Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění vyhlášky č. 296/1999 Sb

	Nulová dávka	Standard S (v m.j./ml)	Přípravek T (v m.j./ml)
koncentrace	B	S1	S2	S3	T1	T2	T3
		0,01	0,02	0,03	,01	0,02	0,03
	0,022	0,133	0,215	0,299	0,120	0,188	0,254
	0,024	0,133	0,215	0,299	0,119	0,188	0,253
	0,024	0,131	0,216	0,299	0,118	0,190	0,255
	0,026	0,136	0,218	0,297	0,120	0,190	0,258
	0,023	0,137	0,220	0,297	0,120	0,190	0,257
	0,022	0,136	0,220	0,305	0,121	0,191	0,257
	0,022	0,138	0,219	0,299	0,121	0,191	0,255
	0,023	0,137	0,218	0,302	0,121	0,190	0,254
průměr	0,0235	0,1351	0,2176	0,2996	0,1200	0,1898	0,2554

[image omitted]

Obr. 5.2.1-I

Grafické zobrazení výsledků potvrzuje vizuálně, že závislost odpovědi na dávce skutečně není pro nízké dávky lineární. Odpověď na nulovou dávku nebude tedy použita pro výpočet (ke zdůvodnění tohoto rozhodnutí bude zapotřebí další zkoušky). Vzorce z tabulek 3.3.3-I a 3.3.3-II jsou:

PS = 0,6524	PT = 0,5651
LS = 1,4693	LT = 1,2656
aS = 0,318	aT = 0,318
bS = 0,329	bT = 0,217
GS = 0,1554	GT = 0,1156
JS = 4,17 × 10-8	JT = 2,84 × 10-6
a
H1 = 0,09524	a’ = 0,05298	K = 1,9764

Analýza rozptylu je v tabulkách 5.2.1-II, 3.3.3.1-III a 3.3.3.1-IV.

Tab. 5.2.1-II AnaIýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F-statistika	Pravděpodobnost
regrese	2	0,1917	0,0958	24 850	0,000
průsečík	1	3×10-9	3×10-9	7×10-9	0,978
nelinearita	2	2×10-5	1×10-5	2,984	0,061
ošetření	5	0,1917
reziduální chyba	42	1,92×10-4	3,86×10-6
celkem	47	0,1919

Byla tedy prokázána statisticky velmi významná závislost odpovědi na dávce, na rozdíl od statisticky nevýznamné odchylky od předpokladu linearity a společného průsečíku. Může být tedy vypočten odhad účinnosti.

Sklon standardu je b´S=6×1,469-36×0,053084=0,0822.

Sklon skušebného přípravku je b´T=6×1,266-36×0,053084=0,0677.

Dosazením do vzorce 3.3.5.1-3 se získá R=0,06770,0822=0,823.

C=0,082220,08222-3,86×10-6×2,0182×0,0357=1,000083.

K’ = 0,000083 × 0,75 = 0,000062

a 95% interval je 0,823±0,000083×1,678+0,000062×-1,646=0,823±0,006.

Odhadovaná relativní účinnost je tedy 0,823 s 95% mezemi spolehlivosti od 0,817 do 0,829.

• 5.2.2 Úplně znáhodněný plán (0,4,4,4)

Zkouška in vitro chřipkové vakcíny

U dvou chřipkových vakcín je zjišťován obsah haemaglutininového antigenu (HA) pomocí jednoduché radiální imunodifuse. Oba přípravky mají deklarovanou účinnost 15 μg HA na dávku, což je ekvivalentní 30 μg HA/ml. Standard má referenční účinnost 39 μg HA/ml.

Standard a zkoušený přípravek byly připraveny ve čtyřech koncentracích po dvou opakováních připravených na základě referenční a deklarované účinnosti. Po ustálení reakcí byla změřena zóna prstence sraženiny. Výsledky jsou zobrazeny v tabulce 5.2.2-I.

Tabulka 5.2.2-I Zóny srážení (mm^2)

| Koncentrace (μg/ml) | Standard S | Přípravek T | Přípravek U | | | | | I | II | I | II | I | II | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 7,5 | 18,0 | 18,0 | 15,1 | 16,8 | 15,4 | 15,7 | | 15,0 | 22,8 | 24,5 | 23,1 | 24,2 | 20,2 | 18,6 | | 22,5 | 30,4 | 30,4 | 28,9 | 27,4 | 24,2 | 23,1 | | 30,0 | 35,7 | 36,6 | 34,4 | 37,8 | 27,4 | 27,0 |

[image omitted]

Obr. 5.2.2-I

Grafické zobrazení výsledků nenaznačuje žádnou neobvyklost. Výsledky vzorců z tabulek 3.3.3-I a 3.3.3-II dávají tyto výsledky:

PS = 108,2	PT = 103,85	PU = 85,8
LS = 301,1	LT = 292,1	LU = 234,1
aS = 141,0	aT = 116,7	aU = 139,8
bS = 61,2	bT = 64,95	bU = 39,2
GS = 3114,3	GT = 2909,4	GU = 1917,3
	JT = 2,227	JU = 0,083
a
HI = 0,0093	a’ = 11,04	K = 14 785,8

a dále se vypočte analýza rozptylu, viz tabulka 5.2.2-II, za použití vzorců z tabulek 3.3.3.1-III a 3.3.3.1-IV.

Tabulka 5.2.2.-II Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný tverec	F-statistika	Pravděpodobnost
regrese	3	1087,7	362,6	339,5	0,000
průsečík	2	3,474	1,737	1,626	0,237
nelinearita	6	5,066	0,844	0,791	0,594
ošetření	11	1096,2
reziduální chyba	12	12,815	1,068
celkem	23	1109,0

Byla tedy prokázána statisticky velmi významná závislost odpovědi na dávce, na rozdíl od statisticky nevýznamné odchylky od předpokladu linearity a společného průsečíku. Může být tedy vypočten odhad účinnosti

Sklon standardu je b´S=6×301,1-60×11,04180=6,3565.

Sklon přípravku T je b´T=6×292,1-60×11,04180=6,056.

Sklon přípravku U je b´U=6×234,1-60×11,04180=4,123.

To vede k odhadu relativní účinnosti 6,0566,356=0,953 pro vakcínu T a 4,1236,356=0,649 pro vakcínu U.

C=6,35626,3562-1,068×2,1792×0,0444=1,0056.

K’ = 0,0056 × 0,625 = 0,0035.

A meze spolehlivosti jsou podle vzorce 3.3.5.1-4 rovny:

pro vakcínu T 0,955±0,0056×1,913+0,0035×-1,913=0,955±0,063

a pro vakcínu U 0,649±0,0056×1,423+0,0035×-1,301=0,649±0,058.

Množství HA na ml se může odhadnout vynásobením relativní účinnosti a jejích mezí spolehlivosti předpokládaným obsahem 30 μg/ml. Výsledky jsou v tabulce 5.2.2-III.

Tab. 5.2.2-III Odhad obsahu HA (μg/ml)

	Dolní mez	Odhad	Horní mez
vakcína T	13,4	14,3	15,3
vakcína U	8,9	9,7	10,6

• 5.3 Kvantální zkoušky

• 5.3.1 Probitová analýza, zkoušení přípravku proti referenčnímu vzorku

Zkouška in vitro vakcíny difterie

Vakcína difterie (s předpokládanou účinností 140 m.j./lahvičku) byla testována oproti standardu (s referenční účinností 132 m.j./lahvičku). Na základě této informace byly připraveny ekvivalentní dávky. Ty byly náhodně přiděleny skupinám morčat. Po daném časovém intervalu byla morčata imunizována toxinem difterie a dále byly zaznamenány počty zvířat, které přežily, viz. tabulka 5.3.1-I.

Tab. 5.3.1-I Výchozí data zkoušky difterie na morčatech

| Standard (S) stanovená účinnost 140 m.j./ml | Zkoušený přípravek (T) předpokládaná účinnost 140 m.j./ml | | | | | | Dávka (m.j./ml) | Počet exponovaných | Počet přeživších | Dávka (m.j./ml) | Počet exponovaných | Počet přeživších | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1,0 | 12 | 0 | 1,0 | 11 | 0 | | 1,6 | 12 | 3 | 1,6 | 12 | 4 | | 2,5 | 12 | 6 | 2,5 | 11 | 8 | | 4,0 | 11 | 10 | 4,0 | 11 | 10 |

Pozorování byla přenesena do první pracovní tabulky, kde jsou vypočteny ještě další sloupce tak, jak je popsáno v části 4.2.1. Tabulka 5.3.1-II obsahuje první iterační cyklus.

