Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al

Norma derogada, con efectos a partir del 1 de enero de 2022, por la disposición derogatoria única.2.c) del Real Decreto 739/2021, de 24 de agosto. Ref. BOE-A-2021-15095#dd

El organismo nocivo Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., conocido anteriormente por Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, es causa de las enfermedades de la «podredumbre parda» en los tubérculos de patata y de la «marchitez bacteriana» en las plantas de patata, tomate y otras especies de solanáceas, y representa una grave amenaza para las producciones de estos cultivos.

Debido a que en los últimos años han aparecido brotes de las enfermedades citadas en algunas partes de la Comunidad Europea y que aún subsisten algunos focos de infección aislados, y en particular respecto a España se han producido algunas intercepciones en Castilla y León y Galicia y, dicha bacteria está presente con una distribución localizada en la isla de La Palma en Canarias; considerando la importancia económica de los citados productos vegetales; y teniendo en cuenta que el conocimiento actual de la biología y epidemiología de Ralstonia solanacearum en las condiciones europeas es incompleto y que puede preverse la necesidad de revisar en el futuro las medidas y los procedimientos de análisis aquí establecidos, se hace preciso adoptar las medidas mínimas necesarias contempladas en la Directiva 98/57/CE del Consejo, de 20 de julio de 1998, sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. mediante el correspondiente programa de erradicación y control y ello sin perjuicio de que se adopten las medidas adicionales más estrictas que resulten necesarias.

En consecuencia, mediante este Real Decreto, se incorpora al ordenamiento interno la Directiva 98/57/CE, del Consejo, de 20 de julio, de acuerdo con las competencias atribuidas al Estado con carácter exclusivo por el artículo 149.1.13.^a de la Constitución Española en materia de bases y coordinación de la planificación general de la actividad económica.

En la elaboración de la presente disposición han sido consultadas las Comunidades Autónomas y los sectores afectados.

En su virtud, a propuesta del Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentación, previo informe del Ministro de Administraciones Públicas, de acuerdo con el Consejo de Estado, y previa deliberación en el Consejo de Ministros del día 22 de octubre de 1999,

DISPONGO:

Artículo 1. Objeto.

La presente disposición establece el programa de erradicación y control del organismo Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., anteriormente denominado Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (denominado en lo sucesivo «del organismo») de acuerdo con el artículo 12 del Real Decreto 1190/1998, de 12 de junio, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación o control de organismos nocivos de los vegetales aún no establecidos en el territorio nacional, con el fin de que, en lo que respecta a las plantas huésped del organismo indicadas en la sección I del anexo I del presente Real Decreto (denominadas en lo sucesivo «del material vegetal indicado»), se adopten las medidas necesarias para:

2. Se declaran de utilidad pública las medidas contempladas en el presente Real Decreto, de conformidad con lo establecido en el Real Decreto 1190/1998.

Artículo 2. Ámbito de aplicación y vigencia del programa.

1. El programa que se aprueba y las medidas de él dimanantes serán de aplicación en todo el territorio nacional.

2. En tanto la Comisión de las Comunidades Europeas no se pronuncie al respecto, la duración del programa se prevé ilimitada. En todo momento y como consecuencia de la situación de la enfermedad, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación podrá introducir las modificaciones que se consideren necesarias o determinar su conclusión.

Artículo 3. Exámenes oficiales.

1. Los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma, a los que se hace referencia en el artículo 11.2 b) del Real Decreto 2071/1993, de 26 de noviembre, relativo a las medidas de protección contra la introducción y difusión, en el territorio nacional y de la Comunidad Europea, de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales; así como para la exportación y tránsito hacia países terceros y el órgano competente de la Comunidad Autónoma de Canarias, llevarán a cabo anualmente exámenes oficiales sistemáticos para detectar la posible presencia del organismo en el material vegetal indicado originario de su territorio.

Con objeto de determinar otras posibles fuentes de contaminación existentes para el cultivo del material vegetal indicado, los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma llevarán a cabo una evaluación de riesgo y, salvo que no se haya detectado riesgo alguno de propagación durante dicha evaluación, efectuarán, en las zonas productoras de dicho material, exámenes oficiales orientados específicamente a la detección del organismo en plantas distintas de ese material, incluidas las solanáceas silvestres huésped, así como en las aguas de superficie que se utilicen para regar tal material y en los residuos líquidos vertidos por las instalaciones industriales de transformación o de embalaje en las que se manipule el material indicado y que se utilicen para regar el material vegetal indicado. La extensión de estos exámenes orientados se determinará en función del riesgo observado.

Los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma podrán realizar también exámenes oficiales destinados a la detección del organismo en otros materiales, como el medio de cultivo, el suelo y los residuos sólidos procedentes de las instalaciones industriales de transformación o de embalaje.

2. Los exámenes oficiales previstos en el apartado 1 del artículo 3 se efectuarán:

Para la realización de esos exámenes, los pormenores de los procedimientos de inspección así como el número, origen y clasificación de las muestras y el calendario de su recogida serán decididos por los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma basándose en principios científicos y estadísticos sólidos y en la biología del organismo y teniendo en cuenta, según la región de que se trate, los sistemas concretos que se utilicen para la producción del material vegetal indicado y, en su caso, de otras plantas huésped del organismo.

3. Los detalles y resultados de los exámenes oficiales previstos en el apartado 1 del artículo 3 serán notificados al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, y éste, a su vez, a través del cauce correspondiente, a los demás Estados miembros y a la Comisión Europea cada año, siguiendo, a tal efecto, las disposiciones del punto 2 de la sección II del anexo I del presente Real Decreto. Estas notificaciones se presentarán, a más tardar, el 15 de mayo, salvo en el caso de las patatas utilizadas para siembra en la propia explotación, que se presentarán, a más tardar, el 15 de agosto. Los detalles y resultados relativos a los cultivos se referirán a la producción del año anterior.

Artículo 4. Obligación de notificación.

Los productores, los almacenes colectivos y los centros de expedición de los materiales contemplados en la sección I del anexo I del presente Real Decreto deberán notificar inmediatamente a los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma, en las que estén situadas sus parcelas o establecimientos, la aparición sospechosa o la presencia confirmadas del organismo en el material que produzca o comercialice.

Artículo 5. Medidas cautelares.

1. En todos los casos de sospecha de brote, los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma afectada velarán por la realización de análisis de laboratorio oficiales o bajo supervisión oficial en los que se aplique, para el material vegetal indicado, el método pertinente establecido en el anexo II y en las condiciones determinadas en el punto 1 del anexo III del presente Real Decreto o, en todos los demás casos, cualquier otro método aprobado oficialmente que permita confirmar o despejar la sospecha en cuestión. En caso de confirmación, serán de aplicación los requisitos dispuestos en el punto 2 del anexo III del presente Real Decreto.

