Legalize
Legalize / Česká republika / Vyhláška

Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Typ Vyhláška
Publikace 1999-12-20
Naposledy aktualizováno 2000-01-01
Stav Platný
Zdroj e-Sbírka
článků Not indexed
Historie novel JSON API

Ultrafiltraci je možno použít tehdy, jestliže interferující faktory procházejí filtrem s nominálním separačním limitem odpovídajícím relativní molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000. Je možno použít asymetrické membránové filtry z triacetatcelulosy, které se však musí přezkoušet na přítomnost složek způsobujících falešně pozitivní výsledky. Látky zachycené na filtru, které obsahují endotoxin, se opláchnou vodou pro LAL nebo vhodným tlumivým roztokem a endotoxiny se získají ve vodě pro LAL nebo ve vhodném tlumivém roztoku. Pro každý zkoušený přípravek je stanoven zkoušený objem a konečný objem pro zpětné uvolnění endotoxinu.

Pro ověření, že zvolený způsob účinně odstraňuje interferenci a přitom neodstraňuje endotoxiny, se zkouška na interferující vlivy opakuje se zkoušeným přípravkem, ke kterému se přidá referenční endotoxin BRP a použije se jeden ze zvolených způsobů na odstranění interferujících faktorů.

METODA A. GELOVÁ METODA (LIMITNÍ ZKOUŠKA)

Zkouška na endotoxin ve zkoušeném přípravku. Provádí se dvojmo, jak je popsáno v části Postup zkoušky, při použití takového ředění, které nepřevyšuje maximální účinné ředění zkoušeného přípravku, který v případě nutnosti byl ještě podroben některému ze způsobů odstraňujících interferující faktory.

Zároveň se zkouší negativní kontrola tvořená z vody pro LAL a dvě pozitivní kontroly, které obsahují referenční endotoxin BRP v koncentraci odpovídající dvojnásobku deklarované citlivosti lyzátu a z nichž jedna obsahuje zkoušený přípravek (podrobený, je-li třeba, postupu k odstranění interferujících faktorů po přidání referenčního endotoxinu) v koncentraci použité ve zkoušce. Zkoušku lze hodnotit, jestliže negativní a obě pozitivní kontroly dávají odpovídající výsledek.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže obě zkoušené směsi dávají negativní výsledek. Zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce, jestliže obě zkoušené směsi dávají pozitivní výsledek. Jestliže je pozitivní výsledek pouze v jedné zkoušené směsi ave druhé negativní, zkouška se opakuje; zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže v obou zkoušených směsích je zjištěn negativní výsledek.

METODA B. SEMIKVANTITATIVNÍ GELOVÁ METODA

Stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Je-li třeba, vzorky určené ke zkoušení se zpracují postupem odstraňujícím interferující faktory. Připraví se tyto roztoky:

Zkouška se provede postupem uvedeným v části Citlivost lyzátu. Zkoušku lze hodnotit, jsou-li splněny tři následující podmínky:

Pro každé ředění (a) se stanoví nejnižší koncentrace přípravku, která dává pozitivní výsledek, tedy obsahuje 1 m.j. endotoxinu v mililitru. Jestliže byl původní roztok zkoušeného přípravku ředěn faktorem d1 aby vyhověl zkoušce na interferující faktory, a tento roztok byl dále ředěn faktorem d2 k získání nejnižší koncentrace s pozitivním výsledkem, pak množství endotoxinu v m.j./ml v původním roztoku zkoušeného přípravku se rovná λ x d1 x d2. Vypočítá se geometrický průměr ze dvou výsledků obou ředění (a). Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže geometrický průměr koncentrací endotoxinu je nižší než limitní koncentrace endotoxinu uvedená v příslušném článku.

Kinetické metody

Obě metody, turbidimetrická kinetická (metoda C) a chromogenní peptidová kinetická metoda (metoda D) používají lineární regresi logaritmu odpovědi na logaritmu koncentrace endotoxinu. Způsob provedení je uveden v části Postup pro každou metodu zvlášť; části Ověření parametrů standardní křivky, Interferující faktory a Stanovení endotoxinu ve zkoušeném přípravku jsou vhodné jak pro turbidimetrickou kinetickou metodu, tak pro chromogenní peptidovou kinetickou metodu.

METODA C. TURBIDIMETRICKÁ KINETICKÁ METODA

Postup. Vhodným zařízením se měří reakční čas potřebný k dosažení předem určeného stupně zákalu v roztoku, ke kterému byl vhodným způsobem přidán lyzát Koncentrace endotoxinu v roztoku se vypočítá z logaritmu reakčního času a kalibrační křivky. Postup pro přípravu kalibrační křivky je uveden v části Ověření parametrů standardní křivky.

Rychlost změny zákalu v lineární části regresní křivky se též může použít ke stanovení koncentrace endotoxinu.

METODA D. CHROMOGENNÍ PEPTIDOVÁ KINETICKÁ METODA

Postup. Měří se reakční čas potřebný k dosažení předem určené intenzity zbarvení po uvolnění barviva z vhodného chromogenního peptidu komplexem endotoxin-lyzát; zbarvení se stanoví spektrofotometricky při vhodné vlnové délce. Koncentrace endotoxinu v roztoku se odvodí z logaritmu reakčního času pomocí kalibrační křivky. Postup pro přípravu kalibrační křivky je uveden v části Ověření parametrů standardní křivky.

METODA C A METODA D

Ověření parametrů standardní křivky. Požaduje se vždy při použití nové šarže lyzátu nebo při změně podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek zkoušky.

Připraví se nejméně dvě samostatné řady, každá nejméně o čtyřech koncentracích referenčního endotoxinu BRP v požadovaném rozsahu. Limity uvedené výrobcem by se neměly překročit. Použije se nejméně jedna koncentrace na jednu jednotku v logaritmické stupnici a jako negativní kontrola voda pro LAL. Do každé zkumavky se přidá stejný objem lyzátu a u metody D vhodné množství chromogenního peptidu. Měří se reakční čas, jak bylo uvedeno výše.

Pro každou zkumavku se stanoví logaritmus reakčního času jako funkce logaritmu koncentrace endotoxinu a analyzuje se regrese logaritmu reakčního času na logaritmu koncentrace endotoxinu za použití standardní metody (metoda nejmenších čtverců).

Regresní křivka má signifikantní sklon a je signifikantně lineární; obojí na 95% hladině významnosti pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedené výrobcem lyzátu.

Stanoví se počet logaritmicky stejně vzdálených koncentrací, pro které je regresní křivka lineární. Je-li tímto číslem trojice (λ1, λ2, λ3), použije se druhá koncentrace λ2 jako λm ve zkoušce na interferující faktory a ve stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Jestliže je toto číslo rovno 4 nebo 5, použije se v tomto případě třetí koncentrace λ3 jako λm.

Kromě těchto požadavků se dodržují všechny další zkoušky nebo požadavky uvedené výrobcem lyzátu.

Interferující faktory. Připraví se čtyři samostatná ředění roztoku obsahujícího referenční endotoxin BRP v koncentraci λm a zkoušený přípravek ředěný faktorem vypočítaným podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinuλm.

Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem. Zkouška se provede se čtveřicí roztoků a vypočítá se průměrná koncentrace endotoxinu jako antilogaritmus průměrné logaritmické koncentrace endotoxinu.

Jestliže je průměrná koncentrace endotoxinu nejméně 50 % hodnoty λm zkoušený přípravek neobsahuje faktory, které by interferovaly s lyzátem v podmínkách zkoušky, a vzorky tohoto přípravku se mohou zkoušet bez dalších úprav k vyloučení interferujících faktorů.

Je-li průměrná koncentrace endotoxinu nižší než 50 % hodnoty λm je nutno odstranit interferující faktory, jak je uvedeno v metodě A. Jestliže průměrná koncentrace přesahuje nej vyšší koncentraci v lineární části regresní křivky, zkouška se opakuje za použití vyššího ředícího faktoru pro zkoušený přípravek vypočítaného podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinuλm,

kde λl < λmˊ < λm

Stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Nejprve se, je-li to třeba, odstraní ze zkoušeného přípravku interferující faktory. Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Připraví se tyto roztoky:

Provede se zkouška postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky. Vypočítá se koncentrace endotoxinu pro každou dvojici roztoků (a) a (b) pomocí regresní křivky připravené z kontrolní série (c).

Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:

Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže koncentrace každého z dvojice roztoků (a) je nižší než λm nebo λmˊ mezinárodních jednotek endotoxinu v mililitru podle toho, která hodnota byla použita. Jestliže koncentrace endotoxinu jednoho z dvojice roztoků je nižší a druhá vyšší než tento limit, zkouška se opakuje. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže oba roztoky (a) vyhovují limitu.

METODA E. CHROMOGENNÍ PEPTIDOVÁ METODA KONEČNÉHO BODU

Postup. Při vhodné vlnové délce se měří spektrometrem koncentrace barviva uvolněného po inkubaci z roztoku obsahujícího endotoxin, lyzát a chromogenní peptid. Koncentrace endotoxinu se vypočítá z absorbace při zvolené vlnové délce pomocí kalibrační křivky připravené postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky.

