se začne v místě kapky suspendované pelety.

• 7.3.3. Řez se zakryje sterilní vazelínou z injekční stříkačky.

• 7.4. Inokulace injekční stříkačkou

• 7.4.1 Pro snížení vnitřního napětí buněk (turgoru) se rostliny lilku den před inokulací nezalévají.

• 7.4.2 Stonky lilku vejcoplodého se inokulují těsně nad děložními lístky pomocí injekční stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23 G). Peleta se rozdělí mezi testovací rostliny lilku vejcoplodého.

• 7.5. Jako pozitivní kontrola se inokuluje 5 rostlin stejnou inokulační metodou (7.2, 7.3 nebo 7.4) vodní suspenzí 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml známé kultury původce kroužkovitosti a kde je to možné i pletivem z přirozeně infikovaných hlíz bramboru.

• 7.6. Jako negativní kontrola se inokuluje 5 rostlin sterilním 0,05 M PBS stejnou inokulační metodou (7.2, 7.3 nebo 7.4).

• 7.7. Po inokulaci se rostliny nechají inkubovat v karanténě ve vhodných podmínkách (dodatek 8) po dobu až 4 týdnů při teplotě 18-24°C. Rostliny se inkubují za dostatečného osvětlení a vysoké vlhkosti (70-80%) a zalévají se tak, aby nedošlo k nasávání vody nebo vadnutí kvůli nedostatku vody. Buňky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus odumírají při teplotách nad 30°C a optimální teplota je 21°C. Aby se zamezilo kontaminaci, inkubují se rostliny pro pozitivní a negativní kontroly ve skleníku nebo růstové komoře na jasně oddělených policích, anebo při nedostatku místa se zajistí přísné oddělení mezi zacházení s nimi. Pokud musí být rostliny pro různé vzorky inkubovány blízko sebe, oddělí se vhodnými přepážkami. Při hnojení, zalévání, kontrole a jiné manipulaci se věnuje maximální pozornost tomu, aby nedošlo ke kontaminaci. Je nezbytné, aby skleníky i růstové komory byly chráněny před veškerým hmyzem, protože by mohl přenášet bakterie z jednoho vzorku na druhý.

• 7.8. Pravidelně po osmi dnech se spočítají rostliny vykazující příznaky. Původce kroužkovitosti působí u lilku vejcoplodého vadnutí listů, které může začít jako okrajová nebo mezižilková ochablost (ztráta turgoru). Zvadlé pletivo může zprvu být tmavozelené nebo strakaté, ale před znekrotizováním zesvětlí. Povadlá místa mezi žilnatinou mívají často mastně vodnatý vzhled. Nekrotická pletiva mívají často jasně žlutý okraj. Rostliny vždy neodumírají; čím déle trvá období do objevení se příznaků, tím je větší naděje na přežití. Rostliny mohou infekci odrůst. Mladé rostliny lilku vejcoplodého jsou mnohem citlivější vůči nízkým koncentracím původce kroužkovitosti než starší rostliny, proto je nezbytné používat rostliny ve fázi tří listů a nebo krátce před ní. Vadnutí mohou také způsobovat populace jiných bakterií nebo hub přítomných v peletě z pletiv hlízy. Patří k nim Erwinia carotovora subsp. carotovora a E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, jakož i velké koncentrace saprofytických bakterií. Tyto případy vadnutí lze odlišit od případů způsobených původcem kroužkovitosti, jelikož rychle vadnou celé listy nebo celé rostliny. Může se také připravit Gramovo barvení: tento test rozliší Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus od Erwinia spp

• 7.9. Jakmile se na lilku vejcoplodém objeví příznaky, měla by být provedena izolace za použití částí pletiva zvadlých listů nebo stonků rostlin. Povrch listů a stonků lilku vejcoplodého se vydezinfikuje otřením 70 % etanolem. Provede se test IF nebo PCR na šťávě z lilku a izoluje se na vhodném (selektivním) médiu (viz oddíl 8). Může se také připravit Gramovo barvení (dodatek 9). Čisté kultury podezřelé z přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují a potvrdí se patogenita (viz oddíl 9 a 10).

