Προεδρικά Διατάγματα — ΦΕΚ A' 214/2000

Τις διατάξεις: α. του άρθρου 4 του Ν.2147/52 "περί προλήψεως και κα?ταστολής των ασθενειών και εχθρών των φυτών και περί οργανώσεως της φυτοπαθολογικής Υπηρεσίας" (ΦΕΚ/155/τ.Α/5-6-1952). β. του Π.Δ. 332/ΦΕΚ 178/τ.Α/29-8-95 άρθρου 19 "Μέτρα προστασίας κατά την εισαγωγή στη χώρα ή μέσω αυτής σε άλλο κράτος μέλος της Ευρωπαϊκής Ένωσης οργανι?σμών επιβλαβών για τα φυτά ή τα φυτικά προϊόντα και κα?τά της εξάπλωσής τους στο εσωτερικό της, σε συμμόρ?φωση προς την οδηγία 77/93/ΕΟΚ του Συμβουλίου". γ. του άρθρου 1 παρ. 1 και 3 του Ν. 1338/83 "εφαρμογή του Κοινοτικού δικαίου" (ΦΕΚ 34/τ.Α/3-3-83) όπως τροπο?ποιήθηκε από το άρθρο 6 του Ν.1440/84 "Συμμετοχή της Ελλάδος στο Κεφάλαιο, στα αποθεματικά και στις προ?βλέψεις της Ευρωπαϊκής Κοινότητας Άνθρακος και Χάλυ?βος και του Οργανισμού Εφοδιασμού ΕΥΡΑΤΟΜ" (ΦΕΚ 70/τ.Α/21-5-1984). γ. Του άρθρου 29Α του Ν. 1558/1985 "Κυβέρνηση και Κυβερνητικά ΄Οργανα" (Α137) όπως το άρθρο αυτό προ?στέθηκε με το άρθρο 27 του Ν. 2081/1992 (Α 154) και α?ντικαταστάθηκε από το άρθρο 1 παρ. 2α του Ν. 2469/1997 (Α 38) και του γεγονότος ότι από τις διατάξεις του παρό?ντος Π. διατάγματος προκαλείται δαπάνη σε βάρος του Προϋπολογισμού του Νομικού προσώπου "Κεντρικό Τα?μείο Γεωργίας, Κτηνοτροφίας και Δασών (Κ.Τ.Γ.Κ. και Δα?σών)" ύψους 15.000.000 δρχ. περίπου για το τρέχον Οικο?νομικό έτος και 30.000.000 δρχ. περίπου για καθένα από τα επόμενα οικονομικά έτη. Για την ανωτέρω δαπάνη έχει εγγραφεί πίστωση στον Προϋπολογισμό του Νομικού αυ?τού προσώπου ύψους 15.000.000 δραχμών με τα στοιχεία φορέας 110 και ΚΑΕ 5184.

Την 353001/2000 (ΦΕΚ 556/2000) κοινή απόφαση του Πρωθυπουργού και του Υπουργού Γεωργίας για "Ανάθε?ση αρμοδιοτήτων στους Υφυπουργούς Γεωργίας Ευάγ?γελο Αργύρη και Φώτη Χατζημιχάλη".

Την υπ' αριθ. 269/2000 Γνωμοδότηση του Συμβουλί?ου της Επικρατείας με πρόταση του Υφυπουργού Εθνικής Οικονομίας και του Υφυπουργού Γεωργίας, αποφασίζου?με:

Η Διεύθυνση Προστασίας Φυτικής Παραγωγής η ο?ποία στο εξής θ' αποκαλείται αρμόδια αρχή πραγματο?ποιεί ετήσιες συστηματικές επίσημες μελέτες για τον ορ?γανισμό στο καταχωρημένο φυτικό υλικό που προέρχεται από την επικράτεια της Χώρας. Προκειμένου να προσδιο?ριστούν οι άλλες πιθανές εστίες μόλυνσης που απειλούν την παραγωγή του καταχωρημένου φυτικού υλικού η αρ?μόδια αρχή πραγματοποιεί αξιολόγηση του κινδύνου και, εκτός από την περίπτωση κατά την οποία ο οργανισμός έχει αναγνωριστεί κατά την αξιολόγηση, διεξάγει, στις πε?ριοχές παραγωγής του καταχωρημένου φυτικού υλικού, στοχοθετημένες επίσημες μελέτες για τον οργανισμό σε φυτά άλλα από το καταχωρημένο φυτικό υλικό, συμπερι?λαμβανομένων των άγριων ξενιστών της οικογένειας των σολανωδών, καθώς και στο επιφανειακό νερό που χρησι?μοποιείται για άρδευση ή ψεκασμό του καταχωρημένου φυτικού υλικού και στα υγρά απόβλητα που απορρίπτο?νται από εγκαταστάσεις βιομηχανικής μεταποίησης ή συ?σκευασίας του καταχωρημένου φυτικού υλικού και που 3285 εγκαταστάσεις βιομηχανικής μεταποίησης ή συσκευα?σίας.

Οι επίσημες μελέτες που προβλέπονται στην παρά?γραφο 1 διενεργούνται:

Οι λεπτομέρειες και τα αποτελέσματα των επίσημων μελετών που προβλέπονται στην παράγραφο 1, γνωστο?ποιούνται κάθε χρόνο στις αρμόδιες αρχές των άλλων κρατών μελών και την Επιτροπή σύμφωνα με τις διατάξεις του σημείου 2 του τμήματος ΙΙ παραρτήματος Ι. Οι γνω?στοποιήσεις αυτές υποβάλλονται έως την 1η Ιουνίου, ε?κτός από εκείνες για το πατατόσπορο που διατηρείται στο αγρόκτημα, οι οποίες υποβάλλονται έως την 1η Σε?πτεμβρίου. Οι λεπτομέρειες και τα αποτελέσματα όσον α?φορά τις καλλιέργειες αφορούν την παραγωγή του προη?γούμενου έτους. Οι λεπτομέρειες των γνωστοποιήσεων αυτών υποβάλλονται στην επιτροπή.

Σε κάθε περίπτωση πιθανολογούμενης εμφάνισης, η αρμόδια αρχή εξασφαλίζει τη διεξαγωγή επίσημης ή υπό επίσημη εποπτεία εργαστηριακής δοκιμής, είτε, για το κα?ταχωρημένο φυτικό υλικό, με τη σχετική μέθοδο του πα?ραρτήματος ΙΙ και σύμφωνα με τους όρους του παραρτή?ματος ΙΙΙ, σημείο 1, είτε, στις άλλες περιπτώσεις, με οποια?δήποτε άλλη επισήμως εγκεκριμένη μέθοδο, προκειμένου να επιβεβαιωθεί ή να διαψευσθεί η πιθανολογούμενη εμ?φάνιση. Σε περίπτωση επιβεβαίωσης, εφαρμόζονται οι α?παιτήσεις του παραρτήματος ΙΙΙ, σημείο 2.

Μέχρις ότου επιβεβαιωθεί ή διαψευσθεί η πιθανολο?γούμενη εμφάνιση σύμφωνα με την παράγραφο 1, στις περιπτώσεις πιθανολογούμενης εμφάνισης κατά τις ο?ποίες, είτε: i) παρατηρήθηκαν διαγνωστικά συμπτώματα των ασθε?νειών που προκαλούνται από τον οργανισμό και ελήφθη θετικό αποτέλεσμα από τη δοκιμή ταχείας διαλογής που αναφέρεται στο παράρτημα ΙΙ, τμήμα Ι, σημείο 1 και τμή?μα ΙΙ, είτε ii) ελήφθη θετικό αποτέλεσμα από δοκιμή ή δοκιμές δια?λογής, όπως ορίζεται στο παράρτημα ΙΙ, τμήμα Ι, σημείο 2 και τμήμα ΙΙΙ,

Στις περιπτώσεις πιθανολογούμενης εμφάνισης κατά τις οποίες υπάρχει κίνδυνος μόλυνσης του καταχωρημέ?νου φυτικού υλικού ή του επιφανειακού νερού από ή σε άλλο κράτος μέλος, η αρμόδια αρχή γνωστοποιεί αμέ?σως, ανάλογα με την έκταση του κινδύνου, τις λεπτομέ?ρειες της πιθανολογούμενης εμφάνισης στο άλλο οικείο κράτος μέλος και συνεργάζεται κατάλληλα. Εάν η αρμό?δια αρχή λάβει σχετική τέτοια γνωστοποίηση από άλλο Κράτος μέλος, λαμβάνει προληπτικά μέτρα σύμφωνα με την παράγραφο 2, σημείο ii στοιχείο γ και, ανάλογα με την περίπτωση, αναλαμβάνει κάθε περαιτέρω δράση, σύμ?φωνα με τις παραγράφους 1 και 2.

Εάν από την επίσημη ή υπό επίσημη εποπτεία εργα?στηριακή δοκιμή, είτε, για το καταχωρημένο φυτικό υλικό, με τη σχετική μέθοδο του παραρτήματος ΙΙ, είτε, στις άλ?λες περιπτώσεις, με άλλη επισήμως εγκεκριμένη μέθοδο, επιβεβαιωθεί η παρουσία του οργανισμού σε δείγμα λη?φθέν σύμφωνα με το παρών Διάταγμα, η αρμόδια αρχή α?φού λάβει υπόψη τις ορθές επιστημονικές αρχές, τη βιο?λογία του οργανισμού και το συγκεκριμένο σύστημα πα?ραγωγής, εμπορίας και μεταποίησης των ξενιστών του οργανισμού:

Η αρμόδια αρχή γνωστοποιεί αμέσως, σύμφωνα με τις διατάξεις του παραρτήματος V, σημείο 3, στις αρμό?διες αρχές των άλλων κρατών μελών και την Επιτροπή κά?θε μόλυνση που προσδιορίζεται βάσει της παραγράφου 1, στοιχείο α, σημείο ii και της παραγράφου 1, στοιχείο γ, σημείο ii, καθώς και τις λεπτομέρειες της οριοθέτησης ζώνης βάσει της παραγράφου 1, στοιχείο α, σημείο iv και, κατά περίπτωση, της παραγράφου 1 στοιχείο γ, σημείο i?ii. Οι λεπτομέρειες της γνωστοποίησης δυνάμει της πα?ρούσας παραγράφου υποβάλλονται στην επιτροπή. Ταυτόχρονα, η αρμόδια αρχή υποβάλλει στην επιτροπή την πρόσθετη γνωστοποίηση που προβλέπεται στο ση?μείο 4 του παραρτήματος V. Οι λεπτομέρειες της γνω?στοποίησης δυνάμει του παρόντος εδαφίου υποβάλλο?νται αμέσως στα μέλη της επιτροπής.

