Verordnung des Bundesministers für Gesundheit, Sport und Konsumentenschutz über Analysenmethoden zur Kontrolle der Zusammensetzung der kosmetischen Mittel (Kosmetik – Analysenverordnung)

3.1. Salpetersäure, 0,02 M.

3.2. Silber-Standardlösungen.

3.2.1. Silber-Standardstammlösung, 1 000 g/ml in 0,5 M Salpetersäure („SpectrosoL“ oder gleichwertiges).

3.2.2. Silber-Standardlösung, 100 g/ml:

4.1. Normale Laborausstattung.

4.2. Atomabsorptionsspektrophotometer mit Silber-Hohlkathodenlampe.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.2. Bedingungen für die Atomabsorptionsspektrometrie

Brenngasbedingungen:	brenngasarm; für eine maximale Absorption ist eine Optimierung der Brennerhöhe und der Brenngasbedingungen erforderlich.

5.3. Eichung

5.3.1. Von der Silber-Standardlösung (3.2.2) werden 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 bzw. 5,0 ml in eine Reihe von 100-ml-Meßkolben pipettiert und jeweils mit 0,02 M Salpetersäure (3.1) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösungen enthalten 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 5,0 g Silber je Milliliter.

5.3.2. Die Extinktion der 0,02 M Salpetersäure (3.1) wird gemessen und der erhaltene Extinktionswert als Blindwert der Silberkonzentration für die Eichkurve verwendet.

5.4. Bestimmung

m =	Einwaage der untersuchten Probe in Gramm (5.1),
c =	aus der Eichkurve abgelesene Silberkonzentration der Prüflösung (5.1) in Mikrogramm je Milliliter.

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(¹) ISO 5725.

Anlage 31

NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON SELENDISULFID IN ANTISCHUPPEN-SHAMPOOS

A. Nachweis

3.1. Konzentrierte Salpetersäure (d 20 = 1,42 g/ml).

3.2. Harnstoff.

3.3. Kaliumiodid-Lösung, 10 % (m/v): 10 g Kaliumiodid werden in 100 ml Wasser gelöst.

4.1. Normale Laborausstattung.

4.2. Druckaufschlußbehälter, 100 ml.

4.3. Heizblock.

4.4. Filterpapier (Whatman Nr. 42 oder gleichwertiges) oder Membranfilter, 0,45 m.

5.1. In einem Druckaufschlußbehälter (4.2) werden zu etwa 1 g Shampoo 2,5 ml konzentrierte Salpetersäure (3.1) gegeben und 30 Minuten lang bei 150 °C in einem Heizblock (4.3) aufgeschlossen.

5.2. Die digerierte Probe wird mit Wasser auf ein Volumen von 25 ml verdünnt und durch ein Papierfilter oder ein 0,45- m-Membranfilter (4.4) filtriert.

5.3. 2,5 ml des Filtrats werden mit 5 ml Wasser und 2,5 g Harnstoff (3.2) versetzt und zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen wird 1 ml Kaliumiodid-Lösung (3.3) hinzugegeben.

5.4. Eine gelbe bis orange Farbe, die beim Stehen rasch nachdunkelt, zeigt das Vorhandensein von Selen an.

B. Bestimmung

3.1. Konzentrierte Salpetersäure (d 20 = 1,42 g/ml).

3.2. Salpetersäure 5 % (v/v): Zu 500 ml Wasser werden in einem Becherglas unter ständigem Rühren 50 ml konzentrierte Salpetersäure (3.1) gegeben. Die Lösung wird in einen 1-Liter-Meßkolben übergeführt und bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt.

3.3. Selen-Standardlösung, 1 000 g/ml in 0,5 M Salpetersäure („SpectrosoL“ oder gleichwertiges).

4.1. Normale Laborausstattung.

4.2. Druckaufschlußbehälter, 100 ml.

4.3. Heizblock.

4.4 Filterpapier (Whatman Nr. 42 oder gleichwertiges) oder Membranfilter, 0,45 m.

4.5. Atomabsorptionsspektrophotometer mit Selen-Hohlkathodenlampe.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.1.1. Ungefähr 0,2 g (m Gramm) einer homogenen Probe Shampoo werden in einen Druckaufschlußbehälter (4.2) genau eingewogen.

5.1.2. Nach Zusatz von 5 ml konzentrierter Salpetersäure (3.1) wird die Mischung im Heizblock (4.3) bei 150 °C 1 Stunde lang aufgeschlossen.

5.1.3. Nach dem Abkühlen wird die Mischung mit Wasser zu 100 ml verdünnt und über ein Papierfilter oder ein 0,45- m-Membranfilter (4.4) filtriert. Das Filtrat dient als Prüflösung.

5.2. Bedingungen für die Atomabsorptionsspektrometrie

5.3. Eichung

5.3.1. Von der Selen-Standardlösung (3.3) werden 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 5,0 ml in einer Reihe von 100 ml Meßkolben pipettiert und jeweils mit 5%iger (v/v) Salpetersäure (3.2) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Eichlösungen enthalten 10, 20, 30, 40 bzw. 50 g Selen je Milliliter.

5.3.2. Die Extinktion der 5%igen (v/v) Salpetersäure (3.2) wird gemessen und der erhaltene Extinktionswert als Blindwert der Selenkonzentration für die Eichkurve verwendet. Die Extinktion jeder Selen-Eichlösung (5.3.1) wird gemessen und die Abhängigkeit des Extinktionswertes von der Selenkonzentration in Form der Eichkurve aufgezeichnet.

5.4. Bestimmung

m =	Einwaage der untersuchten Probe (5.1.1) in Gramm,
c =	aus der Eichkurve abgelesene Selenkonzentration der Prüflösung (5.1.3) in Mikrogramm je Milliliter.

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(¹) ISO 5725.

Anlage 32

BESTIMMUNG VON LÖSLICHEM BARIUM UND STRONTIUM IN FARBPIGMENTEN IN FORM VON SALZEN ODER LACKEN

A. Bestimmung von löslichem Barium

3.1. Absolutes Ethanol.

3.2. Salzsäure, 0,07 M.

3.3. Salzsäure, 0,5 M.

3.4. Kaliumchloridlösung, 8 % (m/v): 16 g Kaliumchlorid werden in 200 ml 0,07 M Salzsäure (3.2) gelöst.

3.5. Barium-Standardlösungen

3.5.1. Barium-Standardstammlösung, 1 000 g/ml in 0,5 M Salpetersäure („SpectrosoL“ oder gleichwertiges).

3.5.2. Barium-Standardlösung, 200 g/ml: 20,0 ml der Barium-Standardstammlösung (3.5.1) werden in einen 100-ml-Meßkolben pipettiert und mit 0,07 M Salzsäure (3.2) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

4.1. Normale Laborausstattung.

4.2. pH-Meter mit einer Genauigkeit von 0,02 Einheiten.

4.3. Schüttelmaschine.

4.4. Membranfilter, 0,45 m.

4.5. Atomabsorptionsspektrophotometer mit Barium-Hohlkathodenlampe.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.1.1. Ungefähr 0,5 g (m Gramm) Farbpigment werden genau in einen Erlenmeyerkolben eingewogen, dessen Fassungsvermögen mindestens 150 ml betragen sollte, um ein wirkungsvolles Schütteln zu gewährleisten.

5.1.2. Nach Zusatz von 1,0 ml Ethanol (3.1) mittels Pipette wird der Kolben vorsichtig geschwenkt, bis das Pigment vollständig durchtränkt ist. Aus einer Bürette wird genau so viel 0,07 M Salzsäure (3.2) zugesetzt, daß ein Verhältnis Volumen der Säure zu Masse des Pigments von genau 50 Milliliter je Gramm erhalten wird. Das gesamte Volumen des Extraktionsmittels einschließlich Ethanol beträgt dann V ml. Der Inhalt des Kolbens wird 5 Sekunden lang geschüttelt, um eine vollkommene Durchmischung zu gewährleisten.

5.1.3. Der pH-Wert der entstandenen Suspension wird mit dem pH-Meter (4.2) gemessen. Liegt der Wert über 1,5, wird tropfenweise 0,5 M Salzsäure (3.3) hinzugefügt, bis er in den Bereich von 1,4 bis 1,5 fällt.

