LegalizeReal Decreto 1533/1991, de 18 de octubre, por el que se aprueban los métodos oficiales de análisis de leche y productos lácteos
El Decreto de la Presidencia del Gobierno número 2484/1967, de 21 de septiembre («Boletín Oficial del Estado» del 17 al 23 de octubre), que aprueba el Código Alimentario Español, prevé que puedan ser objeto de Reglamentaciones Especiales las materias en él reguladas.
Las ordenes de 31 de enero de 1977 («Boletín Oficial del Estado» de 14 a 27 de julio); 31 de julio de 1979 («Boletín Oficial del Estado» de 29 y 30 de agosto); 17 de septiembre de 1981 («Boletín Oficial del Estado» de 14 de octubre); 1 de diciembre de 1981 («Boletín Oficial del Estado» de 20 de enero de 1982), y 26 de enero de 1989 («Boletín Oficial del Estado» de 4 de febrero), establecieron diversos métodos oficiales de análisis de leche y productos lácteos, siendo necesario complementarlos con otros nuevos que atiendan al control de las mezclas de leches citadas anteriormente.
El presente Real Decreto se dicta en virtud de lo dispuesto en el artículo 149.1.16.ª de la Constitución Española, en cuanto atribuye al Estado la competencia exclusiva sobre las bases y coordinación general de la sanidad.
En su virtud a propuesta de los Ministros de Sanidad y Consumo, de Industria, Comercio y Turismo y de Agricultura, Pesca y Alimentación, oídos los sectores afectados, previo informe preceptivo de la Comisión Interministerial para la Ordenación Alimentaria, de acuerdo con el Consejo de Estado y previa deliberación del Consejo de Ministros en su reunión del día 18 de octubre de 1991,
DISPONGO:
Artículo 1.
Se aprueban como oficiales los métodos de análisis de leche y productos lácteos que se detallan en el anexo.
Artículo 2.
Para la detección de la presencia de leche de vaca en mezclas con leche de oveja y leche de cabra, en productos procedentes de otros Estados miembros se reconocen como métodos de control equivalentes los legalmente establecidos en los mismos hasta tanto se apruebe un método único de referencia aplicable en la Comunidad Económica Europea.
Disposición adicional.
El presente Real Decreto se dicta al amparo de lo dispuesto en el artículo 149.1.16.ª de la Constitución Española.
Disposición derogatoria.
Quedan derogadas las disposiciones de igual o inferior rango en lo que se opongan al presente Real Decreto.
Dado en Madrid a 18 de octubre de 1991.
JUAN CARLOS R.
El Ministro de Relaciones con las Cortes y de la Presidencia del Gobierno,
VIRGILIO ZAPATERO GÓMEZ
ANEXO. MÉTODOS OFICIALES DE ANÁLISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS
ÍNDICE
Leche
Detección de leche de vaca en mezclas con leche de oveja y cabra.
Sangre soluble.
23 (a) Determinación de leche de vaca en leche de oveja o de cabra (por electroforesis).
23 (b) Determinación de leche de vaca en leche de oveja o de cabra (por inmunodifusión radial).
24 (a) Determinación de leche de cabra en leche de oveja (por electroforesis).
24 (a) Determinación de leche de cabra en leche de oveja (por inmunodifusión radial).
Mantequilla
Extracción de la grasa.
Queso
Nitratos y nitritos.
Determinación de leche de vaca en queso de oveja o de cabra (por electroforesis).
Determinación de leche de cabra en queso de oveja (por electroforesis).
21. DETECCIÓN DE LECHE DE VACA EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA Y CABRA
21.1 Principio.
Se puede detectar la leche de vaca en mezclas con leche de oveja o cabra mediante extracciones de la caseína y posterior separación por electroforesis en gel de poliacrilamida.
La caseínas as1 de leche de vaca presenta una mayor movilidad electroforética que las caseínas as de leches de oveja o cabra.
21.2 Material y aparatos.
21.2.1 Centrífuga.
21.2.2 Equipo de electroforesis.
21.2.3 Fuente de alimentación.
21.2.4 Tubos para electroforesis de 11 cm de longitud y 0,7 cm de diámetro.
21.2.5 pH-metro.