Jsou vypočteny součty posledních šesti sloupců a přeneseny do druhé pracovní tabulky, viz tabulka 5.3.1-III. Ostatní sloupce jsou vypočteny pomocí vzorců 4.2.1-4 až 4.2.1-10. Odtud se získá i společný sklon b = 1,655 (podle vzorce 4.2.1-9).

Hodnoty Y v první pracovní tabulce se nyní nahradí hodnotami a+bx a provede se druhý iterační cyklus, viz tabulka 5.3.1-IV.

Iterační cyklus se opakuje, dokud není rozdíl mezi po sobě následujícími cykly dostatečně malý. Tak se získá druhá pracovní tabulka 5.3.1-V.

Tab. 5.3.1-II První pracovní tabulka v prvním iteračním cyklu

	Dávka	n	r	x	p	Y	Φ	Z	y	w	wx	wy	wx2	wy2	wxy
S	1,0	12	0	0,000	0,000	0	0,5	0,399	-1,523	7,64	0,00	-9,57	0,00	12,00	0,00
1,6	12	3	0,470	0,250	0	0,5	0,399	-0,627	7,64	3,59	-4,79	1,69	3,00	-2,25
2,5	12	6	0,916	0,500	0	0,5	0,399	0,000	7,64	7,00	0,00	6,41	0,00	0,00
4,0	11	10	1,386	0,909	0	0,5	0,399	1,025	7,00	9,71	7,18	13,46	7,36	9,95
T	1,0	11	0	0,000	0,000	0	0,5	0,399	-1,253	7,00	0,00	-8,78	0,00	11,00	0,00
1,6	12	4	0,470	0,333	0	0,5	0,399	-0,412	7,64	3,59	-3,19	1,69	1,33	-1,50
2,5	11	8	0,916	0,727	0	0,5	0,399	0,570	7,00	6,42	3,99	5,88	2,27	3,66
4,0	11	10	1,386	0,909	0	0.5	0,399	1,025	7,00	9,71	7,18	13,46	7,36	9,95

Tab. 5.3.1-III Druhá pracovní tabulka v prvním iteračním cyklu

	Σw	Σwx	Σwy	Σwx2	Σwy2	Σwxy	Sxx	Sxy	Syy			a
S	29,92	20,30	-7,18	21,56	22,36	7,70	7,79	12,58	20,64	0,68	-0,24	-1,36
T	28,65	19,72	-0,80	21,03	21,97	12,11	7,64	12,66	21,95	0,69	-0,03	-1,17

Tab. 5.3.1-IV První pracovní tabulka v druhém iteračním cyklu

	Dávka	n	r	x	p	Y	Φ	Z	y	w	wx	wy	wx2	wy2	wxz
S	1,0	12	0	0,000	0,000	-1,36	0,086	0,158	-1,911	3,77	0,00	-7,21	0,00	13,79	0,00
1,6	12	3	0,470	0,250	-0,58	0,279	0,336	-0,672	6,74	3,17	-4,53	1,49	3,04	-2,13
2,5	12	6	0,916	0,500	0,15	0,561	0,394	-0,001	7,57	6,94	-0,01	6,36	0,00	-0,01
4,0	11	10	1,386	0,909	0,93	0,824	0,258	1,260	5,07	7,03	6,39	9,75	8,05	8,86
T	1,0	11	0	0,000	0,000	-1,17	0,122	0,202	-1,769	4,20	0,00	-7,43	0,00	13,14	0,00
1,6	12	4	0,470	0,333	-0,39	0,349	0,370	-0,430	7,23	3,40	-3,11	1,60	1,34	-1,46
2,5	11	8	0,916	0,727	0,35	0,637	0,375	0,591	6,70	6,14	3,96	5,62	2,34	3,63
4,0	11	10	1,386	0,909	1,13	0,870	0,211	1,311	4,23	6,03	5,70	8,36	7,48	7,90

Tab. 5.3.1-V Druhá pracovní tabulka po dostatečném počtu cyklů.

	Σw	Σwx	Σwy	Σwx2	Σwy2	Σwxy	Sxx	Sxy	Syy			a
S	18,37	14,80	-2,14	14,85	17,81	5,28	2,93	7,00	17,56	0,81	-0,12	-2,05
T	17,96	12,64	-0,55	11,86	18,35	6,76	2,96	7,15	18,34	0,70	-0,03	-1,72

Test linearity je popsán v části 4.2.2. Hodnota χL2 o 4 stupních volnosti je 0,836 + 1,069 = 1,905 a té odpovídá p-hodnota 0,780, což neprokazuje statisticky významnou odchylku od linearity.

Protože odchylka od linearity není statisticky významná, je možno provést test rovnoběžnosti popsaný ve stejné části. χL2 s jedním stupněm volnosti je 16,724+17,271-14,1525,89=0,002. To odpovídá p-hodnotě 0,964, což není statisticky významné.

Z tabulky 5.3.1-V se podle vzorce 4.2.1-9 vypočte:

b=7,00+7,152,93+2,96=14,155,89=2,402

pomocí vzorců z části 4.2.3 je možno odhadnout logaritmus relativní účinnosti

M´T=-1,721--2,052,402=0,137,

dále

C=2,4022×5,8932,4022×5,893-12×1,9602=1,127,

V=118,34+117,56=0,110,

takže ln mezí spolehlivosti je:

0,155-0,013±0,1270,649+1,127×0,0362=0,142±0,288.

Odlogaritmováním a vynásobením předpokládanou účinností (140 m.j./lahvičku) se získá účinnost a její meze spolehlivosti. Odhad účinnosti je 160,6 m.j./lahvičku s 95% mezemi spolehlivosti od 121,0 do 215,2 m.j./lahvičku.

[image omitted]

Obr. 5.3.1-I

• 5.3.2 Logitová analýza a jiné typy analýzy zkoušeného přípravku proti referenčnímu vzorku

V této části jsou uvedeny výsledky analýz dat z části 5.3.1 získané logitovou analýzou a jinými klasickými metodami. Následující příklad by měl být spíše považován za cvičení než za alternativní řešení příkladu v části 5.3.1. Jiný tvar křivky by měl být použit pouze, pokud pro to existují dostatečné empirické nebo teoretické důvody.

Tab. 5.3.2.-I Výsledky použití alternativních křivek

	Logit	Gompit	Sinit(*)
Φ	11+e-γ	1-e-eγ	12sin⁡Υ+12
Z	e-γ1+e-γ2	eΥ-eγ	12cos⁡Υ
sklon b	4,101	2,590	1,717
χ2 linearity	2,15	3,56	1,50
χ2 rovnoběžnosti	0,0066	0,168	0,0010
účinnost	162,9	158,3	155,8
dolní mez	121,1	118,7	122,6
horní mez	221,1	213,3	200,7

^(*)^ Je-li Υ<-12π, pak Φ = 0 a Z = 0 a je-li Υ>-12π, pak Φ = 1 a Z = 0.

• 5.3.3 Stanovení ED50 přípravku pomocí probitové metody

In vitro zkouška peroralní poliomyelitické vakcíny

Pro stanovení ED50 peorální poliomyelitické vakcíny bylo použito 10 ředění s osmi opakováními 50 μl na Elisaplotnách, výsledky zkoušky jsou v tabulce 5.3.3-I.

Tab. 5.3.3-I Ředění (10^x μl původní vakcíny)

-3,5	-4,0	-4,5	-5,0	-5,5	-6,0	-6,5	-7,0	-7,5	-8,0
+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
+	+	+	-	-	-	-	-	-	-
+	+	+	+	+	-	-	-	-	-
+	+	+	+	+	-	+	-	-	-
+	+	+	+	-	+	-	-	-	-

Pozorované výsledky jsou převedeny do první pracovní tabulky a v ní jsou vypočteny i ostatní sloupce, jak jsou popsány v části 4.2.1. V tabulce 5.3.3-II je zobrazen první cyklus iterační procedury.