Βάσει της γνωστοποίησης σύμφωνα με την παρά?γραφο 2 και των γνωστοποιημένων στοιχείων, οι αρμό?διες αρχές των άλλων κρατών μελών που αναφέρονται στην γνωστοποίηση διενεργούν έλεγχο σύμφωνα με την παράγραφο 1, στοιχείο α, σημείο i και, κατά περίπτωση, την παράγραφο 1, στοιχείο γ, σημείο i και αναλαμβάνουν ενδεχομένως περαιτέρω δράση, σύμφωνα με τις παρα?γράφους 1 και 2.

Το καταχωρημένο φυτικό υλικό που έχει χαρακτηρι?στεί ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο α, σημείο ii, δεν μπορεί να φυτεύεται και πρέπει, υπό τον έλεγχο και την έγκριση της αρμόδιας αρχής, να υ?πόκειται σε μια από τις διατάξεις του παραρτήματος VI, σημείο 1 κατά τρόπο ώστε να εξασφαλίζεται ότι δεν υ?πάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού.

Απαγορεύεται η φύτευση του καταχωρημένου φυτι?κού υλικού που έχει χαρακτηρισθεί ως πιθανώς μολυσμέ?νο βάσει του άρθρου 5, παράγραφος 1, στοιχείο α, σημείο iii, και στοιχείο γ, σημείο iii, συμπεριλαμβανομένου του κα?ταχωρημένου φυτικού υλικού για το οποίο έχει εντοπιστεί κίνδυνος και το οποίο έχει παραχθεί σε τόπους παραγω?γής που έχουν χαρακτηριστεί ως πιθανώς μολυσμένοι σύμφωνα με το άρθρο 5, παράγραφος 1, στοιχείο α, ση?μείο iii, και πρέπει υπό τον έλεγχο της αρμόδιας αρχής, να χρησιμοποιείται ή να διατίθεται καταλλήλως, όπως ορίζε?ται στο παράρτημα VI, σημείο 2, κατά τρόπο ώστε να δια?σφαλίζεται ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού.

Τα μηχανήματα, τα οχήματα, οι περιέκτες, οι αποθή?κες ή τα τμήματα αυτών, και κάθε άλλο αντικείμενο, συ?μπεριλαμβανομένων των υλικών συσκευασίας, που έχουν χαρακτηρισθεί μολυσμένα βάσει του άρθρου 5 παράγρα?φος 1, στοιχείο α, σημείο ii ή που έχουν χαρακτηρισθεί ως πιθανώς μολυσμένα βάσει του άρθρου 5, παράγραφος 1, στοιχείο α, σημείο iii και στοιχείο γ, σημείο iii, πρέπει να καταστρέφονται ή να απολυμαίνονται με κατάλληλες με?θόδους όπως ορίζεται στο παράρτημα VI, σημείο 3. Μετά την απολύμανση, τα αντικείμενα αυτά παύουν να θεω?ρούνται μολυσμένα.

Με την επιφύλαξη των μέτρων που εφαρμόζονται σύμφωνα με τις παραγράφους 1, 2 και 3, για τη ζώνη που οριοθετείται βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο α σημείο iv και στοιχείο γ, σημείο iii, εφαρμόζονται ορι?σμένα μέτρα, όπως καθορίζεται στο παράρτημα VI, ση?μεία 4.1. και 4.2. Οι λεπτομέρειες των μέτρων αυτών γνω?στοποιούνται ετησίως στα άλλα κράτη μέλη και την Επι?τροπή. Οι λεπτομέρειες της γνωστοποίησης αυτής υποβάλλονται στην επιτροπή. ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 3287 Π.Δ. 332 /29-8-1995 (178Α) και να προέρχεται απευθείας από υλικό πατάτας το οποίο παράγεται στο πλαίσιο επι?σήμως εγκεκριμένου προγράμματος και το οποίο έχει κρι?θεί απαλλαγμένο από τον οργανισμό μετά από επίσημη ή υπό επίσημη εποπτεία δοκιμή με τη σχετική μέθοδο του παραρτήματος ΙΙ. Η προαναφερόμενη δοκιμή πραγματοποιείται:

Οι επίσημες μελέτες που αναφέρονται στο άρθρο 2 παράγραφος 2, στοιχείο α), διεξάγονται βάσει της βιολο?γίας του οργανισμού και των συγκεκριμένων συστημάτων παραγωγής και πρέπει να περιλαμβάνουν: i) όσον αφορά την πατάτα, - σε κατάλληλες περιόδους, μακροσκοπική επιθεώρηση των καλλιεργούμενων φυτών, ή/και δειγματοληψία από τους σπόρους και άλλες πατάτες κατά τη βλαστική πε?ρίοδο ή στην αποθήκη. Τα δείγματα αυτά υποβάλλονται σε επίσημο ή υπό επίσημη εποπτεία μακροσκοπικό έλεγχο κομμένων κονδύλων, και - στην περίπτωση του πατατόσπορου και, κατά περί?πτωση, για άλλες πατάτες, επίσημες ή υπό επίσημη επο?πτεία εργαστηριακές δοκιμές με τη μέθοδο του παραρ?τήματος ΙΙ, ii) όσον αφορά την τομάτα, - μακροσκοπική επιθεώρηση, σε κατάλληλες περιό?δους, τουλάχιστον των καλλιεργούμενων φυτών που προορίζονται για μεταφύτευση για επαγγελματική χρή?ση.

Η γνωστοποίηση των επίσημων επιθεωρήσεων που α?ναφέρονται στο άρθρο 2, παράγραφος 3, πρέπει να περι?λαμβάνει: i) στην περίπτωση των επιθεωρήσεων για την πατάτα, - την εκτιμώμενη συνολική καλλιεργούμενη έκταση, σε στρέμματα, πατατόσπορου και άλλης πατάτας, - τη διαστρωμάτωση ανά κατηγορία πατατοσπόρου και πατάτας εμπορίου, και, κατά περίπτωση, ανά περιοχή, - τον αριθμό και το χρόνο λήψης των δειγμάτων, - τον αριθμό μακροσκοπικών ελέγχων στον αγρό, - τον αριθμό (και το μέγεθος του δείγματος) των μακρο?σκοπικών ελέγχων κονδύλων, ii) στην περίπτωση των επιθεωρήσεων, τουλάχιστον, για τα καλλιεργούμενα φυτά τομάτας που προορίζονται για μεταφύτευση για επαγγελματική χρήση, - τον εκτιμώμενο συνολικό αριθμό φυτών, - τον αριθμό των μακροσκοπικών ελέγχων, iii) στην περίπτωση των επιθεωρήσεων που αφορούν ξε?νιστές άλλους από την πατάτα και την τομάτα, συμπερι?λαμβανομένων των άγριων φυτών της οικογένειας των σολανωδών, - το είδος, - τον αριθμό και το χρόνο λήψης των δειγμάτων, - την περιοχή/ποτάμι δειγματοληψίας, κατά περίπτωση, - τη μέθοδο ανάλυσης, iv) στην περίπτωση των επιθεωρήσεων σχετικά με το νε?ρό και τις απορρίψεις υγρών αποβλήτων από εγκαταστά?σεις βιομηχανικής μεταποίησης ή συσκευασίας, - τον αριθμό και το χρόνο λήψης των δειγμάτων, - την περιοχή/το ποτάμι/την τοποθεσία των εγκαταστά?σεων δειγματοληψίας, κατά περίπτωση, - τη μέθοδο ανάλυσης. 3288 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. ΣΚΟΠΟΣ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ΔΟΚΙΜΩΝ Στο παρόν σχήμα περιγράφονται οι διάφορες διαδικα?σίες για: i) τη διάγνωση της καστανής σήψης σε κονδύλους πα?τάτας και της βακτηριακής μάρανσης σε φυτά πατάτας και τομάτας, ii) την ανίχνευση του Ralstonia solanacearum σε δείγ?ματα κονδύλων πατάτας, iii) την αναγνώριση του Ralstonia solanacearum. Στα προσαρτήματα παρέχονται λεπτομέρειες για την παρασκευή των χρησιμοποιουμένων για τις δοκιμές υλι?κών, δηλαδή θρεπτικών υποστρωμάτων, ρυθμιστικών διαλυμάτων, διαλυμάτων, αντιδραστηρίων. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

Διάγνωση της καστανής σήψης σε κονδύλους πα?τάτας και της βακτηριακής μάρανσης σε φυτά πα?τάτας και τομάτας................................................... 12

Ανίχνευση και ταυτοποίηση του Ralstonia solanacearum σε δείγματα κονδύλων πατάτας ..... 14

Συμπτώματα ............................................................. 17

Δοκιμή/ές ταχείας διαλογής .................................... 17

Διαδικασία απομόνωσης.......................................... 19

Δοκιμή/ές επιβεβαίωσης.......................................... 20

Προετοιμασία του δείγματος για τη δοκιμή ............ 24

Δοκιμή ανοσοφθορισμού (ΙF)................................... 25

Δοκιμή ενζυματικής ανοσοααπορρόφησης (ΕLISA). 29

Δοκιμή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCRΤΜ) .................................................................... 30

Δοκιμή επιλεκτικής απομόνωσης επί στερεού υπο?στρώματος.............................................................. 33

Βιοδοκιμή ................................................................. 33

Δοκιμές εμπλουτισμού............................................. 34

Δοκιμή παθογένειας................................................. 34 Προσάρτημα 1: Θρεπτικά υλικά για την απομόνωση και καλλιέργεια του Ralstonia solanacearum ........ 35 Προσάρτημα 2: Υλικά για την προετοιμασία του δείγ?ματος δοκιμής......................................................... 36 Προσάρτημα 3: Υλικά για τη δοκιμή ΙF ........................ 37 Προσάρτημα 4: Προσδιορισμός του βαθμού μόλυν?σης στη δοκιμή IF.................................................... 38 Προσάρτημα 5: Υλικά για τη δοκιμή ELISA ................. 39 Προσάρτημα 6: Υλικά για τη δοκιμή PCR .................... 40 Προσάρτημα 7: Υλικά για τη δοκιμή επιλεκτικής απο?μόνωσης επί στερεού θρεπτικού υποστρώματος και δοκιμές εμπλουτισμού ..................................... 40 Βιβλιογραφία................................................................ 41