2. En espera de la confirmación o disipación de la sospecha a la que se refiere el apartado 1 del artículo 5, en todos los casos en que:

Los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma, en lo que respecta a la producción propia:

3. En los casos de sospecha de brote en que exista un riesgo de contaminación del material vegetal indicado o de las aguas de superficie que procedan o se dirijan a otra u otras Comunidades Autónomas o, en su caso, a otro Estado miembro, la Comunidad Autónoma en la que se haya observado el presunto brote informará inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación de los detalles de dicho brote y del nivel de riesgo identificado para que éste a su vez, a través del cauce correspondiente, informe a las Comunidades Autónomas o a los Estados miembros afectados, y dichas Comunidades Autónomas cooperarán en consecuencia. Las Comunidades Autónomas a las que así se informe aplicarán medidas preventivas acordes con lo dispuesto en la letra c) del apartado 2 del artículo 5 y tomarán cualquier otra medida que resulte adecuada de conformidad con lo dispuesto en los apartados 1 y 2 del mismo.

Artículo 6. Confirmación de la presencia del organismo.

1. Si la presencia del organismo en una muestra, tomada en cumplimiento del presente Real Decreto, fuere confirmada por análisis de laboratorios oficiales o bajo supervisión oficial en los que se utilice, para el material vegetal indicado, el método establecido en el anexo II del presente Real Decreto o, para todos los demás casos, cualquier otro método oficialmente aprobado, los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma, basándose a tal efecto en principios científicos sólidos, en la biología del organismo y en los sistemas concretos de producción, comercialización y transformación que se utilicen en su territorio para las plantas huésped del organismo, adoptarán las siguientes medidas:

ii) declararán contaminados el material vegetal indicado, la partida o el lote de los que se haya tomado la muestra, así como la maquinaria, vehículo, nave, almacén, o unidades de éste, y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que hayan estado en contacto con el material vegetal indicado al que pertenezca la muestra tomada; asimismo, declararán contaminados, en su caso, el campo o campos, la unidad o unidades de producción de cultivos protegidos y el lugar o lugares de producción en los que se haya cosechado el material vegetal indicado y de los que proceda la muestra; además, en el caso de las muestras tomadas durante la fase de cultivo, declararán contaminados el campo o campos, el lugar o lugares de producción y, si procediere, la unidad o unidades de producción de cultivos protegidos de los que se haya tomado la muestra;

iii) determinarán, con arreglo a las disposiciones del punto 1 del anexo V del presente Real Decreto, el alcance de la contaminación que probablemente se haya producido por contactos anteriores o posteriores a la cosecha, por nexos en la producción, riego o por relaciones clonales con la contaminación declarada; y

iv) delimitarán una zona en función de tres factores: la declaración de contaminación contemplada en el inciso ii) anterior, el alcance de la contaminación probable que se determine en el marco del inciso iii) anterior y la posible propagación del organismo, con arreglo a las disposiciones del inciso i) del punto 2 del anexo V del presente Real Decreto.

ii) declararán contaminadas las plantas huésped del organismo de las que se haya tomado la muestra; y iii) con respecto a la producción del material vegetal indicado, determinarán el alcance de la contaminación probable y delimitarán una zona de conformidad con los incisos iii) y iv) de la letra a), respectivamente.

ii) procederán, en la medida que sea pertinente y sobre la base de la investigación mencionada en el inciso i), a declarar contaminadas las aguas de superficie de las que se hayan tomado la muestra o muestras; y,

iii) determinarán el alcance de la contaminación probable y delimitarán una zona en función de la declaración de contaminación contemplada en el inciso ii) anterior y de la posible propagación del organismo, teniendo en cuenta las disposiciones del punto 1 y del inciso ii) del punto 2 del anexo V del presente Real Decreto.

2. De conformidad con las disposiciones de los puntos 3 y 4 del anexo V del presente Real Decreto, las Comunidades Autónomas notificarán inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, y éste, a su vez, a través del cauce correspondiente, a los otros Estados miembros y a la Comisión Europea, cualquier caso de contaminación declarada en virtud del inciso ii) de la letra a) y del inciso ii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 6, así como los datos relativos a la zona que se haya delimitado con arreglo al inciso iv) de la letra a) del apartado 1 del artículo 6 y, en su caso, al inciso iii) de la letra c) de ese mismo apartado.

3. Como resultado de la notificación dispuesta en el apartado 2 y de los datos en ella contenidos, las Comunidades Autónomas afectadas emprenderán una investigación de acuerdo con el inciso i) de la letra a) del apartado 1 del artículo 6 y, en su caso, con el inciso i) de la letra c) del mismo apartado, y tomarán las medidas complementarias que sean adecuadas de conformidad con los apartados 1 y 2 del artículo 6.

4. Se crea en el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación un registro de las explotaciones, los almacenes colectivos y los centros de explotación afectados.

Artículo 7. Medidas fitosanitarias a adoptar sobre el material contaminado.

1. Se prohíbe la plantación del material vegetal indicado que se haya declarado contaminado en virtud del inciso ii) de la letra a) del apartado 1 del artículo 6 y, bajo el control y aprobación de los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma, dicho material será sometido a una de las disposiciones del punto 1 del anexo VI del presente Real Decreto con el fin de que pueda establecerse que no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo.

2. Se prohíbe la plantación del material vegetal indicado que, en virtud del inciso iii) de la letra a) y del inciso iii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 6, se haya considerado probablemente contaminado, incluido el material vegetal indicado respecto del que se haya detectado la existencia de algún riesgo, producido en lugares de producción que con arreglo al inciso iii) de la letra a) del apartado 1 del artículo 6 se hayan considerado probablemente contaminados, y, bajo el control de los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma, dicho material se destinará a un uso adecuado o se eliminará de acuerdo con el punto 2 del anexo VI del presente Real Decreto a fin de que pueda establecerse que no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo.

3. Toda maquinaria, vehículo, nave, almacén o unidades de éstos y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que se hayan declarado contaminados en virtud del inciso ii) de la letra a) y del inciso iii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 6 o que se hayan considerado probablemente contaminados en virtud del inciso iii) de la letra a) del apartado 1 del mismo artículo será destruido o descontaminado, aplicando métodos apropiados, de conformidad con el punto 3 del anexo VI del presente Real Decreto. Tras su descontaminación, todos estos objetos dejarán de considerarse contaminados.

4. Sin perjuicio de las medidas que se ejecuten en virtud de los apartados 1, 2 y 3 del artículo 7, en la zona delimitada con arreglo a los incisos iv) de la letra a) y iii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 6 se aplicarán una serie de medidas acordes con lo dispuesto en los puntos 4.1 y 4.2 del anexo VI del presente Real Decreto. Cada año se notificarán detalles de estas medidas al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, y éste, a su vez, a través del cauce correspondiente, a los demás Estados miembros y a la Comisión Europea.