Dále je vypočten součet posledních šesti sloupců a převeden do druhé pracovní tabulky (viz tabulka 5.3.3-III). Pomocí vzorců 4.2.1-4 až 4.2-10 se vypočtou zbylé sloupce a získá se společný sklon b = -0,295.

Hodnoty Y v první pracovní tabulce se nahradí hodnota a + bx a dokončí se druhý iterační cyklus. V iteračním procesu se pokračuje, dokud není rozdíl mezi dvěma po sobě následujícími cykly dostatečně malý. Tabulka 5.3.3-IV obsahuje údaje z druhé pracovní tabulky po ukončení iteračního procesu.

Tab. 5.3.3-I První pracovní tabulka prvního iteračního cyklu

	Dávka	n	r	x	p	Y	Φ	Z	Y	w	wx	wy	wx2	wy2	wxy
T	10-3,5	8	0	-8,06	0,000	0,00	0,5	0,399	-1,253	5,09	-41,04	-6,38	330,8	8,00	51,4
	10-4,0	8	0	-9,21	0,000	0,00	0,5	0,399	-1,253	5,09	-46,91	-6,38	432,0	8,00	58,8
	10-4,5	8	1	-10,36	0,125	0,00	0,5	0,399	-0,940	5,09	-52,77	-4,79	546,8	4,50	49,6
	10-5,0	8	2	-11,51	0,250	0,00	0,5	0,399	-0,627	5,09	-58,63	-3,19	675,1	2,00	36,7
	10-5,5	8	6	-12,66	0,750	0,00	0,5	0,399	0,627	5,09	-64,50	3,19	816,8	2,00	-40,4
	10-6,0	8	7	-13,82	0,875	0,00	0,5	0,399	0,940	5,09	-70,36	4,79	972,1	4,50	-66,1
	10-6,5	8	7	-14,97	0,875	0,00	0,5	0,399	0,940	5,09	-76,23	4,79	1140,8	4,50	-71,7
	10-7,0	8	8	-16,12	1,000	0,00	0,5	0,399	1,253	5,09	-82,09	6,38	1323,1	8,00	-102,9
	10-8,5	8	8	-17,27	1,000	0,00	0,5	0,399	1,253	5,09	-87,95	6,38	1518,9	8,00	-110,2
	10-8,0	8	8	-18,42	1,000	0,00	0,5	0,399	1,253	5,09	-93,82	6,38	1728,2	8,00	-117,6

Tab. 5.3.3-II Druhá pracovní tabulka prvního iteračního cyklu

	Σw	Σwx	Σwy	Σwx2	Σwy2	Σwx	Sxx	Sxy	Syy			a
T	50,93	-674,3	11,17	9484,6	57,50	-312,4	556,92	-164,43	55,05	-13,24	0,219	-3,690

Tab. 5.3.3-III Druhá pracovní tabulka po provedení dostatečného počtu iterací

	Σw	Σwx	Σwy	Σwx2	Σwy2	Σwx	Sxx	Sxy	Syy			a
T	19,39	-238,2	0,11	2981,1	26,05	-37,45	55,88	-36,11	26,05	-12,28	0,006	-7,931

Linearita se otestuje pomocí vzorců z části 4.2.2. Hodnota Χ^2 o osmi stupních volnosti je 2,711 a tomu odpovídá p-hodnota 0,951, což není statisticky významné.

Je tedy možno pomocí vzorců z části 4.5 odhadnout relativní účinnost,

M´=--7,931-0,646=-12,273,

dále

C=-0,6462×55,883-0,6462×55,883-12×1,962=1,197,

V=119,39=0,052.

Logaritmus mezí spolehlivosti je tedy roven

14,692--2,420±0,197×2,882+1,197×0,0092=-12,272±0,754.

Tento odhad je stále ve tvaru ln(ředění). Odhad vyjádřený jako ln(ED50)/ml je

-M´T+ln⁡100050.

Protože je obvyklé vyjadřovat účinnost této vakcíny ve tvaru log10(ED50)/ml výsledky musí být vyděleny ln(10). Odhadem účinnosti pak je 6,63 log10(ED50)/ml s 95% mezemi spolehlivosti od 6,30 do 6,96 log10(ED50)/ml.

[image omitted]

Obr. 5.3.3-I. Závislost pravděpodobnosti pozitivní odpovědi na ředění

• 6 Kombinace výsledků zkoušky

• 6.1 Úvod

Ke splnění požadavků lékopisu je často nutné zkoušku nezávisle opakovat a výsledky kombinovat. Pak se naskýtá otázka, zda je vhodné kombinovat takové zkoušky, a pokud ano, jakým způsobem.

Zkoušky lze považovat za navzájem nezávislé, když výsledky jedné zkoušky neovlivňují výsledky jiné. Také náhodné chyby ve všech faktorech ovlivňujících výsledek (např. ředění standardu a zkoušeného přípravku, citlivost biologického ukazatele) v jedné zkoušce musí být nezávislé na stejné chybě ve druhé zkoušce. Zkoušky ve dnech po sobě následujících, používající původní ředění standardu, tedy nezávislé nejsou.

Existuje několik způsobů kombinování výsledků nezávislých zkoušek, ty teoreticky nejvhodnější jsou ale také nejobtížněji použitelné. Dále jsou popsány tři přibližné metody. Mohou být použity i další za předpokladu splnění nutných podmínek.

Před kombinováním odhadů účinnosti získaných pomocí modelu rovnoběžnosti je nutné pracovat s logaritmem účinnosti. Při použití modelu poměru sklonů se pracuje přímo s účinností. Protože v praxi je častěji používán model rovnoběžnosti než model poměru sklonů, je použit v této části symbol M označující přirozený logaritmus účinnosti. Při modelu poměru sklonů se použijí stejné vzorce, v nichž se pod M rozumí účinnost R, a nikoliv její logaritmus. Před kombinováním musí být všechny odhady účinnosti upraveny na stanovenou účinnost každého zkoušeného přípravku.

• 6.2 Vážený průměr výsledků zkoušek

Podmínky použití této metody:

• 1. odhady účinnosti jsou z nezávislých zkoušek,

• 1. v každé zkoušce je C blízké 1 (menší než 1,1),

• 1. počet stupňů volnosti jednotlivých reziduálních chyb není menší než 6, pokud možno je větší než 15,

• 1. jednotlivé odhady účinnosti tvoří homogenní skupinu. Test homogenity je popsán v části 6.2.2.

Pokud tyto podmínky nejsou splněny, metodu nelze použít. Metody v následující části 6.3 mohou sloužit k získání nejlepšího odhadu průměrné účinnosti jako předpokládané účinnosti pro další zkoušky.

• 6.2.1 Výpočet váhových koeficientů

Po vyhodnocení každé z n´ nezávislých validních zkoušek je k dispozici n´ hodnot M a příslušných mezí spolehlivosti. Pro každou zkoušku se určí délka intervalu spolehlivosti L jako rozdíl horní a dolní meze. Váha W pro každou hodnotu M se vypočte pomocí vzorce 6.2.1-I, kde t je stejná hodnota jako při výpočtu mezí spolehlivosti:

W=4t2L2 6.2.1-1

• 6.2.2 Homogenita odhadů účinnosti

Umocněním každé odchylky M od váženého průměru, vynásobením příslušnou váhou W a součtem přes všechny zkoušky se získá statistika s přibližně χ^2 rozdělením. Ta může být použita k testování homogenity odhadů logaritmů účinnosti v n´ nezávislých zkouškách.

χ2≈∑n´WM-M¯2 kde M¯=∑WM∑W 6.2.2-1

Je-li vypočtené χ^2 menší než tabelovaná hodnota pro (n´- 1) stupňů volnosti, není významně porušena homogenita účinností a je možno průměrnou účinnost a meze spolehlivosti určit pomocí metody z části 6.2.3.

Je-li χ^2 větší než tabelovaná hodnota, jsou účinnosti nehomogenní. To znamená, že rozdíly mezi jednotlivými odhady M jsou významně větší, než odpovídá odhadům jejich mezí spolehlivosti, tj. je statisticky významná variabilita mezi zkouškami. Rozdíly mezi zkouškami jsou tedy významné, takže podmínka 4 není splněna a není možno použít vzorce z části 6.2.3, místo nich se použijí vzorce ze části 6.2.4.