Διάγνωση της καστανής σήψης σε κονδύλους πατά?τας και της βακτηριακής μάρανσης σε φυτά πατάτας και τομάτας Η περιγραφόμενη διαδικασία εξέτασης προορίζεται για κονδύλους πατάτας που παρουσιάζουν τυπικά συμπτώ?ματα ή γεννούν υπόνοιες για ύπαρξη καστανής σήψης και για φυτά πατάτας και τομάτας που παρουσιάζουν τυπικά συμπτώματα ή γεννούν υπόνοιες για ύπαρξη βακτηρια?κής μάρανσης. Η διαδικασία περιλαμβάνει μία δοκιμή ταχείας διαλογής, απομόνωση του παθογόνου αιτίου από μολυσμένο αγγειώδη ιστό σε διαγνωστικά υλικά και, σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος, αναγνώριση της καλλιέργειας ως Ralstonia solanacearum. Διάγραμμα ροής της διαδικασίας Παραπομπές διαγράμματος: (1) Περιγραφή των συμπτωμάτων δίδεται στο τμήμα ΙΙ.1. (2) Οι δοκιμές ταχείας διαλογής διευκολύνουν την προ?καταρκτική διάγνωση. Κατάλληλες δοκιμές είναι: - η δοκιμή εκκρίσεων του αγγειώδους ιστού του στε?λέχους (τμήμα ΙΙ. 2), - η δοκιμή για πολύ -β-υδροξυβουτυρικά κοκκία (τμή?μα ΙΙ.2), - η δοκιμή ΙF (τμήμα ΙΙΙ.2), - η δοκιμή ELISA (τμήμα ΙΙΙ.3), - η δοκιμή PCR (τμήμα ΙΙΙ. 4). (3) Αν και η απομόνωση του παθογόνου αιτίου με τη δια?δικασία διαδοχικών αραιώσεων επί στερεού υποστρώμα?τος από ιστούς με τυπικά συμπτώματα είναι άμεση, η καλ?λιέργεια μπορεί να αποτύχει αν βρισκόμαστε σε προκεχωρημένα στάδια μολύνσεως. Σαπροφυτικά βακτήρια που αναπτύσσονται σε προσβεβλημένο ιστό μπορεί να ε?πικαλύψουν ή να εμποδίσουν την ανάπτυξη του παθογό?ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 3289 Φυτά πατάτας ή τομάτας ή κόνδυλοι πατάτας με συ?μπτώματα (1) Δοκιμή ταχείας διαλογής (2) ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ Αποικίες με τυπική μορφολογία ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ (3) ΟΧΙ ΔΟΚΙΜΗ (-ΕΣ) ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗΣ Αναγνώριση (4) καθαρής καλλιέρ?γειας ως Ralstonia solanacearum και δοκιμή παθογένειας (4) Φυτά ή και κόνδυλοι μη προσβεβλημένοι από Ralstonia solanacearum Φυτά ή και κόνδυλοι προ?σβεβλημένοι από Ralstonia solanacearum σε συνδυασμό με μία δοκιμή παθογένειας (τμήμα ΙΙ.4.3.). Ο προσδιορισμός του στελέχους είναι προαιρετικός, συ?νιστάται όμως να γίνεται σε κάθε νέο περιστατικό.

Ανίχνευση και ταυτοποίηση του Rαlstonia solanacearum σε δείγματα κονδύλων πατάτας. Η διαδικασία αποσκοπεί στην ανίχνευση μολύνσεων σε λανθάνουσα μορφή σε κονδύλους πατάτας με μία ή, κατά προτίμηση περισσότερες δοκιμές διαλογής οι οποίες, ε?φόσον είναι θετικές επιβεβαιώνονται με την απομόνωση του παθογόνου οργανισμού, ακολουθεί δε, στην περί?πτωση απομόνωσης τυπικών αποικιών, ταυτοποίηση μιας καθαρής καλλιέργειας ως καλλιέργειας Ralstonia solanacearum. Διάγραμμα ροής της διαδικασίας Παραπομπές διαγράμματος: (1) Μ έ γ ε θ ο ς δ ε ί γ μ α τ ο ς Το κανονικό μέγεθος δείγματος είναι 200 κόνδυλοι. Η δοκιμασία όμως μπορεί να εφαρμοσθεί και για δείγματα μικρότερα των 200 κονδύλων. (2) Δ ο κ ι μ ή (ές) α ν ί χ ν ε υ σ η ς Για την ανίχνευση του Ralstonia solanacearum μπορεί να μην αρκεί από πλευράς ευαισθησίας ή αξιοπιστίας πραγματοποίηση μίας μόνον δοκιμής σε ένα δείγμα. Συ?νεπώς, συνιστάται να πραγματοποιούνται περισσότερες από μία δοκιμές, οι οποίες θα πρέπει να βασίζονται κατά προτίμηση σε διαφορετικές βιολογικές αρχές. (3) Δ ο κ ι μ ή α ν ο σ ο φ θ ο ρ ι σ μ ο ύ (IF) Η δοκιμή ανοσοφθορισμού είναι μία καλά καθιερωμένη δοκιμή διαλογής. Το γεγονός αυτό συνιστά πλεονέκτημα σε σχέση με άλλες δοκιμές που δεν έχουν ακόμη αναπτυχθεί πλήρως ή δεν έχει ακόμη επιβεβαιωθεί η εγκυρότητά τους. Η δοκιμή αυτή χρησιμοποιείται για πολλά άλλα κα?θορισμένα βακτήρια, όπως το Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.Βάσει των καθορισμένων παραμέ?τρων ανάγνωσης της μεθόδου, αυτή είναι μία ευαίσθητη δοκιμή {όριο ευαισθησίας 103 - 104 κύτταρα ανά ml εκχυ?λίσματος ιζήματος πατάτας}. Η ποιότητα του αντιορού αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων της δοκιμής. Απο?δεκτοί είναι μόνον αντιοροί με υψηλό τίτλο (κατ' ελάχι?στον 2000 για τον αρχικό αντιορό), όλες δε οι δοκιμές πρέπει να πραγματοποιούνται με τον τίτλο του αντιορού ή μία αραίωση κάτω του τίτλου. Προτιμάται η έμμεση μέ?θοδος. Η άμεση μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί εάν το ε?πίπεδο ευαισθησίας και εξειδίκευσης της δοκιμής είναι ι?σοδύναμο με εκείνο της έμμεσης μεθόδου. Η δοκιμή IF έχει το πλεονέκτημα της υποκειμενικής ερ?μηνείας της μορφολογίας χρώσεως των κυττάρων και της έντασης του φθορισμού, χαρακτηριστικά που παρέχουν στοιχεία σχετικά με την εξειδίκευση της αντίδρασης. Α?ποτελεί σύνηθες φαινόμενο η εμφάνιση ειδικής θετικής α?ντίδρασης (cross-reaction) ορολογικά σχετιζομένων βα?κτηρίων, που προέρχονται από το έδαφος ή σχετίζονται με ιστούς πατάτας και έχουν μορφολογία κυττάρων εκεί?νη του Ralstonia solanacearum. H δοκιμή IF μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως η αποκλειστική δοκιμή διαλογής, αν και σε περιπτώσεις υποψίας εκλεκτικών αντιδράσεων μπορεί να γίνει μια επιπρόσθετη δοκιμή διαλογής που βα?σίζεται σε διαφορετική βιολογική αρχή. Σ' αυτές τις περι?πτώσεις η πιο κατάλληλη δοκιμή είναι η εκλεκτική απομό?νωση επί στερεού θρεπτικού υποστρώματος. (4) Ε κ λ ε κ τ ι κ ή α π ο μ ό ν ω σ η ε π ί σ τ ε ρ ε ο ύ υ π ο?σ τ ρ ώ μ α τ ο ς. Με το τροποποιημένο υλικό SMSA και τη μεθοδολογία εξέτασης που εξειδικεύεται σ' αυτή τη μέθοδο, αυτή συ?νιστά μία ευαίσθητη και εκλεκτική δοκιμή για το Ralstonia solanacearum. Το αποτέλεσμα λαμβάνεται 3-6 ημέρες μετά την προετοιμασία του δείγματος. Το παθογόνο λαμ?βάνεται απ ευθείας στην καλλιέργεια και μπορεί να ταυ?τοποιηθεί εύκολα. Για την πλήρη εκμετάλλευση των δυ?νατοτήτων της, η δοκιμή απαιτεί να γίνεται προσεκτική προετοιμασία των τεμαχίων ιστού λαμβανομένων από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου για την αποφυγή δευ?τερογενών βακτηρίων σχετιζομένων με τους κονδύλους πατάτας που είναι ανταγωνιστές του Ralstonia solanacearum στο θρεπτικό υπόστρωμα και μπορούν να 3290 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) Δείγμα κονδύλων πατάτας (1) ΔΟΚΙΜΕΣ ΔΙΑΛΟΓΗΣ (2) Δοκιμή IF (3) ή/και εκλεκτική απομόνωση επί Σ.Υ.(4) με προαι?ρετικές επιπρόσθετες δοκιμές: Δοκιμή ELISA (5) Δοκιμή PCR (6) Δοκιμή (-ές) εμπλουτισμού (7) τουλάχιστον μία δοκιμή θετική όλες οι δοκιμές αρνητικές Δείγμα μη προ?σβεβλημένο από Ralstonia solanacearum ΔΟΚΙΜΗ (-ΕΣ) ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ Εκλεκτική ή/και βιοδοκιμή (8) απο?μόνωση επί Σ.Υ. Αποικίες με τυπική μορφολογία ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ ΟΧΙ ΔΟΚΙΜΕΣ (-ΕΣ) ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗΣ Ταυτοποίηση (9) της καλλιέργει?ας ως Ralstonia solanacearum και δοκιμή παθογένειας (9) Δείγμα μη προσβεβλη?μένο από Ralstonia solanacearum Δείγμα μη προσβεβλη?μένο από Ralstonia solanacearum Δείγμα προσβεβλημένο α?πό Ralstonia solanacearum να επηρεάσουν το οργανισμό-στόχο. Χρειάζεται επίσης προσοχή ώστε το Ralstonia solanacearum να διαφορο?ποιείται από τυχόν άλλα βακτήρια που μπορεί να αναπτυχθούν στο θρεπτικό υπόστρωμα. Η εκλεκτική απομόνωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αποκλειστική δοκιμή διαλο?γής με την προϋπόθεση ότι σε περίπτωση που υπάρχει υ?ποψία παρεμπόδισης της ανάπτυξης του Ralstonia solanacearum από άλλα βακτήρια επί των τρυβλίων, και προκύπτει αρνητικό αποτέλεσμα, το δείγμα επανεξετάζε?ται χρησιμοποιώντας διαφορετική δοκιμή για την επικύ?ρωση ή απόρριψη της διάγνωσης. Στις περιπτώσεις αυ?τές, η δοκιμή IF είναι η καταλληλότερη. (5) Δ ο κ ι μ ή ELISA Η δοκιμή ΕLISA είναι εν γένει λιγότερο ευαίσθητη από τη δοκιμή IF (όριο ευαισθησίας 104 -105 κύτταρα ανά ml εκχυλίσματος ιζήματος πατάτας). Η δοκιμή είναι φθηνή και γρήγορη, είναι όμως εν γένει πιο επιρρεπής στην εμφάνι?ση εσφαλμένων θετικών (μη ειδικών θετικών αντιδράσε?ων) αποτελεσμάτων και εσφαλμένων αρνητικών (παρε?μπόδιση από φαινολικά μόρια στο εκχύλισμα πατάτας) α?ποτελεσμάτων. Οι απαιτήσεις από πλευράς εξειδίκευσης του αντιορού είναι εξαιρετικά μεγάλες. Η δοκιμή ΕLISA δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αποκλειστική δοκιμή ε?ξέτασης. (6) Δ ο κ ι μ ή ΡCR (α λ υ σ ι δ ω τ ή α ν τ ί δ ρ α σ η π ο λ υ μ ε ρ ά σ η ς). Η ανίχνευση με PCR είναι πολύ ευαίσθητη. Αν και σε έ?να δείγμα είναι δυνατόν να ανιχνευθεί ακόμη και ένα με?μονωμένο μόριο DNA, η δοκιμή παρεμποδίζεται εύκολα από διάφορα συστατικά του εκχυλίσματος του φυτού ή του κονδύλου που οδηγούν σε εσφαλμένο αρνητικό απο?τέλεσμα. Ορισμένες καλλιεργούμενες ποικιλίες πατάτας περιέχουν περισσότερους παρεμποδιστές από άλλες. Χρειάζεται επομένως οι παρεμποδιστές αυτοί να απομα?κρύνονται. Η παρεμπόδιση μπορεί να μειωθεί με αραίωση αλλά έτσι αραιώνονται και οι πληθυσμοί του Ralstonia solanacearum. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται σε ό?λα τα στάδια προετοιμασίας του δείγματος και της δοκι?μής για να αποκλείεται τυχόν μόλυνση που θα μπορούσε να οδηγήσει σε εσφαλμένα θετικά αποτελέσματα. Γι' αυ?τό η δοκιμή PCR δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως η απο?κλειστική δοκιμή εξέτασης. (7) Δ ο κ ι μ ή ε μ π λ ο υ τ ι σ μ ο ύ Επωάζοντας δείγματα εκχυλίσματος ιζήματος πατάτας σε ένα ημιεκλεκτικό θρεπτικό ζωμό, όπως ο τροποποιη?μένος SMSA, μπορούμε να επιτύχουμε τον πολλαπλασια?σμό του Ralstonia solanacearum. Το σημαντικότερο ίσως στην περίπτωση αυτή είναι ότι έτσι αραιώνονται και οι εν δυνάμει παρεμποδιστές στις δοκιμές ELISA ή PCR. Eτσι, το Ralstonia solanacearum σε εμπλουτισμένο ζωμό μπο?ρεί να ανιχνευθεί με τις μεθόδους IF, ELISA και PCR. Συ?νιστούμε να μη γίνεται άμεση απομόνωση επί στερεού υ?ποστρώματος από τους εμπλουτισμένους ζωμούς. Οι μέ?θοδοι αυτές εμπλουτισμού δεν έχουν δοκιμαστεί επισταμένως. Περιλαμβάνονται στο παρόν γιατί έχουν καλές προοπτικές. Εντούτοις, λόγω της σχετικής έλλει?ψης εμπειριών, δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως α?ποκλειστικές μέθοδοι ανίχνευσης. (8) Β ι ο δ ο κ ι μ ή Η βιοδοκιμή χρησιμοποιείται για την απομόνωση του Ralstonia solanacearum από ιζήματα εκχυλισμάτων πατά?τας κατόπιν εκλεκτικού εμπλουτισμού σε ένα φυτό ξενι?στή και μπορεί να γίνει σε φυτά τομάτας ή μελιτζάνας. Η δοκιμή απαιτεί άριστες συνθήκες επωάσεως όπως καθο?ρίζονται στη μέθοδο αυτή, κατά πάσα πιθανότητα, τυχόν βακτήρια που δρουν παρεμποδιστικά έναντι του Ralstonia solanacearum σε SMSA δεν δρουν παρεμβατικά στη δο?κιμή αυτή. (9) Δ ο κ ι μ ή (-ές) ε π ι β ε β α ί ω σ η ς Αξιόπιστη ταυτοποίηση καθαρής καλλιέργειας Ralsto?nia solanacearum επιτυγχάνεται με μία τουλάχιστον από τις δοκιμές που παρατίθενται στο τμήμα ΙΙ.4.1 σε συνδυα?σμό με μία δοκιμή παθογένειας (τμήμα ΙΙ.4.3) Ο χαρακτη?ρισμός του στελέχους είναι προαιρετικός, αλλά συστήνε?ται για κάθε νέα περίπτωση. .