5. Las medidas fitosanitarias ordenadas por los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma contempladas en los apartados 1, 2, 3 y 4 del artículo 7 serán realizadas, bajo control oficial, por el propietario del material afectado.

En el caso de que los afectados no ejecuten a su debido tiempo y forma las medidas a que se refiere el párrafo anterior, la Comunidad Autónoma procederá a ejecutarlas, con sus propios medios o empleando servicios ajenos, cargando los gastos correspondientes a los interesados, cuyo importe podrá exigírseles por vía de apremio, con independencia de las sanciones a que hubiere lugar.

Artículo 8. Medidas aplicables para evitar la contaminación mediante patata de siembra.

1. Las patatas de siembra deberán reunir los requisitos del Real Decreto 2071/1993 y proceder, en línea directa, de patatas que, habiéndose obtenido en el marco de un programa oficialmente aprobado, hayan dado resultados negativos en cuanto a la presencia del organismo en análisis oficiales u oficialmente supervisados en los que se haya utilizado el método pertinente establecido en el anexo II del presente Real Decreto.

2. Dichos análisis serán efectuados:

Artículo 9. Prohibición.

Se prohíbe la conservación y manipulación del organismo a que se refiere el presente Real Decreto.

Artículo 10. Excepciones con fines científicos.

Sin perjuicio de las disposiciones del Real Decreto, 2071/1993, se podrán autorizar excepciones a lo dispuesto en los artículos 7 y 9 del presente Real Decreto, de conformidad con las normas establecidas para la realización de pruebas e investigaciones científicas o de estudios en materia de selecciones varietales en el Real Decreto 401/1996, de 1 de marzo, por el que se establecen las condiciones para la introducción en el territorio nacional de determinados organismos nocivos, vegetales, productos vegetales y otros objetos, con fines de ensayo, científicos y para la actividad de selección de variedades y en el Real Decreto 39/1998, de 16 de enero, por el que se modifica el Real Decreto 401/1996, de 1 de marzo, por el que se establecen las condiciones para la introducción en el territorio nacional de determinados organismos nocivos vegetales, productos vegetales y otros objetos, con fines de ensayo, científicos y para la actividad de selección de variedades.

Artículo 11. Medidas adicionales.

1. Los órganos competentes de las Comunidades Autónomas podrán adoptar las medidas complementarias o más estrictas que sean necesarias para combatir el organismo o impedir su propagación, siempre que tales medidas se ajusten a las disposiciones del Real Decreto 2071/1993.

2. Los detalles de estas medidas deberán ser notificados al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, y éste, a su vez, los notificará, a través del cauce correspondiente, a los demás Estados miembros y a la Comisión.

Artículo 12. Indemnizaciones.

1. Se aplicará el sistema de indemnizaciones previsto en el artículo 18 del Real Decreto 1190/1998, de 12 de junio, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación o control de organismos nocivos de los vegetales aún no establecidos en el territorio nacional.

2. No son indemnizables los gastos ocasionados ni el material vegetal destruido en aplicación de una medida oficial, cuando el propietario de los vegetales o productos vegetales afectados haya incumplido la normativa vigente y, especialmente, lo determinado en el Real Decreto 2071/1993, de 26 de noviembre, relativo a las medidas de protección contra la introducción y difusión en el territorio nacional y de la Comunidad Económica Europea de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales; así como para la exportación y tránsito hacia países terceros.

3. En el caso de que el afectado por la contaminación de un lote suministrado por un productor, almacenista u operador que hubiera incumplido lo determinado en la legislación vigente, percibiera indemnización por parte de cualquiera de estos sujetos, y por parte de la Administración, reembolsará a la Administración la indemnización percibida.

4. El Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, dentro de los límites establecidos por los créditos disponibles para estos fines, participará, con cargo a sus presupuestos, en la cuantía del 50 por 100 de los gastos ocasionados en la ejecución del programa.

Disposición transitoria única. Medidas provisionales.

En tanto no se pronuncie la Comisión Europea y para garantizar unos niveles de seguridad comparables entre las diferentes Comunidades Autónomas, se podrán adoptar, previo informe favorable del Comité Fitosanitario Nacional:

Los métodos apropiados para los exámenes y análisis previstos en las letras b) y c) del párrafo primero del apartado 2 del artículo 3 y cualquier precisión de los procedimientos previstos en el párrafo segundo del apartado 2 del mismo.

Las medidas complementarias previstas en la letra c) del apartado 2 del artículo 5.

Las normas de desarrollo de la letra a) del apartado 2 del artículo 8 y las disposiciones aplicables a las muestras representativas a las que se refiere la letra b) del mismo apartado y artículo.

El Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación solicitará su adopción a la Comisión Europea a través del cauce establecido en el artículo 16 bis de la Directiva 77/93/CEE, del Consejo, de 21 de diciembre de 1976, relativa a las medidas de protección contra la introducción en la Comunidad de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales y contra su propagación en el interior de la Comunidad.

Disposición adicional primera. Comunicación al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.

Sin perjuicio de las notificaciones estipuladas en los apartados 3 de los artículos 3 y 5, en el apartado 2 del artículo 6 y en el artículo 11 los órganos competentes de las Comunidades Autónomas, comunicarán al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación:

Disposición adicional segunda. Normativa general aplicable.

El Real Decreto 2071/1993, de 26 de noviembre, relativo a las medidas de protección contra la introducción en el territorio nacional y de la Comunidad Económica Europea de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales y el Real Decreto 1190/1998, de 12 de junio, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación o control de organismos nocivos de los vegetales aún no establecidos en el territorio nacional serán aplicables sin perjuicio de las normas específicas del presente Real Decreto.

Disposición adicional tercera. Carácter básico.

Lo dispuesto en el presente Real Decreto tendrá carácter de normativa básica, al amparo de lo establecido en el artículo 149.1.13.^a de la Constitución, que reserva al Estado la competencia en materia de bases y coordinación de la planificación general de la actividad económica.

Disposición final primera. Facultad de desarrollo.

Se faculta al Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentación para dictar, en el ámbito de sus competencias, las disposiciones necesarias para el desarrollo y aplicación del presente Real Decreto y, en particular, previo informe del Comité Fitosanitario Nacional, las normas provisionales de desarrollo de las letras a) y b) del apartado 2 del artículo 8 y, a la vista de la evolución de los conocimientos científicos o técnicos, las modificaciones que sea preciso introducir en los anexos del presente Real Decreto, en tanto la Comisión Europea no resuelva al respecto.

Disposición final segunda. Entrada en vigor.

El presente Real Decreto entrará en vigor el día siguiente al de su publicación en el «Boletín Oficial del Estado».

Dado en Madrid a 22 de octubre de 1999.

JUAN CARLOS R.

El Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentación,

JESÚS POSADA MORENO

ANEXO I

SECCIÓN I

Lista de plantas huésped de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.a las que se refiere el artículo 1

Plantas (incluidos los tubérculos), salvo las semillas verdaderas, de Solanum tuberosum L.: Patata.