• 7.10. Za určitých okolností, zejména pokud nejsou růstové podmínky optimální, se může stát, že Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus zůstává v rostlinách lilku vejcoplodého jako latentní infekce dokonce i po uplynutí inkubační doby až 4 týdnů. Pokud nejsou po 4 týdnech pozorovány žádné příznaky, provede se test IF/PCR na složeném vzorku částí stonků o délce 1 cm z každé testované rostliny odebraných nad místem inokulace. Pokud je test pozitivní, měla by být provedena izolace na vhodných (selektivních) médiích postupem podle oddílu 8. Čisté kultury podezřelé z přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují a potvrdí se patogenita (viz oddíl 9 a 10).

• 1. Izolace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

Diagnóza může být potvrzena pouze tehdy, je-li původce kroužkovitosti izolován a takto identifikován. Ačkoliv je původce kroužkovitosti náročným organismem, je možno ho izolovat z pletiv projevujících příznaky napadení.

Mohou jej však přerůst rychle rostoucí saprofytické bakterie, a proto se nedoporučuje provádět izolaci přímo z pelety pletiva hlízy (3.1.5) nebo stonku (3.2). Přímá izolace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus je možná za použití selektivního média a vhodného ředění resuspendované pelety z pupkové části hlízy nebo ze stonků rostliny.

Izolace se provádí ze všech hlíz bramboru nebo částí stonku a z rostlin lilku vejcoplodého, které nevykazují příznaky napadení, ale u nichž byl pozitivní výsledek v testu IF/PCR složených vzorků (viz oddíl 7.9). Pokud je třeba provést maceraci stonků lilku, měla by být provedena podle oddílu 3.1.2.

Jako pozitivní kontroly se připraví desetinná ředění suspenze 10^6 cfu na ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (např. NCPPB 4053 nebo PD 406). Aby se vyloučilo nebezpečí kontaminace, připraví se pozitivní kontroly odděleně od vzorků, které mají být testovány.

Pro každou nově připravenou dávku selektivního média by se měla před použitím k testování obvyklých vzorků přezkoušet jeho vhodnost pro růst patogenu.

Kontrolní materiál se testuje stejným způsobem jako vzorky.

• 8.1. Roztěr na selektivní médium

• 8.1.1. Ze 100 μl alikvotní části ze vzorku resuspendované bramborové pelety nebo šťávy z lilku vejcoplodého se připraví desetinásobné ředění v peletovém pufru (dodatek 3).

• 8.1.2. Izolace z neředěné bramborové pelety se obvykle nepodaří kvůli náročným růstovým podmínkám Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a konkurenci saprofytů. Vzhledem k tomu, že bakterie je obvykle v infikovaných pletivech přítomná ve vysokých koncentracích, lze saprofyty obvykle vypláchnout ředěním, zatímco patogen zůstává. Proto se doporučuje rozetřít 100 μl z každého vzorku, v ředění1/100 až 1/10 000 na MTNA médium nebo NCP-88 médium (dodatek 5), za použití pomůcek určených k roztěrům (hokejek) a techniky roztěrů.

• 8.1.3. Desky se inkubují v temnu při teplotě 21-23°C.

• 8.1.4. Počáteční kontrola misek zahrnuje porovnání s kontrolními miskami a počítání všech kolonií podobných Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se provádějí po třech dnech, s dalším počítáním po 5,7 a 10 dnech.

• 8.2. Čištění podezřelých kolonií

Poznámka:

Subkultury kolonií podobných Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus pro inokulaci lilku vejcoplodého a/nebo následnou identifikaci by se měly pěstovat na YGM médiu; inokulace a identifikace by se měly provést dříve, než jsou média příliš přerostlá, tj. nejlépe po 3-5 dnech.

• 8.2.1. Kolonie podobné Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se rozetřou na jedno z následujících médií (složení uvedena v dodatku 5):

• živný dextrózový agar (pouze pro subkultury),

• kvasničný pepton glukosový agar,

• agar z kvasničného extraktu s minerálními solemi.

Inkubace probíhá při teplotě 21-24 °C po dobu maximálně 10 dní.

Původce kroužkovitosti roste pomalu a obvykle vytváří kolonie velikosti špendlíkové hlavičky, vyklenuté, smetanově zbarvené.