Συμπτώματα 1.1. Σ υ μ π τ ώ μ α τ α σ τ η ν π α τ ά τ α Στο φυτό της πατάτας: Στο αρχικό στάδιο της ασθένει?ας εμφανίζεται μαρασμός των φύλλων προς την κορυφή του φυτού σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της ημέρας με ανάληψη κατά τη διάρκεια της νύχτας. Σύντο?μα ο μαρασμός καθίσταται μη αναστρέψιμος και οδηγεί στο θάνατο του φυτού. Ο αγγειώδης ιστός σε εγκαρσίως κομμένα στελέχη από μαραμένα φυτά μπορεί να γίνει κα?στανός, από δε την κομμένη επιφάνεια εκρέει, ή μπορεί να εξέλθει εύκολα συμπιέζοντάς την, ένα γαλακτώδες εξί?δρωμα. Όταν ένα κομμένο στέλεχος τοποθετηθεί κατα?κόρυφα μέσα σε νερό, από τις αγγειώδεις δέσμες εκρέ?ουν κλωστές γλοιώδους υγρού. Στον κόνδυλο της πατάτας: Οι κόνδυλοι πρέπει να κό?βονται εγκαρσίως κοντά στο σημείο πρόσφυσης του στο?λονίου. Στο αρχικό στάδιο της ασθένειας εμφανίζεται έ?νας υαλώδους όψεως, κίτρινος προς ανοικτό καστανό, μεταχρωματισμός του αγγειώδους δακτυλίου από τον ο?ποίο εκρέει ταυτόχρονα μετά λίγα λεπτά ή μετά από ελα?φρά πίεση με τους αντίχειρες στο φλοιό κοντά στην κομ?μένη επιφάνεια, ένα υπόλευκο εξίδρωμα. Αργότερα, ο αγ?γειακός μεταχρωματισμός καθίσταται εντονότερα καστανός και η νέκρωση μπορεί να επεκταθεί στον πα?ρεγχυματώδη ιστό. Σε προκεχωρημένα στάδια της ασθέ?νειας, η μόλυνση εκδηλώνεται εξωτερικά από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου και τους οφθαλμούς και εμ?φανίζονται στην επιδερμίδα ερυθροκάστανες, ελαφρώς βαθουλωμένες κηλίδες από τις οποίες μπορεί να εκρέει βακτηριακό εξίδρωμα προκαλώντας την προσκόλληση σωματιδίων του εδάφους. 1.2. Σ υ μ π τ ώ μ α τ α σ τ η ν τ ο μ ά τ α Στο φυτό της τομάτας: Το πρώτο ορατό σύμπτωμα εί?ναι η έλλειψη σπαργής στα νεαρά φύλλα. Υπό περιβαλλο?ντικές συνθήκες που είναι ευνοϊκές για το παθογόνο (θερ?μοκρασία εδάφους 250 C, ατμόσφαιρα κορεσμένη σε υ?γρασία), μέσα σε λίγες μέρες εμφανίζεται επιναστία και μαρασμός της μιας πλευράς ή και ολόκληρου του φυτού, στη συνέχεια δε πλήρης κατάρρευση του φυτού. Σε λιγό?τερο ευνοϊκές συνθήκες (θερμοκρασία εδάφους κάτω ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 3291 του στελέχους, από τους καστανόχρωμα μεταχρωματι?σμένους αγγειακούς ιστούς εκρέουν σταγόνες λευκού ή υποκίτρινου βακτηριακού εξιδρώματος.

Δοκιμές ταχείας διαλογής Οι δοκιμές ταχείας διαλογής διευκολύνουν την προκα?ταρκτική διάγνωση. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία ή πε?ρισσότερες από τις ακόλουθες δοκιμές: Δοκιμή εκκρίσεων από το στέλεχος Η παρουσία του Ralstonia solanacearum σε μαραμένα στελέχη πατάτας μπορεί να εκτιμηθεί με την ακόλουθη α?πλή προκαταρκτική δοκιμή: Κόβουμε το στέλεχος πάνω ακριβώς από το έδαφος. Τοποθετούμε την κομμένη επιφάνεια σε ποτήρι ζέσεως με νερό. Λίγο μετά, από τις αγγειώδεις δεσμίδες αρχίζει να τρέχει ταυτόχρονα με μορφή κλωστών ένα βακτηρια?κό γλοιώδες έκκριμα. Κανένα από τα βακτήρια που προ?καλούν αδροβακτηρίωση σε φυτά της πατάτας, δεν εμ?φανίζει το φαινόμενο αυτό. Ανίχνευση πολύ-β-υδροξυβουτυρικών (PHB) κοκκίων Τα κοκκία PHB στα κύτταρα του Ralstonia solanacearum καθίστανται ορατά δια χρώσεως με Nile Blue A ή με Sudan Black B. Παρασκευάζουμε επίχρισμα του εξιδρώματος ή του αι?ωρήματος του ιστού σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικρο?σκοπίου ή επίχρισμα 48ωρης καλλιέργειας σε YPGA, ή S?PA (προσάρτημα 1 τμήμα ΙΙΙ). Παρασκευάζουμε επίσης ε?πιχρίσματα στελέχους βιοποικιλίας 2, φυλής 3, ως θετικούς μάρτυρες, και αν θεωρηθεί χρήσιμο ένα επίχρι?σμα ετερολόγου στελέχους, ως αρνητικό μάρτυρα. Αφήνουμε να ξηρανθούν. Περνάμε μερικές φορές γρή?γορα την κάτω πλευρά της αντικειμενοφόρου πλάκας μέ?σα από φλόγα μέχρι να προσηλωθεί το επίχρισμα. Δ ο κ ι μ ή N i l e B l u e

Περιλούζουμε το προσηλωμένο επίχρισμα με 1% υ?δατικό διάλυμα Nile Blue A και το αφήνουμε για επώαση επί 10 λεπτά στους 550 C.

Αποστραγγίζουμε το διάλυμα χρώσεως, πλένουμε την πλάκα για λίγο προσεκτικά με ρέον νερό της βρύσης και απομακρύνουμε την περίσσεια του νερού με απορρο?φητικό χαρτί.

Περιλούζουμε το επίχρισμα με 8% υδατικό διάλυμα ο?ξικού οξέος και το αφήνουμε για επώαση επί 1 λεπτό σε θερμοκρασία εργαστηρίου.

Ξεπλένουμε ελαφρά με ρέον νερό της βρύσης και το στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί.

Ξαναρίχνουμε μία σταγόνα νερό και τοποθετούμε μία καλυπτρίδα.

Εξετάζουμε το χρωσμένο επίχρισμα σε μικροσκόπιο επιφθορισμού στα 450 nm με ελαιοκαταδυτικό φακό σε μεγέθυνση 1000x. Εφόσον υπάρχουν κοκκία PHB αυτά φθορίζουν με λα?μπρό πορτοκαλί χρώμα. Τα κοκκία παρατηρούνται επίσης και σε κανονικό φως για να ελεγχθεί αν είναι ενδοκυττα?ρικά και αν η κυτταρική μορφολογία είναι η τυπική μορ?φολογία του Ralstonia solanacearum. Δ ο κ ι μ ή S u d a n B l a c k.