• 6.2.3 Výpočet vážených průměrů a mezí spolehlivosti

Pro výpočet váženého průměru logaritmů účinností se vypočtou součiny WM pro každou zkoušku a jejich součet se vydělí celkovým součtem vah všech zkoušek.

M¯=∑WM∑W 6.2.3-1

Střední chyba ln(průměrné účinnosti) je odmocnina převrácené hodnoty součtu všech hmotností.

sM¯=1∑W 6.2.3-2

Přibližné meze spolehlivosti se získají odlogaritmováním hodnot:

M¯±tsM¯ 6.2.3-3

kde počet stupňů volnosti t je roven součtu stupňů volnosti střední chyby jednotlivých zkoušek.

• 6.2.4 Vážený průměr a meze spolehlivosti založené na vnější a vnitřní individuální variabilitě zkoušky

Pokud je kombinováno několik opakování zkoušek, může být hodnota χ^2 statisticky významná. Pak se pozorovaný rozptyl skládá ze dvou složek:

• intra zkoušková variabilita s2M=1/W,

• inter zkoušková variabilita s2M¯=∑M-M¯2n´n´-1 ,

kde M¯ je nevážený průměr. První složka se mění zkoušku od zkoušky, zatímco druhá je společná pro všechna M.

Pro každé M se vypočte váhový koeficient

W´=1s2M+s2M¯,

který nahradí W části 6.2.3, kde je t aproximováno hodnotou 2.

• 6.3 Nevážená kombinace výsledků zkoušek

Nejjednodušší způsob kombinace n´ odhadů M z n´ zkoušek je vypočítat průměr [image omitted] a jeho směrodatnou odchylku odhadnout jako

s2M¯=∑M-M¯2n´n´-1. 6.3-1

Meze spolehlivosti pak jsou

M¯±tsM¯ 6.3-2

kde t má (n´ - 1) stupňů volnosti. Počet n´ odhadů M je obvykle malý, proto bývá hodnota t poměrně velká.

• 6.4 Příklad vážené průměrné účinnosti a jejích mezí spolehlivosti

V tabulce 6.4-I je šest nezávisIých odhadů účinnosti stejného přípravku společně s jejich 95% intervaly spolehlivosti a s počtem stupňů volnosti jejich reziduálních směrodatných odchylek. Podmínky 1, 2 a 3 části 6.2 jsou splněny. Logaritmy účinností a váhy jsou vypočteny tak, jak je popsáno v části 6.2.

Tab. 6.4-I Odhady účinnosti a intervaly spolehlivosti šesti nezávislých zkoušek.

Odhad účinnosti (m.j./lahvičku)	Dolní mez (m.j./lahvičku)	Horní mez (mj./lahvičku)	Stupně volnosti	ln účinnosti M	Váhy W
18 367	17 755	19 002	20	9,8183	3777,7
18 003	17 415	18 610	20	9,7983	3951,5
18 064	17 319	18 838	20	9,8017	2462,5
17 832	17 253	18 429	20	9,7887	4003,0
18 635	17 959	19 339	20	9,8328	3175,6
18 269	17 722	18 834	20	9,8130	4699,5

Homogenita odhadů účinnosti je hodnocena vzorcem 6.2.2-1, který poskytuje hodnotu χ^2 = 4,42, který má 5 stupňů volnosti, což není statisticky významné (p = 0,49). Podmínky jsou tedy splněny.

Vážený průměr vypočtený vzorcem 6.2.3-1 je roven 9,8085.

Vzorec 6.2.3-2 poskytuje odhad směrodatné odchylky 0,00673. Přibližné 95% meze spolehlivosti od 9,7951 do 9,8218 se získají ze vzorce 6.2.3-3, kde t má 120 stupňů volnosti.

Po odlogaritmování je odhad účinnosti rovný 18 187 m.j./lahvičku a 95% meze spolehlivosti od 17 946 do 18 431 m.j./lahvičku.

• 7 Další postupy

Není možné, aby lékopisný text obsahoval úplný popis statistických metod. Nicméně metody popsané v této stati by měly stačit pro většinu lékopisných potřeb. Tato část se pokouší dát abstraktnější přehled alternativních nebo obecnějších metod, které byly vyvinuty. Čtenář zajímající se o tuto problematiku by se měl věnovat studiu další literatury z této oblasti. Použití speciálnějších statistických metod musí být v každém případě prováděno kvalifikovanou osobou.

• 7.1 Obecný lineární model

Metody zmíněné v tomto textu mohou být popsány prostřednictvím obecného lineárního modelu (nebo zobecněný lineární model zahrnuje probitovou a logitovou metodu). Nejprve je nutno definovat lineární strukturální matici X (nebo matici plánu), ve které každý řádek představuje jedno pozorování a každý sloupec lineární efekt (přípravek, blok, sloupec, dávku). Např. plán latinských čtverců z příkladu 5.1.2 je popsán maticí s 36 řádky a 13 sloupci. Jeden sloupec pro každý přípravek, jeden sloupec pro každou dávku, pět sloupců pro každý blok s výjimkou prvního. Všechny sloupce s výjimkou sloupců pro dávky jsou vyplněny čísly 0 nebo 1 podle toho, zda tomuto pozorování odpovídá příslušný efekt. Vektor Y obsahuje (transformované) pozorované hodnoty. Efekty jsou odhadovány vzorcem (X' X)^-1 X' Y a z nich jako podíl odpovídajících efektů se vypočte odhad účinnosti m. Intervaly spolehlivosti se vypočtou pomocí Fiellerovy věty:

mL,mU=m-gv12v22±tsbv11-2mv12+m2v22-gv11-v122v22/1-g,

kde g=t2s2v22b2

a v11, v22 a v12 představují rozptyly čitatele, jmenovatele a jejích kovarianci. Ty se získají přímo z (X' X)^-1 nebo nepřímo z var (a1 - a2) = var (a1) + var (a2) - 2cov (a1, a2) a cov (a1 - a2, b) = cov (a1, b) - cov (a2, b).

Úplná analýza rozptylu, ve které jsou obsaženy všechny komponenty, je poněkud komplikovanější. Matice X by musela být rozšířena o další sloupce, umožňující testovat předpoklad rovnoběžnosti a linearity. Pro zkoušku závisející na kvantální odpovědi se najdou lineární efekty (průsečíky as, aT atd. a společný sklon b se získá maximalizací součtu n ln Φ(ai + bx) + (n - r)ln(1 - Φ(ai + bx)), kde je x logaritmus dávky, Φ představuje tvar rozložení a i є {S, T, ...}.

• 7.2 Heterogenita rozptylů

Heterogenitu rozptylů se vždy nepodaří odstranit jednoduchou transformací odpovědí. Vhodnou cestou k řešení tohoto problému je použití vážené lineární regrese. K získání nevychýlených odhadů se za váhu pozorování použijí převrácené hodnoty rozptylů chyb. Protože skutečná hodnota rozptylu chyby není vždy známa, může být použita iterační metoda opakovaného vážení. Výpočet intervalů spolehlivosti ale přináší další problémy.

• 7.3 Odlehlá pozorování a robustní metody

Metoda nejmenších čtverců, popsaná v tomto textu, má nevýhodu v tom, že je silně ovlivněna případnými odlehlými pozorováními. Jasně odlehlá pozorování mohou zcela znehodnotit celý výpočet. Tento problém se obvykle řeší vyloučením odlehlých hodnot ze zpracovávaných dat. Tento postup může vést k účelovému zamítnutí libovolných dat a to není bez nebezpečí. Je složité dát obecný návod, jak rozhodnout, zda konkrétní pozorování je, či není odlehlé. Pro tyto účely bylo vyvinuto mnoho robustních metod. Tyto metody jsou méně citlivé na odlehlá pozorování, protože kladou menší důraz na hodnoty vzdálené od předpokládaného odhadu. Nové problémy se obvykle objeví při konstrukci intervalu spolehlivosti nebo definici minimalizované ztrátové funkce.

• 7.4 Korelace chyb

Úplné znáhodnění není vždy uskutečnitelné nebo je velmi nežádoucí z praktického důvodu. Pak jednotlivé dávky v ředicí řadě vedou ke korelovaným chybám způsobujícím, že meze spolehlivosti jsou mnohem užší. Byly vyvinuty metody, které berou v úvahu tento efekt autokorelace.