21.2.6 Material de uso corriente en el laboratorio de pipetas, tubos, micropipetas, etcétera.
21.3 Reactivos.
21.3.1 Solución de ácido acético 1N.
21.3.2 Solución de hidróxido sódico 1N.
21.3.3 Solución de urea 7M.
21.3.4 Solución A. Tampón pH 8,9. Disolver 48 ml de HC1 1N, 36,3 g de Trishidroximetilaminometano y 0,46 ml de Temed en agua hasta 100 ml.
21.3.5 Solución B de acrilamida. Disolver 60 g de acrilamida y 1,6 g de NN’ Metilenbisacrilamida (Bis) en agua hasta 200 ml.
21.3.6 Solución tampón para depósitos de los electrodos pH 8,4. Disolver 0,60 g de Trishidroximetilaminometano y 2,88 g de glicina en agua hasta 100 ml. Se puede preparar un tampón concentrado 10 veces y guardar en nevera diluyéndolo en el momento de su utilización.
21.3.7 Solución de persulfato amónio. Disolver 0,56 g de persulfato amónico en agua hasta 100 ml. Este reactivo debe prepararse nuevo cada semana.
21.3.8 Solución de tinción. Disolver 0,56 g de Negro de Amido en una mezcla de 250 ml de metanol, 650 ml de agua y 100 ml de ácido acético glacial.
21.3.9 Solución de lavado. Mezclar 400 ml de metanol, 50 ml de ácido glacial y 550 ml de agua.
21.3.10 Solución de azul de bromofenol. Disolver 1 mg de azul de bromofenol en 100 ml de agua.
21.4 Procedimiento.
21.4.1 Preparación de la muestra:
Diluir la leche, previamente desnatada por centrifugación, a 1/5 con agua destilada. Calentar a 35° C y llevar a pH 4,6 mediante adición de ácido acético 1N. Separar la caseína precipitada por centrifugación y lavar varias veces con agua destilada. Disolver la caseína en un volumen de agua igual a la mitad del volumen de la leche original, añadiendo solución de hidróxido sódico 1N hasta pH7.
Inmediatamente antes de la electroforesis, disolver un volumen igual de urea 7M. preparada recientemente. Para la electroforesis es suficiente aplicar de 100 a 200 ug de caseína disuelta.
21.4.2 Preparación del gel:
Mezclar 5 ml de solución A (21.3.4), 10 ml de solución B (21.3.5) y 11,5 g de urea en una probeta de 50 ml. Añadir agua con agitación hasta 35 ml de disolución. Desairear mediante vacío y añadir 5 ml de la solución de persulfato. Agitar la solución e inmeditamente llenar con la misma los tubos (previamente tapados por su parte inferior) hasta 1 cm del extremo superior, evitando la formación de burbujas de aire.
Completar el llenado de los tubos con una pequeña cantidad de agua que asegura la superficie plana del gel, a la vez que evita la posible inhibición de la polimerización por el oxígeno atmosférico.
La polimerización tiene lugar en veinte-treinta minutos.
21.4.3 Electroforesis:
Colocar los geles, una vez polimerizados y después de eliminar el agua, en los módulos del aparato de electroforesis en posición vertical y llenar las dos cámaras de los electrodos con el tampón pH 8,4.
Aplicar con micropipeta en la superficie del gel una cantidad de la solución de caseína en urea que contenga de 100 a 200 ug de caseína. Añadir una gota de azul de bromofenol y completar el llenado de los tubos con una pequeña cantidad de tampón.
Utilizar el depósito superior como cátodo y el interior como ánodo.
Conectar la corriente y aplicar una intensidad constante de 1 mA por tubo durante 1,5 a dos horas (hasta que el azul de bromofenol llegue al extremo del gel).
21.4.4 Separación, teñido y desteñido de los geles:
Para desprender el gel del tubo de vidrio se puede utilizar una jeringa con una aguja sin punta, colocándola entre el gel y el tubo. Inyectar agua a presión y rotar el tubo, con lo que entra ésta y se desprende el gel.
Una vez desprendido, colocar cada gel en un tubo con solución colorante de Negro de Amido durante una hora.