Ověření parametrů standardní křivky. Požaduje se vždy při použití nové šarže lyzátu nebo při změně podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek zkoušky.

Připraví se čtyři samostatné řady referenčního endotoxinu BRP ve vodě pro LAL tak, aby přesahovala rozmezí uvedené výrobcem lyzátu; rozmezí má obsahovat limit (λ) deklarovaný výrobcem. Použije se kontrolní roztok připravený podle návodu výrobce lyzátu.

Do každé zkumavky se přidají předepsaná množství lyzátu a chromogenního peptidu a směs se inkubuje po dobu stanovenou výrobcem.

Reakce se zastaví a měří se absorbance při vhodné vlnové délce.

Pro každou zkumavku v každé čtveřici ředění se do grafu zaznamená absorbance každé koncentrace jako funkce koncentrace endotoxinu a analyzuje se regrese absorbance na koncentraci použitím standardní analytické metody (metoda nejmenších čtverců). Regresní křivka má signifikantní sklon a je lineární, obojí na 95% hladině významnosti pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedených výrobcem lyzátu. Vypočítá se koncentrace endotoxinu λm, což je aritmetický průměr nejvyšší (λh) a nejnižší (λl) koncentrace endotoxinu, při které je regresní křivka lineární. Všechny hodnoty se uvedou v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Kromě těchto požadavků se dodržují všechny další zkoušky nebo požadavky uvedené výrobcem lyzátu.

Interferující faktory. Připraví se čtyři samostatná ředění roztoku obsahujícího referenční endotoxin BRP v koncentraci λm a zkoušený přípravek ředěný faktorem vypočítaným podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinuλm,

Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Zkouška se provede se čtveřicí roztoků a vypočítá se průměrná koncentrace endotoxinu.

Jestliže je průměrná koncentrace endotoxinu nejméně 50 % a nejvýše 200 % hodnoty λm, zkoušený přípravek neobsahuje faktory, které by interferovaly s lyzátem v podmínkách zkoušky, a vzorky tohoto přípravku mohou být zkoušeny bez dalších úprav k vyloučení interferujících faktorů.

Je-li průměrná koncentrace endotoxinu nižší než 50 % nebo vyšší než 200 % hodnoty λm, je nutno odstranit interferující faktory, jak je uvedeno v metodě A.

Jestliže průměrná koncentrace přesahuje nejvyšší koncentraci v lineární části regresní křivky, zkouška se opakuje za použití vyššího ředícího faktoru pro zkoušený přípravek vypočítaného podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinuλm,

kde λl < λmˊ < λm.

Stanovení endotoxinu ve zkoušeném přípravku. Nejprve se, je-li to třeba, odstraní ze zkoušeného přípravku interferující faktory. Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Připraví se tyto roztoky:

Provede se zkouška postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky. Po inkubaci se ve všech roztocích (a), (b), (c) a (d) změří absorbance. Absorbance roztoků (c) a (d) se použije pro výpočet regresní křivky a vypočítá se koncentrace endotoxinu v roztocích (a) a (b). Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:

Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže koncentrace každého z dvojice roztoků (a) je nižší než λm nebo λmˊ mezinárodních jednotek endotoxinu v mililitru podle toho, která hodnota byla použita. Jestliže koncentrace endotoxinu jednoho z dvojice roztoků je nižší a druhá vyšší než tento limit, zkouška se opakuje. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže oba roztoky (a) vyhovují limitu.

Následující část je uvedena pro informaci a jako návod, netvoří závaznou součást lékopisu.

Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice

Endotoxiny pocházející z gramnegativních bakterií jsou nejčastější příčinou toxických reakcí přisuzovaných kontaminaci farmaceutických přípravků pyrogenními látkami; pyrogenní účinnost endotoxinů je mnohem vyšší než účinnost jiných pyrogenních látek. Endotoxiny jsou lipopolysacharidy. Ačkoli množství pyrogenních látek s odlišnou strukturou je malé, obecně platí, že nepřítomnost bakteriálních endotoxinů v přípravku je známkou absence pyrogenních složek za předpokladu, že lze vyloučit přítomnost neendotoxinových pyrogenních látek.

Přítomnost endotoxinů v přípravku může být zakryta faktory interferujícími s reakcí mezi amebocytárním lyzátem a endotoxiny. Proto analytik, chce-li nahradit zkoušku na pyrogenní látky na králících, která je požadována lékopisným článkem, zkouškou na endotoxin, prokáže, že přípravek lze zkoušet validovaným způsobem, který může obsahovat postup na odstranění interferujících faktorů.

Jak je uvedeno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, je třeba mít dostatečné informace o následujících aspektech dříve, než bude zkouška se vzorkem uznána za validovanou:

Zkouška na bakteriální endotoxin uvádí též způsob odstranění interferujících faktorů (viz Gelové metody); v případě interference se po použití takového postupu provede další zkouška, aby se ověřilo, zda použitá metoda skutečně neutralizovala nebo odstranila interferenci.

Jestliže zkoušený vzorek nevyhovuje zkoušce (pozitivní výsledek), je možno zkoušku opakovat. Zřejmé nevyhovění přípravku požadavkům zkoušky může být způsobeno chybou v jeho přípravě, ředěním nebo jinou náhodnou laboratorní kontaminací.

V této části jsou vysvětleny důvody pro požadavky obsažené ve zkoušce na bakteriální endotoxiny a potom je pojednáno o odečítání a interpretaci výsledků.

Nahrazení lékopisné zkoušky na pyrogenní látky prováděné na králících LAL testem v podstatě představuje použití alternativní metody analýzy, a proto vyžaduje validaci. Některé pokyny k jejímu provedení jsou uvedeny v této části.

Referenční metoda na stanovení bakteriálních endotoxinů je uvedena v článku daného přípravku; není-li metoda uvedena, použije se jako referenční metoda A. Má-li se použít jiná než referenční metoda, musí analytik prokázat, že tato metoda je vhodná pro přípravek a dává výsledky, které jsou shodné s výsledky získanými referenční metodou (viz též část 11).

Ačkoliv ve zkoušce na bakteriální endotoxiny je určen jako zdroj lyzátu druh Limulus polyphemus, je možno aktivní lyzát též získat z blízce příbuzných druhů, jako je rod Tachypleus. Výraz ”amebocytární lyzát” se v textu používá pro označení validovaného amebocytárního lyzátu bez ohledu na jeho biologický původ.

Ačkoliv přidání endotoxinu k roztoku amebocytárního lyzátu může vést ke vzniku zákalu, sraženiny nebo gelu, pouze vznik gelu byl zvolen jako rozhodující u prvního typu zkoušky na bakteriální endotoxiny. Výhodou byla jednoduchost založená na rozhodnutí, zda přípravek vyhovuje nebo nevyhovuje na základě prostým okem patrné tvorby nebo nepřítomnosti gelu. Kvantitativní metody uvedené jako metody C, D, E byly vyvinuty později: vyžadují více přístrojového vybavení, ale jsou vhodnější pro automatické zkoušení velkého počtu vzorků jednoho přípravku.

Endotoxiny se mohou adsorbovat na povrch zkumavek nebo pipet z určitých plastů nebo typů skla. Uvolnění látek z plastických materiálů může vyvolat interferenci. Proto se mají používané materiály kontrolovat; složení následujících šarží zkumavek nebo pipet se mohou mírně lišit, a proto se doporučuje, aby laboratorní pracovník opakoval takové zkoušení u každé nové šarže materiálů.

Zatímco výsledky zkoušky na pyrogenní látky na králících jsou závislé na dávce pyrogenu, výsledky zkoušky na bakteriální endotoxiny závisí na koncentraci endotoxinu ve směsi. Rozhodnutí použít zkoušku na bakteriální endotoxiny jako limitní zkoušku je dáno tím, že za prvé musí být definována prahová koncentrace endotoxinu pro zkoušený přípravek a za druhé analytik provádějící zkoušku má vědět, kdy je koncentrace endotoxinu v přípravku pod nebo nad hranicí této prahové hodnoty. Kvantitativními metodami C, D, E je stanovení koncentrace endotoxinu ve zkoušeném vzorku jednoduché, ale v rutinní kontrole kvality je základním požadavkem otázka, zda-li tato koncentrace je nebo není vyšší než požadovaný limit.

Při stanovování prahové koncentrace endotoxinu u zkoušeného přípravku je nutno brát zřetel na lidskou dávku přípravku, s cílem mít jistotu, že pokud je koncentrace endotoxinu v přípravku pod prahovou hodnotou, pak výsledná maximální dávka podaná odpovídajícím způsobem za hodinu neobsahuje dostatečné množství endotoxinu k rozvoji toxické reakce.

Jestliže je koncentrace endotoxinu v přípravku přesně rovna prahové hodnotě, dojde ke vzniku gelu jako v případě, kdy je koncentrace endotoxinu mnohem vyšší a přípravek nevyhoví zkoušce, protože nelze rozlišit mezi koncentrací přesně se rovnající prahové koncentraci a mezi koncentrací vyšší. Pouze v případě, kdy nedojde ke vzniku gelu, může analytik rozhodnout, že koncentrace endotoxinu nepřesáhla koncentraci prahovou.