Περιλούζουμε το προσηλωμένο επίχρισμα με διάλυ?μα 0,3% Sudan Black B σε 70% αιθανόλη και το αφήνου?με για επώαση επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρί?ου.

Αποστραγγίζουμε το διάλυμα χρώσεως, ξεπλένουμε για λίγο με νερό της βρύσης και απομακρύνουμε την πε?ρίσσεια του νερού με απορροφητικό χαρτί.

Βυθίζουμε το επίχρισμα για μικρό χρονικό διάστημα σε ξυλόλη και το στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί. Προσοχή! Η ξυλόλη είναι επιβλαβής γι' αυτό πρέπει να εργαζόμαστε σε απαγωγό εστία.

Περιλούζουμε το επίχρισμα με 0,5% (β/ο) υδατικό διάλυμα σαφρανίνης και το αφήνουμε για 10 δευτερόλε?πτα σε θερμοκρασία εργαστηρίου. Προσοχή! Η σαφρανίνη είναι επιβλαβής, γι' αυτό πρέπει να εργαζόμαστε σε απαγωγό εστία.

Ξεπλένουμε ήπια με ρέον νερό της βρύσης, στεγνώ?νουμε με απορροφητικό χαρτί και τοποθετούμε μία καλυ?πτρίδα.

Εξετάζουμε το χρωσμένο επίχρισμα σε φωτομικρο?σκόπιο με ελαιοκαταδυτικό φακό και με κλίμακα μεγέθυν?σης 1000 x. Τα κοκκία PHB στα κύτταρα του Ralstonia solanacearum εμφανίζονται χρωσμένα μπλε-μαύρα. Το κυτταρικό τοίχωμα εμφανίζεται με ροζ χρώση. ΄Α λ λ ε ς δ ο κ ι μ έ ς Άλλες κατάλληλες δοκιμές διαλογής είναι η δοκιμή IF (τμήμα ΙΙΙ.2), η δοκιμή ELISA (τμήμα ΙΙΙ.3) και η δοκιμή PCR (τμήμα ΙΙΙ 4).

Διαδικασία απομόνωσης 3.1. Λαμβάνεται εξίδρωμα ή τμήματα μεταχρωματισμέ?νου ιστού από τον αγγειώδη δακτύλιο του κονδύλου πα?τάτας ή τις αγγειώδεις δέσμες του στελέχους πατάτας ή τομάτας. Παρασκευάζεται αιώρημα των ανωτέρω σε μι?κρό όγκο αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού ή σε 50 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος. Το αιώρημα αφήνεται για 5-10 λεπτά πάνω στον πάγκο. 3.2. Παρασκευάζονται σειρές δεκαπλών αραιώσεων του αιωρήματος π.χ. 1/10 και 1/100 ή περισσότερες αν θε?ωρηθεί απαραίτητο. 3.3. Συγκεκριμένη ποσότητα του αιωρήματος και των α?ραιώσεων μεταφέρεται σε γενικής χρήσης θρεπτικό υπό?στρωμα (ΝΑ, YPGA και SPA, τμήμα ΙΙΙ προσάρτημα 1) ή/και σε υπόστρωμα του Kelman με tetrazolium (τμήμα ΙΙΙ προσάρτημα 1) ή/και σε εκλεκτικό υπόστρωμα SMSA (τμήμα ΙΙΙ προσάρτημα 7) και απλώνεται ή εξαπλώνεται γραμμωτά με κατάλληλη τεχνική αραιώσεως επί του υπο?στρώματος. Αν θεωρηθεί χρήσιμο, προετοιμάζονται ξεχωριστά τρυβλία από κάθε υπόστρωμα με αραιωμένο αι?ώρημα καλλιέργειας παθογόνου στελέχους Ralstonia solanacearum βιοποικιλίας 2, φυλής 3 που χρησιμοποιεί?ται ως θετικός μάρτυρας. 3.4. Τα τρυβλία επωάζονται 3 ημέρες στους 280 C. Η ε?πώαση μπορεί να παραταθεί στις 6 ημέρες, αν η ανάπτυ?ξη είναι αργή, αλλά οι αποικίες επί SMSA συχνά γίνονται μη τυπικές και νεκρώνονται. Στα γενικής χρήσεως θρεπτικά υποστρώματα οι παθο?γόνες απομονώσεις Ralstonia solanacearum αναπτύσ?σουν μαργαριτώδους χροιάς λευκές, επίπεδες, ακανόνι?στες και ρευστώδεις αποικίες που εμφανίζουν συχνά χα?ρακτηριστικές σπείρες. Σε υπόστρωμα Kelman με tetrazolium, τυπικές αποικίες παθογόνων απομονώσεων του Ralstonia solanacearum είναι κρεμώδεις, επίπεδες, με ακανόνιστο περιθώριο και υδαρείς με αιματέρυθρες ελικώσεις στο κέντρο. Μη πα?3292 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) χροιάς λευκές, επίπεδες, ακανόνιστες στο περιθώριο και ρευστώδεις αποικίες με αιματέρυθρα κέντρα. Οι μη παθογόνες μορφές Ralstonia solanacearum ανα?πτύσσουν λιγότερο ρευστώδεις αποικίες, οι οποίες στο SMSA εμφανίζονται τελείως ροζ προς ερυθρές. 3.5. Οι αποικίες με χαρακτηριστική μορφολογία καθορί?ζονται με εκ νέου καλλιέργεια σε γενικής χρήσεως θρε?πτικό υπόστρωμα. Πρέπει να αποφεύγονται επανειλημ?μένες εκ νέου καλλιέργειες γιατί αυτό μπορεί να οδηγή?σει σε μείωση της παθογένειας.

Δοκιμή (-ές) επιβεβαίωσης 4.1. Ταυτοποίηση του Ralstonia solanacearum Η ταυτοποίηση καθαρών καλλιεργειών του Ralstonia solanacearum γίνεται με μία από τις ακόλουθες διαδικα?σίες: Θ ρ ε π τ ι κ έ ς κ α ι ε ν ζ υ μ α τ ι κ έ ς δ ο κ ι μ έ ς Σημείωση:Να περιλαμβάνονται κατάλληλα στελέχη ως μάρτυρες σε κάθε δοκιμή. Το Ralstonia solanacearum παρουσιάζει ή όχι εν γένει τις ακόλουθες φαινοτυπικές ιδιότητες: Φθορίζουσα χρωστική - Έγκλειστα PHB + Δοκιμή οξείδωσης/ζύμωσης (O/F) Ο+/F?Καταλάση + Οξειδάση Kovac's + Aναγωγή νιτρικών + Χρησιμοποίηση κιτρικών + Ανάπτυξη σε 400 C - Ανάπτυξη σε 1% ΝaCl + Ανάπτυξη σε 2% NaCl - Διυδρολάση αργινίνης - Ρευστοποίηση ζελατίνης - Υδρόλυση αμύλου - Υδρόλυση αισκουλίνης - Παραγωγή levan - Υλικά και μέθοδοι παρέχονται στην εργασία των Lelliott και Stead (1987). Δ ο κ ι μ ή IF Παρασκευάζουμε αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό μάρτυρα. Παρασκευάζου?με επίσης μία σειρά αραιώσεων του αντιορού στο διπλά?σιο. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία IF (τμήμα ΙΙΙ.2). Ο τίτλος IF της καλλιέργειας πρέπει να είναι ισοδύναμος με εκείνον του θετικού μάρτυρα. Δ ο κ ι μ ή E L I S A Παρασκευάζουμε αιώρημα >106 κυττάρων ανά ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό μάρτυρα. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία ELISA (τμήμα ΙΙΙ.3). Ο τίτλος ELISA της καλ?λιέργειας πρέπει να είναι ισοδύναμος με εκείνον του θετι?κού μάρτυρα. Δ ο κ ι μ ή PCR Παρασκευάζουμε αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό μάρτυρα. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία PCR - (τμήμα ΙΙΙ.4) Το προϊόν PCR της καλ?λιέργειας πρέπει να έχει το ίδιο μέγεθος και μορφή RΕΑ με εκείνα του θετικού μάρτυρα. Φ θ ο ρ ί ζ ω ν i n s i t u υ β ρ ι δ ι σ μ ό ς (F I S H) Παρασκευάζουμε αιώρημα 106 κυττάρων ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό μάρτυρα. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία FISH (van Beuningen et al., 1995) χρησιμοποι?ώντας τον εκκινητή (primer) PCR OLI-1 (Seal et al., 1993) Η καλλιέργεια πρέπει να εμφανίζει την ίδια αντίδραση με το θετικό μάρτυρα. Π ρ ο φ ί λ π ρ ω τ ε ϊ ν ώ ν Οι μετουσιωμένες ολοκυτταρικές πρωτεΐνες διαχωρί?ζονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδιου - PAGE (Stead, 1992a). Π ρ ο φ ί λ σε λ ι π α ρ ά ο ξ έ α (FAP). Αναπτύσσουμε την καλλιέργεια και ένα στέλεχος θετι?κού μάρτυρα για 48 ώρες στους 280 C σε trypticase soy a?gar και εφαρμόζουμε τη διαδικασία FAP (Jance,1991, Stead, 1992a, Stead, 1992b). To προφίλ λιπαρών οξέων της καλλιέργειας πρέπει να είναι ίδιο με εκείνο του θετι?κού μάρτυρα. Στις καθορισμένες συνθήκες, τα χαρακτη?ριστικά λιπαρά οξέα είναι 14:0 3ΟΗ, 16:0 2ΟΗ, 16:1 2ΟΗ και 18:1 2ΟΗ. 4.2. Χαρακτηρισμός στελέχους Ο χαρακτηρισμός του στελέχους είναι προαιρετικό αλ?λά συστήνεται για κάθε νέα περίπτωση, χρησιμοποιώντας τουλάχιστον μία από τις ακόλουθες διαδικασίες: Χ α ρ α κ τ η ρ ι σ μ ό ς β ι ο π ο ι κ ι λ ί α ς To Ralstonia solanacearum διαχωρίζεται σε βιοποικι?λίες βάσει της ικανότητάς του να παράγει οξύ από τρεις εξοζοαλκοόλες και τρία σάκχαρα (Ηayward, 1964 και 1994). Βιοποικιλία 1 2 3 4 5 Χρήση - μαλτόζης - + + - + - λακτόζης - + + - + - κελλοβιόζης - + + - + - μαννιτόλης - - + + + - σορβιτόλης - - + + - - δουλκιτόλης - - + + - Με πρόσθετες δοκιμές, η βιοποικιλία 2 μπορεί να δια?φοροποιηθεί σε υποφαινοτύπους (Hayward, 1994): Βιοποικιλία 2 βιοποικιλία 2-Α Βιοποικιλία 2-Τ Χρήση τρεαλόζης - + + Χρήση ινοσιτόλης + - + Χρήση D-ριβόζης - - + Πηκτινολυτική δράση μικρή Μικρή μεγάλη Π ρ ο σ δ ι ο ρ ι σ μ ό ς φ υ λ ή ς Η φυλή (Buddenhagen et al., 1962) μπορεί να προσδιο?ρισθεί με βάση μία δοκιμή παθογένειας σε φυτά τομάτας ΦΕΚ 214 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 3293 Αντίδραση σε: φυτά τομάτας /μελιτζάνας μαρασμός μη αντίδραση μαρασμός φυτά καπνού μαρασμός μη αντίδραση μη αντίδραση φύλλα καπνού νέκρωση (48 HP (12-24 χλώρωση (2-8 ώρες) και ώρες) ημέρες) μαρασμός (7-8 ημ.) (*) H φυλή 4 (παθογόνος στο ginger και μερικούς άλ?λους ξενιστές) και η φυλή 5 (παθογόνος στη μουριά μό?νο) δεν περιλαμβάνονται. Ο χαρακτηρισμός της φυλής με τις δοκιμές παθογένει?ας ή υπερευαισθησίας σε καπνό, δεν είναι ίσως πολύ α?ξιόπιστος και αντ' αυτών μπορεί να προκύψει από τη βιο?ποικιλία και το φυτό ξενιστή προέλευσης. Το γενωμικό αποτύπωμα Η μοριακή διαφοροποίηση των στελεχών στο σύμπλο?κο Ralstonia solanacearum μπορεί να γίνει με: Ανάλυση RFLP (Cook et al.,1989) Eπαναληπτική αλληλουχία PCR [REP-, ERIC- και BOX?PCR (Louws et al., 1995 Smith et al., 1995)] 4.3. Δοκιμή παθογένειας Η δοκιμή αυτή αποσκοπεί στην επιβεβαίωση της διά?γνωσης του Ralstonia solanacearum και την εκτίμηση της παθογένειας των καλλιεργειών που ταυτοποιούνται ως Ralstonia solanacearum. Παρασκευάζουμε μόλυσμα με 106 κύτταρα ανά ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό στέλεχος μάρτυρα. Μολύ?νουμε 5-10 φυτά τομάτας ή μελιτζάνας στο τρίτο κατά προτίμηση πραγματικό στάδιο φυλλοφορίας (τμήμα ΙΙΙ.6). Αφήνουμε για επώαση μέχρι 2 εβδομάδες σε θερμοκρα?σία 22-280 C και υψηλή σχετική υγρασία με καθημερινό πότισμα. Παρατηρούμε αν εμφανίζονται συμπτώματα μα?ρασμού ή/και επιναστία, χλώρωση ή νανισμός. Απομονώνουμε από φυτά που παρουσιάζουν συμπτώ?ματα, ως ακολούθως: - αφαιρούμε ένα μέρος ιστού από το στέλεχος, 2 cm πά?νω από το σημείο μόλυνσης, - τεμαχίζουμε τους ιστούς και παρασκευάζουμε αιώρη?μα σε ένα μικρό όγκο αποστειρωμένου, αποσταγμένου νερού ή σε 50 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος. Ακολούθως γίνεται εξάπλωση επί στερεού θρεπτικού υ?ποστρώματος, επώαση και έλεγχος παρουσίας τυπικών αποικιών του Ralstonia solanacearum.