Elimar la solución de teñido y añadir solución de lavado, que debe renovar hasta que se observe las bandas de nitidez.
Los geles se pueden conservar durante meses en solución de ácido acético al 7 por 100.
21.5.1 Identificación de las bandas:
El diagrama electroforético de las caseínas de leche de oveja contiene dos grupos de bandas de proteínas.
El primer grupo, de dos bandas, corresponde a las β caseínas, y el segundo, consistente en tres bandas, a las as caseínas, que se designan como as1, as2 y as3.
La leche de vaca se puede detectar en mezclas con leche de oveja o cabra, debido a la mayor migración electroforética de la caseína as, de vaca, que se hace visible por encima de las bandas de caseína de oveja o cabra.
La intensidad de la banda as1 de vaca aumenta cuando es mayor el porcentaje de mezcla.
21.5.2 Determinación cuantitativa:
La determinación cuantitativa de la proporción de leche de vaca añadida a la leche de oveja o cabra se puede realizar por el análisis densitométrico de las bandas obtenidas en las electroforesis, midiendo en la mezcla el contenido de caseína as1 de leche de vaca y comparando este valor con el contenido medio de caseína as de leche de vaca pura.
Es necesario efectuar una curva patrón.
21.5.3 Límite de detección:
La técnica descrita permite detectar un 2% de leche de vaca en leche de oveja o en leche de cabra.
21.6 Observaciones.
21.6.1 La electroforesis en gel de acrilamida se puede efectuar también en un equipo para electroforesis en gel plano.
21.6.2 Todas las soluciones se deben preparar con agua destilada reciente o hervida, ya que el oxígeno inhibe la polimerización y se pueden formar burbujas en el gel.
21.6.3 Todas las soluciones se deben almacenar en botellas oscuras en el frigorífico.
21.6.4 La acrilamida es neurotóxica, por lo que se debe manejar con cuidado.
21.7 Bibliografía.
21.7.1 Pierre, A., y Portmann, A., 1970. Ann Teechnol. Ag. 19, 107-130.
21.7.2. Ramos, j.; Martínez-Castro, I., y Juárez, M. 1977. J. of Dairy Sci. 60, 870-877.
21.7.3 Adroid, P. (1968) «Separation of milk proteins», en Smith «Chromatographic and electrophoretic tecniques». Vol. II, pág. 399. William Heineimann Medical Books, Ltd. London.
22. SANGRE SOLUBLE
22.1 Principio.
Disolución de la hemoglobina en una mezcla acético-agua y posterior determinación de su absorbencia a 396 nanómetros.
Este método es aplicable a muestras de leche o suero de leche en polvo que contengan menos del 5 por 100 de grasa.
22.2 Material y aparatos.
22.2.1 Espectrofotómetro y accesorios (cubeta para 1 cm de espesor de líquido).
22.2.2 Agitador electromagnético.
22.2.3 Centrífuga y tubos de 10 ml.
22.3 Reactivos.
22.3.1 Mecla ácido acético-agua (1:1) VN.
22.4 Procedimiento.
Pesar con precisión de 0,001 g, 10 g de leche o suero de leche en polvo e introducir en un vaso de precipitados de 250 ml. Añadir 150 ml de agua destilada previamente calentada a 40°-50° C y agitar hasta que se forme una emulsión; a continuación, trasvasar esta emulsión a un matraz aforado de 250 ml, lavar el vaso repetidas veces con agua destilada, enfriar y enrasar a 250 ml. Tomar 20 ml de la emulsión y verter en un matraz aforado de 100 ml, enrasar con la mezcla de acético glacial-agua destilada. Si la solución resulta turbia, centrifugar 10 ml durante 15 minutos a unas 5.700 revoluciones; retirar a continuación con ayuda de una espátula la película sobrenadante; filtrar el centrifugado y repetir las operaciones si es necesario de forma que la solución quede finalmente transparente. A continuación medir la absorbancia en cubeta de 1 cm a 396 nm, usando como blanco la solución acético-agua.
22.5 Cálculos.
El porcentaje de sangre soluble se deduce por aplicación de la siguiente fórmula:
Siendo:
S = Porcentaje de sangre soluble presente en la muestra.