U pevných přípravků je třeba prahovou koncentraci endotoxinu na jednotku hmotnosti nebo mezinárodní jednotku přípravku převést na koncentraci endotoxinu v mililitru zkoušeného roztoku, neboť zkoušku lze provádět pouze u roztoků. Přípravky, které existují pouze v tekutém stavu, jako jsou infuzní roztoky, jsou uvedeny dále.

Stanovení prahové koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v jednotce přípravku (jednotka hmotnosti nebo mezinárodní jednotka) vyžaduje definovat:

M = maximální dávka přípravku pro dospělé vyjádřená v jednotkách hmotnosti nebo mezinárodních jednotkách na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, pokud se podává zamýšleným způsobem. Při stanovení maximální dávky pro dospělé se má použít hmotnost 70 kg pro dospělou osobu. Dětská dávka na kilogram hmotnosti za hodinu se má použít jen v případě, jeli vyšší než odpovídající dávka pro dospělé,

K = maximální dávka endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, kterou může pacient dostat předepsaným způsobem bez nežádoucích účinků (Tabulka 2.6.14-1).

Předpokládá se ke zkoušení roztok obsahující c mg (nebo mezinárodních jednotek) přípravku v mililitru. Potom objem M/c ml je objem obsahující maximální dávku M. Jestliže tento objem obsahuje K mezinárodních jednotek endotoxinu, bude výsledek zkoušky pozitivní.

Proto limitní koncentrace endotoxinu (ELC) v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru, jež je shodná s prahovou koncentrací endotoxinu v miligramu nebo v mezinárodní jednotce přípravku v pevném stavu, je rovna:

ELC=K.cM,

v němž značí:

K - nejvyšší přijatelnou dávku endotoxinu v mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu,

c - koncentraci roztoku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách přípravku v mililitru,

M - maximální dávku přípravku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu.

U přípravků, které jsou již v tekuté formě, se vyjádří maximální dávka pro dospělého na kilogram hmotnosti za hodinu v mililitrech. Výše uvedené vyjádření limitní koncentrace endotoxinu platí též pro přípravky, u nichž je uvedena maximální dávka v mililitrech na kilogram hmotnosti za hodinu nahrazením M a c hodnotou jedna.

Prahová koncentrace endotoxinu byla v minulosti definována jako maximální povolená koncentrace endotoxinu (MAEC). Avšak prakticky přípravek obsahující množství endotoxinu, které se rovná přesně MAEC, by nevyhověl zkoušce stejně jako přípravek obsahující endotoxinu více. Jediný způsob, jak se přesvědčit, že MAEC v přípravku nebyla překročena, je prokázat, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než MAEC; takže je mnohem logičtější používat termín limitní koncentrace endotoxinu (ELC) jako koncentraci endotoxinu, která nesmí být dosažena.

Limitní koncentrace endotoxinu závisí na druhu přípravku a jeho použití a je uvedena v jednotlivých článcích, do nichž je třeba nahlédnout. Hodnoty K jsou uvedeny v tabulce 2.6.14-1.

Tab. 2.6.14-1

Zamýšlený způsob podání K v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu
Intravenózní 5,0
Intravenózní pro radiofarmaka 2,5
Intrathekalní 0,2

Které ředění přípravku se má použít ve zkoušce, aby byla naprostá jistota, že negativní výsledek zkoušky znamená, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než ELC a že pozitivní výsledek znamená, že lyzát detegoval alespoň ELC. Toto ředění závisí na ELC a na citlivosti lyzátu: označuje se jako maximální platné ředění (MVD) a tato hodnota se může vypočítat ze vzorce.

MVD=ELCλ=K.cM.λ,

v němž značí:

λ - uvedenou citlivost lyzátu v mezinárodních jednotách endotoxinu v mililitru.

Jestliže hodnota maximálního platného ředění není celým číslem, pak je možno pro rutinní účel zvolit odpovídající celé číslo nižší, než je MVD (čímž je míněna hodnota ředění roztoku přípravku nižší, než je udaná hodnota MVD). V tomto případě negativní výsledek zkoušky ukazuje, že koncentrace endotoxinu v přípravku se nachází pod hladinou limitní hodnoty. Je-li však koncentrace endotoxinu v přípravku v takovéto zkoušce nižší než ELC, ale dostatečně vysoká k tomu, aby při reakci s lyzátem došlo k tvorbě gelu, může být zkouška hodnocena za těchto podmínek jako pozitivní. Tudíž, je-li zkouška s tímto "vhodným" ředícím faktorem pozitivní, je nutno přípravek ředit na MVD a zkoušku opakovat. V jakémkoli případě pochybností nebo sporu se použije MVD.

To zdůrazňuje důležitost potvrzení citlivosti lyzátu.

Příklad

Zkouší se roztok sodné soli fenytoinu obsahující 50 mg/ml (zamýšlený pro intravenózní podání). Stanoví se MVD za použití následujících proměnných:

M - maximální lidská dávka = 15 mg na kilogram hmotnosti za hodinu,

c - 50 mg/ml,

K - 5 m.j. endotoxinu na kilogram za hodinu v mezinárodních jednotkách,

λ - 0,4 m.j. endotoxinu v mililitru.

Řešení:

ELC=K.cM=5.5015

MVD=ELCλ=5.5015.10,4=41,67

Pro rutinní zkoušení tohoto přípravku je vhodné ředit 1 ml roztoku ke zkoušce na 20 ml (MVD/2 zaokrouhleno na nejbližší menší celé číslo). Je-li však zkouška pozitivní, bude analytik muset ředit 1 ml na 41,67 ml a opakovat zkoušku. Ředění na 41,67 ml je rovněž nutné, jestliže se zkoušením má vyřešit sporný výsledek.

Referenční endotoxin BRP je určen pro použití jako porovnávací přípravek. Byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru. Mezinárodní jednotka endotoxinu je definována jako specifická účinnost obsažená v definovaném množství mezinárodního standardu.

Pro rutinní účely je možno použít jiný přípravek endotoxinu, jestliže byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu nebo endotoxinu BRP a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu.

Jedna ampule referenčního přípravku obvykle obsahuje větší množství, než je množství potřebné pro jednu zkoušku, a analytik potřebuje vědět, jak dlouho lze obsah otevřené ampule používat. Pokles účinnosti nebyl pozorován v ampulích, které byly otevřeny v laminárním boxu, uzavřeny vhodným materiálem a dva týdny skladovány při +4 °C. Analytik samozřejmě musí ověřit účinnost takovéto ampule při rutinním laboratorním režimu, je-li odkázán na prodloužené používání otevřené ampule.

Zkoušení na nepřítomnost endotoxinu v této látce zkouškou na pyrogenní látky na králíku bylo vyloučeno z praktických a teoretických důvodů:

Text zkoušky na bakteriální endotoxiny ukazuje, že i jiná metoda, než je trojnásobná destilace, se může použít k přípravě vody pro LAL. Reverzní osmosa byla použita s dobrým výsledkem; někteří analytici mohou dávat přednost vodě destilované více než třikrát. V každém případě použitá metoda musí zaručit, že výsledný produkt je prost zjistitelných endotoxinů.

Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny dochází ke vzniku gelu nejvhodněji při pH 6,0 až 7,5. Při přidání lyzátu ke vzorku může však dojít k poklesu pH. Proto, aby byla jistota, že pH směsi není nižší než 6,0, má se analytik přesvědčit o tom, že hodnota pH zkoušeného vzorku není nižší než 6,5.

Při přípravě roztoku lyzátu je důležité se řídit návodem výrobce.

Poslední pozitivní ředění u gelové metody A a B se převedou na logaritmy. Důvodem toho graficky znázorněné rozložení četnosti těchto logaritmických hodnot dává obvykle normální distribuční křivku mnohem vyrovnanější, než je distribuční rozložení ředících faktorů jako takových; v podstatě jde o tak podobné hodnoty, že je přijatelné použít normální frekvenční distribuci jako matematický model a stanovit interval spolehlivosti Studentovým t-testem.

Kinetické metody C a D používají logaritmus koncentrace endotoxinu, protože lze použít model lineární regrese log reakčního času na log koncentrace endotoxinu. Chromogenní metoda konečného bodu, metoda E, používá odlišný model. V tomto případě výsledek (absorbance závislá na uvolněném barvivu) může být hodnocen jako lineární funkce koncentrace endotoxinu v použitém koncentračním rozmezí.

Některé přípravky nelze přímo zkoušet na přítomnost endotoxinu, protože je nelze smíchat se zkoumadly, nelze u nich upravit hodnotu pH v rozmezí 6,5 až 7,5 nebo inhibují nebo aktivují tvorbu gelu. Proto je nutno provést předběžnou zkoušku na zjištění přítomnosti interferujících faktorů: jsou-li nalezeny, pak analytik prokáže, že postup použitý k jejich odstranění byl dostatečně účinný.

Předmětem předběžného zkoušení je nulová hypotéza, že citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného přípravku se signifikantně neliší od citlivosti lyzátu bez přítomnosti vzorku. Jednoduché kritérium je použito v metodě A a B: nulovou hypotézu lze přijmout, jestliže citlivost lyzátu v přítomnosti přípravku je nejméně poloviční a nejvýše dvojnásobná, než je citlivost lyzátu samotného.