5.1.4. Der Kolben wird verschlossen und anschließend sofort 60 Minuten lang in der Schüttelmaschine (4.3) geschüttelt, wobei eine ausreichend hohe Geschwindigkeit einzustellen ist, damit ein Schaum entsteht. Danach wird die Mischung durch ein 0,45- m-Membranfilter (4.4) filtriert. Die Mischung darf vor der Filtration nicht zentrifugiert werden. 5,0 ml des Filtrats werden in einen 50-ml-Meßkolben pipettiert, mit 0,07 M Salzsäure (3.2) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

5.1.5. In einen 100-ml-Meßkolben werden 5,0 ml Kaliumchloridlösung (3.4) und ein aliquoter Teil (W Ba ml) des verdünnten Filtrats (5.1.4) pipettiert, so daß die erwartete Konzentration zwischen 3 und 10 g Barium je Milliliter liegt. (Ein aliquoter Teil von 10 ml ist ein guter Anfangswert). Die Lösung wird mit 0,07 M Salzsäure (3.2) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

5.1.6. Die atomabsorptionsspektrometrische Bestimmung des Bariumgehaltes der Prüflösung (5.1.5) ist am selben Tag durchzuführen.

5.2. Bedingungen für die Atomabsorptionsspektrometrie

5.3. Eichung

5.3.1. Von der Barium-Standardlösung (3.5.2) werden 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 5,0 ml in einer Reihe von 100-ml-Meßkolben pipettiert. Nach Zusatz von jeweils 5,0 ml Kaliumchloridlösung (3.4) mittels Pipette wird mit 0,07 M Salzsäure (3.2) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

5.3.2. Die Extinktion der Blindlösung (5.3.1) wird gemessen und der erhaltene Extinktionswert als Blindwert der Bariumkonzentration für die Eichkurve verwendet.

5.4. Bestimmung

m	=	Einwaage der untersuchten Probe (5.1.1) in Gramm,
c	=	aus der Eichkurve abgelesene Bariumkonzentration der Prüflösung (5.1.5) in Mikrogramm je Milliliter bzw. der aus der Gleichung für die Regressionsgerade berechnete Wert,
V	=	Gesamtvolumen des Extraktionsmittels (5.1.2) in Milliliter,
WBa	=	aliquoter Teil des Extrakts aus 5.1.5 in Milliliter.

8.1. Unter bestimmten Bedingungen kann bei Anwesenheit von Calcium die Barium-Absorption erhöht werden. Dies kann durch Zusatz von Magnesium-Ionen in einer Konzentration von 5 g/l verhindert werden ( 1 ).

8.2. Die Anwendung der ICP-Atomemmissionsspektrometrie ist als Alternativmethode zur Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie zugelassen.

B. Bestimmung von löslichem Strontium

3.1. Absolutes Ethanol.

3.2. Salzsäure, 0,07 M.

3.3. Kaliumchloridlösung, 8 % (m/v): 16 g Kaliumchlorid werden in 200 ml 0,07 M Salzsäure (3.2) gelöst.

3.4. Strontium-Standardlösungen

3.4.1. Strontium-Standardstammlösung, 1 000 g/ml in 0,5 M Salpetersäure („SpectrosoL“ oder gleichwertiges).

3.4.2. Strontium-Standardlösung, 100 g/ml:

4.1. Normale Laborausstattung.

4.2. Membranfilter, 0,45 m.

4.3. Atomabsorptionsspektrophotometer mit Strontium-Hohlkathodenlampe.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.1.1. In einen 100-ml-Meßkolben werden 5,0 ml Kaliumchloridlösung (3.3) und ein aliquoter Teil (W Sr ml) des verdünnten Filtrates (A. 5.1.4) pipettiert, so daß die erwartete Konzentration zwischen 2 und 5 g Strontium je Milliliter liegt. (Ein aliquoter Teil von 25 ml ist ein guter Anfangswert). Die Lösung wird mit 0,07 M Salzsäure (3.2) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

5.1.2. Die atomabsorptionsspektrometrische Bestimmung des Strontiumgehaltes der Prüflösung (5.1.1) ist am selben Tag durchzuführen.

5.2. Bedingungen für die Atomabsorptionsspektrometrie

5.3. Eichung

5.3.1. Von der Strontium-Standardlösung (3.4.2) werden 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 5,0 ml in eine Reihe von 100-ml-Meßkolben pipettiert. Nach Zusatz von jeweils 5,0 ml Kaliumchloridlösung (3.3) mittels Pipette wird mit 0,07 M Salzsäure (3.2) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

5.3.2. Die Extinktion der Blindlösung (5.3.1) wird gemessen und der erhaltene Extinktionswert als Blindwert der Strontiumkonzentration für die Eichkurve verwendet. Die Extinktion jeder Strontium-Eichlösung (5.3.1) wird gemessen und die Abhängigkeit des Extinktionswertes von der Strontiumkonzentration in Form der Eichkurve aufgezeichnet.

5.4. Bestimmung

m	=	Einwaage der untersuchten Probe (A. 5.1.1) in Gramm,
c	=	aus der Eichkurve abgelesene Strontiumkonzentration der Prüflösung (5.1.1) in Mikrogramm je Milliliter,
V	=	Gesamtvolumen des Extraktionsmittel (A. 5.1.2) in Milliliter,
WSr	=	aliquoter Teil des Extrakts aus 5.1.1 in Milliliter.

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(1) Jerrow, M. et a.: Magnesium as modifier for the determination of barium by flame atomic emission spectrometry. Analytical Proceedings 28, (1991).

Anlage 33

NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON BENZYLALKOHOL IN KOSMETISCHEN MITTELN

A. Nachweis

3.1. Benzylalkohol.

3.2. Chloroform.

3.3. Absolutes Ethanol.

3.4. n-Pentan.

3.5. Fließmittel: Diethylether.

3.6. Benzylalkohol-Standardlösung: 0,1 g Benzylalkohol (3.1) wird in einen 100-ml-Meßkolben eingewogen, mit Ethanol (3.3) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

3.7. DC-Fertigplatten (Glas, 200 mm x 200 mm oder 100 mm x 200 mm).

3.8. Sprühreagenz: 12-Molybdatophosphorsäure, 10% (m/v) in Ethanol (3.3).

4.1. Übliche Ausrüstung zur Dünnschichtchromatographie.

4.2. Doppeltrogkammer, Gesamtmaße ungefähr 80 x 230 x 240 mm.

4.3. Chromatographiepapier: Whatman oder gleichwertiges.

4.4. UV-Lampe, Wellenlänge 254 nm.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.2. Dünnschichtchromatographie

5.2.1. Die Doppeltrogkammer (4.2) wird mit n-Pentan (3.4) wie folgt gesättigt: Die Kammerwand des hinteren Troges wird mit Chromatographiepapier (4.3) ausgelegt, wobei der untere Rand des Papiers in den Trog hineinreicht. 25 ml n-Pentan (3.4) werden durch Gießen über die sichtbare Oberfläche des Chromatographiepapiers in den hinteren Trog eingefüllt. Anschließend wird die Kammer sofort mit dem Deckel verschlossen und 15 Minuten stehengelassen.

5.2.2. 10 l der Probelösung (5.1) und 10 l Benzylalkohol-Standardlösung (3.6) werden auf die Dünnschichtplatte an geeigneten Punkten entlang der Startlinie aufgetragen.

5.2.3. In den vorderen Trog der Kammer werden 10 ml Fließmittel (3.5) pipettiert und anschließend sofort die Dünnschichtplatte (5.2.2) in denselben Trog hineingestellt. Der Kammerdeckel wird sofort wieder aufgesetzt und die Dünnschichtplatte bis zu einer Höhe von 150 mm entwickelt. Die Dünnschichtplatte wird der Kammer entnommen und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis das Fließmittel verdunstet ist.

5.2.4. Die Dünnschichtplatte (5.2.3) wird im ultravioletten Licht der Wellenlänge 254 nm betrachtet; die violetten Flecke werden markiert. Anschließend wird die Dünnschichtplatte mit dem Sprühreagenz (3.8) besprüht und danach ungefähr 15 Minunten (Anm.: richtig: Minuten) lang bei 120 °C erhitzt. Benzylalkohol erscheint als dunkelblauer Fleck.