Plantas, salvo las semillas y los frutos, de Lycopersicum lycopersicum (L.) Karsten ex Farw.: Tomate.

SECCIÓN II

Exámenes

1. Los exámenes oficiales contemplados en la letra a) del apartado 2 del artículo 3 se basarán en la biología del organismo, así como en los sistemas de producción concretos que se utilicen en la Comunidad Autónoma de que se trate, e incluirán lo siguiente:

en los momentos oportunos, una inspección visual del cultivo en crecimiento, y/o muestras de patatas de siembra y de otras patatas durante la fase de crecimiento o almacenadas; estas muestras se someterán a una inspección visual oficial o bajo supervisión oficial, para lo cual se procederá a seccionar los tubérculos, y

en el caso de las patatas de siembra y, si procede, de otras patatas, análisis de laboratorio oficiales o bajo supervisión oficial en los que se utilice el método establecido en el anexo II del presente Real Decreto;

ii) en el caso de los tomates:

en los momentos oportunos, una inspección visual de, al menos, el cultivo en crecimiento de plantas destinadas a la replantación para utilización profesional.

2. La notificación de los exámenes oficiales dispuesta en el apartado 3 del artículo 3 incluirá los datos siguientes:

la superficie total estimada, en hectáreas, de los cultivos de patatas de siembra y de otras patatas,

la clasificación por categorías (de siembra y de consumo) y, en su caso, por regiones,

la cantidad de muestras tomadas para los análisis y el momento de su recogida,

el número de inspecciones visuales efectuadas en el campo,

el número de inspecciones visuales realizadas en tubérculos (y la cantidad de muestras);

ii) en el caso de los exámenes de, al menos, el cultivo en crecimiento de plantas de tomate destinadas a la replantación para utilización profesional:

la cantidad total estimada de plantas,

el número de inspecciones visuales;

iii) en el caso de los exámenes de plantas huésped del organismo distintas de la patata y el tomate, incluidas las solanáceas silvestres huésped:

la especie,

la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida,

la zona o río objeto del muestreo, según proceda, el método de análisis;

iv) en el caso de los exámenes de aguas y de los vertidos de residuos líquidos procedentes de las instalaciones industriales de transformación o de embalaje:

la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida,

la zona, río o ubicación de la instalación objeto del

muestreo, según corresponda, el método de análisis.

ANEXO II. Método de diagnóstico, detección e identificación de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al

ÁMBITO DE APLICACIÓN DEL MÉTODO

El presente método describe los diversos procedimientos relacionados con:

ii) la detección de Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) en muestras de tubérculos de patata, plantas de patata, tomate y otras plantas huésped, agua y suelo,

iii) la identificación de R. solanacearum.

PRINCIPIOS GENERALES

En los apéndices se presentan protocolos optimizados para los diferentes métodos y reactivos validados, así como información detallada para la preparación de materiales de prueba y control. En el apéndice 1 se presenta una lista de los laboratorios que se incluyeron en la optimización y validación de los protocolos.

Habida cuenta de que los protocolos implican la detección de un organismo de cuarentena y de que incluirán la utilización de cultivos viables de R. solanacearum como materiales de control, será preciso llevar a cabo los procedimientos bajo condiciones de cuarentena apropiadas, con instalaciones adecuadas de eliminación de residuos y en aplicación de las condiciones de obtención de los permisos apropiados emitidos por las autoridades oficiales de cuarentena de las plantas.

Los parámetros de las pruebas deben garantizar una detección coherente y reproducible de niveles de R. solanacearum en los límites establecidos en los métodos seleccionados.

Es imprescindible una preparación precisa de los controles positivos.

Asimismo, la realización de pruebas con arreglo a los niveles requeridos implica la utilización de los parámetros correctos, el mantenimiento y el calibrado del equipo, una preservación y manipulación cuidadosa de los reactivos y todas las medidas para evitar la contaminación entre las muestras, como por ejemplo la separación de los controles positivos de las muestras de ensayo. Deben aplicarse normas de control de la calidad para evitar errores administrativos y de otro tipo, especialmente de etiquetado y documentación.

Una sospecha de brote, tal como se menciona en el artículo 5, apartado 2, de este real decreto, implica la obtención de un resultado positivo de las pruebas de diagnóstico o selección efectuadas a una muestra tal como se especifica en los siguientes diagramas de flujo. Un resultado positivo en la primera prueba de selección (prueba IF, PCR/FISH, aislamiento selectivo) debe confirmarse con una segunda prueba de selección basada en un principio biológico diferente.

Si la primera prueba de selección proporciona un resultado positivo, se sospecha entonces la contaminación con R. solanacearum y debe efectuarse una segunda prueba de selección. Si la segunda prueba de selección proporciona un resultado positivo, se confirma entonces la sospecha (sospecha de presencia) y debe continuar la prueba con arreglo al método. Si la segunda prueba de selección proporciona un resultado negativo, se considera entonces que la muestra no está contaminada con R. solanacearum.

Una presencia confirmada, tal como se menciona en el artículo 6, apartado 1, de este real decreto, implica el aislamiento y la identificación de un cultivo puro de R. solanacearum con confirmación de patogenicidad.

SECCIÓN I

APLICACIÓN DEL MÉTODO

1. Método de detección para el diagnóstico de la podredumbre parda y la marchitez bacteriana (R. solanacearum) en tubérculos de patata y plantas de patata, tomate u otras plantas huésped con síntomas de podredumbre parda o marchitez bacteriana

El procedimiento de análisis está destinado a los tubérculos de patata y a las plantas que presentan síntomas típicos de la podredumbre parda o la marchitez vascular o que permiten la sospecha de su presencia. Incluye una prueba de selección rápida, el aislamiento del patógeno del tejido vascular infectado en un medio (selectivo) y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivo como R. solanacearum.

(1) Para la descripción de los síntomas véase la sección II.1.

(2) Las pruebas de diagnóstico rápido facilitan el diagnóstico de presunción, pero no son esenciales. Un resultado negativo no garantiza en todos los casos la inexistencia del patógeno.

(3) En la sección VI.A.1 se describe la prueba de la exudación para el líquido bacteriano del tejido vascular del tallo.

(4) En la sección VI.A.2 se describe la prueba de detección de gránulos de poli-β-hidroxibutirato en células bacterianas.

(5) En la sección VI.A.3 se describen las pruebas de aglutinación serológíca en líquido bacteriano o extractos de tejido sintomático.

(6) En la sección VI.A.5 se describe la prueba IF en líquido bacteriano suspendido en agua o extractos de tejido sintomático.

(7) En la sección VI.A.7 se describe la prueba FISH en líquido bacteriano suspendido en agua o extractos de tejido sintomático.