Klasickým způsobem se stanoví průměrné hodnoty logaritmů ředících faktorů lyzátu pro citlivost s přípravkem a bez něho a vypočítá se rozdíl mezi oběma průměrnými hodnotami Studentovým t-testem.

Zkouška na interferující faktory v gelových metodách A a B vyžaduje použití vzorku přípravku, u něhož nebyla zjištěna přítomnost endotoxinu. To představuje teoretický problém, když se má zkoušet zcela nový přípravek. V důsledku různých přístupů byly navrženy kvantitativní metody C, D, E.

Postup k odstranění interference nemá ani zvyšovat ani snižovat množství endotoxinu ve zkoušeném přípravku (např. nesmí dojít ke snížení vlivem adsorbce). Správný způsob jak toto ověřit je, že se do zkoušky zařadí vzorek přípravku, ke kterému se přidá známé množství endotoxinu a poté se měří zpětně koncentrace endotoxinu.

Metody C a D. Jestliže zkoušený přípravek vykazuje interferenci, kterou nelze odstranit klasickými metodami, provede se CSE křivka se stejným typem přípravku zbaveného endotoxinů vhodným způsobem nebo ředěním přípravku. Zkouška na endotoxiny se provede porovnáním s touto standardní křivkou.

Ukazálo se, že v mnoha případech je dostatečně účinná ultrafiltrace přípravku na asymetrických membránových filtrech z triacetatcelulosy. Filtry mají být patřičně validovány, protože v některých případech mohou deriváty celulosy (β-D-glykany) způsobovat falešně pozitivní výsledky.

Polysulfonové filtry uvedené v dřívějším textu byly shledány nevhodnými, protože někteří uživatelé při jejich použití získali falešně pozitivní výsledky.

Účelem kontroly vody pro LAL a referenčního přípravku endotoxinu ve dvojnásobné koncentraci, než je vyznačená citlivost lyzátu, je ověřit aktuální citlivost lyzátu v podmínkách zkoušky. Účelem negativní kontroly je ověřit nepřítomnost měřitelné koncentrace endotoxinu ve vodě pro LAL.

Druhá pozitivní kontrola, která obsahuje zkoušený přípravek v koncentraci použité ve zkoušce, je zařazena proto, aby byla prokázána nepřítomnost interferujících faktorů v průběhu a v podmínkách prováděné zkoušky.

Jak je uvedeno v úvodním odstavci textu, zkouška s lyzátem z amebocytů se používá jako limitní test a stanovení limitu závisí na popsaných faktorech. Nepatrné množství endotoxinu ve vodě pro LAL nebo v některém jiném zkoumadle nebo materiálu, jemuž je vystaven lyzát při zkoušce, nemusí být zjištěno, pokud nedosáhne limitu citlivosti lyzátu. Může však zvyšovat množství endotoxinu v roztoku se zkoušeným přípravkem právě na hranici hodnoty citlivosti lyzátu a způsobovat pozitivní reakci.

Riziko tohoto případu lze snížit přezkoušením vody pro LAL a ostatních zkoumadel a materiálů s co nejcitlivějším lyzátem, který je dostupný, nebo s takovým, který je mnohem citlivější, než je lyzát použitý pro zkoušený přípravek. Ani takto nelze zcela vyloučit riziko falešně pozitivního výsledku. Tento postup by měl být zařazen, aby byla zajištěna bezpečná interpretace výsledků oproti případu falešně negativního testu, který může vést k propuštění nevyhovujícího přípravku ohrožujícího zdraví pacienta.

V článcích na přípravky pro parenterální použití, které mohou obsahovat toxická množství bakteriálních endotoxinů, se požaduje buď zkouška na pyrogenní látky na králících, nebo zkouška na bakteriální endotoxiny. Je-li předepsána zkouška na bakteriální endotoxiny a není uvedena žádná z pěti metod (A až E) popsaných ve stati 2.6.14, pak se pro tento přípravek validovala gelová limitní metoda A. Je-li uvedena jedna z dalších metod (B až E), je to ta, která byla validována pro tento přípravek. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících zkouškou na bakteriální endotoxin nebo náhrada uvedené či předpokládané metody na stanovení endotoxinu jinou metodou je považována za použití alternativní metody místo lékopisné zkoušky, jak je uvedeno v části

Zkoušky na čistotu a stanovení obsahu nebo účinnosti popsané v lékopisu jsou oficiální metody, na nichž jsou založeny lékopisné normy. Se souhlasem oprávněné autority se pro kontrolní účely mohou použít alternativní analytické metody za předpokladu, že bude dosaženo shody s metodami oficiálními. V případě pochybností nebo sporu jsou rozhodující pouze oficiální metody analýzy.

Pro validaci jiné zkoušky na bakteriální endotoxin, než je obsažena nebo určena v lékopisném článku, jsou navrženy následující postupy:

Postup uvedený v části 11.1 a 11.2 se použije u všech nových přípravků pro parenterální podání, které se mají zkoušet na přítomnost bakteriálních endotoxinů podle požadavků lékopisu.

Jestliže se u nového přípravku během jeho vývoje ukáže, že by mohl ovlivňovat tělní teplotu, je možno použít jednu z metod (A až E) k důkazu nepřítomnosti bakteriálních endotoxinů; zejména kvantitativní metoda (B, C, D nebo E) může dát užitečnou informaci. V tomto případě se postupuje, jak je uvedeno v části 11.1 a 11.2. Avšak jsou-li patrné známky kontaminace přípravku neendotoxinovými pyrogenními látkami, je nutno získat podklady z mnohem rozsáhlejšího zkoušení.

2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách

Pokud tyto zkoušky vyžadují nejprve neutralizaci viru, použijí se specifické protilátky, které nejsou humánního ani opičího původu: jestliže byl virus pomnožen na tkáni ptačího původu, nemohou to být ani protilátky ptačího původu. K přípravě antiséra se užívá imunizační antigen připravený na buněčné kultuře z odlišného druhu, než je kultura užívaná pro přípravu vakcíny a prosté cizích agens. Jestliže je předepsáno použití SPF vajec, tato vejce se získávají z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2).

Virové inokulum

Vzorky virového inokula se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovávají se při teplotě nižší než –40 °C.

Dospělé myši. Každé z nejméně deseti dospělých myší o hmotnosti 15 g až 20 g se vstříkne intracerebrálně 0,03 ml a intraperitoneálně 0,5 ml virového inokula. Myši se pozorují nejméně 21 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti dospělým myším, které se pozorují 21 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných myší.

Sající myši. Každé z nejméně dvaceti myší mladších než 24 h se vstříkne intracerebrálně 0,01 ml a intraperitoneálně 0,1 ml virového inokula. Myši se pozorují denně nejméně 14 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti sajícím myším, které se denně pozorují 14 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná sající myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných sajících myší.

Morčata. Nejméně pěti morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se vstříkne intraperitoneálně po 5 ml virového inokula. Zvířata se pozorují nejméně 42 dní, aby se odhalily všechny příznaky nemoci. U všech zvířat, která po uplynutí prvních 24 h uhynou, nebo která mají příznaky nemoci, se provede pitva s makroskopickým vyšetřením; tkáně se vyšetří mikroskopicky a kultivačně na přítomnost infekce. Zvířata, která přežila dobu pozorování, se usmrtí a vyšetří se stejným způsobem. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádné morče nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných morčat.

Virové inokulum a sklizený virus

Vzorky se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovají se při teplotě nižší než –40 °C.

Bakteriální a houbová sterilita. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Mykoplazmata. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata (2.6.7).

Mykobakterie (2.6.2). 5 ml vzorku se zkouší na přítomnost Mycobacterium spp. kultivačními metodami uznanými za citlivé pro detekci těchto organismů.

Zkoušky na jiná cizí agens na tkáňových kulturách. Množství neutralizovaného vzorku, jestliže není předepsáno jinak, které odpovídá 500 lidských dávek nebo 50 ml vakcíny, podle toho, co je více, se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk kontinuální linie opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže virus rostl na lidských diploidních buňkách, neutralizovaný sklizený virus se také zkouší na oddělené kultuře diploidních buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. Tyto buňky se kultivují při 36 °C ± 1 °C a prohlížejí se 14 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže žádná z buněčných kultur nevykazuje známky přítomnosti jakéhokoli cizího agens, jež nelze přičíst náhodné kontaminaci. Zkoušku lze hodnotit, jestliže přežívá nejméně 80 % buněčných kultur.

Ptačí viry (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Neutralizuje se množství vzorku odpovídající bud’ 100 lidským dávkám, nebo 10 ml, podle toho, co je více. Na jedno kuřecí embryo se použije 0,5 ml. Skupina oplozených SPF vajec 9 až 11 dní starých se inokuluje alantoidní cestou a druhá skupina, 5 až 7 dní starých, do žloutkového vaku. Inkubuje se 7 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže alantoidní tekutiny ani tekutiny žloutkového vaku nevykazují přítomnost hemaglutinačního agens a jestliže všechna embrya a chorioalantoidní membrány makroskopicky vyšetřené, jsou normální. Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % embryí přežije 7 dní.

Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky

Aby se ověřila nepřítomnost virů způsobujících cytopatickou degeneraci, posuzují se kontrolní buňky mikroskopicky buď po celou dobu inkubace, nebo po nejméně 14 dní od naočkování výrobních nádob, podle toho, která doba je delší. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % kontrolních kultur.

Po 14 dnech nebo v čase poslední sklizně, podle toho, které období je delší, se provedou dále popsané zkoušky.

Zkouška na hemadsorbující viry. Nejméně 25 % kontrolních kultur se zkouší na přítomnost hemadsorbujících virů přidáním morčecích červených krvinek. Jestliže jsou morčecí krvinky skladovány, uchovávají se nejdéle 7 dní při 5 °C ± 3 °C. Polovina kultur se odečítá po 30 min inkubace při 5 °C ± 3 °C, druhá polovina po 30 min inkubace při 20 °C až 25 °C. Nezjistí se přítomnost hemadsorbujících agens.

Zkouška na jiná cizí agens v tkáňových kulturách. Směs supernatantních tekutin z kontrolních buněk se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. V každém buněčném systému se zkouší nejméně 5 ml. Naočkované kultury se inkubují při 36 °C ± 1 °C a pozorují se 14 dní. Nezjistí se přítomnost cizího agens.

Jestliže se kultura produkčních buněk uchovává při jiné teplotě než 36 °C ± 1 °C, provede se doplňující zkouška na cizí agens při produkční teplotě na buňkách stejného typu, jaký se použil pro pomnožení viru.

Viry ptačí leukózy (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Zkouška na viry ptačí leukózy se provede s 5 ml supernatantní tekutiny z kontrolních buněk.

Kontrolní vejce

Hemaglutinační agens. 0,25 ml alantoidní tekutiny z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutinačního agens přímým smísením s kuřecími červenými krvinkami. Po pasáži na SPF vejcích se postupuje takto: 5 ml vzorku ze směsi amniových tekutin z kontrolních vajec se naočkuje po 0,5 ml do alantoidních dutin a do amniových dutin SPF vajec. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se v žádné z obou zkoušek nezjistí známky přítomnosti hemaglutinačních agens.

Viry ptačí leukózy. Použije se 10 ml směsné amniové tekutiny z kontrolních vajec. Provede se rozhojnění pěti pasážemi na buněčných kulturách z kuřecích embryí, které prokazatelně neobsahují viry ptačí leukózy; zkouška na přítomnost ptačí leukózy se provede použitím buněk z páté pasáže. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se zkouškou neprokážou žádné známky přítomnosti viru ptačí leukózy.

Ostatní cizorodá agens. 5 ml směsné amniotické tekutiny z kontrolních vajec se naočkuje do lidských a opičích buněčných kultur. Buněčné kultury se pozorují 14 dní. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se nezjistí přítomnost cizích agens. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % naočkovaných kultur.

2.6.21 Techniky amplifikace nukleových kyselin

Techniky amplifikace nukleových kyselin jsou založeny na dvou rozdílných přístupech:

V této všeobecné kapitole se jako referenční technika popisuje metoda PCR. Mohou se používat alternativní metody, pokud splňují dále popsané požadavky na kvalitu.

Tato stať zavádí požadavky na přípravu vzorku, na amplifikaci sekvencí DNK in vitro a na detekci specifického produktu PCR. Za pomoci PCR se mohou detegovat definované sekvence DNK. Rovněž sekvence RNK se mohou detegovat po reverzní transkripci RNK na komplementární DNK (cDNK) a následné amplifikaci.

PCR je postup umožňující in vitro specifickou amplifikaci segmentů DNK nebo segmentů RNK po jejich reverzní transkripci na cDNK.

Po denaturaci dvouřetězcové DNK na jednořetězcovou DNK dva syntetické oligonukleotidové primery opačné polarity se přihybridizují k odpovídajícím komplementárním sekvencím DNK, která má být amplifikována. Krátké dvouřetězcové úseky, které jsou výsledkem specifického párování mezi primerem a komplementární sekvencí DNK, ohraničují segment DNK, který bude amplifikován a slouží jako výchozí body pro syntézu DNK in vitro pomocí tepelně stabilní DNK polymerasy.

Amplifikace DNK probíhá v cyklech, které tvoří:

Opakované cykly tepelné denaturace, přihybridizování primerů a syntéza DNK vedou k exponenciální amplifikaci segmentu DNK omezeného primery.

Specifický produkt PCR známý jako amplikon může být detegován různými metodami s vhodnou specifitou a citlivostí.

Z důvodu vysoké citlivosti PCR je nutno vzorky optimálně chránit před vnější kontaminací cílovými sekvencemi.

Vzorkování, uchovávání a doprava zkoušeného materiálu se provádějí za podmínek minimalizujících degradaci cílové sekvence. Pro cílové sekvence RNK je třeba zvláštní opatrnost, neboť RNK je vysoce citlivá na degradaci ribonukleasami. Je třeba věnovat pozornost i tomu, že některé přidávané látky, jako jsou zkoumadla, antikoagulancia nebo konzervační látky, mohou interferovat v postupu zkoušky.

Riziko kontaminace vyžaduje přísné oddělení prostor podle zpracovávaného materiálu a používané technologie. Faktory, které je třeba uvážit, jsou pohyb personálu, pracovní oděv, pohyb materiálu, větrání a dekontaminační postupy.

Systém se má rozdělit do několika oddělení, jako jsou např.:

Při přípravě vzorku se cílová sekvence extrahuje nebo uvolňuje z testovaného materiálu účinným a reprodukovatelným způsobem tak, aby bylo možné za zvolených reakčních podmínek provést amplifikaci.

Mohou se použít různé způsoby fyzikálně-chemické extrakce anebo obohacovací metody. Aditivá přítomná ve zkoušeném materiálu mohou interferovat s PCR. Pro kontrolu nepřítomnosti inhibitorů pocházejících ze zkoušeného materiálu se použijí postupy uvedené v odstavci 7.3.2.

V případě matric RNK je třeba zabránit působení ribonukleas.

Amplifikace cílové sekvence metodou PCR se provádí opakovanými cykly v optimalizovaných podmínkách (teplotní profil pro denaturaci dvouřetězcové DNK, přihybridizování primerů a jejich prodlužování, inkubační časy při zvolených teplotách, rychlost nabíhání zvolených teplot).

Tyto podmínky závisejí na různých parametrech, jako jsou:

Amplikon vytvořený PCR se může identifikovat velikostí, sekvencí, chemickou modifikací nebo kombinací těchto parametrů. Charakterizace na základě velikosti se může dosáhnout gelovou elektroforézou (použije se vrstva agarosového nebo polyakrylamidového gelu nebo kapilární elektroforéza), nebo chromatografií na koloně (např. HPLC). Charakterizace na základě složení sekvencí se může provést specifickou hybridizací vzorků majících komplementární sekvence k cílové sekvenci nebo štěpením amplifikovaného materiálu restrikčním enzymem ve specifických místech pro cílovou sekvenci.

Charakteristika chemickou modifikací se může provést např. inkorporací fluoroforu do amplikonu a následnou detekcí fluorescence po excitaci.

Detekce amplikonů se může provést použitím značených vzorků umožňujících následnou radioizotopovou nebo imunoenzymatickou detekci.

Výsledky jsou platné pouze tehdy, jsou-li pozitivní kontroly jednoznačně pozitivní a negativní kontroly jednoznačně negativní. Vysoká citlivost PCR metody a potenciální riziko kontaminace vyžaduje potvrzení pozitivních výsledků dvojím opakováním celého zkušebního postupu, pokud možno s novým množstvím vzorku. Vzorky se považují za pozitivní, jestliže alespoň jedna z opakovaných zkoušek je pozitivní.

Validační program zahrnuje validaci přístrojů a validaci použitých metod PCR. Doporučení jsou obsažena v Předpisu ICH (hlava Q2B) Validace analytických metod: Metodologie.

Vhodné národní referenční přípravky nebo pracovní referenční přípravky se kalibrují proti mezinárodnímu standardu na cílové sekvence, pro které bude zkouška používána, a tato kalibrace je nezbytná pro validaci PCR zkoušky.

Při validaci se stanoví pozitivní limitní hodnota. Pozitivní limitní hodnota je definována jako minimální počet cílových sekvencí v objemu vzorku, které mohou být detegovány v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní limitní hodnota závisí na vzájemně souvisejících faktorech, jako jsou objem extrahovaného vzorku a účinnost extrakční metody, přepis cílové RNK na cDNK, amplifikační postup a detekce.

Pro stanovení detekčního limitu zkušebního systému se uvede odkaz na pozitivní limitní hodnotu pro každou cílovou sekvenci a provedení zkoušky nad a pod tímto bodem.

Všechna zkoumadla potřebná pro metodiku se kontrolují dříve, než se běžně použijí. Jejich vhodnost nebo nepřijatelnost je dána předem definovanými kritérii jakosti.

Primery jsou klíčovou složkou zkoušky PCR a je nutné věnovat pečlivou pozornost jejich složení, čistotě a validaci jejich použití ve zkoušce PCR. Každá nová šarže primem se před přijetím zkouší na specificitu, amplifikační účinnost a inhibiční nečistoty. Primery mohou být modifikovány (např. konjugací s fluoroforem nebo antigenem), aby umožnily použití specifické metody detekce amplikonu a to za předpokladu, že tyto modifikace neinhibují přesnost a účinnost amplifíkace cílové sekvence.