Προετοιμασία του δείγματος για δοκιμή. Σημείωση:Το εκχυλισμένο ίζημα πατάτας που λαμβάνε?ται με τη διαδικασία αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για την ανίχνευση του Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Eφόσον κριθεί σκόπιμο, μπορούν να γίνουν και οι εξής προκαταρκτικές εργασίες: i) το δείγμα επωάζεται στους 25-300 C για διάστημα μέχρι 2 εβδομάδες για την ενθάρρυνση πολλαπλασιασμού τυχόν χαμηλών πληθυσμών Ralstonia solanacearum. ii) οι κόνδυλοι πλένονται κάτω από ρέον νερό της βρύ?σης με κατάλληλα απολυμαντικά και απορρυπαντικά. Οι κόνδυλοι στεγνώνουν στον αέρα. 1.1. Με ένα καθαρό και απολυμασμένο νυστέρι ή ειδικό μαχαίρι λαχανικών αφαιρείται η επιδερμίδα γύρω από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου του κονδύλου έτσι ώ?στε να φανούν πρώτα οι αγγειώδεις ιστοί. Αποκόπτουμε με προσοχή ένα μικρό κώνο (διάμετρος 3-5 mm) αγγειώ?δους ιστού από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου κά?θε κονδύλου. Προσοχή ώστε η αφαιρούμενη ποσότητα μη αγγειώδους ιστού από το σημείο πρόσφυσης του στο?λονίου κάθε κονδύλου να είναι η ελάχιστη δυνατή. Συνέχιση της διαδικασίας για κάθε κόνδυλο του δείγματος. Σημείωση:Στο στάδιο αυτό οι κόνδυλοι μπορούν να ε?ξεταστούν μακροσκοπικά (τμήμα ΙΙ.1). Κάθε κόνδυλος με συμπτώματα ή έντονη σήψη αφήνεται παράμερα και εξε?τάζεται χωριστά (τμήμα ΙΙ). 1.2. Οι κώνοι ιστών συλλέγονται μέσα σε ένα κλειστό δοχείο. Κατά προτίμηση, οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου πρέπει να υποβάλλονται σε κατεργασία α?μέσως. Εάν αυτό δεν είναι δυνατόν, αποθηκεύονται για χρονικό διάστημα όχι μεγαλύτερο από 24 ώρες, ή στους 40 C για χρονικό διάστημα όχι μεγαλύτερο από 72 ώρες. 1.3 Οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου υποβάλλονται σε κατεργασία με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες: i) Oι κώνοι μεταφέρονται σε κατάλληλο δοχείο. Προστίθεται ικανή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος διαβροχής (προσάρτημα 2) ώστε να καλυφθούν οι κώνοι. Οι κώνοι θρυμματίζονται σε ένα Waring-Blender (μίξερ) ή με Ultra Turrax μέχρι πλήρους ομοιογενοποιήσεως. Πρέπει να αποφεύγεται η υπερβολική ομοιογενοποίηση. Αφήνουμε το προϊόν να διαβραχεί για 15-30 λεπτά.