5.2.5. Der R f -Wert des Benzylalkohol-Standards wird berechnet. Das Chromatogramm zeigt bei Vorhandensein von Benzylalkohol in der Probelösung einen dunkelblauen Fleck mit dem R f Wert und der Farbe des Fleckes der Benzylalkohol-Standardlösung.

B. Bestimmung

4.1. Methanol.

4.2. 4-Ethoxyphenol.

4.3. Benzylalkohol.

4.4. Fließmittel (Mobile Phase): Methanol (4.1)/Wasser (45 : 55; v/v).

4.5. Benzylalkohol-Stammlösung: Ungefähr 0,1 g Benzylalkohol (4.3) wird genau in einen 100-ml-Meßkolben eingewogen, mit Methanol (4.1) gelöst, zur Marke aufgefüllt und gemischt.

4.6. Stammlösung des inneren Standards: Ungefähr 0,1 g 4-Ethoxyphenol (4.2) wird genau in einen 100-ml-Meßkolben eingewogen, mit Methanol (4.1) gelöst, bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

4.7. Standardlösungen: Gemäß nachstehender Tabelle werden die entsprechenden Volumina der Benzylalkohol-Stammlösung (4.5) und der Stammlösung des inneren Standards (4.6) in eine Serie von 25-ml-Meßkolben einpipettiert und mit Methanol (4.1) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt.

Standard-lösung	Benzylalkohol	4-Ethoxyphenol
(4.5)(ml)	g/ml (*)	(4.6)(ml)	g/ml (*)
I	0,5	20	2,0	80
II	1,0	40	2,0	80
III	2,0	80	2,0	80
IV	3,0	120	2,0	80
V	5,0	200	2,0	80
(*) Diese Werte sind richtungsweisend und entsprechen den Konzentrationen in den bereiteten Standardlösungen, wenn Lösungen von Benzylalkohol (4.5) und 4-Ethoxyphenol (4.6) verwendet werden, die genau 0,1% (m/v) Benzylalkohol bzw. genau 0,1% (m/v) 4Ethoxyphenol enthalten.

5.1. Normale Laborausstattung.

5.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatograph (HPLC) mit Ultra-violett-Detektor mit variabler Wellenlänge und mit 10 l Probenschleife.

5.3. Analytische Trennsäule:

5.4. Wasserbad.

5.5 Ultraschallbad.

5.6. Zentrifuge.

5.7. Zentrifugengläser mit 15 ml Fassungsvermögen.

6.1. Vorbereitung der Probe

6.1.1. Ungefähr 0,1 g (m Gramm) der Probe wird genau in ein Zentrifugenglas (5.7) eingewogen und mit 5 ml Methanol (4.1) versetzt.

6.1.2. Die Mischung wird 10 Minuten im 50 °C warmen Wasserbad (5.4) erwärmt und anschließend in ein Ultraschallbad (5.5) bis zur homogenen Verteilung gestellt.

6.1.3. Nach dem Abkühlen wird die Mischung 5 Minuten bei 3 500 U/min zentrifugiert.

6.1.4. Die überstehende Flüssigkeit wird in einen 25-ml-Meßkolben übergeführt.

6.1.5. Der Rückstand wird mit weiteren 5 ml Methanol (4.1) extrahiert. Die Extrakte werden im 25-ml-Meßkolben vereinigt.

6.1.6. Nach Zusatz von 2,0 ml Stammlösung des inneren Standards (4.6) mittels Pipette wird mit Methanol (4.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung wird, wie im Abschnitt 6.4 beschrieben, chromatographiert.

6.2. Bedingungen für die Chromatographie

6.2.1. Volumenstrom der mobilen Phase: 2 ml/min.

6.2.2. Detektionswellenlänge: 210 nm.

6.3. Eichung

6.3.1. 10 l jeder der fünf Benzylalkohol-Standardlösungen (4.7) werden chromatographiert und die Peakflächen des Benzylalkohols und des 4-Ethoxyphenols gemessen.

6.3.2. Für jede Konzentration der Benzylalkohol-Standardlösungen (4.7) wird das Verhältnis zwischen der Peakfläche des Benzylalkohols und der Peakfläche des 4-Ethoxyphenols ermittelt. Es wird eine Eichkurve gezeichnet, indem die Peakflächenverhältnisse als Ordinate und die entsprechenden Konzentrationen des Benzylalkohols in Mikrogramm je Milliliter als Abszisse aufgetragen werden.

6.4. Bestimmung

6.4.1. 10 l der Probelösung (6.1.6) werden chromatographiert, die Peakflächen des Benzylalkohols und des 4-Ethoxyphenols gemessen und das Peakflächenverhältnis von Benzylalkohol zu 4 Ethoxyphenol ermittelt. Die Wiederholbarkeit des Meßsignals wird durch wiederholtes Chromatographieren überprüft.

6.4.2. Aus der Eichkurve (6.3.2) wird die Konzentration des Benzylalkohols abgelesen, die dem Peakflächenverhältnis von Benzylalkohol zu 4-Ethoxyphenol entspricht.

m =	Einwaage der untersuchten Probe im Gramm (6.1.1),
c =	aus der Eichkurve abgelesene Konzentration an Benzylalkohol der Probelösung (6.1.6) in Mikrogramm je Milliliter.

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(¹) ISO 5725.

Anlage 34

NACHWEIS VON ZIRKONIUM UND BESTIMMUNG VON ZIRKONIUM, ALUMINIUM UND CHLOR IN NICHTAEROSOLFÖRMIGEN ANTITRANSPIRANTIEN

Die Methode umfaßt fünf Schritte:

A. Nachweis von Zirkonium,

B. Bestimmung von Zirkonium,

C. Bestimmung von Aluminium,

D. Bestimmung von Chlor,

E. Berechnung des Verhältnisses von Aluminiumatomen zu Zirkoniumatomen sowie von Aluminium- und Zirkoniumatomen zu Chloratomen.

A. Nachweis von Zirkonium

3.1. Salzsäure, konzentriert (d 20 = 1,18 g/ml).

3.2. Alizarinrot-S-Lösung (Cl. 58005): 2%iges (m/v) wäßriges Natrium-Alizarinsulphonat.

4.1. Normale Laborausstattung.

5.1. In einem Reagenzglas werden zu ca. 1 g Probe 2 ml Wasser gegeben. Das Reagenzglas wird verschlossen und geschüttelt.

5.2. Es werden 3 Tropfen Alizarinrot-S-Lösung (3.2) und dann 2 ml konzentrierte Salzsäure (3.1) zugegeben. Das Reagenzglas wird verschlossen und geschüttelt.

5.3. Das Reagenzglas wird etwa 2 Minuten stehengelassen.

5.4. Eine Lösung und ein Niederschlag von rotvioletter Farbe zeigen das Vorhandensein von Zirkonium.

B. Bestimmung von Zirkonium

3.1. Salzsäure, konzentriert (d 20 = 1,18 g/ml).

3.2. Salzsäurelösung, 10 % (v/v): zu 500 ml Wasser werden in einem Becherglas unter ständigem Rühren 100 ml konzentrierte Salzsäure (3.1) gegeben. Diese Lösung wird in einen 1-l-Meßkolben geschüttet und bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt.

3.3. Zirkonium-Maßlösung, 1 000 g/ml in 0,5 M Salzsäurelösung („SpektrosoL“ oder gleichwertiges).

3.4. Aluminiumchlorid-Reagenz (hydriert) [AlCl 3 6H 2 O] : 22,6 g Aluminiumchloridhexahydrat werden in 250 ml 10%iger (v/v) Salzsäurelösung (3.2) gelöst.

3.5. Ammoniumchloridreagenz: 5,0 g Ammoniumchlorid werden in 250 ml 10%iger (v/v) Salzsäurelösung (3.2) gelöst.

4.1. Normale Laborausstattung.

4.2. Heizplatte mit Magnetrührer.

4.3. Filterpapier (Whatman Nr. 41 oder gleichwertiges).

4.4. Atomabsorptionsspektrometer mit Zirkonium-Hohlkathodenlampe.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.1.1. Ungefähr 1,0 g (m Gramm) einer homogenen Probe des Produkts werden in ein 150-ml-Becherglas sorgfältig eingewogen. Man fügt 40 ml Wasser und 10 ml konzentrierte Salzsäure (3.1) hinzu.