(8) En la sección VI.A.8 se describe la prueba ELISA en líquido bacteriano suspendido en agua o extractos de tejido sintomático.

(9) En la sección VI.A.6 se describe la prueba PCR en líquido bacteriano suspendido en agua o extractos de tejido sintomático.

(10) El patógeno suele aislarse con facilidad del material vegetal sintomático mediante dilución en placas (sección II.3).

(11) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II.3.d.

(12) El aislamiento puede fallar en estados avanzados de infección debido a la competencia o el enmascaramiento por bacterias saprofitas. Sí los síntomas de la enfermedad son los típicos, pero el aislamiento es negativo, deberá repetirse el aislamiento, preferentemente valiéndose de una siembra en medio selectivo.

(13) La identificación fiable de cultivos puros posibles aislados de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B. La caracterización subespecífíca de las cepas es optativa, pero se recomienda en cada caso nuevo.

(14) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.

2. Método de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de tubérculos de patata

Fundamento

El protocolo de análisis tiene por objeto la detección de infecciones latentes en tubérculos de patata. Un resultado positivo de un mínimo de dos pruebas de selección, basadas en diferentes principios biológicos, debe complementarse con el aislamiento del patógeno, seguido, en caso de aislamiento de colonias típicas, por la confirmación de un cultivo puro como R. solanacearum. Un resultado positivo de solamente una de las pruebas de selección no es suficiente para considerar sospechosa la muestra.

Las pruebas de selección y las pruebas de aislamiento deben permitir la detección de 10³ a 10⁴ células/ml de precipitado resuspendido, incluidas como controles positivos en cada serie de pruebas.

(1) El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos, aunque eL procedimiento puede utilizarse con muestras más pequeñas si no se dispone de 200 tubérculos.

(2) En la sección III.1.1 se describen los métodos de extracción y concentración de patógenos.

(3) Si un mínimo de dos pruebas basadas en diferentes principios biológicos proporcionan resultados positivos, debe efectuarse el aislamiento y la confirmación. Efectúese como mínimo una prueba de selección. Cuando esta prueba dé resultados negativos, se considerará que la muestra es negativa. En caso de que la prueba dé resultados positivos, deberá efectuarse una segunda prueba de selección, o varias más, basadas en diferentes principios biológicos, con el fin de verificar el primer resultado positivo. Si la segunda prueba o las pruebas siguientes proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa. No será preciso efectuar otras pruebas.

(4) En la sección VI.A.5 se describe la prueba IF.

(5) En la sección VI.A.4 se describe la prueba de aislamiento selectivo.

(6) En la sección VI.A. 6 se describen las pruebas PCR.

(7) En la sección VI.A.7 se describe la prueba FISH.

(8) En la sección VI.A.8 se describen las pruebas ELISA.

(9) En la sección VI.A.9 se describe la prueba del bioensayo.

(10) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II. 3. d.

(11) El aislamiento o los bioensayos pueden fallar debido a la competencia o la inhibición por bacterias saprofitas. Si se obtienen resultados positivos claros en las pruebas de selección, pero las pruebas de aislamiento dan resultados negativos, entonces deben repetirse las pruebas de aislamiento a partir del mismo precipitado o tomando más tejido vascular cerca de la parte basal de tubérculos cortados de la misma muestra y, en caso necesario, analizar otras muestras,

(12) La identificación fiable de cultivos puros aislados posibles de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B.

(13) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.

3. Método de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de patatas, tomates y otras plantas huésped

(1) Véase la sección III.2.1 para los tamaños recomendados de las muestras.

(2) En la sección III.2.1 se describen los métodos de extracción y concentración de patógenos.

(3) Si un mínimo de dos pruebas basadas en diferentes principios biológicos proporcionan resultados positivos, debe efectuarse el aislamiento y la confirmación. Efectúese como mínimo una prueba de selección. Cuando esta prueba dé resultados negativos, se considerará que la muestra es negativa. En caso de que la prueba dé resultados positivos, deberá efectuarse una segunda prueba de selección, o varias más, basadas en diferentes principios biológicos, con el fin de verificar el primer resultado positivo, Si la segunda prueba o las pruebas siguientes proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa. No será preciso efectuar otras pruebas.

(4) En la sección VI.A.4 se describe la prueba de aislamiento selectivo.

(5) En la sección VI.A.5 se describe la prueba IF.

(6) En la sección VI.A.6 se describen las pruebas PCR.

(7) En la sección VI.A.7 se describe la prueba FISH.

(8) En la sección VI.A.8 se describen las pruebas ELISA.

(9) En la sección VI.A.9 se describe la prueba del bioensayo.

(10) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II.3.d.

(11) El aislamiento o los bioensayos pueden fallar debido a la competencia o la inhibición por bacterias saprofitas. Si se obtienen resultados positivos en las pruebas de selección, pero las pruebas de aislamiento dan resultados negativos, entonces deben repetirse las pruebas de aislamiento.

(12) La identificación fiable de cultivos puros posibles aislados de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B.

(13) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.

SECCIÓN II

MÉTODOS DETALLADOS DE DETECCIÓN DE R. SOLANACEARUM EN TUBÉRCULOS DE PATATA Y PLANTAS DE PATATA, TOMATE U OTRAS PLANTAS HUÉSPED CON SÍNTOMAS DE LA PODREDUMBRE PARDA O LA MARCHITEZ BACTERIANA

1. Síntomas (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1 Síntomas en patata:

En planta de patata. La fase inicial de la infección en el campo se reconoce por un marchitamiento de las hojas en progresión ascendente hacia el extremo superior de la planta, bajo el efecto de las temperaturas diurnas altas, con una recuperación durante la noche. En las primeras fases del marchitamiento, las hojas siguen estando verdes, pero posteriormente se desarrolla necrosis parda y amarilleo. También se produce epinastia. El marchitamiento de un brote o de plantas enteras se hace rápidamente irreversible y ocasiona el colapso y la muerte de la planta. El tejido vascular de los tallos de las plantas marchitadas cortados transversalmente suele ser pardo, y de la superficie del corte brota un exudado mucoso bacteriano o este puede extraerse apretando el tallo. Si se coloca verticalmente un tallo cortado en agua, de los haces vasculares salen hilos viscosos.

En tubérculo de patata. Los tubérculos de patata deben cortarse transversalmente cerca de la parte basal (estolón) o bien longitudinalmente sobre el estolón. Posteriormente, la decoloración vascular adquiere un tono pardo más marcado y la necrosis puede extenderse al tejido parenquimático. En las fases avanzadas, la infección progresa desde la parte basal y los ojos, por las que pueden fluir exudados bacterianos, lo que hace que se adhieran partículas del suelo. Pueden aparecer en la piel lesiones ligeramente hundidas de color pardo rojizo debido al colapso interno de los tejidos vasculares. En las fases avanzadas de la enfermedad es habitual el desarrollo secundario de podredumbres blandas causadas por hongos y bacterias.