• 8.2.2. Opětovně se provede roztěr pro zaručení čistoty. U subkultur se rychlost růstu zlepšuje. Typické kolonie jsou smetanově bílé nebo barvy slonoviny, někdy žluté, okrouhlé, hladké, vyvýšené, konvexně vyklenuté, slizovitě tekuté, s rovnými okraji a obvykle mají v průměru 1 – 3 mm.

Jednoduché Gramovo barvení (dodatek 9) může pomoci vybrat kolonie pro další testování.

• 8.2.3 Podezřelé kultury se identifikují (viz oddíl 9) a provede se zkouška patogenity (viz oddíl 10).

• 1. Identifikace

Čisté kultury pravděpodobné izolované kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují za použití nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.

V případě potřeby se zahrne pro každý provedený test známý referenční kmen.

• 9.1. Nutriční a enzymatické identifikační testy

Zjišťují se následující fenotypické vlastnosti. Veškerá média by se měla inkubovat při 21 °C a po šesti dnech by měla být vyhodnocena. Pokud nedošlo k žádnému růstu, inkubuje se po dobu nejvýše 20 dní.

Všechny testy musí zahrnovat kontrolu se známým kmenem Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Nutriční a fyziologické testy se musí provádět za použití inokula ze subkultur živného agaru. Morfologická srovnání se musí provádět z kultur z živného dextrózového agaru.

Test	Očekávaný výsledek
Oxidačně-fermentační (O/F)	inertní nebo slabě oxidační
Aktivita oxidázy	-
Aktivita katalázy	+
Redukce nitrátů	-
Aktivita ureázy	-
Tvorba H2S	-
Tvorba indolu	-
Využívání citrátu	-
Hydrolýza škrobu	- nebo slabá
Růst při 37 °C	-
Růst v 7% NaCl	-
Hydrolýza želatiny	-
Hydrolýza eskulinu	+
Tvorba kyseliny z:
- glycerolu	-
- laktózy	- nebo slabá
- rhamnózy	-
- salicinu	-
Gramovo barvení (dodatek 9)

• 9.2. IF test

• a) Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk/ml v pufru na IF (dodatek 3).

• b) Připraví se série dvojnásobného ředění vhodného antiséra.

• c) Provede se IF postup (oddíl 4).

• d) Pozitivního výsledku IF testu je dosaženo, jestliže IF titr kultury odpovídá titru pozitivní kontroly.

• 9.3. PCR test

• a) Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na ml ve sterilní vodě (UPW)

• b) Zahřívá se 100 μl suspenze buněk v uzavřených mikrozkumavkách v ohřívacím bloku nebo vřící vodní lázni při teplotě 100 °C po dobu 4 minut. V případě potřeby se může lýza buněk podpořit přidáním čerstvě připraveného NaOH do konečné koncentrace 0,05 M. Vzorky lze potom uložit při teplotě -16 až -24 °C až do použití.

• c) Pro amplifikaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus specifických amplikonů se použijí vhodné postupy PCR (např. Pastrik, 2000; viz dodatek 4; Li a de Boer, 1995; Mills a kol., 1997; Pastrik a Rainey, 1999; Schaad a kol., 1999).

• d) Identifikace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus je pozitivní, pokud jsou amplikony PCR stejné velikosti a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentu jako pozitivní kontrolní kmen.

• 9.4. FISH test

• a) Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na ml v UPW.

• b) Provede se postup FISH (oddíl 5)

• c) Test FISH je pozitivní, jsou-li dosaženy stejné reakce kultury a pozitivní kontroly.

• 9.5. Analýza mastných kyselin (FAP)

• a) Kultura se pěstuje na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) po dobu 72 hodin při teplotě 21 °C (+/- 1°C).

• b) Použije se vhodný postup FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

• c) Test FAP je pozitivní, pokud je profil podezřelé kultury identický s profilem pozitivní kontroly. Přítomnost charakteristických mastných kyselin 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 a 17:0 Anteiso jasně svědčí o přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Jiné rody jako Curtobacterium, Arthrobacter a Micrococcus také obsahují některé z těchto kyselin, ale 15:1 Anteiso A je pro tyto bakterie neobvyklá kyselina, která se však vyskytuje ve všech Clavibacter spp. v rozmezí 1-5 %. U Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se hodnota obvykle pohybuje kolem 5 %.