5.1.2. Das Becherglas wird auf eine Heizplatte mit Magnetrührer (4.2) gestellt. Der Inhalt wird unter Rühren zum Kochen gebracht. Um rasches Verdunsten zu verhindern, wird das Becherglas mit einem Uhrglas abgedeckt. Nach 5minütigem Kochen wird das Becherglas von der Heizplatte genommen und auf Raumtemperatur abgekühlt.

5.1.3. Mit Hilfe des Filterpapiers (4.3) wird der Inhalt des Becherglases in einen 100-ml-Meßkolben filtriert. Das Becherglas wird zweimal mit je 10 ml Wasser gespült, und das Spülwasser wird nach Filtration in den Meßkolben gegeben. Der Meßkolben wird bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt und der Inhalt vermischt. Diese Lösung wird auch für die Aluminiumbestimmung verwendet (Teil C).

5.1.4. In einen 50-ml-Meßkolben werden 20,00 ml der Probenlösung (5.1.3), 5,00 ml Aluminiumchloridreagenz (3.4) und 5,00 ml Ammoniumchloridreagenz (3.5) pipettiert. Die Lösung wird mit 10%iger (v/v) Salzsäurelösung (3.2) bis zur Marke aufgefüllt und vermischt.

5.2. Bedingungen für die Atomabsorptionsspektroskopie

5.3. Eichung

5.3.1. Von der Zirkonium-Maßlösung (3.3) werden 5,00, 10,00, 15,00, 20,00 und 25,00 ml in eine Reihe von 50-ml-Meßkolben pipettiert. In jeden Meßkolben werden 5,00 ml Aluminiumchloridreagenz (3.4) und 5,00 ml Ammoniumchloridreagenz (3.5) pipettiert. Die Lösungen werden mit 10%iger (v/v) Salzsäurelösung (3.2) zur Marke aufgefüllt und vermischt. Sie enthalten 100, 200, 300, 400 bzw. 500 g Zirkonium je Milliliter.

5.3.2. Die Absorption der Blindlösung (5.3.1) wird gemessen und der erhaltene Wert als Nullpunkt der Zirkoniumkonzentration für die Eichkurve gesetzt. Die Absorption jeder Zirkonium-Eichlösung (5.3.1) wird gemessen. Man zeichnet eine Eichkurve, die den Zusammenhang zwischen Absorptionswerten und Zirkoniumkonzentration aufzeigt.

5.4. Bestimmung

m =	Masse der zu analysierenden Probe (5.1.1) in Gramm; und
c =	die aus der Eichkurve abgelesene Zirkoniumkonzentration in der Probenlösung (5.1.4) in Mikrogramm je Milliliter.

C. Bestimmung von Aluminium

3.1. Salzsäure, konzentriert (d 20 = 1,18 g/ml).

3.2. Salzsäurelösung 1 % (v/v): zu 500 ml Wasser werden in einem Becherglas unter ständigem Rühren 10 ml konzentrierte Salzsäure (3.1) gegeben. Die Lösung wird in einen 1-l-Meßkolben geschüttet und bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt.

3.3. Aluminium-Maßlösung, 1 000 g/ml in 0,5 M Salpetersäurelösung („SpektrosoL“ oder gleichwertiges).

3.4. Kaliumchloridreagenz: 10,0 g Kaliumchlorid werden in 250 ml 1%iger (v/v) Salzsäurelösung (3.2) gelöst.

4.1. Normale Laborausstattung.

4.2. Atomabsorptionsspektrometer mit Aluminium-Hohlkathodenlampe.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.1.1. In einen 100-ml-Meßkolben werden 5,00 ml der Probenlösung (B 5.1.3) und 10,00 ml Kaliumchloridreagenz (3.4) pipettiert. Die Lösung wird mit 1%iger (v/v) Salzsäurelösung (3.2) bis zur Marke aufgefüllt und vermischt.

5.2. Bedingungen für die Atomabsorptionsspektroskopie

5.3. Eichung

5.3.1. Von der Aluminium-Maßlösung (3.3) werden 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 und 5,00 ml in eine Reihe von 100-ml-Meßkolben pipettiert. In jeden Meßkolben werden 10,00 ml Kaliumchloridreagenz (3.4) pipettiert. Die Lösungen werden mit 1%iger (v/v) Salzsäurelösung (3.2) zur Marke aufgefüllt und vermischt. Sie enthalten 10, 20, 30, 40 und 50 g Aluminium je Milliliter.

5.3.2. Die Absorption der Blindlösung (5.3.1) wird gemessen und der erhaltene Wert als Nullpunkt der Aluminiumkonzentration für die Eichkurve gesetzt. Die Absorption jeder Aluminiumeichlösung wird gemessen. Man zeichnet eine Eichkurve, die den Zusammenhang zwischen Absorptionswerten und Aluminiumkonzentration aufzeigt.

5.4. Bestimmung

m =	Masse der zu analysierenden Probe (B. 5.1.1) in Gramm; und
c =	die aus der Eichkurve abgeleseneAluminiumkonzentration in der Probenlösung (5.1.1) in Mikrogramm je Milliliter.

D. Bestimmung von Chlor

3.1. Salpetersäure, konzentriert (d 20 = 1,42 g/ml).

3.2. Salpetersäurelösung, 5 % (v/v): zu 250 ml Wasser werden in einem Becherglas unter ständigem Rühren 25 ml konzentrierte Salpetersäure (3.1) gegeben. Die Lösung wird in einen 500-ml-Meßkolben geschüttet und bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt.

3.3. Aceton.

3.4. Silbernitrat, 0,1 M Maßlösung („AnalaR“ oder gleichwertiges).

4.1. Normale Laborausstattung.

4.2. Heizplatte mit Magnetrührer.

4.3. Silberelektrode.

4.4. Calomel-Bezugselektrode.

4.5. pH/Millivoltmeter, das für potentiometrische Titration geeignet ist.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.1.1. Ungefähr 1,0 g (m Gramm) einer homogenen Probe des Produkts werden in ein 250-ml-Becherglas sorgfältig eingewogen. Man fügt 80 ml Wasser und 20 ml 5%ige (v/v) Salpetersäurelösung (3.2) hinzu.

5.1.2. Das Becherglas wird auf eine Heizplatte mit Magnetführer (4.2) gestellt. Der Inhalt wird unter Rühren zum Kochen gebracht. Um schnelles Austrocknen zu verhindern, wird das Becherglas mit einem Uhrglas abgedeckt. Nach 5minütigem Kochen wird das Becherglas von der Heizplattegenommen und auf Raumtemperatur abgekühlt.

5.1.3. Man fügt 10 ml Aceton (3.3) hinzu, taucht die Elektroden (4.3 und 4.4) in die Lösung und beginnt zu rühren. Man titriert potentiometrisch mit 0,1 M Silbernitratlösung (3.4) und zeichnet eine Differentialkurve zur Bestimmung des Endpunkts (V ml).

m =	Masse der zu analysierenden Probe (5.1.1) in Gramm; und
V =	Volumen des bis zum Endpunkt der Titration (5.1.3) verbrauchten 0,1 M Silbernitrats in Milliliter.

E. Berechnung des Verhältnisses von Aluminiumatomen zu Zirkoniumatomen sowie von Aluminium- und Zirkoniumatomen zu Chloratomen

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(1) ISO 5725.

Anlage 35

NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON HEXAMIDEN, DIBROMHEXAMIDIN, DIBROMPROPAMIDIN UND CHLORHEXIDIN

– Hexamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat und p-Hydroxybenzoat,

– Dibromhexamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat,

– Dibrompropamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat,

– Chlorhexidindiacetat, -digluconat und -dihydrochlorid

4.1. Methanol.

4.2. Natriumsalz der 1-Heptansulfonsäure, Monohydrat.

4.3. Essigsäure (Eisessig, d 20 = 1,05 g/ml).

4.4. Natriumchlorid.

4.5. Fließmittel (Mobile Phase).

4.5.1. Eluent I: 0,005 M Lösung des Natriumsalzes der 1-Heptansulfonsäure (4.2) in Methanol (4.1), mit Essigsäure (4.3) auf einen scheinbaren pH-Wert von 3,5 eingestellt.

