Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Poznámka. K 15 s až 30 s zpoždění při neutralizaci škrobového indikátora dochází pro peroxidové číslo 70 a vyšší, trimethylpentan má sklon pěnit na povrchu vodného prostředí a v tomto případě je třeba přiměřeně míchat rozpouštědlo a odměrný roztok, až do uvolnění poslední stopy jodu. Doporučuje se použít thiosíran sodný 0,01 mol/l VS pro peroxidové číslo nižší než 150. Může se přidat malé množství (0,5 % až 1,0 %) vyšších HLB emulgátorů k reakční směsi, aby se zpomalilo dělení fází a zkrátilo se tak zpoždění při uvolnění jodu.

Provede se slepá zkouška. Jestliže spotřeba titračního činidla při slepé zkoušce je vyšší než 0,1 ml, odstraní se nečistoty činidel a opakuje se stanovení.

Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:

Ip=1000·V1-V0·cm,

v němž značí:

c - koncentraci thiosíranu sodného v mol/l,

V1 - spotřebu thiosíranu sodného při titraci v ml,

V0 - spotřebu thiosíranu sodného při slepé zkoušce v ml,

m - navážku zkoušené látky v g.

2.5.31 Ribosa v polysacharidových vakcínách

Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu pro přípravu roztoku přípravku obsahujícího asi 5 mg suchého polysacharidu v mililitru. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah nádobky a zředí se vodou R na potřebný objem. Dále se roztok zředí tak, aby objemy použité při zkoušce obsahovaly 2,5 μg až 25 μg ribosy. Zředěný roztok se převede po 0,20 ml do tří zkumavek a po 0,40 ml do dalších tří zkumavek.

Porovnávací roztoky. 25 mg ribosy R se rozpustí ve vodě R a zředí se ji na 100,0 ml (základní roztok obsahující 0,25 g/l ribosy). Bezprostředné před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou R na 10,0 ml (pracovní zředění: 25 mg/l ribosy). Do šesti zkumavek se přenese 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml, 0,60 ml, 0,80 ml a 1,0 ml tohoto roztoku.

Slepá zkouška. Použijí se 2 ml vody R.

Postup. Obsah každé zkumavky se doplní vodou R na objem 2 ml, protřepe se a do každé zkumavky se přidají 2 ml roztoku chloridu železitého R (0,5 g/l) v kyselině chlorovodíkové R. Po protřepání se přidá 0,2 ml roztoku orcinolu R (100 g/l) v ethanolu R. Zkumavky se vloží na 20 min do vodní lázně a potom se ochladí v ledové vodě. Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 670 nm proti kontrolnímu roztoku získanému při slepé zkoušce. Sestrojí se kalibrační křivka ze zjištěných absorbancí šesti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahu ribosy a odečte se množství ribosy pro každé zředění zkoušeného roztoku. Ze tří získaných hodnot pro každý objem se vypočítá průměr.

• 2.5.32 Coulometrická titrace, mikrometoda

Princip metody

Coulometrická titrace vody je založena na kvantitativní reakci vody s oxidem siřičitým a jodem v bezvodém prostředí za přítomnosti zásady s dostatečnou tlumicí kapacitou. Na rozdíl od odměrné metody uvedené ve stati (2.5.12) je jod produkován elektrochemicky v reakční nádobce oxidací jodidu. Jod generovaný na anodě reaguje okamžitě s vodou a oxidem siřičitým, které jsou obsaženy v reakční nádobce. Množství vody v látce je přímo úměrné množství elektrického náboje spotřebovaného do bodu ekvivalence titrace. Když všechna voda v nádobce (stanovené látce) zreagovala, je dosaženo bodu ekvivalence a objeví se nadbytek jodu. 1 mol jodu odpovídá 1 molu vody, množství elektrického náboje 10,71 C odpovídá 1 mg vody.

Vlhkost ze systému je odstraněna předchozí elektrolýzou. Jednotlivá stanovení se mohou provádět po sobě ve stejném roztoku zkoumadel za následujících podmínek:

• každá složka zkoušené směsi je kompatibilní s dalšími složkami,

• neprobíhají žádné další reakce,

• objem a vodní kapacita elektrolytového zkoumadla jsou dostatečné.

Coulometrická titrace je omezena na stanovení malých množství vody, nejlépe v rozmezí 10 μg až 10 mg.

Přesnost a správnost metody jsou podmíněny především tím, jak účinně lze vyloučit ze systému atmosférickou vlhkost. To lze monitorovat měřením velikosti posunu základní linie.

Zařízení

Zařízení se skládá z reakční nádobky, elektrod a elektromagnetické míchačky. Nádobka je tvořena větším prostorem anodovým a menším prostorem katodovým. V závislosti na tvaru elektrod mohou být oba prostory odděleny membránou a v každém prostoru je platinová elektroda. Kapalné nebo rozpuštěné vzorky jsou vnášeny přes septum injekční stříkačky. Alternativně může být použita technika odpařování, při níž je vzorek zahříván ve zkumavce (sušárně) a voda je odpařována a vedena do reakční nádobky proudem suchého inertního plynu. Obecně je třeba se vyhnout vnášení pevných vzorků do reakční nádobky. Avšak, je-li to nezbytné, provádí se to utěsněným vstupem. Je třeba učinit vhodná opatření, aby se zabránilo zanesení vlhkosti ze vzduchu, např. pracuje se v boxu opatřeném rukavicemi v atmosféře suchého inertního plynu. Postup analýzy je řízen vhodným elektronickým zařízením, které též zobrazuje výsledek.

Pracovní postup

Obě části nádobky se naplní elektrolytovým zkoumadlem pro mikrostanovení vody R podle návodu výrobce a provede se coulometrická titrace do trvalého konečného bodu. Předepsané množství zkoušené látky se vnese do reakční nádobky, 30 s se míchá, pokud není v článku uvedeno jinak, a znovu se titruje do trvalého konečného bodu. V případě, že je použito sušárny, předepsané množství vzorku se převede do zkumavky a zahřívá se. Po odpaření vody ze vzorku do reakční nádobky se začne titrovat. Hodnota se odečte z výstupu přístroje a vypočítá se, je-li to nutné, procentuální obsah nebo množství vody ve zkoušené látce. Pokud je to vhodné podle druhu vzorku a přípravku, provede se slepá zkouška.

Ověření správnosti

Mezi dvě po sobě následující titrace vzorku se vnese do nádobky přesně zvážené množství vody řádově stejné velikosti, jako je množství vody ve vzorku, buď jako voda R, nebo ve formě základního roztoku pro mikrostanovení vody a provede se coulometrická titrace. Výtěžnost se pohybuje v rozmezí 97,5 % až 102,5 % pro přidání 1000 μg H2O, v rozmezí 90,0 % až 110,0 % pro přidání 100 μg H2O.

• 2.6 Biologické zkoušky

2.6.1 Zkoušky na sterilitu 1)

Tato zkouška se provádí s léčivými látkami, pomocnými látkami, léčivými přípravky a zdravotnickými prostředky, u nichž je lékopisem předepsána sterilita. Vyhovující výsledek však pouze udává, že zkoušený vzorek není znečištěn žádným mikrobem zjistitelným v podmínkách zkoušky. Seznam dalších požadavků k prokázání sterility celé šarže je uveden na konci tohoto textu.

Opatření proti mikrobiálnímu znečištění

Zkouška na sterilitu se provádí za aseptických podmínek, např. použitím laminárního boxu o třídě čistoty A umístěného v místnosti vyhovující třídě čistoty B, nebo v izolátoru. Opatření přijatá proti kontaminaci nepůsobí na mikroorganismy, které se mají při zkoušce zjistit. Pracovní podmínky, v nichž je zkouška prováděna, se pravidelně monitorují vhodným vzorkováním pracovního prostředí a provádějí se vhodné kontroly, jak jsou popsány v příslušných směrnicích Evropského společenství a v navazujících Notes for guidance on GMP.

Živné půdy

Následující živné půdy byly shledány vhodnými pro zkoušku na sterilitu. Thioglykolanová půda je především určena pro kultivaci anaerobních bakterií, ale umožní zjistit také aerobní bakterie. Půda z hydrolyzátů soji a kaseinu je především určena pro kultivaci aerobních bakterií, ale je vhodná i pro kultivaci hub. Mohou se používat i jiné živné půdy, pokud prokazatelně podporují růst široké řady mikroorganismů.

Thioglykolanová půda

L-cystin	0,5 g
agar granulovaný (obsah vlhkosti do 15 %)	0,75 g
chlorid sodný	2,5 g
glukosa monohydrát	5,5 g
kvasničný výtažek (rozpustný ve vodě)	5,0 g
pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
thioglykolan sodný nebo	0,5 g
kyselina thioglykolová	0,3 ml
roztok sodné soli resazurinu (1 g/l) čerstvě připravený	1,0 ml
voda R	1000 ml
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2.

Smíchá se L-cystin, agar, chlorid sodný, glukosa, kvasničný výtažek a pankreaticky hydrolyzát kaseinu s vodou a zahřívá se, dokud se nerozpustí. Přidá se thioglykolan sodný nebo kyselina thioglykolová do roztoku a přidá se, je-li třeba, hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok po sterilizaci měl pH 7,1 ± 0,2. Je-li zapotřebí filtrace, zahřeje se roztok téměř až k varu a za tepla se filtruje navlhčeným filtračním papírem. Potom se přidá roztok sodné soli resazurinu, promíchá se a rozplní do vhodných nádob, které zajistí takový poměr povrchu k výšce sloupce půdy, aby se do konce inkubační doby nezměnilo pohlcováním kyslíku barevně víc, než horní třetina půdy. Používá se validovaný postup sterilizace. Uchovává se při teplotě 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, není-li určen a k okamžitému použití. Je-li třeba, regeneruje se půda těsně před použitím, např. 20 min zahříváním ve vodní lázni a rychlým ochlazením. Nesterilní vzduch se přitom nesmí dostat do nádoby.

Půda z hydrolyzátu sóji a kaseinu

pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
voda R	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2.

Pevné látky se za mírného zahřátí rozpustí ve vodě a roztok se ochladí na pokojovou teplotu. V případě potřeby se přidá hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok měl po sterilizaci pH 7,3 ± 0,2. Je-li třeba, filtruje se do vyjasnění, rozplní se do vhodných nádob a sterilizuje se validovaným postupem. Uchovává se při teplotě mezi 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, pokud není určena pro okamžité použití.