• 9.6. BOX-PCR

• a) Připraví se suspenze přibližně 10^6 buněk na ml v UPW.

• b) Provede se test postupem podle Smith a kol., 2001.

• 1. Test patogenity

Pro konečné potvrzení původce kroužkovitosti a pro stanovení virulence kultur identifikovaných jako Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus musí být provedena zkouška patogenity.

• 10.1. Připraví se inokulum přibližně 10^6 buněk na ml z 3-denních kultur testované izolované látky a vhodného pozitivního kmene Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

• 10.2. Naočkuje se 5-10 stonků mladých semenáčků lilku vejcoplodého ve fázi 3 pravých listů.

• 10.3. Inkubuje se při teplotě 18-24 °C při dostatečném světle a vysoké relativní vlhkosti s přiměřeným zaléváním, aby nedošlo k přemokření nebo vyschnutí. U čistých kultur by mělo během 2 týdnů nastat typické vadnutí, avšak rostliny, které po uplynutí této doby nevykazují žádné příznaky infekce, by se měly inkubovat až 3 týdny při teplotách příznivých pro růst lilku vejcoplodého, ale nepřesahujících 25 °C. Jestliže se po 3 týdnech příznaky infekce nevyskytují, nemůže být kultura považována za patogenní formu Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

• 10.4. Izolace se provádí z rostlin s příznaky infekce odstraněním části stonku 2 cm nad místem inokulace. Pletiva se rozdrtí a suspendují v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fosfátového pufru. Izoluje se ze suspenze rozetřením nebo nanesením na MTNA a YPGA, inkubuje se po dobu 3-5 dní při teplotě 21-23°C a sleduje se vznik kolonií typických pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Dodatek 1

Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů

Laboratoř (1)	Místo	Země
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit	Vídeň a Linec	Rakousko
Departement Gewasbescherming	Merelbeke	Belgie
Plantedirektoratet	Lyngby	Dánsko
Central Science Laboratory	York	Anglie
Scottish Agricultural Science Agency	Edinburgh	Skotsko
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Unité de Bactériologie	Angers	Francie
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre	Le Rheu	Francie
Biologische Bundesanstalt	Kleinmachnow	Německo
Pflanzenschutzamt Hannover	Hannover	Německo
State Laboratory	Dublin	Irsko
Plantenziektenkundige Dienst	Wageningen	Nizozemsko
Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre	Aas	Norsko
Direcção-General de Protecção das Culturas	Lisabon	Portugalsko
Nacionalni institut za biologijo	Ljubljana	Slovinsko
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia	Salamanca	Španělsko
(1) Kontaktní osoby: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Dodatek 2

Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH

Vypěstuje se 72 hodinová kultura virulentního kmene C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 nebo PD 406) na základním médiu MTNA a suspenduje se v 10 mMfosfátového pufru pro získání hustoty přibližně 1 až 2 x 10^8 buněk schopných tvorby kolonií/ml. Toho se obvykle dosáhne prostřednictvím slabě zakalené suspenze odpovídající optické hustotě 0,20 – 600 nm.

Výkrojky pletiva se odeberou z pupkových konců 200 hlíz odebraných z produkce odrůdy s bílou slupkou, u které je jisté, že je prosta C. m. subsp. sepedonicus.

Pupkové výkrojky se zpracují obvyklým způsobem a resuspenduje se peleta v 10 ml.

Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 μl resuspendované pelety.

Přenese se 100 μl suspenze C. m. subsp. sepedonicus do první mikrozkumavky. Nechá se protřepat.

V následujících pěti mikrozkumavkách se provedou desetinná ředění.

Šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako pozitivní kontrola. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako negativní kontroly. Mikrozkumavky se opatří štítkem.

Připraví se alikvotní části z 100 μl ve sterilních mikrozkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Skladování probíhá při teplotě – 16 až – 24 °C až do doby použití.

Přítomnost a množství C. m. subsp. sepedonicus v kontrolních vzorcích by měla být nejprve potvrzena prostřednictvím imunofluorescence.

Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Pro IF a FISH testy se provedou kvantitativní rozbory pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být C. m. subsp. sepedonicus zjištěn v nejméně v 10^6 a 10^4 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

Dodatek 3

Pufry pro testovací postupy

OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

• 1. Pufry pro extrakci

• 1.1. Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)

Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.

Na2 HPO4 (bezvodý)	4,26 g
KH2PO4	2,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Užitečné mohou být následující složky:

	Účel	Množství (na litr)
Lubrolové vločky	Protisrážlivý prostředek (*)	0,5 g
DC silikonový odpěňovač	Odpěňovací činidlo (*)	1,0 ml
Tetrasodiumpyrofosfát	Antioxidační činidlo	1,0 g
Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP ‒ 40)	Vázání inhibitorů PCR	50 g
(*) pro použití při extrakci homogenizací

• 1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)

Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.

Na2HPO4.12H2O	2,7 g
NaH2PO4.2H2O	0,4 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

• 1. Pufry pro IF test

• 2.1. Pufry pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)

Tento pufr se používá k ředění protilátek.

Na2HPO4.12H2O	2,7 g
NaH2PO4.2H2O	0,4 g
NaCl	8,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min

• 2.2. IF-pufr-Tween

Tento pufr se používá k mytí sklíček.

Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.

• 2.3. Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6

Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.

Na2HPO4.12H2O	3,2 g
NaH2PO4.2H2O	0.15 g
Glycerol	50 ml
Destilovaná voda	100 ml

Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield^® (Vector Laboratories) nebo Citifluor^® (Leica).

Dodatek 4

Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk

• 1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).

• 1. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku mikroskopického sklíčka (C).

C = c x S/s,

kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více jamkami a

s = plocha pole objektivu.

s=πi2/4G2K2,

kde i = koeficient pole (v rozmezí od 8 ‒ 24 podle typu okuláru),

K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),

G = zvětšení objektivu (100 x, 40 x atd.).

• 1. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).

N = C x 1 000/y x F,

kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a

F = zřeďovací faktor resuspendované pelety

Dodatek 5

Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus

• 1. Obecná růstová média

Živný agar (Nutrient agar = NA)

Živný agar (Difco)	23 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Živný dextrózový agar (Nutrient dextrose agar = NDA)

Difco bakto živný agar obsahující 1 % D(+) glukózy (monohydrátu). Provede se sterilizace v autoklávu při 121 C po dobu 20 min.

Kvasnično-pepton-glukózový agar (Yeast peptone glucose agar = YPGA)

Kvasnicový extrakt (Difco)	5,0 g
Baktopepton (Difco)	5,0 g
D(+) glukóza (monohydrát)	10,0 g
Baktoagar (Difco)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Médium s kvasnicovým extraktem a minerálními solemi (Yeast extract mineral salts medium = YGM)

Kvasnicový extrakt (Difco)	2,0 g
D(+) glukóza (monohydrát)	2,5 g
K2HPO4	0,25 g
KH2PO4	0,25 g
MgSO4.7H2O	0,1 g
MnSO4.H2O	0,015 g
NaCl	0,05 g
FeSO4.7H2O	0,005 g
Baktoagar (Difco)	18,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí a provede se sterilizace 0,5 l média v autoklávu při 115 °C po dobu 20 min.

• b) Validovaná selektivní růstová média

Médium MTNA

Pokud není uvedeno jinak, pocházejí všechny složky médií z BDH.

Kvasnicový extrakt (Difco)	2,0 g
Manit	2,5 g
K2HPO4	0,25 g
KH2PO4	0,25 g
MgSO4.7H2O	0,1 g
MnSO4.H2O	0,015 g
NaCl	0,05 g
FeSO4.7H2O	0,005 g
Agar (Oxoid č. 1)	16,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí, pH se upraví na 7,2. Po autoklávování (při 121 °C po dobu 15 min.) a ochlazení na 50 C se přidají antibiotika: trimethoprim 0,06 g, nalidixic acid 0,002 g, amphotericin B 0,01 g.