• 8 Tabulky a algoritmy

V tabulkách této části jsou otištěny kritické hodnoty pro nejčastěji se vyskytující stupně volnosti. Pokud některé kritické hodnoty zde nejsou uvedeny, je nutno použít rozsáhlejší statistické tabulky. Mnohé počítačové programy v sobě zahrnují statistické funkce, ty pak jsou vhodnější než tabulky v této části. Jinou alternativou jsou dále popsané procedury, které vypočtou pravděpodobnost odpovídající daným statistikám při zadaných stupních volnosti.

• 8.1 Tabulka kritických hodnot F-rozdělení

| sv1→ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 10 | 12 | 15 | 20 | ∞ | | sv2↓ | | | | | | | | | | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 10 | 4,965 | 4,103 | 3,708 | 3,478 | 3,326 | 3,217 | 3,072 | 2,978 | 2,913 | 2,845 | 2,774 | 2,538 | | | 10,044 | 7,559 | 5,994 | 5,994 | 5,636 | 5,386 | 5,057 | 4,849 | 4,706 | 4,558 | 4,405 | 3,909 | | 12 | 4,747 | 3,885 | 3,490 | 3,259 | 3,106 | 2,996 | 2,849 | 2,753 | 2,687 | 2,617 | 2,544 | 2,296 | | | 9,330 | 6,927 | 5,953 | 5,412 | 5,064 | 4,821 | 4,499 | 4,296 | 4,155 | 4,010 | 3,858 | 3,361 | | 15 | 4,543 | 3,682 | 3,287 | 3,056 | 2,901 | 2,790 | 2,641 | 2,544 | 2,475 | 2,403 | 2,328 | 2,066 | | | 8,683 | 6,359 | 5,417 | 4,893 | 4,556 | 4,318 | 4,004 | 3,805 | 3,666 | 3,522 | 3,372 | 2,868 | | 20 | 4,351 | 3,493 | 3,098 | 2,866 | 2,711 | 2,599 | 2,447 | 2,348 | 2,278 | 2,203 | 2,124 | 1,843 | | | 8,096 | 5,849 | 4,938 | 4,431 | 4,103 | 3,871 | 3,564 | 3,368 | 3,231 | 3,088 | 2,938 | 2,421 | | 25 | 4,242 | 3,385 | 2,991 | 2,759 | 2,603 | 2,490 | 2,337 | 2,236 | 2,165 | 2,089 | 2,007 | 1,711 | | | 7,770 | 5,568 | 4,657 | 4,177 | 3,855 | 3,627 | 3,324 | 3,129 | 2,993 | 2,850 | 2,699 | 2,169 | | 30 | 4,171 | 3,316 | 2,922 | 2,690 | 2,534 | 2,421 | 2,266 | 2,165 | 2,092 | 2,015 | 1,932 | 1,622 | | | 7,562 | 5,390 | 4,510 | 4,018 | 3,699 | 3,473 | 3,173 | 2,979 | 2,843 | 2,700 | 2,549 | 2,006 | | 50 | 4,034 | 3,183 | 2,790 | 2,557 | 2,400 | 2,286 | 2,130 | 2,026 | 1,952 | 1,871 | 1,784 | 1,438 | | | 7,171 | 5,057 | 4,199 | 3,720 | 3,408 | 3,186 | 2,890 | 2,698 | 2,563 | 2,419 | 2,265 | 1,683 | | ∞ | 3,841 | 2,996 | 2,605 | 2,372 | 2,214 | 2,099 | 1,938 | 1,831 | 1,752 | 1,666 | 1,571 | 1,000 | | | 6,635 | 4,605 | 3,782 | 3,319 | 3,017 | 2,802 | 2,511 | 2,321 | 2,185 | 2,039 | 1,878 | 1,000 |

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0,05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0,01). sv1 je počet stupňů volnosti čitatele a sv2 jmenovatele.

Počítačový postup: Nechť F je vypočtená testovací statistika, sv1, sv2 výše popsané stupně volnosti a pi = π = 3,14159265358979.... Následující program vypočte odpovídající p-hodnotu.

Je-li sv1 sudé	Je-li sv1 liché a sv2 sudé	Je-li sv1 a sv2 liché
x=sv1 / (sv1+sv2/F)	x=sv2/ (sv2+sv1*F)	x=atn(sqr(sv1*F/sv2))
s=1 : t=1	s=1 : t=1	cs=cos (x) : sn=sin(x) : x=x/2
for i=2 to (sv1-2) step 2	for i=2 to (sv2-2) step 2	s=0 : t=sn*cs/2 : v=0 : w=1
t=tx(sv2+i-2)/i	t=tx (sv1+i-2)/i	for i=1 to (sv2-1) step 2
s=s+t	s=s+t	s=s+t
next i	next i	t=ti/(i+1)cs*cs
p=s*(1-x)^(sv2/2)	p=1-s*(1-x)^(sv1/2)	next i
		for i=1 to (sv1-2) step 2
		v=v+w
		w=w (sv2+i) / (i+2) sn*sn
		next i
		p=1+(tsv2v-x-s) / pi*4

• 8.2 Tabulka kritických hodnot t- rozdělení

sv	p = 0,05	p = 0,01
1	12,706	63,656
2	4,303	9,925
3	3,182	5,841
4	2,776	4,604
5	2,571	4,032
6	2,447	3,707
7	2,365	3,499
8	2,306	3,355
9	2,262	3,250
10	2,228	3,169
12	2,179	3,055
14	2,145	2,977
16	2,120	2,921
18	2,101	2,878
20	2,086	2,845
22	2,074	2,819
24	2,064	2,797
26	2,056	2,779
28	2,048	2,763
30	2,042	2,750
35	2,030	2,724
40	2,021	2,704
45	2,014	2,690
50	2,009	2,678
60	2,000	2,660
70	1,994	2,648
80	1,990	2,639
90	1,987	2,632
100	1,984	2,626
∞	1,960	2,576

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0,05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0,01).

Počítačový postup: p-hodnota pro t-rozdělení s sv stupni volnosti se vypočte pomocí postupu v části 8.1, kde F = t^2, sv1 = 1 a sv2 = sv.

Kritickou hodnotu t-rozdělení (p = 0,05) pro daný počet stupňů volnosti sv vypočteme pomocí následujícího postupu s přesností na 6 platných míst.

t =	1,95994+
	2,37228/sv+
	2,82202/sv^2+
	2,56449/sv^3+
	1,51956/sv^4+
	1.02579/sv^5+
	0,44210/sv^7

• 8.3 Tabulka kritických hodnot χ^2-rozdělení

sv	p = 0,05	p = 0,01
1	3,841	6,635
2	5,991	9,210
3	7,815	11,345
4	9,488	13,277
5	11,070	15,086
6	12,592	16,812
7	14,067	18,475
8	15,507	20,090
9	16,919	21,666
10	18,307	23,209
11	19,675	24,725
12	21,026	26,217
13	22,362	27,688
14	23,685	29,141
15	24,996	30,578
16	26,296	32,000
20	31,410	37,566
25	37,652	44,314
30	43,773	50,892
40	55,758	63,691

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0,05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0,01).

Počítačový postup: Nechť x2 je vypočtená hodnota χ^2 a sv stupně volnosti, pak p-hodnotu vypočte postup:

Je-li sv sudé	Je-li sv liché
s=1 : t=exp (-x2/2)	x=sqr(x2) : s=0
for i=2 to sv step 2	t=x*exp(-x2/2) / sqr(pi/2)
s=s+t	for i=3 to sv step 2
t=t*x2/i	s=s+t : t=t*x2/i
next i	next i
p=1-s	p=1-s-2*phi (x)

kde phi je hodnota kumulativní distribuční funkce normálního rozdělení Φ (viz část 8.4).