Užité půdy, ať již ty výše popsané nebo jiné, vyhovují následujícím zkouškám provedeným před zkouškou zkoušeného přípravku nebo současně s ní.

Sterilita. Vzorky živné půdy se 14 dní inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1. Není pozorován růst mikroorganismů.

Růstová zkouška aerobních a anaerobních bakterií a hub. Části vybrané půdy se naočkují malým počtem jednoho typu mikroorganismu (10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie), který je uveden v tabulce 2.6.1-1, a inkubují se za podmínek podle této tabulky nejdéle 3 dny v případě bakterií a nejdéle 5 dní v případě hub. Rody a kmeny uvedené v tabulce nejsou jediné, které lze použít; jiné mikroorganismy mohou být také vhodné.

Použije se metoda výchozí kultury (systému jednotné inokulace), takže živé mikroorganismy užité pro očkování nejsou vzdáleny o více než pět generací od původní výchozí kultury.

Půdy jsou vhodné tehdy, objeví-li se jasně viditelný časný růst mikroorganismů.

Validační zkouška

Pro každý typ mikroorganismu uvedený v tabulce 2.6.1-1 se provede zkouška, jak je popsáno dále v odstavci Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku. Užije se přesně stejná metoda s výjimkou následujících modifikací.

Membránová filtrace

Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob na membránu se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie) do poslední části sterilního promývacího roztoku.

Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku

| Živná půda | Mikroorganismus | Inkubace | | | | druh | doporučený kmen | Teplota (°C) maximální doba | | Aerobní bakterie | Pro všechny aeroby | | | | --- | --- | --- | --- | | Staphylococcus aureus | ATCC 6538P | | | | Thioglykolanová půda | CIP 53,156 | | | | NCTC 7447 | | | | | CCM 2022 | | | | | CNCTC Mau 28/58 | | | | | Bacillus subtilis | ATCC 6633 | | | | CIP 52,62 | 32,5+ 2,5 | 3 dny | | | NCIB 8054 | | | | | CCM 1999 | | | | | CNCTC Bs 8/58 | | | | | Pseudomonas aeruginosa | ATCC 9027 | | | | NCIMB 8626 | | | | | CIP 82,118 | | | | | CCM 1961 | | | | | CNCTC Ps 37/65 | | | | | Anaerobní bakterie | Pro všechny anaeroby | | | | --- | --- | --- | --- | | Clostridium sporogenes | ATCC 19404 | 32,5 ± 2,5 | 3 dny | | CIP 79,3 | | | | | CCM 4409 | | | | | CNCTC Cl 66/79 | | | | | Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu* | Houby | Pro všechny houby | | | --- | --- | --- | --- | | Candida albicans | ATCC 10231 | | | | IP 4872 | 22,5 ± 2,5 | 5 dní | | | ATCC 2091 | | | | | IP 1180,79 | | | | | CCM 8226 | | | | | CNCTC 55/79 | | | | | Aspergillus niger | ATCC 16404 | | | | CCM 8222 | | | |

*v této půdě se pomnožuje též Baccilus subtilis (ATCC 6633 nebo CIP 52,62)

Přímé očkování

Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob do živné půdy se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie).

V obou případech se provede růstová zkouška jako pozitivní kontrola. Všechny nádoby s živnou půdou se inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1 po dobu nejvýše 3 dnů pro bakterie a 5 dnů pro houby.

Dojde-li k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému srůstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, potom přípravek nemá v podmínkách zkoušky žádný protimikrobní účinek nebo takový účinek byl uspokojivě vyloučen. Zkouška na sterilitu se pak může provést bez dalších modifikací.

Nedojde-li v přítomnosti zkoušeného přípravku k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému s růstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, přípravek má protimikrobní účinek, který nebyl v podmínkách zkoušky uspokojivě vyloučen. Podmínky zkoušky se upraví tak, aby byl protimikrobní účinek odstraněn a zkouška se opakuje.

Tato validace se provádí:

• a) má-li se na sterilitu zkoušet nový přípravek,

• b) kdykoliv se změní experimentální podmínky zkoušky.

Validace se může provést současně se zkouškou na sterilitu zkoušeného přípravku, ale před hodnocením výsledku této zkoušky.

Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku

Zkouška se může provést metodou membránové filtrace nebo přímým očkováním zkoušeného přípravku do živné půdy. Vhodné negativní kontroly jsou obsaženy v každém případě. Všude tam, kde to povaha přípravku dovolí, tj. u filtrovatelných vodných, lihových nebo olejových přípravků, u přípravků mísitelných nebo rozpustných ve vodných nebo olejových rozpouštědlech, které samy v podmínkách zkoušky nemají žádný protimikrobní účinek, se použije metoda membránové filtrace.

Membránová filtrace

Použijí se membránové filtry s jmenovitou velikostí pórů nejvýše 0,45 μm, jejichž účinnost zadržet mikroorganismy byla ověřena. Filtry např. z dusičnanů celulosy se používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky, filtry z octanu celulosy se používají pro silně lihové roztoky. Pro určité přípravky, např. antibiotika, mohou být zapotřebí speciální filtry.

Dále popsaná metoda je určena pro filtry o průměru 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacího i promývacího roztoku. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil vyjmutí membránového filtru a jeho přenesení do živné půdy nebo aby bylo možné provést inkubaci po přidání živné půdy do přístroje.

Vodné roztoky. Je-li to vhodné, přenese se na membránový filtr malé množství vhodné sterilní tekutiny, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l) o pH 7,1 ± 0,2, a zfiltruje se. Tekutina může obsahovat vhodné neutralizační anebo inaktivační látky, např. v případě antibiotik.

Na membránový filtr nebo filtry se přenese obsah zkoušené nádoby nebo nádob, a je-li třeba, zředí se na asi 100 ml vybraným sterilním rozpouštědlem, v každém případě se však použije nejméně množství předepsané v tabulce 2.6.1-2 a ihned se zfiltruje. Membránový filtr se nejméně třikrát stejnou rychlostí promyje vybraným sterilním rozpouštědlem, jehož množství je stejné jako při validační zkoušce. Membránový filtr se přenese do živné půdy nebo se asepticky rozdělí na dvě stejné části a každá z nich se přenese do vhodné půdy. Užije se stejný objem půdy jako při validační zkoušce. Lze též nalít půdu na membránu v přístroji. Pokud není předepsáno jinak, inkubují se půdy určené zejména k průkazu bakterií při teplotě 32,5 °C ± 2,5 °C a půdy určené zejména k průkazu hub při 22,5 °C ± 2,5 °C a to vždy nejméně 14 dní.

Rozpustné pevné látky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky, které se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l), a dále se postupuje stejně jako u vodných roztoků za použití membránového filtru vhodného pro zvolené rozpustidlo.

Oleje a olejové roztoky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky. Oleje a olejové roztoky s dostatečně nízkou viskozitou se bez ředění filtrují přímo suchým membránovým filtrem. Viskózní oleje se mohou zředit vhodným sterilním ředidlem, jako je isopropylmyristat, u něhož je prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinky. Olej se nechá proniknout membránovým filtrem vlastní tíhou a tlak nebo sání se nastavuje postupně. Membránový filtr se promyje nejméně třikrát stejnou rychlostí asi 100 ml vhodného sterilního roztoku, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l), obsahující 1 g/l (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol nebo 10 g/l polysorbátu 80. Membránový filtr nebo filtry se přenesou do živné půdy nebo živných půd nebo naopak se k nim půda přidá, jak je uvedeno u vodných roztoků, a inkubují se při stejných teplotách po stejnou dobu.

Masti a krémy. Na každou živnou půdu se použije množství přípravku uvedené v tabulce 2.6.1-2. Masti s hydrofobním základem a emulze typu v/o se mohou ředit až na 1% koncentraci isopropylmyristatem, jak je popsáno výše, a zahřívat, pokud je to nutné, na nejvýše 40 °C. Výjimečně je lze, pokud je to nutné, zahřát až na 44 °C. Zfiltruje se tak rychle, jak je to jen možné, a postupuje se, jak je popsáno u olejů a olejových roztoků.

Přímé očkování do živných půd

Do živné půdy se dá takové množství zkoušeného přípravku, jak je předepsáno v tabulce 2.6.1-2 tak, aby objem vzorku nečinil více než 10 % objemu živné půdy, není-li předepsáno jinak.

Olejové kapaliny. Použijí se živné půdy, k nimž se přidá roztok polysorbátu 80 (10 g/l) nebo (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l) nebo jiné emulgující látky ve vhodné koncentraci, u níž bylo prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek.

Masti a krémy. Zředí se v poměru 1 : 10 vhodným emulgátorem ve sterilním rozpouštědle, např. neutrálním roztoku masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Zředěný přípravek se očkuje do živné půdy, která neobsahuje emulgující látku.

Má-li zkoušený přípravek protimikrobní účinky, provede se zkouška po neutralizaci vhodnou neutralizační látkou nebo po zředění dostatečným množstvím živné půdy. Je-li nutné použít větší objem přípravku, lze dát přednost použití koncentrované živné půdy připravené tak, aby se dosáhlo potřebného zředění. V některých případech lze koncentrovanou živnou půdu přímo přidat k přípravku v jeho obalu.

Pokud není předepsáno jinak, inkubují se naočkované půdy nejméně 14 dní při teplotách uvedených v tabulce 2.6.1-1. V průběhu inkubace se půdy několikrát prohlížejí. Půdy s olejovými přípravky se každý den opatrně protřepou. Pokud se však použije k důkazu anaerobů thioglykolanová nebo jí podobná půda, je nutno omezit třepání nebo míchání na minimum, aby byly zachovány anaerobní podmínky.

Odečítání a hodnocení výsledků

V živných půdách se v průběhu a na závěr inkubace makroskopicky zjišťuje případný růst mikrobů. Jestliže zkoušený přípravek způsobí zakalení živné půdy, takže nelze určit přítomnost nebo absenci mikrobiálního růstu vizuálně po 14 dnech od začátku inkubace, přenese se vhodná část živné půdy do nové nádobky se stejnou živnou půdou. Pokračuje se v inkubaci původního i nového vzorku nejméně 14 + 7 dní od původního očkování.