Δοκιμή ανοσοφθορισμού (IF) Χρησιμοποιείται αντιορός για Ralstonia solanacearum, κατά προτίμηση για φυλή 3, βιοποικιλία 2. Ο τίτλος προσ?διορίζεται σε αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από το ομό?λογο στέλεχος Ralstonia solanacearum με κατάλληλη α?ραίωση συμπλόκου ισοθειοκυανικής φθορεϊσίνης (FITC), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο πρωτογε?νής αντιορός πρέπει να έχει τίτλο IF τουλάχιστον 1:2.000. Χρησιμοποιούνται πολυφατνιακές αντικειμενοφόροι πλάκες μικροσκοπίου με 10 κατά προτίμηση φατνία δια?μέτρου τουλάχιστον 6 mm. Σε κάθε αντικειμενοφόρο περιλαμβάνεται μάρτυρας συμπλόκου FITC. Αν τυχόν στο μάρτυρα FITC παρατηρη?θούν θετικά κύτταρα η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβά?νεται συμπεριλαμβάνοντας και το μάρτυρα PBS. Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες α?ντικειμενοφόροι με αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από στέλεχος Ralstonia solanacearum κατάλληλης φυλής/βιοποικιλίας (π.χ. φυλής 3, βιοποικιλίας 2). Σε κάθε σειρά δοκιμών χρησιμοποιείται μία αντικειμενοφόρος. 2.1. Οι προς δοκιμή αντικειμενοφόροι ετοιμάζονται με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες: i) Σε περίπτωση ιζημάτων με μικρή σχετικά ποσότητα α?μύλου: Σε μία σειρά φατνίων, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15μl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) του αιωρήματος του ιζήματος. Η άλ?λη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα εις διπλούν ή για ένα δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 1. ii) Σε περίπτωση άλλων ιζημάτων: Παρασκευάζονται δεκαπλές αραιώσεις, δηλαδή 1/10, 1/100 και 1/1000 του αιωρήματος του ιζήματος σε ρυθμι?στικό διάλυμα ιζήματος. Σε μία σειρά φατνίων, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 μl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώ?νεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) του αιωρήμα?τος του ιζήματος από κάθε αραίωση. Η άλλη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα εις διπλούν ή για ένα δεύτε?ρο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 2. 2.2. Το περιεχόμενο των φατνίων αφήνεται να ξηραθεί. Τα βακτηριακά κύτταρα στην αντικειμενοφόρο προσηλώ?νονται με θέρμανση, με φλόγα ή με 95% αιθανόλη. 2.3. Διαδικασία IF i) Σύμφωνα με την ετοιμασία της αντικειμενοφόρου στο σημείο 2.1.i: Παρασκευάζεται μία σειρά αραιώσεων του αντιορού στο διπλάσιο σε ρυθμιστικό διάλυμα για IF (προσάρτημα 3): 1/4 του τίτλου (Τ/4), ½ του τίτλου (Τ/2), ο τίτλος (Τ) και το διπλάσιο του τίτλου (2Τ). ii) Σύμφωνα με την ετοιμασία της αντικειμενοφόρου στο σημείο 2.1.ii: Παρασκευάζεται η αραίωση εργασίας (WD) του αντιο?ρού σε ρυθμιστικό διάλυμα για IF. Αραίωση εργασίας εί?ναι η αραίωση του αντιορού που εμφανίζει την καλύτερη εξειδίκευση και είναι συνήθως το μισό του τίτλου. Εικόνα 1 Ετοιμασία της αντικειμενοφόρου δοκιμής σύμφωνα με τα σημεία 2.1.i. και 2.3.i. Καθορισμένη αραίωση αιωρήματος ιζήματος (Τ= τίτλος) FITC T/4 Τ/2 Τ 2Τ πΑραιώσεις αντιορού Δείγμα 1 •1 •2 •3 •4 •5 Δείγμα 1 εις διπλούν ή δείγμα 2 •6 •7 •8 •9 •10 Εικόνα 2 Ετοιμασία της αντικειμενοφόρου δοκιμής σύμφωνα με τα σημεία 2.1.ii. και 2.3.ii. FITC Καθορισμένη αραίωση αντιορού Μη Μη αραιωμένο αραιωμένο 1/10 1/100 1/1000 πΔεκαδική αραίωση ιζήματος Δείγμα 1 •1 •2 •3 •4 •5 Δείγμα 1 εις διπλούν ή δείγμα 2 •6 •7 •8 •9 •10 2.3.1. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται πάνω σε ένυ?γρο απορροφητικό χαρτί. Τα φατνία δοκιμής καλύπτονται με την ή τις αραιώσεις του αντιορού. Στα φατνία FITC φέρεται PBS. Ο όγκος του χρησιμοποιούμενου στα φατνία αντιορού πρέπει να είναι ισοδύναμος με τον όγκο του χρησιμοποιούμενου εκχυλί?σματος. 2.3.2. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται κάτω από ένα κάλυμμα και επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία πε?ριβάλλοντος. 2.3.3. Τα σταγονίδια του αντιορού απομακρύνονται με ένα ελαφρό τίναγμα από την αντικειμενοφόρο και οι αντι?κειμενοφόροι ξεπλένονται προσεκτικά με ρυθμιστικό διά?λυμα IF. Πλύση επί 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα-Tween IG και ακολούθως επί 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα IF (προσάρτημα 3). Η περίσσεια του υγρού απομακρύνεται προσεκτικά. 2.3.4. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται πάνω σε ένυ?γρο απορροφητικό χαρτί. ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 3295 με τον όγκο του χρησιμοποιούμενου αντιορού. 2.3.5. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται κάτω από ένα κάλυμμα και επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία πε?ριβάλλοντος. 2.3.6. Τα σταγονίδια του συμπλόκου τινάζονται μακριά από την αντικειμενοφόρο και οι αντικειμενοφόροι ξεπλέ?νονται και πλένονται όπως προηγουμένως (2.3.3.). Η πε?ρίσσεια του νερού απομακρύνεται προσεκτικά. 2.3.7. Σε κάθε φατνίο φέρονται με σιφώνιο 5-10 μl φω?σφορικού ρυθμιστικού διαλύματος γλυκερίνης 0,1Μ (προσάρτημα 3) ή παρομοίου ρευστού και τα φατνία κα?λύπτονται με μία καλυπτρίδα. 2.4. Ανάγνωση της δοκιμής IF Οι αντικειμενοφόροι δοκιμής εξετάζονται σε μικροσκό?πιο επιφθορισμού με φίλτρα κατάλληλα για την διέγερση του FITC, με ελαιοκαταδυτικό φακό και με μεγέθυνση 501000. Τα φατνία εξετάζονται κατά μήκος δύο καθέτων διαμέτρων και κατά την περίμετρό τους. Πρώτα ελέγχεται η αντικειμενοφόρος του θετικού μάρτυρα. Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσμένα με λαμπρό φθορισμό. Σημείωση: Σε περίπτωση αποτυχίας, η δοκιμή επανα?λαμβάνεται. Γίνεται ανάγνωση αντικειμενοφόρων δοκιμής. Ελέγχεται κατ' αρχάς ότι δεν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα στα φατνία των μαρτύρων FITC. Αν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα στο φατνίο FITC αυτό δείχνει μη ει?δική σύζευξη του συμπλόκου, αυτοφθορισμό ή επιμόλυν?ση. Σημείωση: Στις περιπτώσεις αυτές, η δοκιμή επανα?λαμβάνεται. Εξετάζεται αν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα με τη χα?ρακτηριστική μορφολογία του Ralstonia solanacearum στα φατνία δοκιμής. Η ένταση του φθορισμού πρέπει να είναι ίδια με εκείνη του θετικού μάρτυρα με ίδια αραίωση αντιορού. Κύτταρα με ατελή χρώση ή με ασθενή φθορι?σμό δεν πρέπει να λαμβάνονται υπόψη, εκτός κι αν υπάρχουν πολλά τέτοια κύτταρα (βλέπε ερμηνεία αποτελε?σμάτων της δοκιμής IF). Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής IF i) Εφόσον σε ένα δείγμα δεν ανευρίσκονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, η δοκιμή IF είναι αρνητική. ii) Εφόσον σε ένα δείγμα βρίσκονται λαμπρώς φθορίζο?ντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, προσδιορί?ζεται ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου και υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων (Ν) ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος (προσάρτημα 4). Ένας πληθυσμός 103 περίπου ανά ml αναδιαλυμένου ι?ζήματος, θεωρείται το όριο ανίχνευσης της δοκιμής IF: - σε δείγματα με Ν>103 κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος, η δοκιμή IF θεωρείται θετική, - σε δείγματα με Ν<103 κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος, η δοκιμή IF μπορεί να θεωρηθεί θετική. iii) Aν παρατηρηθούν μεγάλοι αριθμοί (Ν>105 κύτταρα ανά ml) κυττάρων με ατελή ή ασθενή φθορισμό, με τον τίτ?λο του αντιορού, πρέπει να πραγματοποιείται μία δεύτε?ρη δοκιμή: - είτε μία δοκιμή βασισμένη σε μία διαφορετική βιολογι?κή αρχή, - ή επανάληψη της δοκιμής IF, με ένα δεύτερο αντιορό ή με 10 φορές αραιωμένο ίζημα.