V zásobě se nechají roztoky antibiotik: trimethoprim (Sigma) a nalidixic acid (Sigma) (obě 5 mg/ml) v 96 % metanolu, amphotericin B (Sigma) (1 mg/ml) v dimethyl sulfoxidu. Zásobní roztoky jsou sterilizované filtrací.

Poznámka:

Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 °C.

Médium NCP-88

Živný agar (Difco)	23,0 g
Kvasnicový extrakt (Difco)	2,0 g
D-manit	5,0 g
K2HPO4	2,0 g
KH2PO4	0,5 g
MgSO4.7H2O	0,25 g
Destilovaná voda	1,00 l

Složky se rozpustí,upraví se pH na 7,2. Po autoklávování a ochlazení na 50 °C se přidají následující antibiotika: polymyxin B sulphate (Sigma) 0,003g, nalidixic acid (Sigma) 0,008 g, cycloheximide (Sigma) 0,2 g.

Antibiotika se rozpustí pro přípravu zásobních roztoků následovně: nalidixic acid v 0,01 M NaOH, cykloheximid v 50% etanolu, polymyxin B sulphate v destilované vodě. Zásobní roztoky se sterilizují filtrací.

Poznámka:

Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 °C.

Dodatek 6

Validované protokoly a činidla pro PCR

Poznámka:

Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 10^3 až 10^4 buněk C. m. subsp. sepedonicus na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií.

• 1. Vícenásobný PCR protokol s interní PCR kontrolou (Pastrik, 2000)

• 1.1. Oligonukleotidní primery

primer PSA-1	5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'
primer PSA-R	5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'
primer NS-7-F	5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'
primer NS-8-R	5'- tcc gca ggt tca cct acg ga -3'

Předpokládaná velikost amplikonu z DNA C. m. subsp. sepedonicus šablony = 502 bp (sada PSA-primerů).

Předpokládaná velikost amplikonu z interní PCR kontroly 18S rRNA = 377 bp (sada NS- primerů).

• 1.2. Reakční směs PCR

Činidlo	Množství na reakci	Konečná koncentrace
Sterilní voda (UPW)	15,725 μl
10x PCR pufr (1) (15 mM MgCl2)	2,5 μl	1x(1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 μl	0,1 %
Směs d-nTP (20 mM)	0,125 μl	0,1 mM
Primer PSA-1 (10 μM)	0,5 μl	0,2 μM
Primer PSA-R (10 μM)	0,5 μl	0,2 μM
Primer NS-7-F(10 μM) (2)	0,1 μl	0,04 μM
Primer NS-8-R (10 μM) (2)	0,1 μl	0,04 μM
Taq polymeráza (5 U/μl) (1)	0,2 μl	1,0 U
Vzorkové množství	5,0 μl
Celkový objem	25,0 μl

(^1) Metody byly validovány za použití Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq nebo Gold) a Gibco BRL.

(^2) Koncentrace primerů NS-7 F a NS-8-R byla optimalizována pro extrakci pupkové části bramboru za použití homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz oddíl 6.1 písm. a) a 6.2). Při použití extrakce třepáním nebo jinými metodami izolace DNA je nutná nová optimalizace koncentrací činidla.

• 1.3. Reakční podmínky pro PCR

Postupuje se podle následujícího programu:

1 cyklus:	i)	3 minuty při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
10 cyklů	ii)	1 minuta při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
	iii)	1 minuta při teplotě 64 °C (připojení primerů)
	iv)	1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie)
25 cyklů	v)	30 sekund při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
	vi)	30 sekund při teplotě 62 °C (připojení primerů)
	vii)	1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie)
1 cyklus	viii)	5 minut při teplotě 72 °C (závěrečná prodlužování)
	ix)	Udržuje se při teplotě 4 °C

Poznámka:

Tento program je optimalizován pro použití s tepelným cyklerem MJ Research PTC 200. Při použití jiných modelů může být nutná modifikace kroků cyklů ii), iii) iv), v), vi) a vii).

• 1.4. Analýzy ampliconu restriktivním enzymem

Produkty PCR amplifikované z DNA C. m. subsp. sepedonicus produkují charakteristickou mnohotvárnost délky fragmentu s enzymem Bgl II po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Fragmenty získané z fragmentu specifického pro C. m. subsp. sepedonicus mají rozměry 282 bp a 220 bp.