Jestliže není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu, pokud nelze jasně prokázat, že zkouška byla neplatná z důvodů, jež se nevztahují na zkoušený přípravek. Zkouška může být považována za neplatnou, je-li splněna jedna nebo více z následujících podmínek:

• a) údaje o mikrobiologické kontrole prostředí, ve kterém jsou prováděny zkoušky na sterilitu, odhalí chybu,

• b) prověření testovacího postupu užitého během předmětné zkoušky odhalí chybu,

• c) mikrobiální růst se objeví v negativních kontrolách,

• d) po identifikaci mikroorganismů izolovaných zkouškou může být růst tohoto nebo těchto druhů jednoznačně připsán chybám materiálu nebo metody užitých při provádění zkoušky na sterilitu.

Je-li zkouška prohlášena za neplatnou, opakuje se se stejným množstvím jednotek jako původní zkouška.

Jestliže při opakování zkoušky není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li při opakované zkoušce zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu.

Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita

Pokud se použije metoda membránové filtrace, zkouší se, pokud možno, celý obsah nádoby, ale nejméně množství uvedené v tabulce 2.6.1-2. Je-li třeba, zředí se asi na 100 ml vhodným sterilním roztokem, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Celkový objem filtrovaný jedním filtrem nepřesahuje 1000 ml, není-li uvedeno a schváleno jinak.

Použije-li se metoda přímého očkování do živné půdy, očkuje se množství podle tabulky 2.6.1-2. Zkoušky na bakteriální a houbovou sterilitu se provádějí se stejným vzorkem zkoušeného přípravku. Pokud objem nebo množství v jedné nádobě nestačí k provedení obou zkoušek, použije se obsah dvou nebo více nádob k naočkování různých půd.

Je-li obsah přípravku v obalu větší než 100 ml, použije se membránová metoda, není-li uvedeno a schváleno jinak

Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku

Typ přípravku	Množství v obalu	Minimální množství, které se použije pro každou půdu, není-li uvedeno a schváleno jinak
Parenterální přípravky	Tekutiny
- méně než 1 ml	celý obsah obalu polovina obalu, ale nejvýše 20 ml
- 1 ml a více
Pevé látky
- méně než 50 mg	celý obsah obalu
- více než 50 mg, ale méně než 300 mg	polovina obalu 150 mg
- 300 mg a více
Oční přípravky, ostatní neinjekční přípravky	Vodné roztoky	celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 2,5 ml
Ostatní přípravky rozpustné ve vodě nebo isopropylmyristatu	celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 0,25 g
Nerozpustné přípravky, krémy a masti, jež je nutno suspendovat nebo emulgovat	celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 0,25 g

Pokyny k použití zkoušky na sterilitu

Účel zkoušky na sterilitu, jako ostatně všech lékopisných zkoušek, je poskytnout nezávislému kontrolujícímu analytikovi prostředky k ověření, že jednotlivý materiál splňuje požadavky lékopisu. Výrobci nejsou povinni provádět takové zkoušky, ani vyloučit užití modifikací nebo alternativ popsaných metod za předpokladu, že jsou přesvědčeni o tom, že bude-li přípravek zkoušen oficiálními metodami, vyhoví požadavkům lékopisu.

Pokyny pro výrobce

Stupeň jistoty získaný uspokojivým výsledkem zkoušky na sterilitu (nepřítomnost kontaminovaných jednotek ve vzorku) a vztažený na kvalitu celé šarže, je funkcí stejnorodosti podmínek výroby a efektivnosti přijatého systému odebírání vzorků. Pro účely tohoto textu je šarže definována jako homogenní soubor těsně uzavřených obalů připravených takovým způsobem, že riziko kontaminace je stejné pro každou jednotku v tomto souboru obsaženou.

Pokud se přípravek sterilizuje v uzavřených konečných obalech, vyšší stupeň záruky než provedení zkoušky na sterilitu poskytuje sledování správného průběhu sterilizace celé šarže pomocí měření a automatického zaznamenávání hodnot biologicky opodstatněných fyzikálních parametrů. Podmínky, za kterých může být považováno za vhodné parametrické uvolnění, jsou popsány ve stati 5.1.1-Metody přípravy sterilních přípravků. Pro vyhodnocení postupu aseptické výroby může být použita metoda, při níž se tento postup napodobí za použití živných půd. Nehledě k tomu, že zkouška na sterilitu je jediná analytická metoda použitelná pro přípravky vyrobené v aseptických podmínkách, je to dále v každém případě jediná dostupná analytická metoda pro autority, které mají vzorky přípravků zkoušet na sterilitu.

Pravděpodobnost detekce mikroorganismů zkouškou na sterilitu roste s jejich počtem ve zkoušeném vzorku a kolísá podle schopnosti růstu přítomných mikroorganismů. Pravděpodobnost odhalení velmi nízkého stupně kontaminace, i když je homogenní v celé šarži, je velmi malá. Interpretace výsledků zkoušky na sterilitu se opírá o předpoklad, že obsahy všech obalů v šarži, pokud by byly zkoušeny, daly by stejný výsledek. Jelikož je zřejmé, že každý obal nemůže být zkoušen, je třeba přijmout vhodný plán odběru vzorků. Vodítko pro minimální počet jednotek doporučených ke zkoušení ve vztahu k velikosti šarže je v tabulce 2.6.1-3 a vychází z předpokladu, že přípravek byl vyroben za podmínek určených k vyloučení kontaminace. Aplikace doporučení musí brát ohled na objem přípravku v obalu, na validaci sterilizační metody a na jiné speciální zřetele týkající se sterility přípravku.

Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu

Počet jednotek v šarži	Nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu pro každou půdu (*)
Parenterální přípravky
- nejvýše 100 obalů	10 % nebo 4 obaly – podle toho, co je více
- více než 100, méně než 500 obalů	10 obalů
- více než 500 obalů	2 % nebo 20 obalů – podle toho, co je méně
Oční přípravky a ostatní neinjekční přípravky
- nejvýše 200 obalů	5 % nebo 2 obaly – podle toho, co je více
- více než 200 obalů	10 obalů
Je-li přípravek v jednodávkovém obalu, použije se tabulka pro parenterální přípravky
Nerozplněné pevné přípravky
- do 4 obalů	každý obal
- více než 4, méně než 50 obalů	20 % nebo 4 obaly – podle toho, co je více
- více než 50 obalů	2 % nebo 10 obalů – podle toho, co je více

(*) Stačí-li obsah jednoho obalu k inokulaci dvou půd, pak tento sloupec udává počet obalů potřebných pro obě půdy dohromady

2.6.2 Mykobakterie

Podstata zkoušky. Nepřítomnost mykobakterií se zjišťuje kultivací ve vhodných živných půdách.

Postup zkoušky. Je-li zkoušený vzorek kontaminován jinými mikroorganismy, než jsou mykobakterie, ošetří se vhodným dekontaminačním roztokem, jako je např. roztok acetylcysteinu s hydroxidem sodným nebo roztok laurylsíranu sodného.

Na dvě vhodné pevné půdy (za vhodnou se považuje Löwenstein-Jensenova půda a Middle-brookova 7H10 půda) se trojmo naočkuje po 0,2 ml vzorku a dále se do vhodné tekuté půdy trojmo naočkuje po 0,5 ml vzorku. Všechny půdy se inkubují 56 dnů při 37 °C.

Růstové vlastnosti živných půd v přítomnosti zkoušeného přípravku se ověří naočkováním vhodného kmene Mycobacterium tuberculosis, jako je např. BCG, a je-li třeba, použije se vhodná neutralizační látka.

Jestliže v prvních osmi dnech inkubace vyrostou kolonie kontaminujících mikroorganismů, zkouška se opakuje a zároveň se provede bakteriologická zkouška na sterilitu.

Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se na konci inkubační doby nezjistí nárůst mykobakterií v žádné zkumavce

2.6.7 Zkouška na mykoplazmata

Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro banku základních buněk, banku pracovních buněk, výchozí kulturu viru nebo kontrolní buňky, použije se metoda kultivační a metoda imunofluorescence v buněčné kultuře. Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro virovou sklizeň ve vakcíně před rozplněním nebo v šarži, použije se kultivační metoda. Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře se může také použít, je-li třeba, k ověření půd.

KULTIVAČNÍ METODA

Výběr kultivačních půd

Zkouška se provádí za použití dostatečného počtu jak pevných, tak tekutých živných půd, aby se za vybraných podmínek inkubace zajistil růst malých počtů mykoplazmat, která mohou být přítomna ve zkoušeném přípravku.

Tekuté živné půdy obsahují fenolovou červeň. Vybrané druhy živných půd mají prokazatelně dostatečné živné vlastnosti nejméně pro organismy uvedené dále. Živné vlastnosti každé nové šarže živné půdy jsou ověřovány pro příslušné organismy uvedené na seznamu.

Acholeplasma laidlawii (vakcíny pro humánní a veterinární použití, při jejichž výrobě byla použita antibiotika)

Mycoplasma gallisepticum (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)

Mycoplasma hyorhinis (neaviární veterinární vakcíny)

Mycoplasma orale (vakcíny pro humánní a veterinární užití)

Mycoplasma pneumoniae (vakcíny pro humánní užití) nebo jiný vhodný druh, fermentující glukózu

Mycoplasma synoviae (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)

Zkušební kmeny jsou izoláty z terénu, které neprošly více než patnácti subkultivacemi a jsou uchovávány zmrazené nebo v lyofilizovaném stavu.

Po klonování se kmeny identifikují jako požadované druhy vhodnou metodou, porovnáním se sbírkovými kulturami např.:

Acholeplasma laidlawii	NCTC 10116	CIP 75,27	ATCC 23206
Mycoplasma gallisepticum	NCTC 10115	CIP 104967	ATCC 19610
Mycoplasma hyorhinis	NCTC 10130	CIP 104968	ATCC 17981
Mycoplasma orale	NCTC 10112	CIP 104969	ATCC 23714
Mycoplasma pneumoniae	NCTC 10119	CIP 103766	ATCC 15531
Mycoplasma synoviae	NCTC 10124	CIP 104970	ATCC 25204

Inkubační podmínky

Naočkovaná živná půda se rozdělí na dvě stejné části a jedna část se inkubuje za aerobních a druhá část za mikroaerofílních podmínek; pevné živné půdy se udržují v atmosféře s patřičnou vlhkostí, aby se zamezilo vysychání povrchu půd. Za aerobních podmínek se inkubuje v atmosféře vzduchu s odpovídající vlhkostí a obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Za mikroaerofilních podmínek se inkubuje v dusíkové atmosféře, obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého.