Ke snížení rizika kontaminace a zajištění dostatečné citlivosti jsou do každé PCR zkoušky zařazeny následující vnější kontroly:

Vnitřní kontroly jsou definované sekvence nukleových kyselin obsahující vazebná místa pro příměry. Vnitřní kontroly jsou amplifikovány s podobnou účinností jako zkoušená cílová sekvence, ale amplikony jsou jasně rozpoznatelné. Vnitřní kontroly jsou téhož typu nukleové kyseliny (DNK/RNK) jako zkoušený materiál. Vnitřní kontrola se přidává ke zkoušenému materiálu před izolací nukleové kyseliny, a slouží proto jako celková kontrola (extrakce, reverzní transkripce, amplifikace, detekce).

Účast v programech vnějšího hodnocení jakosti je důležitým postupem jištění jakosti PCR pro každou laboratoř a každého pracovníka.

2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu citlivých mikroorganismů vyvolané známými koncentracemi zkoušeného antibiotika a referenční látky.

Referenční látky použité ke stanovení jsou ty, jejichž účinnost byla přesně stanovena v poměru k odpovídajícímu mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu přípravku.

Plán stanovení je takový, aby dovolil ověřit validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžných přímek, dvě logaritmické přímky dávky a odpovědi (nebo transformované odpovědi) zkoušeného přípravku a referenčního přípravku jsou rovnoběžné a jsou lineární v intervalu dávek použitých k výpočtu. Tyto podmínky se validují pro danou hladinu pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05. Jiné matematické modely, jako model např. regresního poměru, mohou být též použity, je-li prokázána validita zkoušky.

Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení nejméně 95 % a nejvýše 105 % stanovené účinnosti.

Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.

A. Difuzní metoda

Živná půda vhodná pro stanovení se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní je naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.

Pro přípravu roztoků stejných účinností a známých koncentrací zkoušeného antibiotika a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, případně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Do každého cylindříku nebo otvoru se přidá stejný objem roztoků. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.

K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat i dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije metoda třídávková, jak je předepsáno výše.

Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.

Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, jak je vhodné, se může použít k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.

Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.

V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inhibičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.

Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda

Antibiotikum Referenční látka Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku Tlumívý roztok (pH) Mikroorganis-mus Půda a konečné pH (± 0,1) Inkubační teplota (°C)
Amphotericinum B Amphotericinum B CRL Dimethyl-formamid R pH 10,5 (0,2 mol/l) Saccharomy-cescerevisiae IP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65 F – pH 6,1 35 až 37
Bacitracinum zincium Bacitracinum zincicum CRL kyselina chlorovodíková 0,01 mol/l VS pH 7,0 (0,05 mol/l) Micrococcus flavus NCTC 7743 CIP 53.160 ATCC 10240 CCM 732 CNCTC M 8/58 A – pH 7,0 35 až 39
Bleomycini sulfas Bleomycini sulfas CRL voda R pH 6,8 (0,1 mol/l) Mycobacterium smegmatis ATCC 607 CCM 4622 CNCTC My 23/64 G – pH 7,0 35 až 37
Colistini sulfas Colistini sulfas CRL Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617 B – pH 7,3 35 až 39
Colistimethatum natricum Colistimethatum natricum CRL voda R pH 6,0 (0,05 mol/l) CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71 B – pH 7,3 35 až 39
Dihydro- streptomycini sulfas Dihydro-streptomycini sulfas CRL voda R pH 8,0 (0,05 mol/l) Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 A – pH 7,9 30 až 37
CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 A – pH 7,9 30 až 37
Erythromycini estolas Erythromycinum CRL methanol R viz články Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 A – pH 7,9 30 až 37
Erythromycini ethylsuccinas methanol R pH 8,0 (0,05 mol/l)
Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 A – pH 7,9 30 až 37
Erythromycini stearas
Framycetini sulfas Framycetini sulfas CRL voda R pH 8,0 (0,05 mol/l) Bacillus subtilis E – pH 7,9 30 až 37
NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 E – pH 7,9 30 až 37
Gentamicini sulfas Gentamicini sulfas CRL voda R pH 8,0 (0,05 mol/l) Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Staphylococcus epidermidis NCIB 8853 CEP 68.21 ATCC 12228 CCM 4418 NCTC M 12/63 A – pH 7,9 A – pH 7,9 35 až 39 35 až 39
Kanamycini monosulfas Bacillus Subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Staphylo coccus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 A – pH 7,9 30 až 37
Kanamycini monosulfas CRL voda R pH 8,0 (0,05 mol/l)
Kanamycini sulfas acidus A – pH 7,9 35 až 39
Neomycini sulfas Neomycini sulfas CRL voda R pH 8,0 (0,05 mol/l) Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 E – pH 7,9 30 až 37
E – pH 7,9 30 až 37
Netilmicini sulfas Netilmicini sulfas CRL voda R pH 8 ± 0,1 Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 A – pH 7,9 32 až 35
Nystatinum Nystatinum CRL dimethyl-formamid R pH 6,0 (0,05 mol/l) obsahující 5 % (V/V) dimethyl-formamidu R Candida tropicalis CIP 1433-83 NCYC 1393 CCM8223 Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65 F – pH 6,0 30 až 37 30 až 32
Polymyxini B sulfas Polymyxini B sulfas CRL voda R pH 6,0 (0,05 mol/l) Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CEP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 B – pH 7,3 35 až 39
Rifamycinum natricum Rifamycinum natricum CRL methanol R pH 7,0 (0,05 mol/l) Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58 A – pH 6,6 35 až 39
Spiramycinum Spiramycinum CRL methanol R pH 8,0 (0,05 mol/l) Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 A – pH 7,9 30 až 32
Streptomycini sulfas Streptomycini sulfas CRL voda R pH 8,0 (0,05 mol/l) Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 A – pH 7,9 30 až 32
A – pH 7,9 30 až 32
Tobramycinum Tobramycinum CRL voda R pH 8,0 (0,05 mol/l) Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 A – pH 7,9 30 až 37
Tylosinum a.u.v. Tylosinum CRL roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l) směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60) Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58 A – pH 8,0 32 až 35
Tylosini tartras a.u.v.
Vancomycini hydrochloridum Vancomycini hydrochloridum CRL voda R pH 8,0 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 A – pH 8,0 37 až 39

B. Turbidimetrická metoda

Vhodná živná půda se naočkuje suspenzí vybraného mikroorganismu, který je citlivý na zkoušené antibiotikum tak, aby se v podmínkách zkoušky docílilo vhodně rozsáhlého potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé množství suspenze vybrané tak, aby byl asi po čtyřhodinové inkubaci dobře měřitelný zákal.

Naočkovaná půda se použije ihned po naočkování.

Pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá stejná účinnost, se použije rozpouštědlo a tlumivý roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2. K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky referenční látky a tři dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu tři následující dávky za použití odpovídajících dávek referenční látky a zkoušeného antibiotika.

Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede stejný objem jednoho z roztoků a stejný objem naočkované živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy).

Zároveň se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika s naočkovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá 0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky slouží ke standardizaci optického přístroje použitého k měření růstu.

Zkumavky se umístí buď náhodně, nebo podle latinského čtverce, nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného přístroje, dovolujícího uvést rychle všechny zkumavky na uvedenou inkubační teplotu. Uchovávají se při této teplotě 3 h až 4 h a zabezpečí se stejná teplota a stejná doba inkubace.

Po inkubaci se zastaví ve všech zkumavkách růst mikroorganismů přidáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím a změří se zákal s přesností na tři místa za použití vhodného optického přístroje. Alternativně lze použít jiný postup, který dovoluje měřit zákal každé zkumavky po přesně stejné době inkubace.

Vypočítá se účinnost za pomoci vhodných statistických metod.

Linearita vztahu dávka – odpověď, transformovaná nebo netransformovaná, je často získána pouze ve velmi omezeném intervalu; je to ten interval, který se má použít pro výpočet účinnosti a obsahuje nejméně tři následné dávky dovolující ověřit linearitu. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému, pokud byla na přiměřeném počtu třídávkových stanovení a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije třídávková metoda.

V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik zkumavek, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.

Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda

Antibiotikum Referenční látka Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku Tlumivý roztok (pH) Mikroorganis-mus Půda a konečné pH (± 0,1) Inkubační teplota (°C)
Colistini sulfas Colistimethatum natricum Colistini sulfas CRL Colistimethatum natricum CRL voda R pH 7,0 Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637 CCM 2024 C – pH 7,0 35 až 37
Dihydrostrep- tomycini sulfas Dihydrostrepto-mycini sulfas CRL voda R pH 8,0 Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69 C – pH 7,0 35 až 37
Erythromycini estolas Erythromycini ethylsuccinas Erythromycin CRL methanol R viz články pH 8,0 Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 D – pH 7,0 35 až 37
Erythromycini stearas CNCTC Klp 85/69 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 35 až 37
Framycetini sulfas Framycetini sulfas CRL voda R pH 8,0 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 35 až 37
Gentamicini sulfas Gentamicini sulfas CRL voda R pH 7,0 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 35 až 37
Gramicidinum Gramicidinum CRL methanol R pH 7,0 K zamezení ztrát způsobených adsorpcí v průběhu ředění může být nutná přísada detergentu, např. poly-sorbátu 80 R (0,1 mg/ml) Streptococcus faecalis ATCC 10541 CCM 4533 CNCTC Str 6/58 Staphylococcus aureus ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 35 až 37
Kanamycini monosulfas Kanamycini monosulfas CRL voda R pH 8,0 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 35 až 37
Kanamycini sulfas acidus
Neomycini sulfas Neomycini sulfas CRL voda R pH 8,0 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 35 až 37
Rifamycinum natricum Rifamycinum natricum CRL methanol R pH 7,0 Escherichia coli NICB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71 C – pH 7,0 35 až 37
Spiramycinum Spiramycinum CRL methanol R pH 7,0 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 35 až 37
Streptomycini sulfas Streptomycini sulfas CRL voda R pH 8,0 Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69 C – pH 7,0 35 až 37
Tobramycinum Tobramycinum CRL voda R pH 7,0 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 35 až 37
Tylosinum a.u.v. Tylosini tartras a.u.v. Tylosinum CRL roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l) směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60) Staphyloco-ccusaureus NCTC 6571 CIP 53.154 ATCC 9144 CCM 2107 CNCTC Mau 76/69 C – pH 7,0 37
Vancomycini hydrochloridum Vancomycini hydrochloridům CRL voda R pH 8,0 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 C – pH 7,0 37 až 39

Následující část se uvádí pro informaci a jako návod, netvoří závaznou součást obecné metody.

Doporučené mikroorganismy

Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky jejich použití. Jiné mikroorganismy se mohou použít, pokud mají prokazatelně stejnou citlivost na zkoušené antibiotikum a použijí se ve vhodné živné půdě a ve vhodných podmínkách teploty a pH. Výběr koncentrací roztoků se má provést tak, aby zaručil, že v podmínkách zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky a odpovědí.

Příprava inokula

Bacillus subtilis a Bacillus pumilus. Suspenze spor mikroorganismu použitého k naočkování se připraví takto:

Mikroorganismy se kultivují 7 dní při 35 °C až 37 °C na vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R (1 mg/l). Nárůst, který obsahuje zejména spory, se spláchne sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá při 70 °C a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor, obvykle 10.10^6 až 100.10^6 v ml. Suspenze spor se mohou uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.

Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů v půdě C při 26 °C po dobu 4 dní až 6 dní. Potom se asepticky přidá dostatek síranu manganatého R do koncentrace 1 mg/l a inkubuje se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %), a suspenze se odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R tak, aby se dosáhla koncentrace spor v ml 10.10^6 až 100.10^6, a potom se zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě nepřevyšující 4 °C.

Bordetella bronchiseptica. Testovací mikroorganismus se kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Micrococcus flavus, Staphylococcus epidermidis. Připraví se stejně, jak je popsáno v odstavci Bordetella bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový zákal, který při turbidimetrickém stanovení prokazatelně poskytuje uspokojující vztah dávky k odpovědi nebo při difuzním stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny postačujícího průměru.

Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis. Testovací mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilním roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a zředí se jím na vhodný zákal.

Tlumivé roztoky

Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8 až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS, uvedeným v následující tabulce a doplněním čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.

Tab. 2.7.2-3

pH množství hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS v ml
5,8 3,72
6,0 5,70
6,2 8,60
6,4 12,60
6,6 17,80
6,8 23,65
7,0 29,63
7,2 35,00
7,4 39,50
7,6 42,80
7,8 45,20
8,0 46,80

Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou:

1) bleomyciniumsulfatu, pro který se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví takto: rozpustí se 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g hydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml.

2) amfotericinu, na který se tlumivý roztok o pH 10,5 (0,2 mol/l) připraví takto: 35,08 g hydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí ve vodě destilované R, přidá se 1,12 g hydroxidu draselného R a zředí se vodou destilovanou R na 1000,0 ml.

Živné půdy

Mohou se použít následující půdy nebo půdy jím rovnocenné.

Půda A
pepton 6 g
pankreatický hydrolyzát kaseinu 4 g
hovězí výtažek 1,5 g
kvasničný výtažek 3 g
glukosa monohydrát 1 g
agar 15 g
voda do 1000 ml
Půda B
--- ---
pankreatický hydrolyzát kaseinu 17 g
papainový hydrolyzát sóji 3 g
chlorid sodný 5 g
hydrogenfosforečnan draselný 2,5 g
glukosa monohydrát 2,5 g
agar 15 g
polysorbát 80 10 g
voda do 1000 ml

Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních složek po jejich rozvaření a bezprostředně před upravením objemu.

Půda C
pepton 6 g
hovězí výtažek 1,5 g
kvasničný výtažek 3 g
chlorid sodný 3,5 g
glukosa monohydrát 1 g
hydrogenfosforečnan draselný 3,68 g
dihydrogenfosforečnan draselný 1,32 g
voda do 1000 ml
Půda D
--- ---
výtažek ze srdce 1,5 g
kvasničný výtažek 1,5 g
pepton z kaseinu 5,0 g
glukosa monohydrát 1 g
chlorid sodný 3,5 g
hydrogenfosforečnan draselný 3,68 g
dihydrogenfosforečnan draselný 1,32 g
dusičnan draselný 2 g
voda do 1000 ml
Půda E
--- ---
pepton 5 g
masový výtažek 3 g
hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát 26,9 g
agar 10 g
voda do 1000 ml

Hydrogenfosforečnan sodný se přidá jako sterilní roztok po sterilizaci půdy.

Půda F
pepton 9,4 g
kvasničný výtažek 4,7 g
hovězí výtažek 2,4 g
chlorid sodný 30,0 g
glukosa monohydrát 10,0 g
agar 23,5 g
voda do 1000 ml
Půda G
--- ---
glycerol 10 g
pepton 10 g
masový výtažek 10 g
chlorid sodný 3 g
agar 15 g
voda do 1000 ml

pH 7 ± 0,1 po sterilizaci

2.7.10 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII

Podstata zkoušky. Při stanovení účinnosti koagulačního faktoru VII se využívá jeho biologické aktivity v komplexu faktor Vlla-tkáňový faktor při aktivaci faktoru X za přítomnosti vápenatých iontů a fosfolipidů. Účinnost přípravku faktoru VII se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného k dosažení určitého stupně tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky účastnící se aktivace faktoru X s množstvím mezinárodního standardu nebo porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí ke stejnému stupni tvorby faktoru Xa.

Mezinárodní jednotka je účinnost faktoru VII obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná plazma. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Metoda chromogenního stanovení účinnosti se skládá ze dvou fází: z aktivace reakční směsi faktoru X, která obsahuje tkáňový faktor, fosfolipidy a vápenaté ionty a závisí na faktoru VII, a z následného enzymatického rozštěpení chromogenního substrátu faktoru Xa na chromofor, jehož množství se může stanovit spektrofotometricky.

Za vhodných podmínek stanovení účinnosti je lineární závislost mezi stupněm tvorby faktoru Xa a koncentrací faktoru VII. Stanovení účinnosti je shrnuto ve schématu na obrázku 2.7.10-1.

V obou fázích se používají zkoumadla, která lze získat komerčně z různých zdrojů. Ačkoliv se složení jednotlivých zkoumadel může lišit, existují jejich nezbytné vlastnosti, které jsou dále podrobně popsány.

Fáze 1: a) faktor VII→tkáňový faktor+Ca++faktor VIIa

Fáze 2: chromogenní substrát→faktor Xapeptid + chromofor

Obr. 2.7.10-1. Schematické znázornění stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII

Zkoumadla

Názvem zkoumadla koagulačního faktoru se označuje skupina přečištěných bílkovin lidského či hovězího původu. Zahrnuje faktor X a tromboplastinový tkáňový faktor/fosfolipid jako aktivátor faktoru VII. Tyto bílkoviny jsou částečně přečištěny a neobsahují nečistoty, které zasahují do aktivace faktoru VII nebo faktoru X. Faktor X je přítomen v množství, které během první fáze stanovení dává konečnou koncentraci 10 nmol/l až 350 nmol/l, přednostně 14 nmol/l až 70 nmol/l. Jako tkáňový faktor/fosfolipid se mohou používat tromboplastin přírodního původu (hovězí nebo králičí mozek) nebo syntetické přípravky. Tromboplastin vhodný ke stanovení tromboplastinového času se ředí 1 : 5 až 1 : 50 tlumivým roztokem tak, aby konečná koncentrace vápenatých iontů byla 15 mmol/l až 25 mmol/l. Konečná tvorba faktoru Xa probíhá v roztoku, který obsahuje lidský nebo hovězí albumin v takové koncentraci, že nedochází k adsorpčním ztrátám, a jehož pH je vhodně upraveno na 7,3 až 8,0. V konečné inkubační směsi je faktor VII jedinou složkou limitující stupeň tvorby faktoru Xa a žádná reakční složka nemá mít vlastní schopnost tvořit faktor Xa.