• 8.4 Tabulka kritických hodnot Φ-rozdělení

x	Φ
0,00	0,500
0,05	0,520
0,10	0,540
0,15	0,560
0,20	0,579
0,25	0,599
0,30	0,618
0,35	0,637
0,40	0,655
0,45	0,674
0,50	0,691
0,55	0,709
0,60	0,726
0,65	0,742
0,70	0,758
0,75	0,773
0,80	0,788
0,85	0,802
0,90	0,816
0,95	0,829
1,00	0,841
1,05	0,853
1,10	0,864
1,15	0,875
1,20	0,885
1,25	0,894
1,30	0,903
1,35	0,911
1,40	0,919
1,45	0,926
1,50	0,933
1,55	0,939
1,60	0,945
1,65	0,951
1,70	0,955
1,75	0,960
1,80	0,964
1,85	0,968
1,90	0,971
1,95	0,974
2,00	0,977
2,05	0,980
2,10	0,982
2,15	0,984
2,20	0,986
2,25	0,988
2,30	0,989
2,35	0,991
2,40	0,992
2,45	0,993
2,50	0,994
2,55	0,995
2,60	0,995
2,65	0,996
2,70	0,997
2,75	0,997
2,80	0,997
2,85	0,998
2,90	0,998
2,95	0,998

Pro záporná x je: Φ(x) = 1 - Φ(-x).

Počítačový postup: Následující postup vypočte pro 0 ≤ x ≤ 8,15 odpovídající hodnotu funkce Φ. Je-li větší než 8,15, pak se položí Φ = 1. Pokud je x záporné, je možno použít výše zmíněný vzorec. Tento postup předpokládá, že počítač pracuje asi s patnácti platnými místy. Pokud je použit jiný počet platných čísel, je nutno provést jisté prosté úpravy postupu.

s=0 : t=x : i=1
repeat
s=s+t : i=i+2 : t=txx/i
until t<1E-16
phi=0.5+sexp(-xx/2)/sqr(2*pi)

• 8.5 Náhodné permutace

Pro plán náhodných bloků se potřebují náhodné permutace. Následující algoritmus ukazuje, jak použít zabudovaný generátor náhodných čísel k vytvoření náhodných permutací N ošetření.

• 1. Do řádku se zapíše všech Ν ošetření.

• 1. Získá se celé náhodné číslo r z intervalu 1 ≤ r ≤ N,

• 1. V řádku se vymění r-té ošetření s N-tým.

• 1. Položí se N = N – 1 a zopakují se kroky 2 až 4, dokud nebude N = 1.

Příklad algoritmu pro 6 ošetření

1	N = 6	S1	S2	S3	T1	T2	T3
2	r = 2	→		←
3		S1	T3	S3	T1	T2	S2
4	N = 5
2	r = 4	→	←
3		S1	T3	S3	T2	T1	S2
4	N = 4
2	r = 4		↓
3		S1	T3	S3	T2	T1	S2
4	N = 3
2	r = 1	→	←
3		S3	T3	S1	T2	T1	S2
4	N = 2
2	r = 1	→	←
3		T3	S3	S1	T2	T1	S2
4	N = 1

• 8.6 Latinské čtverce

Dále je uvedeno použití tří nezávislých permutací k vytvoření latinského čtverce.

• 1. Vygeneruje se jedna náhodná permutace N ošetření (viz část 8.5):

T3	S3	S1	T2	T1	S2

• 1. Nyní se dá jednoduchý latinský čtverec vytvořit pomocí „rotace“ této permutace doprava. To se provede následujícím způsobem. Napíše se permutace nalezená při prvním kroku do prvního řádku. Druhý řádek obsahuje tutéž permutaci, ale se všemi ošetřeními posunutými doprava. Ošetření, které bylo nejvíce vpravo, se zapíše do levého volného políčka. Tento postup se zopakuje pro každou řádku tolikrát, aby v každém sloupci byla všechna ošetření, ale pouze jedenkrát.

T3	S3	S1	T2	T1	S2
S2	T3	S3	S1	T2	T1
T1	S2	T3	S3	S1	T2
T2	T1	S2	T3	S3	S1
S1	T2	T1	S2	T3	S3
S3	S1	T2	T1	S2	T3

• 1. Vygenerují se dvě náhodné permutace čísel 1 až N:

jednu pro řádky

2	3	6	1	4	5

a druhou pro sloupce

3	4	6	2	5	1

• 1. Latinský čtverec se nyní získá seřazením řádků a sloupců latinského čtverce podle těchto dvou permutací pro řádky a sloupce:

	3	4	6	2	5	1
2	T3	S3	S1	T2	T1	S2
3	S2	T3	S3	S1	T2	T1
6	T1	S2	T3	S3	S1	T2
1	T2	T1	S2	T3	S3	S1
4	S1	T2	T1	S2	T3	S3
5	T3	S1	T2	T1	S2	T3
	1	2	3	4	5	6
---	---	---	---	---	---	---
1	S1	T3	T2	T1	S3	S2
2	S2	T2	T3	S3	T1	S1
3	T1	S1	S2	T3	T2	S3
4	S3	S2	S1	T2	T3	T1
5	T3	T1	S3	S1	S2	T2
6	T2	S3	T1	S2	S1	T3

• 9 Slovník symbolů

Symbol	Definice
a	průsečík lineárních regresních přímek závislosti odpovědi na dávce nebo ln dávky
b	sklon v modelu lineární regrese závislosti odpovědi na dávce nebo logaritmu dávky, společný pro všechny přípravky ve zkoušce
d	počet úrovní dávek pro každý přípravek ve vyvážené zkoušce (bez nulové dávky v modelu sklonu)
e	základ přirozených logaritmů (e = 2,71828182845905...)
g	veličina používaná ve Fiellerově větě g=C-1C
h	počet přípravků zkoušky včetně standardu
m	odhad účinnosti získaný jako podíl efektů v obecném lineárním modelu
n	počet opakování každého ošetření
p	pravděpodobnost, že daná statistika je větší než pozorovaná hodnota; v probitové analýze je použito též pro podíl r/n
r	počet odpovědí na jednotlivá ošetření v kvantálních zkouškách
s	odhad směrodatné odchylky s2
s2	odhad reziduálního rozptylu určený z analýzy rozptylu
t	Studentova testovací statistika (tabulka 8.2)
v11, v12, v22	rozptyly a kovariance použité ve jmenovateli a čitateli ve Fiellerově větě
w	váhový koeficient
x	logaritmus dávky
y	jednotlivá odpověď nebo transformovaná odpověď
A	předpokládaná účinnost použitá pro přípravu dávek zkoušeného přípravku
B	průměrná odpověď na nulovou dávku v modelu sklonu
C	statistika užívaná pro výpočet mezí spolehlivosti: C=11-g
C1, ...Cn	průměrná odpověď v každém sloupci v modelu latinských čtverců
D1, D2	průměrná odpověď v čase 1 nebo 2 v křížovém pokuse
F	podíl nezávislých odhadů rozptylů (tabulka 8.1)
Gs, GT	efekty ošetření v analýze rozptylu pro model poměru sklonů
HP, HL	veličiny použité v analýze rozptylu v modelu rovnoběžnosti
HB, HI	veličiny použité v analýze rozptylu v modelu poměru sklonů
I	v modelu rovnoběžnosti logaritmus poměru sousedních dávek; v modelu poměru sklonů interval mezi sousedními dávkami
JS, JT	lineární kontrasty používané v analýze rozptylu pro model poměru sklonů
K	korekční faktor používaný k výpočtu součtu čtverců v analýze rozptylu
L	šířka intervalu spolehlivosti v logaritmech
LS, ...LT	lineární kontrasty standardu a zkoušeného přípravku
M´	logaritmus účinnosti daného zkoušeného přípravku
N	celkový počet odpovědí zkoušky (= d.h)
PS, PT	součet pro standard a zkoušený přípravek
R	odhadovaná účinnosti daného zkoušeného přípravku
R´	relativní účinnost daného zkoušeného přípravku
R1 ...Rn	průměrná odpověď v každém řádku v modelu latinských čtverců nebo v každém bloku v modelu náhodných bloků
S	standardní přípravek
S1,., Sd	průměrné odpovědi od nejmenší dávky 1 do největší dávky d na standardní přípravek
SS	součet čtverců (daného zdroje variability)
T, U, V	zkoušené přípravky
T1,., Td	průměrné odpovědi od nejmenší dávky 1 do největší dávky d zkoušeného přípravku T
V	variační koeficient používaný pro výpočet mezí spolehlivosti
W	statistické váhy používané ke kombinaci výsledků zkoušek
X	lineární strukturální matice plánu zkoušky používaná v obecném lineárním modelu
Y, Y´	vektor (transformovaných) odpovědí v obecném lineárním modelu
Z	první derivace Φ
π	3,141592653589793238...
Φ	kumulativní distribuční funkce normálního rozložení (tabulka 8.4)
χ2	testovací statistika chi-kvadrát (tabulka 8.3)

• 10 Literatura

Seznam literatury doporučené pro další studium:

Finney, D. J. (1971). Probit analysis. 3^rd Ed. Cambridge University Press, Cambridge.