Živné vlastnosti

S každou novou šarži živé půdy se provede zkouška živných vlastnosti. Vybraná živná půda se naočkuje vhodnými zkušebními mikroorganismy; použije se nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie na misku o průměru 60 mm obsahující 9 ml pevné živné půdy a nejvýše 40 jednotek vytvářejících kolonie pro 100ml nádobu s odpovídající tekutou půdou; pro každý druh organismu se použije samostatná plotna a nádoba. Živné půdy se inkubují za podmínek, které budou použity ke zkoušce zkoušeného výrobku (aerobní, mikroaerofilní nebo obojí, v závislosti na požadavcích zkušebního organismu). Půdy vyhovují zkoušce na živné vlastnosti, dojde-li k přiměřenému růstu zkušebních organismů doprovázenému příslušnou barevnou změnou v tekutých živných půdách.

Inhibiční látky

Zkouška na živné vlastnosti se provede v přítomnosti zkoušeného přípravku. Je-li růst zkušebních organismů zřetelně menší než ten, který byl zjištěn bez přítomnosti zkoušeného přípravku, přípravek obsahuje inhibiční látky, které se před provedením zkoušky na mykoplazmata neutralizují (nebo se jejich účinek vyloučí jinak např. ředěním). Účinnost neutralizace nebo jiného postupu se kontroluje opakováním zkoušky na inhibiční látky po neutralizaci.

Zkouška na mykoplazmata ve zkoušeném přípravku

Pro pevné živné půdy se použijí misky o průměru 60 mm a obsahující 9 ml půdy. Každá z nejméně dvou misek s každou pevnou půdou se naočkuje 0,2 ml zkoušeného přípravku a 100 ml každé tekuté půdy se naočkuje 10 ml zkoušeného přípravku. Inkubuje se 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek a současně se jako kontrola inkubuje nenaočkovaná dávka 100 ml každé tekuté živné půdy. Objeví-li se po přidání zkoušeného přípravku jakékoliv významné změny pH, původní hodnota pH se obnoví přidáním roztoku bud’ hydroxidu sodného, nebo kyseliny chlorovodíkové. První, druhý nebo třetí den po naočkování se vyočkuje po 0,2 ml z každé tekuté půdy na dvě misky s každou pevnou půdou a inkubuje se nejméně 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek. Postup se opakuje šestý, sedmý nebo osmý den a znovu třináctý nebo čtrnáctý den zkoušky. Tekuté živné půdy se prohlížejí každý druhý nebo třetí den, a objeví-li se změna barvy, okamžitě se přeočkují. Pevné živné půdy se prohlížejí jednou týdně.

Jestliže jsou tekuté živné půdy kontaminovány bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje. Jestliže nejdříve za sedm dní po naočkování je nejvýše jedna miska v každé části zkoušky náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo zničena, vyloučí se tato miska za předpokladu, že se při bezprostředním vyšetření neprokáže růst mykoplazmat. Pokud je v kterékoliv části v průběhu zkoušky více než jedna miska náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo rozbita, je zkouška neplatná a opakuje se.

Do zkoušky se zařadí pozitivní kontrola připravená naočkováním nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie vhodného druhu, jako M. orale a M. pneumoniae.

Na konci inkubační doby se všechny pevné naočkované půdy mikroskopicky vyšetří na přítomnost mykoplazmat.

Přípravek vyhovuje zkoušce, nezjistí-li se růst mykoplazmat v žádné z naočkovaných půd. Zjistí-li se růst mykoplazmat, zkouška se může opakovat s použitím dvojnásobného množství inokula, půd a misek. Nezjistí-li se růst mykoplazmat, přípravek vyhovuje zkoušce. Zkouška není platná, jestliže pozitivní kontrola neprokáže růst zkušebního mikroorganismu.

Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře

Buněčné kultury se obarví fluorescenčním barvivem, které se váže na DNK. Mykoplazmata se zjistí pomocí fluorescence jejich charakteristických částic nebo nitkovitých útvarů na povrchu buněk, a jestliže je kontaminace silná, i v okolním prostředí.

Ověření substrátu

Jako substrát se použije kultura buněk Vero, předem odzkoušená pomocí inokula, které neobsahuje více než 100 jednotek vytvářejících kolonie kmene rostoucího dobře v tekuté nebo pevné půdě a dokáže se schopnost metody prokázat případnou kontaminaci mykoplazmaty, např. vhodnými kmeny Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Mohou se použít různé buněčné substráty, např. produkční buněčná linie, jestliže se prokázalo, že poskytne přinejmenším stejnou citlivost pro důkaz možné kontaminace mykoplazmaty.

Zkušební metoda

Nejméně 1 ml zkoušeného přípravku se použije k dvojnásobnému naočkování, jak je popsáno v odstavci Postup zkoušky, na kulturu indikátorových buněk představující plochu nejméně 25 cm^2 souvislé buněčné kultury.

Do zkoušky se zařadí negativní (neinfikovaná) kontrola a dvě pozitivní kontroly mykoplazmat, jako např. Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Pro pozitivní kontrolu se použije k očkování inokulum, které obsahuje nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie.

Jestliže pro virové suspenze je interpretace výsledků ovlivněna zřetelnými cytopatickými efekty, může se virus neutralizovat specifickým antisérem, které nemá inhibiční účinek na mykoplazmata, nebo se použije substrát buněčné kultury, který neumožní pomnožení viru. K průkazu nepřítomnosti inhibičního účinku v séru se provedou kontrolní zkoušky v přítomnosti a v nepřítomnosti antiséra.

Postup zkoušky

• 1. Připraví se kultura v pravidelné hustotě (2 · 10^4 až 2 · 10^5 buněk v mililitru, 4 · 10^3 až 2,5 · 10^4 buněk/cm^2) a inkubuje se při 36 °C ± 1 °C nejméně dva dny. Naočkuje se zkoušený přípravek a inkubuje nejméně dva dny. Provede se nejméně jedna subkultivace. Poslední subkultura se pěstuje na krycím sklíčku ve vhodné nádobě nebo na nějakém jiném povrchu vhodném pro postup zkoušky. U poslední subkultury se nenechá dojít ke splývání nárůstu, protože by to mohlo inhibovat barvení a narušit zobrazení mykoplazmat.

• 1. Odstraní se živná půda.

• 1. Nárůst se promyje tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,4 a potom směsí stejných objemových dílů tohoto tlumivého roztoku a vhodného fixačního roztoku a nakonec fixačním roztokem. Pokud se pro barvení používá bisbenzimid R, pak je vhodným fixačním roztokem čerstvě připravená směs objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (1 +3).

• 1. Přidá se fixační roztok a nechá se 10 min stát.

• 1. Fixační roztok se odstraní.

• 1. Jestliže se nárůst bude barvit později, úplně se vysuší. Zvláštní péči potřebuje barvení na sklíčku po vysušení, protože mohou vznikat artefakty.

• 1. Jestliže se nárůst barví ihned, vymyje se fixační roztok dvakrát sterilní vodou, která se odstraní.

• 1. Přidá se bisbenzimid pracovní roztok R nebo nějaký jiný vhodný roztok barvící DNK a nechá se stát 10 min.

• 1. Odstraní se barvivo a nárůst se promyje vodou.

• 1. Každé podložní sklíčko, je-li to vhodné, se pokryje kapkou směsi stejných objemových dílů glycerolu R a tlumivého roztoku fosforečnan-citronanového o pH 5,5, přebytečná kapalina se odsaje z rohů podložního sklíčka.

• 1. Vyšetří se epifluorescencí (330 nm/380 nm excitační filtr, LP 440 nm clona) při 100 až 400 násobném zvětšení nebo větším.

• 1. Mikroskopický vzhled zkoušené kultury se porovná s negativní a pozitivní kontrolou a vyšetří na mimojadernou fluorescenci. Mykoplazmata se jeví jako body nebo vlákna v cytoplasmě a občas i v mezibuněčném prostoru.

Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže není prokázána přítomnost mykoplazmat v kulturách jím očkovaných. Zkoušku lze hodnotit, jestliže pozitivní kontroly ukážou přítomnost použitých zkušebních organismů.

Následující část se uvádí pro informaci a jeho návod, netvoří závaznou součást obecných metod.

Doporučené živné půdy pro kultivační metodu

Následující půdy se doporučují. Jiné půdy mohou být použity za předpokladu, že se u každé šarže prokáže schopnost podporovat růst mykoplazmat v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku.

I. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma gallisepticum.

• a) Tekutá půda

infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
koňské sérum (nezahřáté)	20,0 ml
roztok kvasničného výtažku (250 g/l)	10,0 ml
roztok octanu thallného (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml
roztok kyseliny deoxyribonukleové (2 g/l)	1,2 ml
pH se upraví na 7,8.

• b) Pevná půda

Připraví se stejně jako tekutá půda s tím rozdílem, že infuze z hovězího srdce obsahuje v litru 15 g agaru.

II. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma synoviae.

• a) Tekutá půda

infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
esenciální vitaminy (2)	0,025 ml
roztok glukosy monohydrátu (500 g/l)	2,0 ml
prasečí sérum (inaktivované 30 min při 56 °C)	12,0 ml
roztok β-nikotinamid-adeninu dinukleotidu (10 g/l)	1,0 ml
roztok cysteiniumchloridu (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml

Smíchají se roztoky β-nikotinamid-adeninu dinukleotidu a cystemiumchloridu a za 10 mm se přidají k ostatním složkám.

pH se upraví na 7,8.

• b) Pevná půda

infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
ionagar (3)	1,4 g
pH se upraví tak, aby bylo 7,8, sterilizuje se v autoklávu a pak se přidají:
esenciální vitaminy (2)	0,025 ml
roztok glukosy monohydrátu (500 g/l)	2,0 ml
prasečí sérum (nezahřáté)	12,0 ml
roztok B-nicotinamid-adeninu dinukleotidu (10 g/l)	1,0 ml
roztok cysteiniumchloridu (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml

III. Půdy doporučené pro důkaz neaviárních mykoplazmat.

• a) Tekutá půda

tlumivý solný roztok podle Hankse (modifikovaný) (4)	800 ml
destilovaná voda	67 ml
infuze ze srdce a mozku (5)	135 ml
PPLO tekutá půda (6)	248 ml
roztok kvasničného výtažku (170 g/l)	60 ml
bacitracin	250 mg
meticilin	250 mg
roztok červeně fenolové (5 g/l)	4,5 ml
roztok octanu thallného (56 g/l)	3 ml
koňské sérum	165 ml
prasečí sérum	165 ml
pH se upraví na 7,4 až 7,45.