Δοκιμή ELISA (βασίζεται στην εργασία των Robinson-Smith et al., 1995) Xρησιμοποιείται αντιορός για Ralstonia solanacearum, κατά προτίμηση έναντι φυλής 3, βιοποικιλίας 2. Ο τίτλος προσδιορίζεται σε αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από το ομόλογο στέλεχος Ralstonia solanacearum. Συνιστάται η χρήση μικρότιτλων πλακών NUNC Polysorp. Περιλαμβάνεται ένας αρνητικός μάρτυρας εκχυλίσμα?τος πατάτας και ένας μάρτυρας από ρυθμιστικό φωσφο?ρικό διάλυμα αλατιού (PBS). Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιείται αιώρημα > 106 κυττάρων ανά ml από στέλεχος Ralstonia solanacearum κατάλληλης φυλής/βιοποικιλίας. Η δοκιμή γίνεται με ταυ?τόσημο τρόπο με εκείνη του ή των δειγμάτων αλλά διαχωρίζεται σαφώς από τα δείγματα στη πλάκα. 3.1. 100-200 μl του αιωρήματος του ιζήματος φέρονται με σιφώνιο σε ένα μικροφιαλίδιο και θερμαίνονται για 4 λεπτά στους 1000 C. Κατόπιν το μικροφιαλίδιο τοποθετεί?ται σε πάγο. 3.2. Προστίθεται ίσος όγκος ανθρακικού ρυθμιστικού διαλύματος επικάλυψης διπλής ιοντικής ισχύος (προσάρ?τημα 5) και το περιεχόμενο ανακατεύεται σε συσκευή vortex. 3.3. Σε δύο τουλάχιστον φατνία της μικρότιτλης πλάκας φέρονται από 100 μl του ανωτέρω διαλύματος και επωά?ζονται για 1 ώρα στους 370 C ή όλη τη νύκτα στους 40 C. 3.4. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να απομακρυνθούν τα εκχυλίσματα από τα φατνία. Τα φατνία πλένονται τρεις φορές με PBS-Tween (προσάρτημα 5), αφήνοντας το τε?λευταίο διάλυμα πλυσίματος στα φατνία για 5 λεπτά του?λάχιστον. 3.5. Παρασκευάζεται η κατάλληλη αραίωση αντιορού Ralstonia solanacearum σε ρυθμιστικό προστατευτικό διάλυμα (blocking buffer) (προσάρτημα 5). Στα φατνία φέ?ρονται 100 μl αραίωσης αντιορού. Επωάζονται για 1 ώρα στους 370 C. 3.6. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να απομακρυνθεί ο α?ντιορός από τα φατνία και τα φατνία πλένονται όπως και προηγουμένως (σημείο 3.4). 3.7. Παρασκευάζεται η κατάλληλη αραίωση συμπλόκου αλκαλικής φωσφατάσης σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύ?σεως. Φέρονται στα φατνία 100 μl από αυτή και επωάζο?νται για 1 ώρα στους 370 C. 3.8. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα του συμπλόκου από τα φατνία και τα φατ?νία πλένονται όπως και προηγουμένως (σημείο 3.4 και 3.6). 3.9. Παρασκευάζεται διάλυμα υποστρώματος αλκαλι?κής φωσφατάσης (προσάρτημα 5). Φέρονται στα φατνία 100 μl από αυτό και ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά έως 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία εργαστηρίου. 3.10. Διαβάζεται η απορρόφηση στα 409 nm. Ερμηνεία της δοκιμής ΕLISA Η δοκιμή ELISA είναι αρνητική εάν η οπτική πυκνότητα (Ο.D.) του δείγματος είναι < 2xO.D. του αρνητικού μάρ?τυρα. Η δοκιμή ELISA είναι θετική εάν η οπτική πυκνότητα (Ο.D.) του δείγματος είναι > 2x O.D. του αρνητικού μάρ?τυρα. 3296 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) PCR, πρέπει να χρησιμοποιούνται ογκομετρικά ακροστό?μια (pipette tips) με φίλτρο. Παρασκευάζεται αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από στέλεχος Ralstonia solanacearum φυλής 3, βιοποικιλίας 2 ως θετικός μάρτυρας. Η δοκιμή γίνεται με ταυτόσημο τρόπο με εκείνη του ή των δειγμάτων. 4.1. 100 μl του αιωρήματος του ιζήματος φέρονται με σι?φώνιο σε ένα μικροφιαλίδιο. Εναλλακτικά 90 μl του αιωρήματος μεταφέρονται σε μι?κροφιαλίδιο περιέχον 10 μl NaOH 0,5M. Το περιεχόμενο του φιαλιδίου ανακατεύεται αναποδογυρίζοντας επανει?λημμένα πάνω κάτω το μικροφιαλίδιο. 4.2. Το φιαλίδιο θερμαίνεται για 4 λεπτά στους 1000 C και κατόπιν απομακρύνεται αμέσως πάνω σε πάγο. 4.3. Παρασκευάζονται δύο τουλάχιστον δεκαδικές α?ραιώσεις π.χ. 1/10 και 1/100, ή περισσότερες αν θεωρηθεί απαραίτητο, σε αποστειρωμένο απεσταγμένο ή υπέρ κα?θαρό νερό (UPW). 4.4. Παρασκευάζεται το μείγμα αντίδρασης PCR (προ?σάρτημα 6) προσθέτοντας σε αποστειρωμένο φιαλίδιο τα παρακάτω συστατικά με την ακόλουθη σειρά: Για όγκο αντίδρασης 50 μl Συστατικό Ποσότητα Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο απεσταγμένο ή UPW 30,8 μl-33,8 μl - 10x ρυθμιστικό διάλυμα PCR 5,0 μl 1x d-ATP 1,0 μl 0,2 mM d-CTP 1,0 μl 0,2 mM d-GTP 1,0 μl 0,2 mM d-ΤΤP 1,0 μl 0,2 mM Eκκινητής ΟLI-1 (20 μΜ) 2,5 μl 1 μM Εκκινητής Υ-2 (20 μΜ) 2,5 μl 1 μΜ Taq πολυμεράση (5U/μl) 0,2 μl 1,0 U Συνολικός όγκος _____ 45 μl - 48 μl Για περισσότερες αντιδράσεις Υπολογίζεται η ποσότητα κάθε συστατικού για τον α?παιτούμενο αριθμό αντιδράσεων. Τα συστατικά αναμειγνύονται και 45 μl-48 μl του μείγ?ματος μεταφέρονται σε αποστειρωμένα φιαλίδια PCR. Τα φιαλίδια με το μείγμα αντίδρασης PCR διατηρούνται σε πάγο. Για όγκο 25 ml H ποσότητα των συστατικών μειώνεται αναλογικά. 4.5. Σύνθεση PCR 4.5.1. Προαιρετικό! Τα φιαλίδια με το βρασμένο δείγμα και τον θετικό μάρτυρα υποβάλλονται σε παλμική φυγο?κέντρηση. Προστίθενται, με την καθοριζόμενη σειρά, 2-5 μl του ή των δειγμάτων, υδατικού μάρτυρα και θετικού μάρτυρα στα φιαλίδια με το μείγμα αντίδρασης PCR.Τα φιαλίδια τοποθετούνται στο θερμικό μπλοκ στη μονάδα θέρμαν?σης του θερμικού κυκλοποιητή DNA. 4.5.2. Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα: 1 κύκλος από: i) 2 λεπτά στους 960 C: μετουσίωση του αρχικού DNA 50 κύκλοι από: ii) 20 δευτερόλεπτα στους 940 C: μετουσίωση iii) 20 δευτερόλεπτα στους 680 C: προσκόλληση εκκινη?τών iv) 30 δευτερόλεπτα στους 720 C: επέκταση αντιγράφου 1 κύκλος από: v) 10 λεπτά στους 720 C: περαιτέρω επέκταση 1 κύκλος συνιστάμενος σε: vi) διατήρηση στους 40 C Σημείωση: Οι παράμετροι αυτές ισχύουν για θερμικό κυκλοποιητή DNA Perkin Elmer 9600. Άλλοι θερμικοί κυ?κλοποιητές μπορεί να απαιτούν επίστρωση ορυκτελαίου στα φιαλίδια PCR ή/και τροποποίηση της διάρκειας των σταδίων ii), iii) και iv) στο πρόγραμμα σύνθεσης. 4.5.3. Τα φιαλίδια απομακρύνονται από τον θερμικό κυ?κλοποιητή. Το προϊόν PCR αναλύεται. Εάν αυτό δεν γίνει αμέσως, τα φιαλίδια αποθηκεύονται στους 40 Cγια χρήση την ίδια μέρα ή στους -180 C για αργότερα. 4.6. Ανάλυση του προϊόντος PCR Τα Τμήματα DNA PCR ανιχνεύονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο 4.6.1 Παρασκευάζεται κατάλληλη πηκτή αγαρόζης βράζοντας ήπια ποσότητα αγαρόζης σε tris-οξικό ρυθμι?στικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (ΤΑΕ). 4.6.2. Η τηγμένη αγαρόζη ψύχεται στους 50-600 C, χύ?νεται στο καλούπι της μονάδας ηλεκτροφόρησης και ει?σάγεται η χτένα. Η πηκτή αφήνεται να στερεοποιηθεί. 4.6.3. Απομακρύνεται η χτένα. Η πηκτή βυθίζεται σε ΤΑΕ έτσι ώστε ίσα-ίσα να καλύπτεται (2-3 mm) από το ρυθμι?στικό διάλυμα. 4.6.4. 3 μl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης φέρονται πάνω σε παραφίλμ. Προστίθενται 12 μl του προϊόντος PCR από τα δείγματα, το θετικό μάρτυρα ή τον υδατικό μάρτυρα και αναμειγνύονται με ελαφρά αναρρόφηση στο ογκομετρικό ακροστόμιο πριν από την φόρτωση στην πη?κτή. Οι αναφερόμενοι όγκοι μπορούν να τροποποιηθούν προκειμένου να προσαρμοστούν στη χωρητικότητα των φατνίων στην πηκτή αγαρόζης. 4.6.5. Η φόρτωση γίνεται με προσοχή στα φατνία της πηκτής. Σε ένα τουλάχιστον φατνίο φέρεται για λόγους α?ναφοράς κατάλληλος ιχνηθέτης DNA. 4.6.6. Συνδέονται τα καλώδια στη συσκευή ηλεκτροφό?ρησης και την πηγή τροφοδοσίας. Εφαρμόζεται τάση 5-8 V/cm μέχρις όπου το μέτωπο του ιχνηλάτη δείκτη φθάσει στο 1 cm από το άκρο της πηκτής. 4.6.7. Διακόπτεται η τροφοδοσία ρεύματος. Τα καλώδια αποσυνδέονται από τη μονάδα ηλεκτροφόρησης, απομα?κρύνεται με προσοχή η πηκτή και εμβαπτίζεται σε βρωμι?ούχο αιθίδιο για 30-45 λεπτά. Σημείωση:Όταν χρησιμοποιούμε βρωμιούχο αιθίδιο, πρέπει να φορούμε πάντοτε γάντια γιατί είναι ισχυρό με?ταλλαξιογόνο. 4.6.8. Ακολουθεί αποχρωματισμός σε απεσταγμένο νε?ρό για 10-15 λεπτά. 4.6.9. Το ή τα συντεθειμένα τμήματα DNA εμφανίζονται με υπεριώδη ακτινοβολία. Το προϊόν PCR του Ralstonia solanacearum με εκκινητές OLI-1 και Υ-2 έχει μήκος 288 bp. Συγκρίνεται σε σχέση με τον ιχνηθέτη DNA και τον θε?τικό μάρτυρα. Σημείωση: Ο υδατικός μάρτυρας πρέπει σε κάθε περί?ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 3297 DNA επιβεβαιώνεται με ανάλυση με ένζυμο περιορισμού (REA). 4.7. Ανάλυση με περιοριστικό ένζυμο (REA). 4.7.1. 8,5 μl από το προϊόν PCR (σημείο 4.5.3.) μεταφέ?ρονται σε νέο μικροφιαλίδιο. Προστίθεται 1 μl 10 x ρυθμι?στικού διαλύματος του ενζύμου και 0,5 μl ένζυμο περιορι?σμού Avall. 4.7.2. Aναμειγνύονται με ήπια αναρρόφηση στο ακρο?στόμιο. Εάν στα τοιχώματα του φιαλιδίου παραμείνουν σταγόνες, φυγοκεντρείται σε παλμική μικροφυγόκεντρο. Ακολουθεί επώαση για 1 ώρα στους 370 C. 4.7.3. Το Τμήμα DNA που υπέστη πέψη αναλύεται με η?λεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης όπως προηγουμένως (σημείο 4.6.). Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής PCR Η δοκιμή PCR είναι αρνητική εφόσον δεν ανιχνεύεται το χαρακτηριστικό τμήμα 288 bp και το τμήμα ανιχνεύεται στο θετικό μάρτυρα Ralstonia solanacearum. H δοκιμή PCR είναι θετική εάν το τμήμα 288 bp ανιχνεύ?εται και η ανάλυση REA του συντεθειμένου τμήματος εί?ναι ίδια με εκείνη του θετικού μάρτυρα Ralstonia solanacearum.

Εκλεκτική απομόνωση επί στερεού υποστρώματος. (βασίζεται στην εργασία των Elphinstone et al., 1996) 5.1. H δοκιμή πραγματοποιείται με κατάλληλη τεχνική αραιώσεων επί στερεού υποστρώματος π.χ.: i) Παρασκευάζονται δύο τουλάχιστον δεκαδικές αραιώ?σεις, συγκεκριμένα 1/10 και 1/100 ή περισσότερες αν θε?ωρηθεί χρήσιμο, του αιωρήματος του ιζήματος σε ρυθμι?στικό διάλυμα ιζήματος. Συγκεκριμένος όγκος (50-100 μl) του αιωρήματος και κάθε αραίωσης μετρημένος με σιφώ?νιο φέρεται σε τροποποιημένο εκλεκτικό υπόστρωμα SM?SA (προσάρτημα 7) και απλώνεται με μία γυάλινη ράβδο σε όλη την επιφάνεια του υποστρώματος. Eφόσον κρίνεται σκόπιμο, πραγματοποιείται γραμμική εξάπλωση αραίωσης, 10 μl αναδιαλυμένου ιζήματος περ?νώντας κάθε φορά τη βελόνα από φλόγα. ii) Συγκεκριμένος όγκος (50-100μl) του αιωρήματος με?τρημένος με σιφώνιο μεταφέρεται σε τροποποιημένο ε?κλεκτικό υπόστρωμα SMSA και απλώνεται με μία γυάλινη ράβδο σε όλη την επιφάνεια του υποστρώματος. Η ρά?βδος σύρεται γραμμωτά σε δύο ακόμη τροποποιημένα τρυβλία SMSA χωρίς να την περάσουμε από φλόγα. 5.2. Αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από παθογόνο στέ?λεχος Ralstonia solanacearum φυλής 3, βιοποικιλίας 2 που παίζει ρόλο θετικού μάρτυρα εξαπλούται, με την ίδια τεχνική, σε μία σειρά ξεχωριστών τρυβλίων τροποποιημέ?νων SMSA. 5.3. Τα τρυβλία επωάζονται στους 280 C. Μετά 3 ημέρες ξεκινά η ανάγνωση των τρυβλίων. Εάν το αποτέλεσμα εί?ναι αρνητικό, αφήνονται να επωαστούν ακόμη μέχρι 6 η?μέρες. Οι παθογόνες απομονώσεις του Ralstonia solanacearum αναπτύσσουν γαλακτώδους χροιάς λευ?κές, επίπεδες, ακανόνιστες και ρευστώδεις αποικίες με διακριτά ερυθρά προς το πορφυρούν κέντρα που εμφανί?ζουν εσωτερικές ραβδώσεις ή ελικώσεις. 5.4. Οι αποικίες με χαρακτηριστική μορφολογία καθα?ρίζονται με εκ νέου καλλιέργεια σε θρεπτικό υπόστρωμα γενικής χρήσεως (προσάρτημα 1). 5.5. Οι καθαρές καλλιέργειες ταυτοποιούνται (τμήμα ΙΙ.4.1.) και οι καλλιέργειες του Ralstonia solanacearum ε?πιβεβαιώνονται με μία δοκιμή παθογένειας (τμήμα ΙΙ.4.3). Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής (εκλεκτικής απομόνωσης επί στερεού υποστρώματος) Η δοκιμή είναι αρνητική εάν δεν απομονωθούν αποικίες βακτηρίων μετά 6 ημέρες ή εάν δεν απομονωθούν χαρα?κτηριστικές αποικίες Ralstonia solanacearum υπό την προϋπόθεση ότι δεν υπάρχουν υπόνοιες για παρεμπόδι?ση από αποικίες άλλων βακτηρίων και χαρακτηριστικές α?ποικίες του Ralstonia solanacearum απομονώνονται από τους θετικούς μάρτυρες. Η δοκιμή είναι θετική εάν απομονωθούν χαρακτηριστι?κές αποικίες Ralstonia solanacearum.