4.5.2. Eluent II: 0,005 M wäßrige Lösung des Natriumsalzes der 1-Heptansulfonsäure (4.2), mit Essigsäure (4.3) auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt.

Bemerkung:	Die Eluenten I und II können erforderlichenfalls zur Verbesserung der Peakform modifiziert und wie folgt hergestellt werden:

– Eluent I: 5,84 g Natriumchlorid (4.4) und 1,1013 g des Natriumsalzes der 1 Heptansulfonsäure (4.2) werden in 100 ml Wasser gelöst. Nach Zusatz von 900 ml Methanol (4.1) wird die Mischung mit Essigsäure (4.3) auf einen scheinbaren pH-Wert von 3,5 eingestellt.

– Eluent II: 5,84 g Natriumchlorid (4.4) und 1,1013 g des Natriumsalzes der 1 Heptansulfonsäure (4.2) werden in 1 Liter Wasser gelöst und mit Essigsäure (4.3) auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt.

4.6. Hexamidindiisethionat [C 20 H 26 N 4 O 2 2C 2 H 6 O 4 S].

4.7. Dibromhexamidindiisethionat [C 20 H 24 Br 2 N 4 O 2 2C 2 H 6 O 4 S].

4.8. Dibrompropamidindiisethionat [C 17 H 18 Br 2 N 4 O 2 2C 2 H 6 O 4 S].

4.9. Chlorhexidindiacetat [C 22 H 30 Cl 2 N 10 2C 2 H 4 O 2 ].

4.10. Referenzlösungen: 0,05%ige (m/v) Lösungen von jedem der vier Konservierungsmittel (4.6 bis 4.9) in Eluent I (4.5.1).

4.11. 3,4,4'-Trichlor-carbanilid (Triclocarban).

4.12. 4,4'-Dichlor-3-trifluormethyl-carbanilid (Halocarban).

5.1. Normale Laborausstattung.

5.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit UV-Detektor mit variabler Wellenlänge.

5.3. Analytische Trennsäule.

5.4. Ultraschallbad.

6.1. Vorbereitung der Probe

6.2. Chromatographie

6.2.1. Gradientenprogramm:

Zeit	Eluent I	Eluent II
(Minuten)	(4.5.1) (% v/v)	(4.5.2) (% v/v)
0	50	50
15	65	35
30	65	35
45	50	50

6.2.2. Volumenstrom der mobilen Phase (6.2.1): 1,5 ml/min, Säulentemperatur: 35 °C.

6.2.3. Detektionswellenlänge: 264 nm.

6.2.4. 10 l jeder Referenzlösung (4.10) werden injiziert und die Chromatogramme aufgezeichnet.

6.2.5. 10 l der Probelösung (6.1) werden injiziert und das Chromatogramm aufgezeichnet.

6.3. Durch Vergleich der Retentionszeiten der nach 6.2.5 aufgezeichneten Peaks mit den nach 6.2.4 ermittelten Retentionszeiten wird das Vorhandensein von Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin bzw. Chlorhexidin nachgewiesen.

7.1. Herstellung der Standardlösungen

7.1.1. 0,05%ige (m/v) Stammlösung des nach 6.3 identifizierten Konservierungsmittels in Eluent I (4.5.1).

7.1.2. 0,05%ige (m/v) Stammlösung des als inneren Standard gewählten Konservierungsmittels in Eluent I (4.5.1).

7.1.3. Gemäß nachstehender Tabelle werden für jedes identifizierte Konservierungsmittel vier Standardlösungen hergestellt, indem die entsprechenden Volumina der Stammlösung des identifizierten Konservierungsmittels (7.1.1) und der Stammlösung des inneren Standards (7.1.2) in eine Serie von 10-ml-Meßkolben pipettiert und mit Eluent I (4.5.1) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt werden.

Standard-lösung	Stammlösung des inneren Standards	Stammlösung des identifizierten Konservierungsmittels
ml (7.1.2)	ml (7.1.1)	g/ml (*)
I	1,0	0,5	25
II	1,0	1,0	50
III	1,0	1,5	75
IV	1,0	2,0	100

7.2. Vorbereitung der Probe

7.2.1. Ungefähr 0,5 g der Probe (p Gramm) werden in einen 10-ml-Meßkolben genau eingewogen, mit 1,0 ml der Lösung des inneren Standards (7.1.2) und 6 ml Eluent I (4.5.1) versetzt und gemischt.

7.2.2. Die Mischung wird 10 Minuten in ein Ultraschallbad (5.4) gestellt und nach dem Abkühlen mit dem Eluenten I (4.5.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert oder durch ein Faltenfilter filtriert. Die überstehende Flüssigkeit bzw. das Filtrat wird chromatographiert.

7.3. Chromatographie

7.3.1. Der Gradient und der Volumenstrom der mobilen Phase, die Säulentemperatur und die Detektionswellenlänge werden entsprechend den Bedingungen für den Nachweis (6.2.1 bis 6.2.3) eingestellt.

7.3.2. 10 l der Probelösung (7.2.2) werden chromatographiert, die Peakflächen gemessen und das Verhältnis zwischen der Peakfläche des zu bestimmenden Konservierungsmittels und der Peakfläche des inneren Standards ermittelt. Die Wiederholbarkeit des Meßsignals wird durch wiederholtes Chromatographieren überprüft.

7.4. Eichung

7.4.1. 10 l jeder der vier Standardlösungen (7.1.3) werden chromatographiert und die Peakflächen gemessen.

7.4.2. Für jede Standardlösung (7.1.3) wird das Verhältnis zwischen der Peakfläche des Hexamidins, des Dibromhexamidins, des Dibrompropamidins bzw. des Chlorhexidins und der Peakfläche des inneren Standards ermittelt.

7.4.3. Aus der Eichkurve (7.4.2) wird die Konzentration des zu bestimmenden Konservierungsmittels abgelesen, die dem nach 7.3.2 ermittelten Peakflächenverhältnis entspricht.

c	=	aus der Eichkurve abgelesene Konzentration des zu bestimmenden Konservierungsmittels der Probelösung in Mikrogramm je Milliliter,
p	=	Einwaage der untersuchten Probe in Gramm (7.2.1),
MW1	=	Molmasse der basischen Form des zu bestimmenden Konservierungsmittels,
MW2	=	Molmasse des entsprechenden Salzes (siehe Abschnitt 10).

Hexamidin	C20H26N4O2	354,45
Hexamidindiisethionat	C20H26N4O22C2H6O4S	606,72
Hexamidin-bis (p-hydroxybenzoat)	C20H26N4O22C7H6O3	630,71
Dibromhexamidin	C20H24Br2N4O2	512,24
Dibromhexamidindiisethionat	C20H24Br2N4O22C2H6O4S	764,51
Dibrompropamidin	C17H18Br2N4O2	470,18
Dibrompropamidindiisethionat	C17H18Br2N4O22C2H6O4S	722,43
Chlorhexidin	C22H30Cl2N10	505,45
Chlorhexidindiacetat	C22H30Cl2N102C2H4O2	625,56
Chlorhexidindigluconat	C22H30Cl2N102C6H12O7	897,76
Chlorhexidindihydrochlorid	C22H30Cl2N102HCl	578,37

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(1) ISO 5725.

Anlage 36

NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON BENZOESÄURE, 4HYDROXYBENZOESÄURE, SORBINSÄURE, SALICYLSÄURE UND PROPIONSÄURE IN KOSMETISCHEN MITTELN

– zum Nachweis dieser Konservierungsstoffe,

– zur Bestimmung von Benzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Sorbinsäure und Salicylsäure,

– zur Bestimmung von Propionsäure.

A. NACHWEIS

2.1. Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Wasser muß destilliert sein oder zumindest gleichwertige Reinheit aufweisen.