• b) Pevná půda

Tlumivý solný roztok podle Hankse (modifikovaný) (4)	200 ml
DEAE - dextran	200 mg
ionagar (3)	15,65 g

Dobře se promíchá a sterilizuje v autoklávu. Ochladí se na 100 °C a přidá se do 1740 ml tekuté půdy popsané výše.

(1) Infuze z hovězího srdce

hovězí srdce (pro přípravu infuze)	500 g
pepton	10 g
chlorid sodný	5 g
destilovaná voda do	1000 ml
Sterilizuje se v autoklávu.

(2) Esenciální vitaminy

biotin	100 mg
pantotenan vápenatý	100 mg
choliniumchlorid	100 mg
kyselina listová	100 mg
i-inositol	200 mg
nikotinamid	100 mg
pyridoxoliumchlorid	100 mg
riboflavin	10 mg
thiaminiumchlorid	100 mg
destilovaná voda do	1000 ml

(3) Ionagar

Velmi čistý agar používaný pro mikrobiologii a imunologii se připravuje výměnou iontů, čímž vzniká produkt mající vyšší čistotu, čirost a pevnost gelu.

Obsahuje přibližně:

voda	12,2 %
popel	1,5 %
popel nerozpustný v kyselině	0,2 %
chloridy	0
fosforečnany (jako P2O5)	0,3 %
celkový dusík	0,3 %
měď	8 μg/g
železo	170 μg/g
vápník	0,28 %
hořčík	0,32 %

(4) Tlumivý solný roztok podle Hankse (modifikovaný)

chlorid sodný	60,4 g
chlorid draselný	0,32 g
síran hořečnatý heptahydrát	0,08 g
chlorid hořečnatý hexahydrát	0,08 g
chlorid vápenatý bezvodý	0,112 g
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	0,0596 g
dihydrogenfosforečnan draselný, bezvodý	0,048 g
destilovaná voda do	800 ml

(5) Infuze ze srdce a mozku

infuze z telecího mozku	200 g
infuze z hovězího srdce	250 g
pepton (enzymaticky připravený)	10 g
glukosa	2 g
chlorid sodný	5 g
hydrogenfosforečnan sodný, bezvodý	2,5 g
destilovaná voda do	1000 ml

(6) PPLO tekutá půda

infuze z hovězího srdce	50 g
pepton	10 g
chlorid sodný	5 g
destilovaná voda do	1000 ml
2.6.12 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků (celkový počet živých mikroorganismů)
---	---

Dále popsaná zkouška umožňuje kvantitativně spočítat mezofilní houby a bakterie, které mohou růst v aerobních podmínkách.

Zkouška je určena především ke zjištění, zda látka, která je předmětem lékopisného článku vyhovuje nebo nevyhovuje mikrobiologickým požadavkům uvedeným v tomto článku. Pokud se zkouška používá pro tyto účely, postupuje se podle následujících pokynů, včetně potřebného počtu odebraných vzorků a dále uvedené interpretace výsledků. Zkouška se může také použít ve stati Účinnost protimikrobních konzervačních látek (5.1.3), jak je popsána v lékopise. Dále se může užít pro monitorování kvality surovin a může se použít ve spojení s požadavky uvedenými ve stati Mikrobiologická jakost léčivých přípravků (5.1.4). Pokud ji výrobce použije v takových případech, jako je monitorování kvality surovin anebo konečných přípravků nebo při validaci postupu, je provedení zkoušky, včetně počtu odebraných vzorků a interpretace výsledků, záležitostí dohody mezi výrobcem a oprávněnou autoritou.

Stanovení se provádí za podmínek vylučujících nahodilé znečištění zkoušeného výrobku. Opatření vylučující znečištění mají být taková, aby nepůsobila na prokazované mikroorganismy. Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, musí být přiměřeným způsobem zneutralizovány. Používají-li se k tomuto účelu inaktivující látky, prokáže se jejich účinek a také že nejsou toxické pro mikroorganismy.

Celkový počet živých mikroorganismů se stanoví metodou membránové filtrace nebo počítáním na pevných půdách, jak je předepsáno v lékopisném článku.

Metoda nejpravděpodobnějšího počtu je vyhrazena pro stanovení počtu bakterií v případech, kdy se nedá provést žádná jiná metoda. Výběr metody může být založen na různých faktorech, jako jsou např. povaha výrobku a očekávaný počet mikroorganismů. Kterákoliv vybraná metoda se dostatečně validuje.

Ve spojení s kapitolou (5.1.3) nebo (5.1.4) se může použít metoda zalévání do agaru, metoda očkování na povrch agarové půdy nebo metoda membránové filtrace.

Příprava vzorku

Plán vzorkování. Vzorkování výrobku se provede podle dobře definovaného plánu odběru vzorků. Tento plán závisí na faktorech, jako jsou velikost šarže, zdravotní riziko spojené s nepřijatelně vysokou kontaminací přípravku, na jeho charakteru a na očekávaném stupni kontaminace. Jestliže není předepsáno jinak, použije se 10 g nebo 10 ml zkoušené látky nebo přípravku odebraných za shora uvedených podmínek. Vzorky se vyberou náhodně z nerozplněného materiálu nebo z dostupných obalů přípravku. K získání potřebného množství se smíchá, je-li třeba, obsah dostatečného počtu obalů, které postačují k vytvoření vzorku podle povahy zkoušené látky nebo přípravku.

Trojúrovňový vzorkovací plán je příkladem vzorkovacího plánu vhodného pro výrobky, kde může být homogenita problémem ve vztahu k rozložení mikroorganismů. V tom případě se z každé šarže odebere a vyzkouší odděleně pět vzorků. Tři uznané úrovně jsou: (i) přijatelné vzorky, tj. obsahující méně než m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru, kde m je limit určený v příslušném článku; (ii) kritické vzorky, tj. které obsahují více než m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru, ale méně než 10 m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru; (iii) vadné vzorky, tj. obsahující více než 10 m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru.

Výrobky rozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se rozpustí nebo zředí v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo v jiné vhodné tekutině. Obecně se připraví desetinné ředění, ale vlastnosti výrobku nebo požadovaná citlivost mohou vyžadovat použití jiných poměrů. Jestliže je známa protimikrobní účinnost výrobku, může se do rozpouštědla přidat inaktivující látka. Pokud je třeba, upraví se pH na hodnotu asi 7 a připraví se řada desetinásobných ředění za použití stejného rozpouštědla.

Nelipofilní výrobky nerozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se suspenduje v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo jiné vhodné tekutině. Obecně se připraví desetinná suspenze, ale vlastnosti některých výrobků mohou vyžadovat použití větších objemů. Je možné přidat vhodnou povrchově aktivní látku, např. polysorbát 80 (1 g/l) k usnadnění tvorby suspenze špatně smáčitelných látek. Jestliže je známa protimikrobní účinnost výrobku, může se do rozpouštědla přidat inaktivující látka. Pokud je třeba, upraví se pH na hodnotu asi 7 a připraví se řada desetinásobných ředění za použití stejného rozpouštědla.

Výrobky lipofilní. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se zhomogenizuje s nejvýše polovinou jeho hmotnosti sterilního polysorbátu 80 nebo jiné vhodné povrchově aktivní látky, kterou je možno v případě potřeby zahřát nejvýše na 40 °C, ve výjimečných případech nejvýše na 45 °C. Dobře se promíchá a udržuje se při této teplotě na vodní lázni nebo v termostatu a přidá se dostatečné množství předehřátého tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 k přípravě desetinného ředění původního výrobku. Zatímco se udržuje teplota, míchá se pečlivě co nejkratší dobu nezbytnou k vytvoření emulze, nejdéle však 30 min. Další řada desetinásobných ředění se může připravit za použití tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 obsahujícího vhodnou koncentraci sterilního polysorbátu 80 nebo jiné povrchově aktivní látky.

Zkoušení vzorku

Membránová filtrace

Použijí se membránové filtry s nominální velikostí pórů nejvýše 0,45 μm, jejichž účinnost zadržet bakterie byla ověřena. Typ materiálu filtru se vybere tak, aby účinnost filtru nebyla ovlivněna složkami zkoušeného vzorku. Filtry z dusičnanů celulosy se např. používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky a filtry z octanu celulosy se např. používají pro silně lihové roztoky. Přístroj je navržen tak, aby umožnil přenést filtr na agarovou půdu.

Vhodné množství vzorku, připraveného jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku (přednostně představující 1 g výrobku nebo méně, jestliže se očekává větší množství jednotek vytvářejících kolonie), se přenese na každý ze dvou membránových filtrů a ihned se zfiltruje. Každý filtr se promyje třemi dávkami, z nichž každou tvoří asi 100 ml vhodné tekutiny, jako např. tlumivý roztok chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. K tomuto roztoku je možné přidat povrchově aktivní látky, jako je polysorbát 80, nebo látky inaktivující protimikrobní účinky. Je-li postup validován, může se na promytí použít méně než tři dávky. Membránový filtr určený především pro počítání bakterií se přenese na povrch vhodné agarové půdy (jako je agarová půda B) a druhý, určený především pro počítání hub, na povrch vhodné půdy (jako je agarová půda C). Misky s agarem B se inkubují při 30 °C až 35 °C a misky s agarem C při 20 °C až 25 °C po dobu 5 dní, pokud se nezíská spolehlivý počet dříve. Vyberou se misky s nejvyšším počtem kolonií, který však nepřesahuje 100, a vypočítá se počet jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru výrobku.

Počítání na pevných půdách

Metoda zalévání do agaru. Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 1 ml vzorku připraveného, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku, a 15 ml až 20 ml rozehřáté agarové půdy vhodné pro kultivaci bakterií (jako např. agarová půda B) nebo rozehřáté agarové půdy vhodné pro kultivaci hub (jako např. agarová půda C). Půdy se rozehřívají při teplotě, která nepřesahuje 45 °C. Použijí-li se větší Petriho misky, zvětší se příslušně i množství agaru. S každou živnou půdou a s každým zředěním se připraví nejméně dvě Petriho misky. Plotny s půdou pro bakterie se inkubují při 30 °C až 35 °C (pro houby při 20 °C až 25 °C) po dobu 5 dní, pokud se nezíská spolehlivý počet dříve. Vyberou se misky odpovídající jednomu ředění a ukazující nejvyšší počet kolonií, který však nepřesahuje 300 (100 kolonií pro houby). Z aritmetického průměru počtů se vypočítá množství jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru.