Ve druhé fázi se určí množství vzniklého faktom Xa za použití chromogenního substrátu, který je specifický pro faktor Xa. Obvykle je tvořen krátkým peptidem o třech až pěti aminových kyselinách vázaným na chromoforovou skupinu. Při odštěpení této skupiny od peptidového substrátu se její absorpční maximum posune k vlnové délce umožňující spektrofotometrické stanovení množství. Substrát se obvykle rozpustí ve vodě R a používá se ve výsledné koncentraci 0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může také obsahovat vhodné inhibitory k zastavení další tvorby faktoru Xa (přidání edetanu).

Postup stanovení účinnosti

Celý obsah jedné ampule porovnávacího přípravku a zkoušeného přípravku se rozpustí přidáním vhodného množství vody R; použije se během 1 h. Rozpuštěné přípravky se dále naředí tak, aby vznikly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. faktoru VII v mililitru.

Připraví se další ředění porovnávacího a zkoušeného přípravku za použití izotonického tlumivého roztoku nevázajícího vápník, která obsahují 1 % hovězího nebo lidského albuminu a přednostně mají pH 7,3 až 8,0. Připraví se nejméně tři oddělená nezávislá ředění pro každý přípravek, nejlépe ve dvojici. Ředění se připraví tak, aby konečná koncentrace faktoru VII byla nižší než 0,005 m.j. v mililitru.

Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky kromě faktoru VII.

Všechna ředění se připravují ve zkumavkách z plastů a použijí se během 1 h.

Aktivace faktoru X se nechá probíhat po vhodnou dobu. Obvykle se reakce ukončí předtím, než koncentrace faktoru Xa dosáhne své maximální hladiny, aby se docílila uspokojivá lineární závislost mezi dávkou a odpovědí. Doba aktivace se volí také tak, aby tvorba faktoru Xa byla lineárně závislá na čase. Vhodné doby aktivace obvykle kolísají mezi 2 min a 5 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud je dosaženo přijatelné linearity ve vztahu mezi dávkou a odpovědí.

Zkontroluje se validita stanovení a vypočítá se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými statistickými metodami (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

2.7.11 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru IX

Podstata zkoušky. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného ke zkrácení srážecího času zkušební směsi obsahující jiné látky než faktor IX, jež se podílejí na srážení krve, s množstvím porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí k vyvolání stejného účinku.

Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncentrát lidského koagulačního faktoru IX. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Postup stanovení. Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se odděleně rozpustí podle návodu uvedeného v označení na obalu a ihned se použijí. Pokud přípravek obsahuje heparin, stanoví se jeho množství (2.7.12) a heparin se neutralizuje přidáním protaminiumsulfatu R (10 μg protaminiumsulfatu neutralizuje 1 m.j. heparinu). Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se zředí dostatečným množstvím tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 tak, aby se získaly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. v mililitru. Směsí objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 (1 + 5) se připraví řada dvojnásobných ředění v rozmezí 1 : 10 až 1 : 80. Tato ředění je třeba připravit přesně a ihned je použít.

Použijí se např. inkubační zkumavky, které se ponechají ve vodní lázni při 37 °C. Do každé z nich se dá 0,1 ml plazmy substrátu RS2 a 0,1 ml příslušného ředění zkoušeného nebo porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml vhodného ředění zkoumadla cefalinového R nebo krevních destiček náhrady R a 0,1 ml suspenze 0,5 g kaolinu lehkého R ve 100 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Pak se obsah zkumavek inkubuje 10 min za stálého protřepávání. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml chloridu vápenatého R (7,4 g/l).

Pomocí stopek se změří srážecí čas, tj. interval mezi přidáním chloridu vápenatého a prvními známkami tvorby fibrinu, což je možno určit vizuálně nebo vhodným přístrojem. K výpočtu účinnosti se použijí obvyklé statistické metody (např. 5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

Aby se zajistilo, že plazma substrát RS2 neobsahuje zjistitelnou kontaminaci faktorem IX, provede se slepá zkouška, v níž se místo zkoušeného přípravku použije odpovídající množství směsi objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 R (1 + 5). Zkoušku lze hodnotit, jestliže srážecí čas slepé zkoušky je v rozmezí 100 s až 200 s.

2.7.12 Stanovení účinnosti heparinu v koncentrátech koagulačních faktorů

Podstata zkoušky. Měří se absorbance při 405 nm roztoku zkoušeného vzorku a roztoku referenčního přípravku heparinu po inkubaci s definovaným nadbytkem trombinu a chromogenního substrátu specifického pro trombin. Nárůst absorbance (v závislosti na množství uvolněného p-nitroanilinu) při 405 nm je nepřímo úměrný množství heparinu ve vzorku.

Zkoušené roztoky. Přípravek se rozpustí předepsaným způsobem a naředí se vhodným tlumivým roztokem (např. roztok chloridu sodného R (7 g/l) a citronanu sodného R (6 g/l) o pH 7,3) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru. Připraví se řada ředění (až do 1 : 32) za použití vhodného tlumivého roztoku (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4). Naředěné roztoky se nechají stát 30 min.

Porovnávací roztoky. Referenční přípravek heparinu se naředí vhodným tlumivým roztokem (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru a připraví se řada ředění (až do 1 : 32).

Postup stanovení. Do řady zkumavek z plastu se napipetuje po 200 μl zkoušeného roztoku nebo porovnávacího roztoku nebo kontrolního roztoku (tlumivý roztok použitý k ředění) a po 200 μl roztoku antitrombinu III R (3 m.j./ml). Směs se nechá stát 30 min a přidá se po 200 μl roztoku trombinu hovězího R (20 m.j./ml). Řádně se promíchá pomocí vibrační míchačky a nechá se stát 90 s při 37 °C.

Připraví se roztok chromogenního substrátu specifického pro trombin v koncentraci odpovídající nejméně dvojnásobku hodnoty Km (Michaelisovy konstanty).

Substrátový roztok se ohřeje na 37 °C a přidá se po 200 μl do každé zkumavky, která obsahuje zkoušený roztok, porovnávací roztok nebo kontrolní roztok. Vše se řádně promíchá pomocí vibrační míchačky. Inkubuje se 90 s při 37 °C a reakce se zastaví přidáním po 200 μl roztoku kyseliny octové R (500 g/l C2H4O2) a změří se absorbance při 405 nm.

Obsah heparinu ve zkoušeném přípravku se vypočítá za použití obvyklých statistických metod (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

2.9.18 Přípravky k inhalaci: aerodynamické stanovení jemných částic

Podstata zkoušky. Zkouškou se stanovují jemné částice charakterizující obláčky aerosolů vytvářené přípravky k inhalaci.

Pokud není uvedeno a schváleno jinak, použijí se ke zkoušce níže uvedené přístroje a zkušební postupy.

Přístroj 1. Vícestupňový kapalinový odlučovač

Přístroj se skládá z prvního patra (předseparátoru), odlučovacích pater 2, 3, 4 a z filtračního patra 5, které s nimi tvoří celek, viz obrázky 2.9.18-1/3.

K odlučovacímu patru patří horní kovová přepážka (B), kterou prochází vstupní kovová trubice – tryska (A) s odlučovací deskou (D), skleněný válec (E) opatřený vzorkovacím okénkem (F), tvořící svislou stěnu patra, a vodorovná spodní kovová přepážka (G), kterou prostupuje trubice (H) spojující patro s nejblíže nižším patrem. Trubice (U) vedoucí do 4. patra je zakončena sadou trysek. Odlučovací deska (D) je zajištěna kovovým rámem (J) upevněným dvěma dráty (K) k objímce (L) na přepadové trubce (C). Vodorovný povrch sběrné desky je kolmý k ose přepadové trubky. Sběrné desky mají soustředné uspořádání.

Horní povrch odlučovací desky poněkud převyšuje okraj kovového rámu. Vybrání podél obvodu vodorovné příčky slouží ke správnému umístění skleněného válce. Skleněné válce jsou v přepážkách zajištěny těsněním (M) a dohromady jsou sepnuty šesti svorníky (N). Vzorkovací okénka se uzavírají zátkami. Spodní strana nižší přepážky čtvrtého patra má soustředný výstupek opatřený gumovým kroužkem (P), který utěsňuje okraj filtru zachycený v držáku filtru. Držák filtru (R) je konstruován jako miska se soustředným vybráním, v němž je zapuštěna perforovaná podpěra filtru (S). Soustava odlučovacích pater je sepnuta s držákem filtru pomocí dvou úchytných uzávěrů (T). Držák filtru je upraven pro filtry o průměru 76 mm. Na vstup do prvního patra se připojí vstupní díl tvořený trubkou s pravoúhlým kolenem - viz obrázek 2.9.18-4. Vzduchotěsnost spojení se zajistí pryžovým těsnicím kroužkem. Ke vstupnímu dílu, pomocí vhodného adaptéru, se vzduchotěsně připojí náustek inhalačního přípravku. Konec náustku je zarovnán s čelem vstupního dílu.

[image omitted]

Obr. 2.9.18-1 Vícestupňový kapalinový odlučovač

Tab. 2.9.18-1 Specifikace dílů k obrázkům 2.9.18-1/3

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)