• 1. Příprava nanášecího pufru

• 2.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)

Bromfenolová modř	5g
Destilovaná voda	50 ml

Nanášecí pufr

Glycerol (86 %)	3,5 ml
Bromfenolová modř	300 μl
Destilovaná voda	6,2 ml

• 1. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0

TRIS	48,4 g
Ledová kyselina octová	11,42 ml
EDTA (sodná sůl)	3,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Před použitím se zředí na 1x.

Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).

Dodatek 7

Validovaná činidla pro FISH test

• 1. Oligosondy

Sonda specifická pro Cms CMS-CY3-01:	5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'
Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC:	5'- gct gcc tcc cgt agg agt-3'

• 1. Fixační roztok

[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ! POUŽÍVAT RUKAVICE A NEVDECHOVAT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]

ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Indikačním proužkem se zkontroluje pH a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH.

[UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ pH!]

iii) Roztok se přefiltrujte přes membránový filtr 0,22 μm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.

iv) Poznámka:

Alternativní fixační roztok: 96 % etanol.

• 1. 3x Hybmix

NaCl	2,7 M
Tris-HCl	60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)	15 mM

Zředí se až 1x, podle potřeby.

• 1. Hybridizační roztok

1x Hybmix
Sodium dodecyl sulfát (SDS)	0,01 %
Sonda EUB 338	5 ng/μl
Sonda CMSCY301	5 ng/μl

Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 μl hybridizačního roztoku.

Tabulka: Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

	2 sklíčka	8 sklíček
Sterilní ultra čistá voda	50,1	200,4
3x hybmix	30,0	120,0
1 % SDS	0,9	3,6
sonda EUB 338 (100 ng/μl)	4,5	18,0
sonda CMSCY301 (100 ng/μl)	4,5	18,0
Celkový objem (μl)	90,0	360,0

Poznámka.:

Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě – 20 °C. Během použití je nutné je ochraňovat před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.

• 1. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0

Na2HPO4	8,52 g
KH2PO4	5,44 g
Destilovaná voda	1,001

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a sterilizuje se autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Dodatek 8

Pěstování lilku vejcoplodého

Semena lilku vejcoplodého (Solanum melongena) se vysejí do pasterizovaného výsevního substrátu. Semenáčky s plně rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přepichují do pasterizovaného pěstebního substrátu.

Lilek by se měl pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

Délka dne:		14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;
Teplota:	den:	21 až 24 °C,
	noc:	15 °C.
Vhodné odrůdy lilku vejcoplodého	„Black Beauty“,
---	---
„Long Tom“,
„Rima“,
„Balsas“.

Dodavatel: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Dodatek 9

Gramovo barvení v Huckerově modifikaci (Doetsch, 1981) (^1)

Roztok krystalové violeti

Rozpustí se 2 g krystalové violeti v 20 ml 95 % etanolu.

Rozpustí se 0,8 g šťavelanu amonného v 80 ml destilované vody.

Oba roztoky se smíchají.

Lugolův jódový roztok

Jód	1 g
Jodid draselný	2 g
Destilovaná voda	300 ml

Pevné látky se společně rozetřou pomocí tloučku v misce. Nasypou se do vody a míchají se v uzavřené nádobě do rozpuštění.

Safraninový roztok kontrastního barviva

Zásobní roztok:

Safranin O	2,5 g
95 % etanol	100 ml

Zamíchá se a uloží se.

Ředění: 1:10 pro přípravu pracovního roztoku.

Postup barvení

• 1. Připraví se roztěry, vysuší se na vzduchu a fixují se zahřátím.

• 1. Sklíčko se zalije roztokem krystalové violeti a nechá se působit 1 minutu.

• 1. Krátce se omyje pod tekoucí vodou.

• 1. Zalije se Lugolovým jódovým roztokem a nechá se působit po dobu jedné minuty.

• 1. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.

• 1. Odbarvuje se pomocí po kapkách přidávaného 95 % etanolu tak dlouho, pokud se vyplavuje barvivo, nebo ponořením za jemného pohybování do etanolu na dobu 30 sekund.

• 1. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.