Metoda očkování na povrch agarové půdy. Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 15 ml až 20 ml agarové půdy vhodné pro kultivaci bakterií (jako je agarová půda B) nebo agarové půdy vhodné pro kultivaci hub (jako je agarová půda C) rozehřáté asi na 45 °C a se utuhnout. Používají-li se větší Petriho misky, použije se přiměřeně větší množství živné půdy. Povrch půd se nechá zaschnout, např. ve skříni s laminárním prouděním vzduchu nebo v termostatu. Odměřený objem, nejméně však 0,1 ml vzorku připraveného jak je posáno v odstavci Příprava vzorku, se rozetře na povrch půdy. Pro každou půdu a každé ředění se použijí nejméně dvě Petriho misky. Při inkubaci a počítání jednotek vytvářejících kolonie se postupuje stejně, jak je popsáno v metodě zalévání do agaru.

Metoda nejpravděpodobnějšího počtu

Správnost a přesnost této metody (MPN) je menší než u metody membránové filtrace nebo počítání na pevných půdách. Nespolehlivé výsledky jsou získávány obzvláště při počítání plísní. Z těchto důvodů se metoda MPN používá pro počítání bakterií v případě, kdy se žádná jiná metoda nedá provést. Je-li použití této metody oprávněné, postupuje se následujícím způsobem.

Připraví se řada nejméně tří následujících desetinásobných ředění výrobku, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku. Z každého ředění se použijí tři stejné dávky (1 g nebo 1 ml) k očkování tří zkumavek s 9 ml nebo 10 ml vhodné tekuté půdy (jako je půda A). Je-li třeba, může se k půdě přidat povrchově aktivní látka, jako je polysorbát 80, nebo látka inaktivující proitimikrobní účinky. Jestliže jsou připraveny tři stupně ředění, naočkuje se devět zkumavek a všechny se 5 dnů inkubují při 30 °C až 35 °C. Pro každý stupeň ředění se zaznamenává počet zkumavek, které vykazují mikrobiální růst. Jestliže odečítání výsledků je obtížné nebo nejisté vzhledem k povaze zkoušeného výrobku, vyočkuje se do stejné půdy nebo na vhodnou pevnou půdu (jako je agarová půda B) a inkubuje se 18 h až 24 h při stejné teplotě a použijí se tyto výsledky. Nejpravděpodobnější počet bakterií v gramu nebo miligramu zkoušeného výrobku se stanoví z tabulky 2.6.12-1.

Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet bakterií

| | Tři zkumavky pro každé ředění | | | | | | | | Počet zkumavek s pozitivním růstem | Nejpravděpodobnější počet v 1 g | Kategorie* | 95% meze spolehlivosti | | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 0,1 g | 0,01 g | 0,001 g | | 1 | 2 | | | | 0 | 0 | 0 | < 3 | | | - | - | | 0 | 1 | 0 | 3 | | x | < 1 | 17 | | 1 | 0 | 0 | 3 | x | | 1 | 21 | | 1 | 0 | 1 | 7 | | x | 2 | 27 | | 1 | 1 | 0 | 7 | x | | 2 | 28 | | 1 | 2 | 0 | 11 | | x | 4 | 35 | | 2 | 0 | 0 | 9 | x | | 2 | 38 | | 2 | 0 | 1 | 14 | | x | 5 | 48 | | 2 | 1 | 0 | 15 | x | | 5 | 50 | | 2 | 1 | 1 | 20 | | x | 8 | 61 | | 2 | 2 | 0 | 21 | x | | 8 | 63 | | 3 | 0 | 0 | 23 | x | | 7 | 129 | | 3 | 0 | 1 | 38 | x | | 10 | 180 | | 3 | 1 | 0 | 43 | x | | 20 | 210 | | 3 | 1 | 1 | 75 | x | | 20 | 280 | | 3 | 2 | 0 | 93 | x | | 30 | 390 | | 3 | 2 | 1 | 150 | x | | 50 | 510 | | 3 | 2 | 2 | 210 | | x | 80 | 640 | | 3 | 3 | 0 | 240 | x | | 100 | 1400 | | 3 | 3 | 1 | 460 | x | | 200 | 2400 | | 3 | 3 | 2 | 1100 | x | | 300 | 4800 | | 3 | 3 | 3 | > 1100 | | | - | - |

• Kategorie 1: normální výsledky obdržené v 95 % případů. Kategorie 2: méně pravděpodobné výsledky obdržené pouze ve 4 % případů. Tyto se nemohou použít pro důležitá rozhodnutí. Výsledky, které jsou ještě menší než tyto v kategorii 2, nejsou uvedeny a jsou vždy nepřijatelné.

Účinnost kultivační půdy a validita metod na stanovení počtu

Bakteriální kmeny se 18 h až 24 h kultivují odděleně v nádobách obsahujících vhodnou tekutou půdu (jako je půda A) při 30 °C až 35 °C. Kmeny hub se kultivují odděleně na vhodné agarové půdě (jako je půda C bez antibiotik) při 20 °C až 25 °C 48 h (Candida albicans) nebo 7 dní (Aspergillus niger).

Staphylococcus aureus	ATCC 6538 (NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Escherichia coli	ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Bacillus subtilis	ATCC 6633 (NCIB 8054, CIP 52.62, CCM 1999, CNCTC Bs 8/58)
Candida albicans	ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91)
Aspergillus niger	ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83, CCM 8222)

K přípravě referenční suspenze obsahující asi 100 jednotek vytvářejících kolonie se použije tlumivý roztok chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. Suspenze každého z mikroorganismů se použije samostatně jako u metod na stanovení počtu, v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pokud se zkouška provádí pomocí membránové filtrace nebo počítáním na pevných půdách, počty kolonií všech zkoušených mikroorganismů by se neměly lišit od hodnot vypočítaných z inokula o více než faktor 5. Pokud se zkouška provádí metodou nejpravděpodobnějšího počtu, pak vypočítaný výsledek je v 95% mezích spolehlivosti. Pro zkoušku sterility agarové půdy a ředícího roztoku a aseptického provedení zkoušky se místo zkoušeného přípravku použije sterilní roztok chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. Nesmí se objevit růst mikroorganismů.

Interpretace výsledků

Za celkový počet bakterií se považuje průměrný počet jednotek vytvářejících kolonie nalezený na agarové půdě B. Za celkový počet hub se považuje průměrný počet jednotek vytvářejících kolonie nalezený na agarové půdě C. Celkový počet živých mikroorganismů je součet počtu bakterií a hub. Jestliže je prokázáno, že stejné typy mikroorganismů rostou na obou agarových půdách, může se provést oprava. Jestliže se použila metoda nejpravděpodobnějšího počtu, tak vypočítaná hodnota je počet bakterií.

Je-li v článku uveden limit počtu mikroorganismů, interpretuje se takto:

10^2 mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 x 10^2,

10^3 mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 x 10^3, atd.

Jestliže je např. použit trojúrovňový vzorkovací plán, postupuje se následovně:

Pro každý z pěti vzorků se spočítá samostatně celkový počet živých mikroorganismů. Látka nebo přípravek vyhovují zkoušce, jestliže jsou splněny následující podmínky: (i) žádný z jednotlivých výsledků celkového počtu živých mikroorganismů nepřesahuje desetinásobek předepsaného limitu (tj. žádné nepřijatelné vzorky) a (ii) nejvýše dva z jednotlivých výsledků celkového počtu živých mikroorganismů jsou mezi předepsaným limitem a desetinásobkem tohoto limitu (tj. nejvýše dva kritické vzorky).

Doporučené roztoky a agarové půdy jsou popsány v kapitole (2.6.13).

2.6.13 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků (zkoušky na specifické mikroorganismy)

V těchto obecných metodách se předpokládá použití určitých selektivních půd. Vlastností společnou pro všechny selektivní půdy je, že subletálně poškozené mikroorganismy nejsou zachyceny. Jelikož subletálně poškozené mikroorganismy jsou důležité pro kvalitu výrobku, jejich oživení musí být zahrnuto do zkušebních postupů, které používají selektivní půdy.

Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, neutralizují se tyto účinky odpovídajícím způsobem.

Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie

Přestože zkouška byla určena pro zjištění bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae, je známo, že mohou být nalezeny i jiné typy mikroorganismů (např. Aeromonas, Pseudomonas).

Důkaz. Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda D. Zhomogenizuje se a inkubuje při 35 °C až 37 °C po dobu postačující k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení (obvykle 2 h, ale nejvýše 5 h). Obal se protřepe a obsah homogenizátu A odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku se kvantitativně přenese do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misky s agarovou půdou F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže na žádné misce nevyrostou kolonie gramnegativních bakterií.

Kvantitativní stanovení. Do vhodných množství obohacené tekuté půdy E se přidají z homogenizátu A a/nebo z jeho ředění množství odpovídající 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g nebo 0,1 ml, 0,01 ml a 0,001 ml zkoušeného výrobku. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Z každé kultury se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F. Inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Růst dobře vyvinutých, červených nebo načervenalých kolonií gramnegativních bakterií se hodnotí jako pozitivní výsledek. Zaznamená se nejmenší množství zkoušeného výrobku, které dává pozitivní výsledek a největší množství zkoušeného výrobku, které dává negativní výsledek.

Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.

Tab. 2.6.13-1

| Výsledky pro množství přípravku | Pravděpodobný počet bakterií v 1 g přípravku | | | | 0,1 g nebo 0,1 ml | 0,01 g nebo 0,01 ml | 0,001 g nebo 0,001 ml | | | --- | --- | --- | --- | | + | + | + | více než 103 | | + | + | - | méně než 103 a více než 102 | | + | - | - | méně než 102 a více než 10 | | - | - | - | méně než 10 |

Escherichia coli

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Obsah nádoby se protřepe a množství odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku se přenese do 100 ml půdy G a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Vyočkuje se na agarovu půdu H a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst červených, nemukózních kolonií gramnegativních tyčinek indikuje možnou přítomnost Escherichia coli. Ta se potvrdí vhodnými biochemickými zkouškami, jako je tvorba indolu. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné takovéto kolonie nejsou pozorovány nebo když jsou potvrzující biochemické zkoušky negativní.

Salmonella

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale použije se místo tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 tekutá půda A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. 1 ml obohacené kultury se přenese do 10 ml tekuté půdy I a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Potom se vyočkuje na nejméně dvě různé pevné půdy vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Pravděpodobná přítomnost salmonel je indikována růstem kolonií tohoto vzhledu:

- na půdě J:	dobře rozvinuté bezbarvé kolonie,
- na půdě K:	dobře rozvinuté červené kolonie s černým středem nebo bez něho,
- na půdě L:	malé průsvitné bezbarvé nebo růžové až matně bílé kolonie, často obklopené růžovou nebo červenou zónou.