Nelder, J. A. & Wedderburn, R. W. M. (1972). Generalized linear models, Journal of the Royal Statistical Society, Series A 135, 370-384.

Finney D. J. (1978) Statistical Method id Biological Assay, 3^rd Ed. Griffin, London.

Sokal, R. R. & Rohlf, F. R. (1981). Biometry: Principles and Practice of Statistics in Biological Research, 2^nd Ed. W. H. Freemann & CO, New York.

Peace K. E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for Drug Development, Marcel Dekker Inc., New York/Basel.

Bowerman, B. L. & O´Connell, R. T. (1990). Linear Statistical Models an Appleid Approach, 2^nd Ed. PWS-KENT Publishing Company, Boston.

Roth Z., Josífko M., Malý V., Trčka V. (1962). Statistické metody experimentální medicíny, Státní zdravotnické nakladatelství.

“

• 1. V příloze části 5 Všeobecné dodatky, se za kapitolu 5.5 doplňují kapitoly 5.6 a 5.7, které znějí:

„

5.6 Stanovení účinnosti interferonů [image omitted]

Následující stať se uvádí pouze pro informaci a jako návod, netvoří závaznou část lékopisu.

• 1 Úvod

Lékopisné články na lidské interferony všeobecně obsahují biologická stanovení založená na inhibičním účinku interferonu na virový cytopatický efekt v kulturách buněčných linií. V mnoha případech ale nejsou specifikovány ani virus, ani buněčná linie, ani detaily stanovení, aby se dovolila vhodná volnost provedení, když se článek týká více než jedné podtřídy interferonu.

Tento text je určen k tomu, aby poskytl analytikovi zásadní informace, jak navrhnout, optimalizovat a validovat takovou zkoušku, když byla určena vhodná kombinace buněčné linie a cytopatického viru. Je popsán podrobný postup pro zvláštní cytopatické antivirové stanovení jako příklad vhodné metody spolu s informací o jiných kombinacích viru a buněčné linie a s návodem, jak upravit a validovat postup pro tyto jiné kombinace.

• 2 Antivirová (snižující cytopatický efekt) stanovení

Antivirové stanovení lidských interferonů je založeno na indukci buněčné odpovědi v lidských buňkách, která zamezuje nebo snižuje cytopatický efekt infekčního viru. Účinnost interferonu se stanoví porovnáním jeho ochranného účinku proti virovému cytopatickému efektu se stejným účinkem vhodného porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

• 3 Stanovení interferonu používající Hep2c buňky a virus infekční encefalomyokarditidy

Popsané stanovení lidských interferonů je typu snižujícího cytopatický efekt. K měření účinnosti různých zkoušených přípravků lidského interferonu se používají lidské Hep2c buňky infikované virem encefalomyokarditidy (EMCV). Toto stanovení bylo použito ve třech mezinárodních kolaborativních studiích pro navržené mezinárodní standardy, pořádaných Světovou zdravotnickou organizací pro lidský interferon alfa, lidský interferon beta a lidský interferon gama a opakovaně bylo prokázáno, že je citlivé, spolehlivé a reprodukovatelné pro stanovení účinnosti různých typů lidského interferonu.

S kulturami savčích buněk se vždy zachází podle standardních operačních postupů pro udržení kultur buněčných linií. Objemy zkoumadel jsou stanoveny pro buněčné kultury pěstované v láhvích o ploše 75 cm^2. Mohou se použít jiné typy nádob (láhve nebo destičky), ale musí se podle toho upravit objemy zkoumadel.

• 3.1 Udržování a příprava hep2c buněk

Hep2c buňky se udržují a pasážují v živném médiu A. Buňky se uchovávají jako zmrazená zásoba podle standardního postupu. Rostoucí buňky se udržují až do povolené 30. pasáže, po které se založí nové kultury ze zmrazených zásob.

Na začátku postupu stanovení se sklidí buňky z láhví narostlých na 90% buněčné monomolekulární vrstvy za použití dále popsaného postupu trypsinizace:

• odstraní se živné médium z láhví,

• do každé láhve se přidá 5 ml trypsinového roztoku zahřátého na 37 °C (zásobní roztok trypsinu obsahuje 4 mg/ml trypsinu R a 4 mg/ml edetanu disodného R, bezprostředně před použitím se padesátkrát zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným); monomolekulární vrstva se opláchne krouživým pohybem zazátkované láhve, přebytek trypsinového roztoku se odstraní,

• láhve se inkubují 5 min až 10 min při 37 °C, známky odtržení buněk se pozorují mikroskopicky nebo prostým okem. Při mikroskopickém pozorování se buňky zdají kroužit nebo oddělené a volně plavající. Láhví se silně třese, aby se uvolnily všechny buňky, a přidá se asi 5 ml živného média A. Opět se láhví silně třese, aby se utvořila suspenze jednotlivých buněk,

• připraví se buněčná suspenze pro stanovení, buňky se pipetováním opatrně rozptýlí, aby se rozpadly buněčné shluky, buňky se spočítají a naředí na koncentraci 6.10^5 buněk v 1 ml.

• 3.2 Pomnožení viru encefalomyokarditidy

Virus encefalomyokarditidy (EMCV) se pomnoží na myších buňkách L-929, aby se připravila zásoba původního viru. Buňky L-929 se trypsinizují a pasážují stejně jako buňky Hep2c (Poznámka: jestliže buňky špatně rostou, je nezbytné nahradit neonatální telecí sérum bovinním sérem fetálním).

Z několika láhví obsahujících splývající kultury buněk L-929 se odstraní médium. Inokuluje se po 2 ml suspenze EMCV ředěné živným médiem B tak, aby obsahovala asi 2,5.10^8 PFU/ml. Každá láhev obsahuje 4 až 6.10^7 buněk L-929, a proto bude mnohonásobnost infekce asi 10 PFU na buňku. Virová suspenze se opatrně krouživým pohybem rozestře po celé buněčné monomolekulární vrstvě a láhve se asi na 1 h vrátí do inkubátoru. Živné médium se udržuje při pH 7,4 až 7,8.

Po adsorpci EMCV se do každé infikované Iáhve přidá 40 ml živného média B a Iáhve se asi na 30 h vrátí do inkubátoru při 37 °C. Aby se získalo maximální množství viru, udržuje se pH média na hodnotě 7,4 až 7,8. Kultivační tekutina se z láhví odstraní a uchovává se při asi 40 °C.

Láhve se umístí do -20 °C, aby buněčná monomolekulární vrstva zmrzla. Poté se nechá roztát při pokojové teplotě. Přidá se asi 5 ml živného média a láhve se protřepou, aby se buněčné stěny rozrušily. Obsah každé láhve se převede do nádoby obsahující kultivační tekutinu z buněk. Kultivační tekutina obsahující EMCV se převede do plastových centrifugačních zkumavek a odstřeďuje se 10 min při 500 g, aby se odstranily zbytky buněk. Čirá tekutina se rozplní do skleněných nádob se šroubovacím uzávěrem po objemech např. 20 ml, 10 ml, 5 ml, 1 ml, 0,5 ml nebo 0,2 ml, jak je vhodné. Uchovává se při teplotách -70 °C. Větší objemy se mohou rozmrazit, rozplnit po menších množstvích a opět zmrazit, je-li to žádáno. Zásoba EMCV si uchová původní titr při stálém uchovávání při -70 °C, ale opakovaným rozmrazováním, případně uchováváním při vyšší teplotě, např. při asi -20 °C, dochází k postupným ztrátám titru.

• 3.3 Postup stanovení

• 3.3.1 Určení rozmezí dávka - odpověď

Příprava roztoků

Naředí se příslušný standard interferonu (např. specifický subtypový interferonový standard SZO) v živném médiu A, v desetinásobných dávkových přírůstcích, aby se obdržely dávky pokrývající rozpětí od 1000 m.j./ml do 0,001 m.j./ml. Stanovení se provede v mikrotitračních destičkách o 96 jamkách. Každá jamka obsahuje 100 μl živného média A. Do všech jamek, kromě jamek obsahujících kontroly viru, se přidá 100 μl každého ředění porovnávacího přípravku. Obsahy jamek se promíchají pomocí vícekanálové pipety na 100 μl.