2.2. Aceton

2.3. Diethylether

2.4. Acetonitril

2.5. Toluen

2.6. n-Hexan

2.7. Flüssiges Paraffin

2.8. Salzsäure, 4 M

2.9. Kalilauge, 4 M

2.10. Calciumchlorid, CaCl 2 2 H 2 O

2.11. Lithiumcarbonat, Li 2 CO 3

2.12. 2-Brom-2'-acetonaphthon

2.13. 4-Hydroxybenzoesäure

2.14. Salicylsäure

2.15. Benzoesäure

2.16. Sorbinsäure

2.17. Propionsäure

2.18. Vergleichslösungen

2.19. Derivatisierungsreagenz

2.20. Katalysator-Lösung

2.21. Fließmittel

2.22. Tauch-Lösung

3.1. Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar

3.2. Chromatographiekammer

3.3. UV-Lampe, 254 und 366 nm

3.4. DC-Fertigplatten (200 mm x 200 mm)

3.5. Mikroliterspritze, 10 l

3.6. Mikroliterspritze, 25 l

3.7. Trockenschrank, bis auf 105 °C konstant einstellbar

3.8. Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen, 50 ml und 200 ml

3.9. Papierfilter, Durchmesser 90 mm (Schleicher und Schüll, Weißband Nr. 5892, oder gleichwertiges Erzeugnis)

3.10. Universal pH-Indikatorpapier, pH 1-11

3.11. Probenfläschchen, 5 ml

3.12. Rotationsverdampfer

3.13. Heizplatte

4.1. Vorbereitung der Probe

4.2. Dünnschichtchromatographie

B. BESTIMMUNG VON BENZOESÄURE, 4-HYDROXYBENZOESÄURE, SORBINSÄURE UND SALICYLSÄURE

2.1. Alle Reagenzien müssen analysenrein und, wo erforderlich, für die HPLC geeignet sein. Wasser muß destilliert sein oder zumindest gleichwertige Reinheit aufweisen.

2.2. Absolutes Ethanol

2.3. 4-Hydroxybenzoesäure

2.4. Salicylsäure

2.5. Benzoesäure

2.6. Sorbinsäure

2.7. Natriumacetat, CH 3 COONa 3H 2 O

2.8. Essigsäure,

d = 1,05 g/ml

2.9. Acetonitril

2.10. Schwefelsäure, 2 M

2.11. Kalilauge, 0,2 M

2.12. 2-Methoxybenzoesäure

2.13. Ethanol/Wasser-Mischung

2.14. Lösung des inneren Standards

2.15. Mobile Phase

2.15.1. Acetatpuffer: 6,35 g Natriumacetat (2.7) und 20,0 ml Essigsäure (2.8) werden in 1 l Wasser gelöst.

2.15.2. Mobile Phase: 9 Volumenteile Acetatpuffer (2.15.1) und 1 Volumenteil Acetonitril (2.9) werden gemischt.

2.16. Stammlösung der Konservierungsstoffe

2.17. Standardlösungen der Konservierungsstoffe

3.1. Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar

3.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit UV-Detektor mit variabler Wellenlänge und mit 10 l-Probenschleife

3.3. Analytische Trennsäule

3.4. Papierfilter, Durchmesser 90 mm (Schleicher und Schüll, Weißband Nr. 5892, oder gleichwertiges Erzeugnis)

3.5. Erlenmeyerkolben, 50 ml

3.6. Probenfläschchen, 5 ml

3.7. Siedesteinchen (Karborund), Größe 2 bis 4 mm, oder gleichwertiges Material

4.1. Vorbereitung der Probe

4.1.1. Vorbereitung der Probe ohne Zugabe des inneren Standards 1 g der Probe wird in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben (3.5) eingewogen. Nach Zusatz von 1,00 ml 2 M Schwefelsäure (2.10) und 40,0 ml der Ethanol/Wasser-Mischung (2.13) sowie ungefähr 1 g Siedesteinchen (3.7) wird der verschlossene Kolben kräftig geschüttelt, bis eine homogene Suspension entstanden ist, mindestens jedoch 1 Minute. Zur Verbesserung der Extraktion wird der Kolben genau 5 Minuten im Wasserbad (3.1) auf 60 °C erwärmt. Danach wird der Kolben sofort unter fließendem kaltem Wasser abgekühlt und anschließend eine Stunde lang bei 5 °C aufbewahrt. Der Extrakt wird durch ein Papierfilter (3.4) filtriert. Etwa 2 ml des Filtrats werden in ein Probenfläschchen (3.6) übergeführt und bei 5 °C aufbewahrt.

4.1.2. Vorbereitung der Probe unter Zugabe des inneren Standards

4.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

4.2.1. Kalibrierung

4.2.2. Bestimmung

– Peakauflösung: Die Peakauflösung soll mindestens 0,90 betragen (zur Definition der Peakauflösung siehe Abbildung 1).

– Peakasymmetrie: Der Asymmetriefaktor AS soll zwischen 0,9 und 1,5 liegen (zur Definition des Asymmetriefaktors siehe Abbildung 2). Bei der Aufzeichnung des Chromatogramms zur Bestimmung der Peakasymmetrie sollte der Papiervorschub mindestens 2 cm/min betragen.

– Basislinie: Die Basislinie sollte stabil sein.

a =	Einwaage der untersuchten Probe (4.1.2) in Gramm
b =	aus der Kalibrierkurve abgelesene Konzentration des Konservierungsstoffes in der Probelösung (4.1.2) in Mikrogramm je Milliliter bzw. der aus der Gleichung für die Regressionsgerade berechnete Wert

7.1. Der Robustheitstest (ruggedness test) mit dieser Methode ergab, daß die für die Extraktion der Konservierungsstoffe vorgeschriebene Menge an Schwefelsäure das Ergebnis beeinflussen kann und die Einwaage der Probe in den angegebenen Grenzen erfolgen muß.

7.2. Falls erforderlich, kann eine geeignete Vorsäule verwendet werden.

C. BESTIMMUNG VON PROPIONSÄURE

4.1. Ethanol, 96% (V/V)

4.2. Propionsäure

4.3. 2-Methylpropionsäure

4.4. Orthophosphorsäure, 10% (m/V)

4.5. Propionsäure-Standardlösung

4.6. Lösung des inneren Standards

5.1. Normale Laborausstattung und

5.2. Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor

5.3. Reagenzglas, 20 ml, mit Schliffstopfen

5.4. Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar

5.5. 10-ml-Glasspritze mit Membranfiltereinheit, 0,45 m

6.1. Vorbereitung der Probe

6.1.1. Vorbereitung der Probe ohne Zugabe des inneren Standards

6.1.2. Vorbereitung der Probe unter Zugabe des inneren Standards

6.2. Bedingungen für die Gaschromatographie

Säule:
Material	Edelstahl
Länge	2 m
Innerer Durchmesser	( 3 mm)
Fester Träger	Chromosorb W AW, 100-120 msh
Stationäre Flüssigphase	10% Polyethylenglycol 20 000 für Säuren (SPTM 1000 oder gleichwertiges Erzeugnis) und 1% H3PO4
Temperatur:
Injektor	200 °C
Säule	120 °C
Detektor	200 °C
Trägergas:
Stickstoff
Volumenstrom:	25 ml/min

6.3. Chromatographie

6.3.1. Kalibrierung

6.3.2. Bestimmung

7.1. Aus der Kalibrierkurve (6.3.1) wird das Verhältnis der Masse (K) abgelesen bzw. aus der Gleichung für die Regressionsgerade berechnet, das dem gemäß 6.3.2 berechneten Peakflächenverhältnis entspricht.

7.2. Der Propionsäuregehalt in Prozent (x) der Probe wird unter Verwendung des ermittelten Masseverhältnisses nach folgender Formel berechnet:

K =	nach 7.1 ermitteltes Masserverhältnis (Anm.: richtig: Masseverhältnis)
a =	Einwaage der untersuchten Probe (6.1.2) in Gramm
e =	Einwaage des inneren Standards (4.6) in Gramm

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(1) ISO 5725.