K potvrzení nálezu se samostatně naočkuje několik podezřelých kolonií na povrch a vpichem do agarové půdy M. Přítomnost salmonel je předběžně potvrzena, jestliže uvnitř půdy, ale nikoliv na jejím povrchu, dojde ke změně barvy z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu. Tvoří se nebo též netvoří sirovodík. Potvrzení se může zpřesnit vhodnými biochemickými a sérologickými zkouškami. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se nenajdou kolonie popsaného typu nebo jestliže jsou potvrzující biochemické a sérologické zkoušky negativní.

Pseudomonas aeruginosa

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misku s agarovou půdou N a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Není-li zjištěn růst mikroorganismů, výrobek vyhovuje. Jestliže se objeví růst gramnegativních tyčinek, vhodné množství z morfologicky odlišných izolovaných kolonií se přenese do tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže při 41 °C až 43 °C není pozorován žádný růst.

Staphylococcus aureus

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Vyočkuje se na misku s agarovou půdou O a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Černé kolonie grampozitivních koků obklopené jasnou zónou indikují přítomnost S. aureus. Výsledek je možno potvrdit vhodnými biochemickými zkouškami, jako jsou koagulasová a deoxyribonukleasová zkouška. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se na agarové půdě O neobjeví popsaný typ kolonií nebo jestliže jsou ověřovací biochemické zkoušky negativní.

Růstové a selektivní vlastnosti půd a validace zkoušky

Dále uvedené zkoušky se provedou nejméně u každé šarže dehydrované tekuté půdy.

Postupuje se následujícím způsobem. Dále uvedené zkušební kmeny se 18 h až 24 h kultivují samostatně ve zkumavkách obsahujících vhodné tekuté půdy při 30 °C až 35 °C:

Staphylococcus aureus	např. ATCC 6538 (NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58): tekutá půda A,
Pseudomonas aeruginosa	např. ATCC 9027 (NCIB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65): tekutá půda A,
Escherichia coli	např. ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517): tekutá půda A,
Salmonella typhimurium	nedoporučuje se žádný určitý kmen (může se použít nějaká pro člověka nepatogenní salmonela, např. Salmonella abony (NCTC 6017, CIP 80.39, CCM 4518): tekutá půda A.

Část roztoku každé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 tak, aby suspenze obsahovala asi 1000 živých mikroorganismů v 1 ml. Smíchají se stejné díly od všech suspenzí a použije se 0,4 ml (přibližně 100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na S. aureus, Ps. aeruginosa, E. coli a na Salmonelly, a to za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pro všechny mikroorganismy se má dosáhnout pozitivního výsledku.

Klostridie

Dále popsané zkoušky jsou určeny pro vymezené účely. První metoda je určena pro výrobky, u nichž je nezbytné vyloučit přítomnost patogenních klostridií a které je proto nutno zkoušet na jejich nepřítomnost. Tyto výrobky mají obecně nízký celkový počet mikroorganismů. Druhá metoda je semikvantitativním stanovením Clostridium perfringens a je určena pro přípravky, kde množství tohoto druhuje kritériem jejich kvality.

• 1. Zkouška na klostridie. Zkoušený výrobek se zpracuje tak, jak je popsáno v obecné metodě (2.6.12). Připraví se dvě stejné dávky odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku. Jedna dávka se zahřívá 10 min na 80 °C a potom se rychle ochladí. Po protřepání se z ní naočkuje 10 ml do zkumavky (38 mm x 200 mm) nebo do jiné vhodné nádoby obsahující 100 ml živné půdy P. Druhá dávka se nezahřívá a naočkuje se stejným způsobem do druhé zkumavky. Obě zkumavky se inkubují za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se obě zkumavky vyočkují na tekutou půdu Q, do níž byl přidán gentamicin a inkubují se opět 48 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže není pozorován růst mikroorganismů.

Je-li pozorován růst, přeočkuje se každá odlišná kolonie na tekutou půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se ža aerobních a anaerobních podmínek. Dojde-li jenom k anaerobnímu růstu grampozitivních tyčinek (s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí, indikuje to přítomnost rodu Clostridium. Je-li to nutné, porovná se růst kolonií na obou plotnách a použije se katalasová zkouška k vyloučení aerobních a fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus, které dávají pozitivní katalasovou reakci. Tato zkouška může být provedena na rozlišení stejných kolonií na agarové půdě nebo nepřímo po přenesení kolonie na podložní sklíčko přidáním kapky peroxidu vodíku zředěného RS. Tvorba bublinek plynu indikuje pozitivní katalasovou reakci.

• 1. Stanovení počtu Clostridium perfringens

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a připraví se ještě stonásobné a tisícinásobné zředění v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. Stanoví se nejpravděpodobnější počet bakterií, jak je uvedeno při stanovení celkového počtu živých aerobních mikroorganismů (2.6.12) za použití živné půdy R ve zkumavce nebo v jiné vhodné nádobě s malou Durhamovou zkumavkou. Opatrně se promíchá a inkubuje se 24 h až 48 h při 45,5 °C až 46,5 °C. Zkumavky, které zčernají od sirníku železitého a v nichž je Durhamova zkumavka naplněna plynem (nejméně v jedné desetině objemu), indikují přítomnost Clostridium perfringens. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se odečte z tabulky 2.6.12-1.

Ke kontrole se použijí tyto kmeny:

pro 1. metodu: Clostridium sporogenes, např.	ATCC 19404 (NCTC 532, CIP 79.3, CCM 4409, CNCTC Cl 66/79),
pro 2. metodu: Clostridium perfringens, např.	ATCC 13124 (NCIB 6125, NCTC 8237, CIP 103 409, CCM 4435, CNCTC Cl 68/83).

Je-li to nutné, použije se Clostridium sporogenes ke kontrole selektivity a anaerobních podmínek.

Následující část se uvádí pro informaci a jako návod, netvoří závaznou část lékopisu.

Doporučené živné půdy a roztoky

Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Jiné půdy mohou být použity, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, které se mají zjišťovat.

Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

Dihydrogenfosforečnan draselný	3,6 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,2 g
Chlorid sodný	4,3 g
Pepton (z masa nebo kaseinu)	1,0 g
Voda	1000 ml

Mohou se přidat povrchově aktivní látky nebo látky inaktivující protimikrobní účinek, jako např.:

Polysorbát 80	1 g/l až 10 g/l.

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
Papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
Glukosa monohydrát	2,5 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 mm v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
Papainový hydrolyzát sóji	5,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Agar	15,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)

Pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
Glukosa monohydrát	40,0 g
Agar	15,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 mm v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku, nebo se přidá 50 mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.

Tekutá půda D (laktosová půda)

Masový výtažek	3,0 g
Pankreatický hydrolyzát želatiny	5,0 g
Laktosa monohydrát	5,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.

Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	10,0 g
Glukosa monohydrát	5,0 g
Sušená hovězí žluč	20,0 g
Dihydrogenfosforečnan draselný	2,0 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	8,0 g
Zeleň brilantní	15 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.

Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, violetí krystalovou a červení neutrální)

Kvasničný výtažek	3,0 g
Pankreatický hydrolyzát želatiny	7,0 g
Žlučové soli	1,5 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Glukosa monohydrát	10,0 g
Agar	15,0 g
Červeň neutrální	30 mg
Violeť krystalová	2 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.

Tekutá půda G (MacConkeyova půda)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sušená hovězí žluč	5,0 g
Červeň bromkresolová	10 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda H (MacConkeyův agar)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	17,0 g
Pepton (z masa a kaseinu)	3,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Žlučové soli	1,5 g
Agar	13,5 g
Červeň neutrální	30 mg
Violeť krystalová	1 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a zelení brilantní)

Pepton	8,6 g
Sušená hovězí žluč	8,0 g
Chlorid sodný	6,4 g
Uhličitan vápenatý	20,0 g
Tetrathionan draselný	20,0 g
Zeleň brilantní	70 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.

Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)

Masový výtažek	10,0 g
Pepton z masa	10,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Citronan sodný	20,0 g
Citronan železitý	1,0 g
Deoxycholan sodný	5,0 g
Agar	13,5 g
Červeň neutrální	20 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Povaří se 1 min, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda K (deoxycbolanový agar s xylosou a lysinem)

Xylosa	3,5 g
L-lysin	5,0 g
Laktosa monohydrát	7,5 g
Sacharosa	7,5 g
Chlorid sodný	5,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Červeň fenolová	80 mg
Agar	13,5 g
Desoxycholan sodný	2,5 g
Thiosíran sodný	6,8 g
Citronan amonno-železitý	0,8 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda L (agar se zelení brilantní, červení fenolovou, laktosou a sacharosou)

Pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sacharosa	10,0 g
Agar	20,0 g
Červeň fenolová	80 mg
Zeleň brilantní	12,5 mg
Voda	1000 ml

Povaří se 1 min. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.

Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)

Masový výtažek	3,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Pepton (z masa a kaseinu)	20,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sacharosa	10,0 g
Glukosa monohydrát	1,0 g
Citronan amonno-železitý	0,3 g
Thiosíran sodný	0,3 g
Červeň fenolová	25 mg
Agar	12,0 g
Voda	1000 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.

Agarová půda N (cetrimidový agar)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
Chlorid hořečnatý	1,4 g
Síran draselný	10,0 g
Cetrimid	0,3 g
Agar	13,6 g
Voda	1000 ml
Glycerol	10,0 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
Masový výtažek	5,0 g
Kvasničný výtažek	1,0 g
Chlorid lithný	5,0 g
Agar	20,0 g
Glycin	12,0 g
Pyruvan sodný	10,0 g
Voda	950 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 45 °C až 50 °C a přidá se 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.

Živná půda P (obohacená půda pro klostridia)

Masový výtažek	10,0 g
Pepton	10,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Rozpustný škrob	1,0 g
Glukosa, monohydrát	5,0 g
Cysteiniumchlorid	0,5 g
Chlorid sodný	5,0 g
Octan sodný	3,0 g
Agar	0,5 g
Voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Půda Q (Columbia agar)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
Peptický hydrolyzát masa	5,0 g
Pankreatický hydrolyzát srdce	3,0 g
Kvasničný výtažek	5,0 g
Kukuřičný škrob	1,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Agar podle schopnosti tvořit gel	10,0 až 15,0 g
Voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.