1.2 Síntomas en tomate

En planta de tomate. El primer síntoma visible es el aspecto flácido de las hojas más jóvenes. Si se producen condiciones medioambientales favorables para el patógeno (temperaturas del suelo de 25°C; humedad saturada), en un plazo de pocos días se produce epinastia y marchitamiento de un lado de la planta o de toda ella, lo que desemboca en un colapso total de la planta. En condiciones menos favorables (temperatura del suelo por debajo de 21°C), se produce un menor marchitamiento, pero pueden surgir numerosas raíces adventicias del tallo. En ocasiones se observan estrías húmedas desde la base del tallo, lo que demuestra la existencia de necrosis en el sistema vascular.

Al cortar transversalmente el tallo, los tejidos vasculares que presentan una decoloración parda exudan gotas de líquido bacteriano blanco o amarillento.

1.3 Sintomas en otros huéspedes

Plantas de Solanum dulcamara y S. nigrum. En condiciones naturales, en pocos casos se observan síntomas de marchitamiento en estos huéspedes herbáceos a no ser que la temperatura del suelo supere los 25°C o los niveles de inóculo sean extremadamente elevados (por ejemplo, para S. nigrum que crezca junto a plantas enfermas de patatas o tomates). Cuando se produce el marchitamiento, los síntomas son como los descritos para el tomate. Las plantas de S. dulcamara, que no se marchitan y que crecen con tallos y raíces en el agua, pueden mostrar una decoloración interna pardo claro de los tejidos vasculares en una sección transversal de la base del tallo, o de las partes del tallo que se encuentran bajo el agua. Pueden fluir bacterias de los tejidos vasculares cortados, o formar hilos viscosos, si el tallo cortado se coloca verticalmente en el agua, incluido en caso de inexistencia de síntomas de marchitamiento.

2. Pruebas de selección rápida

Las pruebas de selección rápida facilitan el diagnóstico de presunción, pero no son esenciales. Realícese una o más de las siguientes pruebas validadas:

2.1 Prueba de la exudación del tallo (Véase la sección VI.A.1.)

2.2 Prueba de la detección de gránulos de poli-βhidroxibutirato (PHB)

Los gránulos de PHB característicos en las células de R. solanacearum se visualizan tiñendo frotis de exudado bacteriano fijado con calor procedente de tejido infectado en un portaobjetos con azul Nilo A o negro Sudán B (véase la sección VI.A.2).

2.3 Pruebas de aglutinación serológica (Véase la sección VI.A.3.)

2.4 Otras pruebas

Otras pruebas de selección rápida apropiadas incluyen la prueba IF (véase la sección VI.A.5), la prueba FISH (véase la sección VI.A.7), las pruebas ELISA (véase la sección VI.A.8) y las pruebas PCR (véase la sección VI.A.6).

3. Proceso de aislamiento

– En un medio nutritivo general, los aislados virulentos de R. solanacearum desarrollan colonias de color blanco nacarado, planas, irregulares y fluidas, que con frecuencia presentan los verticilos característicos en el centro. Las formas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butirosas pequeñas, redondas y no fluidas, que son completamente blancas.

– En los medios de tretrazolio de Kelman y SMSA, los verticilos son de color rojo sangre. Las formas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butirosas pequeñas, redondas y no fluidas, que son totalmente de color rojo oscuro.

4. Pruebas de identificación de R. solanacearum

Las pruebas para confirmar la identidad de presuntos aislados de R. solanacearum se muestran en la sección VI.B.

SECCIÓN III

1. Métodos detallados de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de tubérculos de patata

1.1 Preparación de la muestra

Nota:

– El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos. Un muestreo más intensivo requiere más pruebas en muestras de este tamaño. Un mayor número de tubérculos en la muestra producirá inhibición o una interpretación difícil de los resultados. Sin embargo, el procedimiento puede aplicarse convenientemente a muestras de menos de 200 tubérculos, cuando se disponga de pocos tubérculos.

– La validación de todos los métodos de detección descritos a continuación se basa en la realización de pruebas a muestras de 200 tubérculos.

– El extracto de patata descrito a continuación puede utilizarse también para la detección de la bacteria de la necrosis bacteriana de la patata, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Pretratamiento opcional previo a la preparación de la muestra:

1.1.1 Quitar la epidermis de la parte basal (estolón) del tubérculo con un bisturí o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que los tejidos vasculares queden a la vista. Extraer con cuidado una cuña cónica pequeña de tejido vascular de la parte basal y extraer el mínimo volumen posible de tejido no vascular.

(véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main).

Nota: Retirar los tubérculos (podridos) que presenten síntomas sospechosos de «podredumbre parda» y analizarlos por separado.

Si durante la extracción de la cuña de la parte basal se observan síntomas sospechosos de podredumbre parda, deberá efectuarse una inspección visual del tubérculo, y cortarse este cerca de la parte basal. Todo tubérculo cortado con síntomas sospechosos deberá guardarse durante un mínimo de dos días a temperatura ambiente a fin de permitir la suberización y almacenar refrigerado (a 4-10°C) en condiciones de cuarentena apropiadas. Todos los tubérculos, incluidos los que presenten síntomas sospechosos, deberán mantenerse con arreglo a lo establecido en el anexo III.

1.1.2 Colocar las cuñas de la parte basal en recipientes desechables no utilizados que puedan cerrarse y/o sellarse (en caso de reutilización de los recipientes, deberán limpiarse y desinfectarse por completo utilizando compuestos de cloro). Es conveniente procesar las cuñas inmediatamente. Si esto no es posible, almacenarlas en el recipiente, sin añadir ningún tampón, refrigeradas durante un período máximo de 72 horas o de 24 horas a temperatura ambiente.

Procesar las cuñas por uno de los métodos siguientes:

o bien

Nota: Existe un elevado riesgo de contaminación cruzada de muestras cuando se homogenizan las muestras utilizando una trituradora. Tomar precauciones a fin de evitar la generación de aerosoles o el vertido durante el proceso de extracción. Debe asegurarse que se utilizan para cada muestra recipientes y cuchillas de trituradora esterilizados. Si se utiliza la prueba PCR, evitar la transferencia de ADN en los recipientes o el aparato de trituración. Al utilizar PCR, se recomienda machacar el material en bolsas desechables y utilizar tubos desechables.

1.1.3 Se decanta el sobrenadante. Si es demasiado turbio, clarificarlo con una centrifugación a baja velocidad (no más de 180 g durante diez minutos a una temperatura entre 4-10°C) o mediante filtración al vacío (40-100 µm), lavando el filtro con tampón de extracción adicional (10 ml).

1.1.4 Concentrar las bacterias por centrifugación a 7.000 g durante 15 minutos (o 10.000 g durante diez minutos) a una temperatura entre 4-10°C y descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.