A = Absorbancia leída de la muestra.
P = Peso en gramos de la leche o suero de leche en polvo.
= Absorbancia específica de la sangre.
22.6 Observaciones.
22.6.1 En el caso de dispoper de la harina de sangre utilizada como desnaturalizante, el valor de se obtendrá como se indica a continuación:
Pesar con precisión de 0,0001 g, 100 mg de harina de sangre, e introducirla en un vaso de precipitado de 250 ml. Añadir 150 ml de agua destilada, agitar durante cinco minutos la solución, transferir a un matraz aforado de 250 ml. A continuación, tomar 20 ml de esta solución, llevar a un matraz aforado de 100 ml y enrasar con la mezcla de ácido acético glacial-agua. Centrifugar 10 ml de esta solución y medir su absorbancia en cubeta de 1 cm a 396 nanómetros usando como blanco la solución acético-agua.
Siendo:
= Absorbancia específica.
A = Absorbancia leída.
P = Peso en gramos de la harina de sangre.
La absorbancia específica no deberá ser inferior a 50. En caso contrario, la harina de sangre no debe ser utilizada como desnaturalizante.
22.6.2 Si no se ha podido determinar este valor previamente a la adición de la harina de sangre a la leche o suero se tomará como valor medio de referencia = 52,4.
23(A) DETERMINACIÓN DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE CABRA (MÉTODO ELECTROFORÉTICO)
23(a)1. Principio.
La fracción sérica de la muestra se extrae por adición de solución tampón a pH 4,6 y posterior centrifugación.
Las proteínas de suero son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida a pH 8,3.
Las β lactoglobulinas de leche de vaca presentan una mayor movilidad electroforética que las α lactoalbúminas y las β lactoglobulinas de la leche de ovjea y de la leche de cabra.
El método es aplicable a la leche cruda o pasterizada a una temperatura máxima de 90° C, durante treinta segundos, fresca o conservada mediante congelación o adición de dicromato potásico.
23(a)2. Material y aparatos.
23(a)2.1 Material de uso corriente en laboratorio.
23(a)2.2 Microjeringa.
23(a)2.3 pH metro.
23(a)2.4 Centrífuga.
23(a)2.5 Equipo de electroforesis.
23(a)2.6 Fuente de alimentación.
23(a)2.7 Densitómetro.
23(a)3. Reactivos.
23(a)3.1 Reactivos para la obtención de la fracción serica.
23(a)3.1.1 Solución de Ácido Acético al 10%.
23(a)3.1.2 Solución de Acetado Sódico 1N.
23(a)3.2 Reactivos para la electroforesis. 23(a)
3.2.1 Tampón de los geles pH 8,9.
– Trishidroximetil aminometano: 46 g.
– Ácido Clorhídrico concentrado: 4 ml.
– Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
23(a)3.2.2 Solución de Acrilamida Bisacrilamida (T = 9,4%; c = 4,2).
– Acrilamida: 9 g.
– N N’ Metilenbisacrilamida: 0,4 g.
– Tampón de los geles: 100 ml.
23(a)3.2.3 Tampón de los electrodos pH 8,3.
– Trishidroximetil aminometano: 1,2 g.
– Glicina: 5,8 g.
– Agua destilada: Hasta 2.000 ml.
23(a)3.2.4 Solución de Persulfato amónico al 10% (este reactivo debe prepararse cada semana).
23(a)3.2.5 NNN’N’ Tetrametiletilendiamina (TEMED).
23(a)3.2.6 Solución de azul de bromofenol al 1/1.000.
23(a)3.2.7 Solución de Glicerol al 40%.
23(a)3.3 Reactivos para la tinción.
23(a)3.3.1 Tinción con azul Coomassie R-250.
23(a)3.3.1.1 Solución fijadora.
– Ácido Sulfosalicílico: 17,3 g.
– Ácido Tricloroacético: 57,5 g.
– Agua destilada: Hasta 500 ml.
23(a)3.3.1.2 Solución decolorante.
– Etanol: 500 ml.
– Ácido Acético glacial: 160 ml.
– Agua destilada: Hasta 2.000 ml.
23(a)3.3.1.3 Solución de tinción.