Anlage 37

NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON HYDROCHINON, HYDROCHINONMONOMETHYLETHER, HYDROCHINONMONOETHYLETHER UND HYDROCHINONMONOBENZYLETHER IN KOSMETISCHEN MITTELN

A. NACHWEIS

3.1. Ethanol, 96% (V/V)

3.2. Chloroform

3.3. Diethylether

3.4. Fließmittel: Chloroform/Diethylether, 66 + 33 (V + V)

3.5. Ammoniak-Lösung, 25% (m/m)

(d = 0,91 g/ml)

3.6. Ascorbinsäure

3.7. Hydrochinon

3.8. Hydrochinonmonomethylether

3.9. Hydrochinonmonoethylether

3.10. Hydrochinonmonobenzylether (Monobenzon)

3.11. Vergleichslösungen

3.11.1. 0,05 g Hydrochinon (3.7) werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt.

3.11.2. 0,05 g Hydrochinonmonomethylether (3.8) werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt.

3.11.3. 0,05 g Hydrochinonmonoethylether (3.9) werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt.

3.11.4. 0,05 g Hydrochinonmonobenzylether (3.10) werden in ein graduiertes 10-ml-Reagenzglas eingewogen. Nach Zusatz von 0,25 g Ascorbinsäure (3.6) und 5 ml Ethanol (3.1) wird die Mischung mit Ammoniaklösung (3.5) auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Anschließend wird die Mischung mit Ethanol (3.1) zu 10 ml aufgefüllt.

3.12. Silbernitrat

3.13. 12-Molybdatophosphorsäure

3.14. Kaliumhexacyanoferrat (III)

3.15. Eisen (III)-chlorid-hexahydrat

3.16. Sprühreagenzien

3.16.1. Einer 5%igen (m/V) wäßrigen Lösung von Silbernitrat (3.12) wird Ammoniak-Lösung (3.5) hinzugefügt, bis sich der gebildete Niederschlag wieder auflöst.

3.16.2. 10%ige (m/V) Lösung von 12-Molybdatophosphorsäure (3.13) in Ethanol (3.1).

3.16.3. Lösung 1: 1%ige (m/V) wäßrige Lösung von Kaliumhexacyanoferrat (III) (3.14)

4.1. Übliche Ausrüstung zur Dünnschichtchromatographie

4.2. DC-Fertigplatten (200 mm x 200 mm)

Sorbensschicht:	Kieselgel 60 mit Fluoreszenzindikator 254 nm
	Schichtdecke: 0,25 mm

4.3. Ultraschallbad

4.4. Zentrifuge

4.5. UV-Lampe, Wellenlänge 254 nm

5.1. Vorbereitung der Probe

5.2. Dünnschichtchromatographie

5.2.1. Die Chromatographiekammer wird mit dem Fließmittel (3.4) gesättigt.

5.2.2. Je 2 l der Vergleichslösungen (3.11) und 2 l der Probelösung (5.1) werden auf die Dünnschichtplatte aufgetragen. Die Dünnschichtplatte wird bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz bis zu einer Höhe von 150 mm entwickelt.

5.2.3. Die Dünnschichtplatte wird der Kammer entnommen und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis das Fließmittel verdunstet ist.

5.3. Detektion

5.3.1. Die Dünnschichtplatte wird im ultravioletten Licht der Wellenlänge 254 nm betrachtet; die Flecke werden markiert.

5.3.2. Anschließend wird die Dünnschichtplatte besprüht entweder mit

– dem Silbernitrat-Reagenz (3.16.1) oder

– dem 12-Molybdatophosphorsäure-Reagenz (3.16.2) und auf etwa 120 °C erhitzt oder

– der Mischung aus Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung und Eisen(III)-chlorid-Lösung (3.16.3).

Hydrochinon	0,32
Hydrochinonmonomethylether	0,53
Hydrochinonmonoethylether	0,55
Hydrochinonmonobenzylether	0,58

B. BESTIMMUNG

3.1. Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Wasser muß destilliert sein oder zumindest gleichwertige Reinheit aufweisen.

3.2. Methanol

3.3. Hydrochinon

3.4. Hydrochinonmonomethylether

3.5. Hydrochinonmonoethylether

3.6. Hydrochinonmonobenzylether (Monobenzon)

3.7. Tetrahydrofuran für die HPLC

3.8. Wasser/Methanol-Mischung 1 + 1 (V + V): 1 Volumenteil Wasser und 1 Volumenteil Methanol (3.2) werden gemischt.

3.9. Mobile Phase: Tetrahydrofuran/Wasser-Mischung 45 + 55 (V + V): 45 Volumenteile Tetrahydrofuran (3.7) und 55 Volumenteile Wasser werden gemischt.

3.10. Standardlösung

4.1. Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar

4.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit UV-Detektor mit variabler Wellenlänge und mit 10 l-Probenschleife

4.3. Analytische Trennsäule

4.4. Papierfilter, Durchmesser 90 mm (Schleicher und Schüll, Weißband Nr. 5892, oder gleichwertiges Erzeugnis)

5.1. Vorbereitung der Probe

5.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

5.2.1. Bedingungen für die Chromatographie

5.2.2. 10 l der Probelösung (5.1) werden chromatographiert, das Chromatogramm aufgezeichnet und die Peakflächen ermittelt.

5.2.3. Kalibrierung

pi =	Peakfläche für Hydrochinon, Hydrochinonmonomethylether, Hydrochinonmonoethylether oder Hydrochinonmonobenzylether
ci =	Konzentration (g/50 ml) von Hydrochinon, Hydrochinonmonomethylether, Hydrochinonmonoethylether oder Hydrochinonmonobenzylether in der Standardlösung (3.10)

– Peakauflösung: Die Peakauflösung soll mindestens 0,90 betragen (zur Definition der Peakauflösung siehe Abbildung 1).

– Peakasymmetrie: Der Asymmetriefaktor AS soll zwischen 0,9 und 1,5 liegen (zur Definition des Asymmetriefaktors siehe Abbildung 2). Bei der Aufzeichnung des Chromatogramms zur Bestimmung der Peakasymmetrie sollte der Papiervorschub mindestens 2 cm/min betragen.

– Basislinie: Die Basislinie sollte stabil sein.

a	=	Einwaage der untersuchten Probe in Gramm
bi	=	Peakfläche des Analyten i in der Probelösung
RFi	=	Responsefaktor nach 5.2.3

7.1. Bei einem Hydrochinongehalt von 2,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,13% (m/m) voneinander abweichen.

7.2. Bei einem Hydrochinonmonomethylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,1% (m/m) voneinander abweichen.

7.3. Bei einem Hydrochinonmonoethylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,11% (m/m) voneinander abweichen.

7.4. Bei einem Hydrochinonmonobenzylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,11% (m/m) voneinander abweichen.

8.1. Bei einem Hydrochinongehalt von 2,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe unter Vergleichsbedingungen (verschiedene Laboratorien, verschiedene Bearbeiter, verschiedene Geräteausrüstung) durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,37% (m/m) voneinander abweichen.

8.2. Bei einem Hydrochinonmonomethylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe unter Vergleichsbedingungen (verschiedene Laboratorien, verschiedene Bearbeiter, verschiedene Geräteausrüstung) durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,21% (m/m) voneinander abweichen.

8.3. Bei einem Hydrochinonmonoethylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe unter Vergleichsbedingungen (verschiedene Laboratorien, verschiedene Bearbeiter, verschiedene Geräteausrüstung) durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,19% (m/m) voneinander abweichen.

8.4. Bei einem Hydrochinonmonobenzylethergehalt von 1,0% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe unter Vergleichsbedingungen (verschiedene Laboratorien, verschiedene Bearbeiter, verschiedene Geräteausrüstung) durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,11% (m/m) voneinander abweichen.

9.1. Wenn ein wesentlich höherer Hydrochinongehalt als 2% (m/m) ermittelt wird und eine genaue Gehaltsbestimmung erforderlich ist, sollte die Probelösung (5.1) auf einen ähnlichen Gehalt verdünnt werden, wie er sich bei einer 2% Hydrochinon enthaltenden Probe ergeben würde, und die Bestimmung ist zu wiederholen.