1.1.5 Resuspender el precipitado en 1,5 ml de tampón de precipitado (apéndice 4). Utilizar 500 µl para pruebas de R. solanacearum, 500 µl para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus y 500 µl para referencia. Añadir glicerol estéril a la concentración final de 10-25% (v/v) a los 500 µl de la alícuota de referencia y a la restante alícuota de prueba, mezclar y almacenar a una temperatura comprendida entre –16 a –24°C (semanas) o entre –68 a –86°C (meses). Mantener las alícuotas de prueba a entre 4-10°C durante la prueba.

No se aconseja congelar y descongelar repetidamente.

Si debe transportarse el extracto, entréguese en un recipiente frío en un plazo de 24 a 48 horas.

1.1.6 Es de capital importancia tratar por separado todos los controles y muestras positivos de R. solanacearum para evitar la contaminación. Esto se aplica a los portaobjetos IF y a todas las pruebas.

1.2 Análisis

Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas y los protocolos optimizados en los apéndices pertinentes:

Aislamiento selectivo (véase la sección VI.A.4)

Prueba IF (véase la sección VI.A.5)

Pruebas PCR (véase la sección VI.A.6)

Prueba FISH (véase la sección VI.A.7)

Pruebas ELISA (véase la sección VI.A.8)

Bioensayo (véase la sección VI.A.9)

2. Métodos detallados de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de patatas, tomates y otras plantas huésped

2.1 Preparación de la muestra

Nota: Para la detección de poblaciones latentes de R. solanacearum se aconseja someter a prueba muestras mixtas. El procedimiento puede aplicarse convenientemente a muestras mixtas de hasta 200 partes del tallo. Cuando se efectúen exámenes, deberán basarse en una muestra estadísticamente representativa de la población de plantas investigada.

2.1.1 Colocar segmentos de tallo de 1-2 cm en un recipiente estéril cerrado con arreglo a los siguientes procedimientos de muestreo:

Plántulas de tomate de vivero: con un cuchillo limpio y desinfectado, cortar un segmento de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo.

Plantas de tomate cultivadas en el campo o en un invernadero: con un cuchillo limpio y desinfectado, arrancar el brote lateral más inferior de cada planta cortando justo por encima de la unión con el tallo principal. Cortar un segmento de 1 cm del extremo inferior de cada brote lateral.

Otros huéspedes: con un cuchillo limpio y desinfectado o con tijeras de podar, cortar un segmento de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo. En el caso de S. dulcamara o de otras plantas huésped que crecen en el agua, cortar secciones de 1-2 cm de los tallos bajo el agua o estolones con raíces acuáticas.

Cuando se muestree un lugar específico, se recomienda analizar una muestra estadísticamente representativa de un mínimo de diez plantas por punto de muestreo de cada huésped herbáceo potencial. La detección del patógeno será más fiable a finales de primavera, en verano y en otoño, aunque las infecciones naturales pueden detectarse durante todo el año en Solanum dulcamara perenne que crece en cursos de agua. Los huéspedes conocidos incluyen plantas de patata espontáneas (groundkeepers), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium y otros miembros de la familia Solanaceae. Otros huéspedes son Pelargonium spp. y Portulaca oleracea. Entre las especies herbáceas europeas que pueden albergar potencialmente poblaciones de R. solanacearum biovar 2/raza 3 en raíces y/o rizosferas, en condiciones medioambientales específicas, se incluyen: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra y Urtica dioica.

Nota: Puede efectuarse en este momento el examen visual para detectar síntomas internos (coloración vascular o líquido bacteriano). Retirar todos los segmentos del tallo con síntomas y analizarlos por separado (véase la sección II).

2.1.2 Desinfectar brevemente los segmentos del tallo con etanol al 70% y secar inmediatamente con un pañuelo de papel. A continuación, procesar los segmentos del tallo mediante uno de los procedimientos siguientes:

o bien

2.1.3 Desechar el sobrenadante tras 15 minutos de sedimentación.

2.1.4 No suele ser necesaria otra clarificación del extracto o la concentración de la fracción bacteriana, pero puede conseguirse por filtración y/o centrifugación tal como se describe en la sección III.1.1.3 a 1.1.5.

2.1.5 Dividir el extracto de la muestra pura o concentrada en dos partes iguales. Mantener una mitad entre 4 y 10°C durante el análisis y almacenar la otra mitad con glicerol estéril al 10-25% (v/v) entre –16 y –24°C (semanas) o entre –68 y –86°C (mes) en caso de que deban efectuarse nuevas pruebas.

2.2 Análisis

Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas y los protocolos optimizados en los apéndices pertinentes:

Aislamiento selectivo (véase la sección VI.A.4)

Prueba IF (véase la sección VI.A.5)

Pruebas PCR (véase la sección VI.A.6)

Prueba FISH (véase la sección VI.A.7)

Pruebas ELISA (véase la sección VI.A.8)

Bioensayo (véase la sección VI.A.9)

SECCIÓN IV

1. Esquema del método de detección e identificación de R. solanacearum en el agua

(1) Véase la sección IV.2.1 para los tamaños recomendados de las muestras.

(2) En la sección IV.2.1 se describen los métodos de concentración de patógenos. La concentración incrementa las poblaciones de patógenos y de bacterias saprofitas competidoras, y únicamente se recomienda si no provoca una inhibición de la prueba de aislamiento.

(3) En la sección VI.A.4 se describe la prueba de aislamiento selectivo.

(4) En la sección VI.A.9 se describe la prueba del bioensayo.

(5) En las secciones VI.A.4.2 y Vl.A.6 se describen los métodos de enriquecimiento PCR.

(6) En las secciones VI.A.4.2 y VI.A.8 se describen los métodos de enriquecimiento ELISA.

(7) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II.3.d.

(8) El aislamiento puede fallar debido a la competencia o la inhibición por bacterias saprofitas. Si se sospecha que una elevada población saprofita afecta a la fiabilidad del aislamiento, repetir entonces las pruebas de aislamiento tras la dilución de la muestra en agua estéril.

(9) La identificación fiable de cultivos puros posibles aislados de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B.

(10) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.

2. Métodos de detección e identificación de R. solanacearum en el agua

Principio

El método validado de detección que se describe en la presente sección es aplicable a la detección del patógeno en muestras de aguas superficiales y puede aplicarse asimismo a las muestras para análisis del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales. No obstante, es importante señalar que la sensibilidad previsible de la detección variará en función del sustrato. La sensibilidad de la prueba de aislamiento se ve afectada por las poblaciones de bacterias saprofitas competidoras, que son generalmente muy superiores en el proceso de transformación de la patata y las aguas residuales que en las aguas superficiales. Si bien se espera que el método que se describe a continuación solamente detecte 10³ células por litro de aguas superficiales, la sensibilidad de la detección en el proceso de transformación de la patata o las aguas residuales será con toda probabilidad mucho menor. Por este motivo, se recomienda analizar las aguas residuales después de todo tratamiento de purificación (por ejemplo, sedimentación o filtración), durante el cual las poblaciones de bacterias saprofitas se reducen. Deberán tenerse en cuenta las limitaciones de sensibilidad del método de prueba a la hora de evaluar la fiabilidad de cualquier resultado negativo obtenido. Si bien se ha utilizado con éxito este método en trabajos de investigación para determinar la presencia o ausencia del patógeno en las aguas superficiales, deberán tenerse en cuenta sus limitaciones cuando se utilice en investigaciones similares del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales.