– Azul Coomassie Brillante R-250: 0,46 g.
– Solución decolorante [23(a)3.3.1.2]: 40 ml.
23(a)3.3.2 Tinción con azul Coomassie G-250.
23(a)3.3.2.1 Solución única de fijación y tinción.
– Azul Coomassie G-250: 1 g.
– Agua destilada: 500 ml.
– Solución de Ácido Sulfúrico 2 N: 500 ml.
– Solución de hidróxido potásico 10 N.
– Ácido Tricloroacético.
Disolver el azul de Coomassie G-250 en agua destilada y añadir la solución de Ácido Sulfúrico 2 N. Mezclar bien agitando durante una hora y filtrar por papel Whatman número 1. Medir el volumen de filtrado y añadir 1/9 de este volumen de la solución de hidróxido potásico 10 N. Añadir Ácido Tricloroacético a esta disolución hasta que la concentración final sea de 12%. Esta solución de teñido es estable durante varios meses si el pH se mantiene por debajo de 1. Se puede utilizar varias veces pero es conveniente filtrarla antes de cada uso.
23(a)4. Procedimiento.
23(a)4.1 Obtención de la fracción soluble a pH 4,6.
Añadir a 10 ml de leche, 5 ml de solución de Ácido Acético al 10% [23(a)3.1.1] y 5 ml de solución de Acetato Sódico 1 N [23(a)3.1.2], mezclar y comprobar con pH metro que el pH de la mezcla es exactamente 4,6. Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante diez minutos y filtrar el sobrenadante a través de un papel de filtro de velocidad media.
23(a)4.2 Preparación de la curva patrón.
Dependiendo del tipo de muestra que se desee analizar, preparar patrones puros de leche de oveja o de leche de cabra y de leche de vaca y mezclas de leche de vaca en leche de oveja o de leche de vaca en leche de cabra en concentraciones del 5%, 10% y 20%. La leche utilizada para la preparación de estos patrones podrá ser cruda o pasterizada, en este último caso la leche deberá ser pasterizada a una temperatura máxima de L 74° C durante un tiempo máximo de treinta segundos.
La fracción soluble de los patrones se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en 23(a)4.1.
23(a)4.3 Inmediatamente antes de su aplicación en el gel mezclar:
– 1 Volumen de la fracción soluble obtenida según [23(a)4.1].
– 1 Volumen de la solución de glicerol al 40% [23(a)3.2.7].
– ½ Volumen de la solución azul de Bromofenol al 1/1.000 [23(a)3.2.6].
23(a)4.4 Preparación del Gel de Poliacrilamida.
Preparar el gel laminar de espesor comprendido entre 0,5 mm y 1 mm. Para 50 ml de la solución de acrilamida-bisacrilamida, añadir 0,5 ml de solución de persulfato amónico al 10% [23(a)3.2.4], desairear en un Kitasato mediante vacío y añadir como agente polimerizante 50 ml de TEMED [23(a)3.2.5].
23(a)4.5 Electroforesis.
Colocar el gel en el aparato de electroforesis y llenar las cámaras de los electrodos con el tampón pH 8,3 [23(a)3.2.4].
Aplicar con microjeringa en cada uno de los pocillos del gel un volumen comprendido entre 10 µl y 20 µl de las soluciones obtenidas según 23(a)4.3, tanto de la muestra como de los patrones.
La electroforesis se realiza a 60 mA (220 V) dejando correr el frente hasta que la línea del azul de bromofenol esté a 0,5 mm del extremo inferior del gel. La duración es aproximadamente de tres horas.
23(a)4.6 Métodos de tinción.
23(a)4.6.1 Tinción con azul Coomassie R-250.
Una vez completada la electroforesis, introducir el gel sucesivamente en:
1.° La solución fijadora [23(a)3.3.1.1]: Una hora.
2.° La solución decolorante [23(a)3.3.1.2]: Diez minutos.
3.° La solución de tinción [23(a)3.3.1.3]: Doce horas.
4.° La solución decolorante [23(a)3.3.1.2], que se renovará con frecuencia, hasta eliminar el fondo.
23(a)4.6.2 Tinción con azul Coomassie G-250.
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