• 1. Zalije se safraninovým roztokem a nechá se působit 10 s.

• 1. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.

Grampozitivní bakterie se zbarví fialově modře, gramnegativní bakterie se zbarví růžovočerveně.

(^1) Mohou se také použít komerčně dostupné roztoky nebo barvicí soupravy.

LITERATURA

• 1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers. Commission of the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11 288 EN, 21 pp.

• 1. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213‒218.

• 1. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147‒152.

• 1. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. V: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21‒23.

• 1. Hugh, R. a Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24‒26.

• 1. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fattyacid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335‒345.

• 1. Janse, J. D. a J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., č. 17, 1987, pp. 1‒10.

• 1. Jansing, H. a K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590‒601.

• 1. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.

• 1. Klement Z.; Rudolph, K a D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

• 1. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114‒118.

• 1. Lelliott, R. A., E. Billing a A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470‒489.

• 1. Lelliott, R. A. a P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101‒106.

• 1. Li, X. a S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837–842.

• 1. Mills, D., Russell, B., W. a J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phytopathology, 87, 8, 853‒861.

• 1. Pastrik, K. -H. a R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687‒693.

• 1. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155‒165.

• 1. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

• 1. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. a Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095‒1100.

• 1. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. ‒ 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp.

• 1. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.

• 1. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739‒748.

• 1. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481‒527.

• 1. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281‒295.

• 1. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. a A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546‒4554.

B. METODY DIAGNÓZY, DETEKCE A IDENTIFIKACE PŮVODCE HNĚDÉ HNILOBY

Předložené postupové diagramy popisují různé postupy, které jsou součástí:

ii) detekce Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru, rostlin bramboru, rostlin rajčete a jiných hostitelských rostlin, a ve vzorcích vody a půdy,

iii) identifikace Ralstonia solanacearum (R. solanacearum)

OBECNÉ ZÁSADY

Optimalizované protokoly pro různé metody, schválená činidla a podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku 1.

Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a zahrnují použití životaschopných kultur R. solanacearum jako kontrolních materiálů, je nutné pracovat za vhodných karanténních podmínek s odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek stanovených příslušným povolením rostlinolékařské správy.

Testovací parametry musí zajišťovat stálé a reprodukovatelné zjištění úrovní R. solanacearum jako stanovené prahy vybraných metod.

Zcela nezbytná je přesná příprava pozitivních kontrol.

Testování podle požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení, údržbu a kalibraci zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich uchovávání a všechna opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky, např. oddělení pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být uplatněno standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním a jiným chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.

Podezření z výskytu, jak je uvedeno v § 4 odst. 1, naznačuje pozitivní výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech. První pozitivní screeningový test ( test IF, PCR/FISH, selektivní izolace) musí být potvrzen druhým screeningovým testem založeném na jiném biologickém principu.

Pokud je první screeningový test pozitivní, existuje podezření na infekci R. solanacearum a musí být proveden druhý screeningový test. Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je podezření potvrzeno a musí se pokračovat v testování podle daného schématu. Jestliže je druhý screeningový test negativní, pak vzorek není považován za infikovaný R. solanacearum.

Potvrzená přítomnost podle §. 5 odst. 1 vyžaduje izolaci a identifikaci čisté kultury R. solanacearum s potvrzením patogenity.

• 1. Použití postupových diagramů

• 1.1. Postupový diagram pro diagnózu hnědé hniloby a bakteriálního vadnutí (Ralstonia solanacearum) hlíz bramboru a rostlin bramboru, rajčete a jiných hostitelských rostlin vykazujících příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního vadnutí

Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z výskytu nebo typickými příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního vadnutí. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogena z infikovaného vodivého pletiva na selektivní živné půdě a v případě pozitivního výsledku identifikaci kultury Ralstonia solanacearum.

[image omitted]

1) Popis příznaků se nachází v oddíle 2.1.

2) Rychlé diagnostické testy usnadňují předběžnou diagnózu, ale nejsou dokonalé. Negativní výsledek naznačuje vždy nepřítomnost patogenu.

3) Test na výtok slizu ze svazků cévních stonku je popsán v oddíle 6.1.1.