2.1 Preparación de la muestra

Nota:

– La detección de R. solanacearum en las aguas superficiales es más fiable a finales de primavera, en verano y en otoño, cuando la temperatura del agua supera los 15°C.

– Un muestreo repetido en diferentes momentos durante los períodos mencionados en puntos de muestreo designados incrementará la fiabilidad de la detección al reducir los efectos de la variación climática.

– Ténganse en cuenta los efectos de las fuertes precipitaciones y la geografía del curso de agua a fin de evitar que se produzcan importantes efectos de dilución que puedan ocultar la presencia del patógeno.

– Tomar muestras de agua superficial en las inmediaciones de plantas huésped si estos huéspedes están presentes.

2.1.1 Recoger muestras de agua en puntos de muestreo seleccionados llenando botellas o tubos estériles desechables, a una profundidad, si es posible, por debajo de 30 cm y a 2 m de la orilla. Para los efluentes resultantes de la transformación de la patata y las aguas residuales, recoger muestras en el punto de vertido de las aguas residuales. Se recomiendan las muestras de hasta 500 ml por punto de muestreo. Si se prefieren muestras más pequeñas, se aconseja tomar muestras como mínimo en tres ocasiones por punto de muestreo, cada una de las cuales consistirá en dos submuestras duplicadas de un mínimo de 30 ml. Para un trabajo de investigación intensivo, seleccione como mínimo tres puntos de muestreo por 3 km de curso de agua y asegúrese de que también se toman muestras en los afluentes que desembocan en el curso de agua.

2.1.2 Transportar las muestras en un entorno fresco y oscuro (4-10°C) y analizarlas en un plazo de 24 horas.

2.1.3 Si es preciso, podrá concentrarse la fracción bacteriana utilizando uno de los métodos siguientes:

No suele aconsejarse la concentración para muestras del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales, ya que unas poblaciones mayores de bacterias saprofitas competidoras inhibirán la detección de R. solanacearum.

2.2 Análisis

Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas en los apéndices pertinentes.

SECCIÓN V

1. Esquema del método de detección e identificación de R. solanacearum en el suelo

(1) Véase la sección V.2.1 para los tamaños recomendados de las muestras.

(2) En la sección VI.A.4 se describe la prueba de aislamiento selectivo.

(3) En las secciones VI.A.4.2 y VI.A.6 se describen los métodos de enriquecimiento PCR.

(4) En la sección VI.A.9 se describe la prueba del bioensayo.

(5) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II.3.d.

(6) El aislamiento puede fallar debido a la competencia o la inhibición por bacterias saprofitas. Si se sospecha que una elevada población saprofita afecta a la fiabilidad del aislamiento, repetir entonces las pruebas de aislamiento tras la dilución de la muestra.

(7) La identificación fiable de cultivos puros posibles aislados de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B.

(8) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.

2. Métodos de detección e identificación de R. solanacearum en el suelo

Principios

El método validado de detección que se describe en la presente sección es aplicable a la detección del patógeno en muestras del suelo, pero también puede utilizarse para analizar muestras de residuos sólidos de la transformación de la patata o de lodos de depuradora. No obstante, debe señalarse que estos métodos no son lo suficientemente sensibles para asegurar la detección de poblaciones pequeñas y/o irregularmente distribuidas de R. solanacearum que pueden encontrarse en muestras naturalmente infectadas de estos sustratos.

Deberán tenerse en cuenta las limitaciones de sensibilidad de este método de prueba a la hora de evaluar la fiabilidad de cualquier resultado negativo obtenido, así como cuando se utilice en investigaciones para determinar la presencia o ausencia del patógeno en el suelo o los lodos. El método más fiable para determinar la presencia del patógeno en el suelo del campo es plantar un posible huésped del mismo y supervisar si se produce infección, pero incluso con este método no se detectarán niveles bajos de contaminación.

2.1 Preparación de la muestra

2.1.1 El muestreo del suelo del campo deberá seguir los principios habituales utilizados para el muestreo de nematodos. Para muestrear 0,3 ha, recoger muestras de 0,5 a 1 kg de suelo en 60 puntos a una profundidad de 10 a 20 cm (o de una cuadrícula de 7 × 7 metros). Si se sospecha la presencia del patógeno, incrementar el número de puntos de recogida a 120 por 0,3 ha. Mantener las muestras a una temperatura comprendida entre 12 y 15°C antes del análisis. Tomar muestras de la transformación de la patata y de lodos de depuradora, recogiendo un total de 1 kg de sitios que representen el volumen total de lodos que se analizará. Mezclar adecuadamente cada muestra antes del análisis.

2.1.2 Dispersar submuestras de 10 a 25 g de suelo o lodos mediante agitación rotatoria (250 rpm) en 60-150 ml de tampón de extracción (apéndice 4) durante un máximo de dos horas. En caso necesario, el añadido de 0,02% de Tween-20 estéril y de 10 a 20 g de grava estéril puede contribuir a la dispersión.

2.1.3 Mantener la suspensión a 4°C durante el análisis.

2.2 Análisis

Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas en los apéndices pertinentes.

SECCIÓN VI

PROTOCOLOS OPTIMIZADOS PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE R. solanacearum

A. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN

1. Prueba de la exudación del tallo

La presencia de R. solanacearum en tallos de patata, tomate u otras plantas huésped marchitas puede observarse mediante la sencilla prueba de presunción que se indica a continuación: cortar el tallo justo por encima del nivel del suelo. Suspender la superficie del corte en un tubo de agua limpia. Observar si se produce la característica exudación espontánea de hilos de flujo bacteriano de los haces vasculares cortados unos minutos después.

2. Prueba de la detección de gránulos de poli-βßhidroxibutirato

1. Preparar un frotis de exudado bacteriano procedente del tejido infectado o de un cultivo de 48 horas en un medio YPGA o SPA (apéndice 2) en un portaobjetos.

2. Preparar frotis de control positivos de una cepa de biovar 2 de R. solanacearum y, si se considera útil, un frotis de control negativo de un PHB sp. negativo conocido.

3. Dejar que se seque al aire y pasar con rapidez varias veces por la llama la cara inferior del portaobjetos para fijar los frotis.

4. Teñir el preparado con azul Nilo A o negro Sudán B y observar microscópicamente tal como se describe a continuación.

Prueba del azul Nilo