9.2. Störeinflüsse

Analytische Trennsäule (2) : 4,6 mm x 25 cm
Aktiver Festkörper:	Mit Octadecylgruppen modifiziertes Kieselgel (Zorbax ODS oder gleichwertiges Erzeugnis)
Temperatur: 36 °C
Volumenstrom der mobilen Phase: 1,5 ml/min
Mobile Phase:	für Hydrochinon Methanol/Wasser 5 + 95 (V + V)
	für Hydrochinonmonomethylether: Methanol/Wasser 30 + 70 (V + V)
	für Hydrochinonmonobenzylether: Methanol/Wasser 80 + 20 (V + V)
Analytische Trennsäule (3):
Aktiver Festkörper:	Mit Octadecylgruppen modifiziertes Kieselgel (Spherisorb S5-ODS oder gleichwertiges Erzeugnis)
Volumenstrom der mobilen Phase: 1,5 ml/min
Mobile Phase: Wasser/Methanol 90 + 10 (V + V)
Diese Bedingungen eignen sich für Hydrochinon.

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(¹) ISO 5725

(²) M. Herpol-Borremans und M. O. Masse, Indentification et dosage de l'hydroquinone et ses ethers methylique et benzylique dans les produits cosmethiques pour blanchir la peau, Int. J. Cosmet. Sci 8 – 203-214 (1986).

(³) J. Firth und I. Rix, Determination of Hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, S. 129.

Anlage 38

NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON 2-PHENOXYETHANOL, 1-PHENOXYPROPAN-2-OL, METHYL-, ETHYL-, PROPYL-, BUTYL- UND BENZYL-4-HYDROXYBENZOAT IN KOSMETISCHEN MITTELN

A. NACHWEIS

3.1. Allgemeines

3.2. Aceton

3.3. Diethylether

3.4. n-Pentan

3.5. Methanol

3.6. Eisessig

3.7. Salzsäure, c(HCl)= 4 mol/l

3.8. Kalilauge, c(KOH)= 4 mol/l

3.9. Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl 2 2H 2 O

3.10. Nachweisreagenz: Millon's Reagenz

3.11. 2-Phenoxyethanol

3.12. 1-Phenoxypropan-2-ol

3.13. Methyl-4-hydroxybenzoat (Methylparaben)

3.14. Ethyl-4-hyrdoxybenzoat (Ethylparaben)

3.15. n-Propyl-4-hydroxybenzoat (Propylparaben)

3.16. n-Butyl-4-hydroxybenzoat (Butylparaben)

3.17. Benzyl-4-hydroxybenzoat (Benzylparaben)

3.18. Vergleichslösungen

3.19. Fließmittel

4.1. Wasserbad, auf 60 °C konstant einstellbar

4.2. Entwicklungskammer (nicht mit Filterpapier ausgekleidet)

4.3. UV-Lampe, 254 nm

4.4. DC-Fertigplatten (200 mm x 200 mm), Sorbensschicht: Kieselgel 60 F 254 (Fluoreszensindikator), Schichtdicke: 0,25 mm mit Konzentrierungszone 25 mm x 200 mm (Merck 11798, Darmstadt oder gleichwertiges Erzeugnis)

4.5. Trockenschrank, bis auf 105 °C konstant einstellbar

4.6. Heißluftfön

4.7. Woll-Farbroller, etwa 10 cm breit, Außendurchmesser etwa 3,5 cm. Die Dicke der Wollschicht soll 2 bis 3 mm betragen; gegebenenfalls ist die Wolle zu kürzen. (Siehe Anmerkung unter 5.2).

4.8. Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen, 50 ml

4.9. Elektrische Heizplatte mit Thermostatregler.

5.1. Vorbereitung der Probe

5.2. Dünnschichtchromatographie

7.1. Millon's Reagenz wird wegen seiner Toxizität am besten nach einem der beschriebenen Verfahren angewandt. Sprühen ist nicht zu empfehlen.

7.2. Andere Hydroxylgruppen enthaltende Verbindungen können ebenfalls mit Millon's Reagenz angefärbt werden. Eine Übersicht über Färbungen und R f -Werte für eine Reihe von Konservierungsstoffen findet man in: N. De Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranoto-Soetardhi und A. Schouten: Determination of preservatives in cosmetic products I: Thin layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J. Chromatogr., 410, 395-411 (1987)).

7.3. Die in folgender Tabelle aufgelisteten R f -Werte geben Hinweise auf die zu erwartenden Werte.

Substanz	hRf	Anfärbung
4-Hydroxybenzoesäure	11	rot
Methylparaben	12	rot
Ethylparaben	17	rot
Propylparaben	21	rot
Butylparaben	26	rot
Benzylparaben	16	rot
2-Phenoxyethanol	29	gelb
1-Phenoxypropan-2-ol	50	gelb

7.4. Keine Trennung erreicht man für 4-Hydroxybenzoesäure und Methylparaben bzw. für Benzylparaben und Ethylparaben. Der Nachweis dieser Substanzen sollte mittels HPLC nach Abschnitt B durch Vergleich der Retentionszeiten der Probenpeaks mit denen der Standards bestätigt werden.

B. BESTIMMUNG

4.1. Allgemeines

4.2. Absolutes Ethanol

4.3. 2-Phenoxyethanol

4.4. 1-Phenoxypropan-2-ol

4.5. Methyl-4-hydroxybenzoat (Methylparaben)

4.6. Ethyl-4-hydroxybenzoat (Ethylparaben)

4.7. n-Propyl-4-hydroxybenzoat (Propylparaben)

4.8. Isopropyl-4-hydroxybenzoat (Isopropylparaben)

4.9. n-Butyl-4-hydroxybenzoat (Butylparaben)

4.10. Benzyl-4-hydroxybenzoat (Benzylparaben)

4.11. Tetrahydrofuran

4.12. Methanol

4.13. Acetonitril

4.14. Schwefelsäure, c(H 2 SO 4 )= 2 mol/l

4.15. Ethanol/Wasser-Mischung

4.16. Lösung des inneren Standards

4.17. Mobile Phase

4.18. Stammlösung der Konservierungsstoffe

4.19. Standardlösungen der Konservierungsstoffe

5.1. Wasserbad, auf 60 °C 1 °C einstellbar

5.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit UV-Dektektor (Anm.: richtig: Detektor) , Wellenlänge 280 nm

5.3. Analytische Trennsäule

5.4. Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen, 100 ml

5.5. Siedesteinchen (Karborund), Größe 2 bis 4 mm, oder gleichwertiges Material

6.1. Vorbereitung der Probe

6.1.1. Vorbereitung der Probe ohne Zugabe des inneren Standards

6.1.2. Vorbereitung der Probe unter Zugabe des inneren Standards

6.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

6.2.1. Bedingungen für die Chromatographie

– Mobile Phase: Tetrahydrofuran/Wasser/Methanol/Acetonitril-Mischung (4.17)

– Volumenstrom der mobilen Phase: 1,5 ml/min

– Detektionswellenlänge: 280 nm

6.2.2. Kalibrierung

6.2.3. Bestimmung

– Peakauflösung p: Die Peakauflösung des am schlechtesten getrennten Paares soll mindestens 0,90 betragen (zur Definition der Peakauflösung s. Abb. 1).

– Peakasymmetrie: Der Asymmetriefaktor A s aller interessierenden Peaks soll zwischen 0,9 und 1,5 liegen (zur Definition des Asymmetriefaktors s. Abb. 2). Bei der Aufzeichnung des Chromatogramms zur Bestimmung der Peakasymmetrie sollte der Papiervorschuß mindestens 2 cm/min betragen.

– Basislinie: Die Basislinie sollte stabil sein.

bi = aus der Kalibrierkurve abgelesene Konzentration des Konservierungsstoffes i in der Prüflösung (6.1.2) in Mikrogramm je Milliliter bzw. der aus der Gleichung für die Regressionsgerade berechnete Wert

a = Einwaage der untersuchten Probe (6.1.2) in Gramm

10.1. Stationäre Phase

10.2. Detektionswellenlänge

10.3. Interferenzen

10.4. Zum Schutz der Trennsäule empfiehlt sich die Verwendung einer geeigneten Vorsäule.

10.5. Die Methode ist in einem Ringversuch unter Beteiligung von 9 Laboratorien an drei kosmetischen Erzeugnissen untersucht worden. In der folgenden Tabelle sind für jede der drei Proben der Mittelwert m in Prozent (% m/m), die Wiederholbarkeit r und die Vergleichbarkeit R für die jeweils ermittelten Analyten aufgelistet:

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(¹) ISO 5725.