Půda R (laktoso-siřičitanová půda)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	5,0 g
Kvasničný výtažek	2,5 g
Chlorid sodný	2,5 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Cysteiniumchlorid	0,3 g
Voda	1000 ml

Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ± 0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu železito-amonného (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).

Neutralizační činidla

Neutralizační činidla se mohou použít k neutralizaci protimikrobních účinků. Mohou se přidat k tlumivému roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 přednostně před sterilizací. Jestliže se použijí, prokáže se jejich účinnost a že nejsou pro mikroorganismy toxické.

Typický neutralizační roztok má následující složení:

Polysorbát 80	30 g
Lecitin vaječný	3 g
Histidin hydrochlorid	1 g
Pepton (z masa nebo kaseinu)	1 g
Chlorid sodný	4,3 g
Dihydrogenfosforečnan draselný	3,6 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,2 g
Voda	1000 ml

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Pokud má roztok nedostatečnou neutralizační schopnost, může se zvýšit množství polysorbátu 80 nebo lecitinu. Jako alternativa se mohou přidat inaktivující látky uvedené v tabulce 2.6.13-2.

Tab. 2.6.13-2 Látky inaktivující protimikrobní účinky, které se mohou přidat k tlumivému roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0

Druh protimikrobní látky	Inaktivující látka	Koncentrace	Poznámka
Fenoly	Laurylsulfat sodný Polysorbát 80 a lecitin Vaječný žloutek	4 g/l 30 g/l a 3 g/l 5 ml/l až 50 ml/l	Přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0
Organické sloučeniny rtuti	Thioglykolat sodný	0,5 g/l až 5 g/l
Halogeny	Thiosíran sodný	5 g/l
Kvartérní amoniové sloučeniny	Vaječný žloutek	5 ml/laž 50 ml/l	Přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0
2.6.14 Bakteriální endotoxiny
---	---

Pět metod uvedených v tomto článku je určeno ke zjištění, zda koncentrace endotoxinu v přípravku, který má v lékopise článek obsahující limit pro bakteriální endotoxiny, vyhovuje tomuto limitu. Výrobci, kteří mají v úmyslu se přesvědčit, zda-li např. jejich výrobní postupy snižují koncentraci endotoxinu v přípravku během výroby, nejsou vázáni postupy uvedenými v tomto článku.

Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny se používá lyzát z amebocytů ostrorepa, Limulus polyphemus (LAL test). Po přidání roztoku s obsahem endotoxinů k roztoku lyzátu vzniká ve směsi zákal, sraženina nebo gel. Rychlost reakce závisí na koncentraci endotoxinu, hodnotě pH a teplotě. K reakci je nutná přítomnost určitých dvojmocných kationtů, enzymatický komplex podporující srážení a srážlivý protein, které jsou obsaženy v lyzátu. Štěpení chromogenního peptidu v roztoku lyzátu po aktivaci endotoxiny obsaženými v roztoku lze též použít ke stanovení koncentrace endotoxinů z koncentrace uvolněného barviva.

V této kapitole je popsáno pět následujících metod:

Metoda A. Gelová metoda: limitní zkouška

Metoda B. Semikvantitativní gelová metoda

Metoda C. Turbidimetrická kinetická metoda

Metoda D. Chromogenní peptidová kinetická metoda

Metoda E. Chromogenní peptidová metoda konečného bodu

Jestliže je v článku uvedena zkouška na endotoxiny bez uvedení metody, provede se zkoušení gelovou metodou A, která byla pro přípravek validována. Jinak se zkouška provádí metodou validovanou pro přípravek a uvedenou v článku.

V článcích jsou uvedeny požadavky na bakteriální endotoxiny jako limitní koncentrace endotoxinu; přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže neobsahuje více endotoxinu, než je limitní koncentrace. Splnění tohoto požadavku může být ale doloženo jedině důkazem, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu.

Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje mikrobiální kontaminaci.

Před provedením zkoušky na endotoxiny na zkoušeném přípravku je nutno ověřit:

• zda použité zařízení neadsorbuje endotoxiny,

• hodnotu lambda (λ) použitého lyzátu. Lambda je definována jako deklarovaná citlivost lyzátu uvedená na obalu (gelová metoda) nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standardní křivky (kvantitativní metoda),

• nepřítomnost interferujících faktorů.

Je-li třeba, očistí se laboratorní zařízení od endotoxinů.

Není-li v článku pro přípravek, který je analyzován, uvedeno jinak, uplatňují se u všech pěti metod stejné požadavky popsané pro metodu A až metodu E.

V této stati jsou označením zkumavka míněny všechny druhy nádob, včetně jamek mikrotitrační destičky.

Ve zkoušce se používá tento referenční přípravek a tato zkoumadla.

Referenční endotoxin BRP. Je kalibrován v mezinárodních jednotkách (m.j.) porovnáním s mezinárodním standardem.

Lyzát z amebocytů limula. Je vyroben podle požadavků odpovědné autority země výrobce. Lyzát se rozpustí podle návodu. U každé šarže se ověří deklarovaná citlivost (λ,); ta je uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Voda pro LAL. Voda má požadovanou jakost, jestliže dává negativní výsledek v podmínkách předepsaných pro zkoušku na endotoxiny ve zkoušeném přípravku. Je možno ji připravit trojnásobnou destilací vody na přístroji vybaveném účinným zařízením, které zabraňuje hromadění kapek, nebo jinými prostředky dávajícími vodu požadované jakosti.

Kyselina chlorovodíková pro LAL 0,1 mol/l a hydroxid sodný pro LAL 0,1 mol/l. Připravují se z kyseliny chlorovodíkové R a hydroxidu sodného R a vody pro LAL. Obě látky jsou vhodné pro zkoušku, jestliže po úpravě pH na 6,0 až 8,0 dávají v podmínkách zkoušky negativní výsledek.

Není-li uvedeno jinak, ve zkoušce se pro přípravu roztoků a ředění použije voda pro LAL.

Gelové metody

Metody A a B jsou založeny na tvorbě pevného gelu v roztoku obsahujícím bakteriální endotoxiny po smíchání a inkubaci s lyzátem. U obou metod je požadováno ověřit citlivost lyzátu udanou výrobcem podle postupu uvedeného v části Citlivost lyzátu a prokázat nepřítomnost interferujících faktorů podle postupu uvedeného v části Interferující faktory.

Metody A a B se odlišují v tom, že metoda A ověřuje, zda oba vzorky zkoušeného přípravku obsahují méně endotoxinu, než je limit koncentrace endotoxinu uvedený v odpovídajícím článku, zatímco v metodě B se koncentrace endotoxinu ve zkoušeném přípravku stanoví semikvantitativně a geometrický průměr ve zkoušeném přípravku koncentrace endotoxinu je nižší, než je limit koncentrace endotoxinu uvedený v lékopisném článku.

Následující části: Postup, Citlivost lyzátu a Interferující faktory se používají u obou metod A a B.

Postup. Odpovídající objem lyzátu se nakape do všech zkumavek nebo jiných vhodných nádob (např. podložní sklo) vyhřátých na teplotu 37 °C ± 1 °C. V dostatečně dlouhých intervalech umožňujících odečtení jednotlivých výsledků se k jednotlivým lyzátům přidá stejný objem zkoušeného roztoku a ihned se opatrně smíchá s lyzátem. Reakční směs se za vyloučení vibrací a odpařování vody inkubuje po konstantní dobu, která byla stanovena experimentálně (obvykle 20 min až 60 min) a poté se odečtou výsledky. Jako pozitivní reakce se hodnotí tvorba pevného gelu, který se neporuší při opatrném převrácení nádoby. Výsledek je negativní, jestliže se takový gel nevytvoří.

Citlivost lyzátu. Připraví se nejméně čtyři sériová dvojnásobná ředění referenčního endotoxinu BRP tak, aby v jednotlivých ředěních byla dosažena koncentrace 2 λ, λ, 0,5 λ a 0,25 λ, kde λ je deklarovaná citlivost použitého lyzátu. Alespoň poslední ředění každé série dává negativní výsledek. Postupem uvedeným v části Postup zkoušky se zkouší všechna ředění a negativní kontrolní roztok, kterým je voda pro LAL. Vypočítá se průměr logaritmů nejnižší koncentrace endotoxinu, u které byla v každé sérii ředění zjištěna pozitivní reakce. Antilogaritmus tohoto průměru vyjadřuje citlivost lyzátu. Pokud se její hodnota neliší více než dvojnásobně od hodnoty deklarované, je uvedená citlivost potvrzena a používá se ve všech zkouškách prováděných s tímto lyzátem.

Interferující faktory. pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla mívá pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem. Postupuje se stejně, jak je popsáno v části Citlivost lyzátu, ale připraví se ředění referenčního endotoxinu BRP v neošetřených vzorcích zkoušeného přípravku, ve kterých již není endotoxin zjistitelný. Tyto vzorky se použijí ve zředění nepřesahujícím nejvyšší účinné ředění (MVD), které se vypočítá ze vzorce:

MVD=limitní koncentrace endotoxinucitlivost lyzátu,

kde jsou obě hodnoty vyjádřeny v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Jestliže je limitní koncentrace endotoxinu v jednotlivém lékopisném článku uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v miligramu přípravku nebo v mezinárodní jednotce přípravku, vynásobí se limit endotoxinu koncentrací přípravku ve zkoušeném roztoku (v miligramech v mililitru nebo v mezinárodních jednotkách zkoušeného přípravku v mililitru), aby se získala limitní koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru zkoušeného přípravku. Výše popsaný postup násobení se použije u roztoků přípravků připravených rozpuštěním podle návodu uvedeného na obalu.

Jestliže se citlivost lyzátu stanovená v přítomnosti zkoušeného přípravku neliší více než dvojnásobně od citlivosti stanovené bez přítomnosti zkoušeného přípravku, pak přípravek neobsahuje faktory, které interferují v experimentálních podmínkách, a může se zkoušet bez dalších úprav. V opačném případě, kdy zkoušený přípravek působí inhibici nebo aktivaci, se interferující faktory odstraní vhodným způsobem, jako je ředění, filtrace, neutralizace, dialýza nebo přidání látek schopných uvolnit adsorbované endotoxiny. Použití citlivějšího lyzátu umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a usnadňuje tak odstranění interference.

Jestliže zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce v ředění nižším, než je MVD, zkouška se opakuje za použití MVD.