Rozdělení buněčné suspenze

Buněčná suspenze Hep2c buněk, obsahující asi 6.10^5 buněk ml v živném médiu A se vyleje do plastové Petriho misky. Buněčná suspenze se z Petriho misky rozplní do všech jamek mikrotitrační destičky pomocí vícekanálové pipety po 100 μl.

Destičky se inkubují asi 24 h v inkubátoru při 37 °C a v 5% atmosféře oxidu uhličitého.

Virová infekce

V tuto dobu se pomocí inverzního mikroskopu kontroluje, zda je monomolekulární vrstva Hep2c buněk souvislá, zda vykazuje dostatečné rozvrstvení buněk a zda buňky mají správnou morfologii a zda jsou zdravé.

Většina živného média z jamek se odstraní obrácením destičky a odstříknutím na papírovou utěrku (stejně se provádí odstranění tekutiny z mikrotitračních destiček popsané později). Zásoba EMCV se naředí čerstvým kultivačním médiem A na titr asi 3.10^7 PFU/ml (Poznámka: na každou destičku je zapotřebí asi 20 ml ředěného viru, plus 5 % až 10 % navíc). Ředěná suspenze se rozplní z 9cm sterilních Petriho misek vícekanálovou pipetou po 200 μl do všech jamek destičky, včetně jamek obsahujících virovou kontrolu, ale s výjimkou jamek obsahujících kontrolu buněk. Do všech jamek obsahujících buněčné kontroly se přidá po 200 μl živného média A (bez viru). Destičky se na 24 h vrátí do inkubátoru při 37 °C a 5% atmosféře oxidu uhličitého.

Barvení

Destičky se mikroskopicky vyšetří, aby se zkontrolovalo, zda EMCV vyvolal cytopatický efekt ve virových kontrolách. Časový interval pro maximální cytopatický efekt může kolísat od zkoušky ke zkoušce, pro vlastní variabilitu buněk Hep2c k virové čelenži po danou dobu kontinuální kultivace.

Většina kultivačního média se odstraní z jamek odstříknutím do vhodného dekontaminačního roztoku (vhodný je chlornan sodný). Do každé jamky se přidá tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným o pH 7,4. Také tento tlumivý roztok se odstraní do dekontaminačního roztoku a do každé jamky se přidá 150 μl barvicího roztoku. Buňky se barví 30 min při pokojové teplotě. Barvicí roztok se rovněž odstraní do dekontaminačního roztoku. Přidá se 150 μl fixačního roztoku a nechá se působit 10 min při pokojové teplotě. Fixační roztok se odstraní do dekontaminačního roztoku a buněčné monomolekulární vrstvy se promyjí ponořením mikrotitračních destiček do plastového boxu s tekoucí vodou. Voda se sleje a povrch destiček se osuší papírovým tamponem. Destičky se ponechají při 20 °C až 37 °C do úplného odpaření vlhkosti.

Do každé jamky se přidá 150 μl hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS. Zbytky barvy se odstraní mírným protřásáním destiček nebo poklepáváním o dlaň ruky. Před spektrofotometrickým odečítáním je třeba mít jistotu, že barva je ve všech jamkách rozložena rovnoměrně.

Používá se čtecí zařízení pro destičky a měří se adsorbance při 610 nm až 620 nm proti prázdné jamce nebo řadě jamek neobsahujících buňky, ale asi 150 μl hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS.

Stanoví se koncentrace interferonového standardu, způsobující minimální a maximální redukci cytopatického efektu. To je dávková odpověď udávající pracovní rozmezí při stanovení.

• 3.3.2 Provedení zkoušky

Zkouška se provede tak, jak je uvedeno výše, přičemž:

• jako zkoušené roztoky se použije řada roztoků zkoušené látky ředěná živným médiem A ve dvojnásobných ředěních tak, aby se dosáhly jmenovité koncentrace pokrývající pracovní rozmezí při stanovení,

• jako porovnávací roztoky se použije řada roztoků vhodného standardu interferonu (např. specifický SZO subtyp interferonu) ředěných živným médiem A ve dvojnásobných ředěních tak, aby se dosáhly jmenovité koncentrace pokrývající pracovní rozmezí pro stanovení.

• 3.3.3 Analýza dat

Výsledky stanovení redukce cytopatického efektu obecně odpovídají sigmoidní křivce odpovědi na dávce, jestliže se vynesou koncentrace interferonu (převrácený logaritmus ředění interferonu) proti absorbanci barvy.

Vynese se koncentrace interferonu (převrácený log ředění) proti absorbanci barvy pro porovnávací přípravek interferonu a pro roztoky zkoušeného interferonu. Z lineární části křivky se vypočítá koncentrace interferonu ve vzorku srovnáním odpovědí zkoušeného a porovnávacího roztoku za použití obvyklých statistických metod pro model rovnoběžnosti.

• 4 Validace jiných postupů

• 4.1 Výběr buněčné linie a viru

Pro antivirové stanovení účinnosti interferonu byly použity různé kombinace buněčných linií a virů.

Např. EMCV se použije v kombinaci s linií A549 lidských plicních epitelových nádorových buněk, Semliki Forest virus nebo virus Sindbis se použije s lidskými fibroblasty a virus vesikulární stomatitidy s jinými lidskými diploidnímí fibroblasty, s linií WISH lidských amniotických buněk nebo s linií Madin-Darby ledvinných buněk skotu. V každém případě záleží výběr kombinace virus-buněčná linie na co nejcitlivější odpovědi a zda dává zkoušený interferonový přípravek rovnoběžné odpovědi při srovnávání zkoušeného přípravku a interferonového standardu.

• 4.2 Výběr odpovědi

Shora popsaný postup barvení měří zbylé živé buňky. Bylo použito mnoho jiných odpovědí včetně barvení violetí methylovou nebo violetí krystalovou nebo postup přeměny modře thiazolylové (MTT).

V každém případě tato metoda byla vybrána na základě toho, že vytváří vhodnou lineární a citlivou závislost barevné odpovědi na počtu živých buněk.

• 4.3 Statistická validace

Jako ve všech biologických stanovení využívajících model rovnoběžnosti, musí toto stanovení účinnosti splňovat obvyklá statistická kritéria linearity odpovědi, rovnoběžnosti a variability.

• 4.4 Validace plánu zkoušky

Stejně jako u ostatních zkoušek prováděných na mikrotitračních destičkách se věnuje pozornost validaci plánu zkoušky. Zvláště se musí vyšetřit a odstranit možnost chyb způsobených špatným pořadím při pipetování nebo okrajové jevy destičky, a to náhodným rozmístěním v plánu zkoušky nebo vyloučením použití krajních jamek.

Zkoumadla a živná média

Živné médium A (10 % neonatálního telecího séra)
RPMI 1640 živné médium, doplněné podle potřeby antibiotiky
(penicilin 10 000 m.j./ml; streptomycin 10 ng/ml)	450 ml
L-glutamin 0,2 mol/l, sterilní roztok	5 ml
neonatální telecí sérum	50 ml
Živné médium Β (2 % fetálního bovinního séra)
RPMI 1640 živné médium, doplněné podle potřeby antibiotiky
(penicilin 10 000 m.j./ml; streptomycin 10 ng/ml)	490 ml
L-glutamin 0,2 mol/l, sterilní roztok	5 ml
fetální bovinní sérum	10 ml
Barvicí roztok
čerň naftalenová	0,5 g
kyselina octová ledová	90 ml
octan sodný bezvodý	8,2 g
voda do	1000 ml
Fixační roztok
roztok formaldehydu 40%	100 ml
kyselina octová ledová	90 ml
octan sodný bezvodý	8,2 g
voda do	1000 ml

5.7 Tabulka fyzikálních vlastností radionuklidů [image omitted]

Následující tabulka doplňuje článek Radiofarmaca.

Hodnoty jsou získány z databáze Národního jaderného centra dat (National Nuclear Data Center (NNDC) at Brookhaven National Laboratory, Upton, N.Y., USA) prostřednictvím internetu na adrese: „http://www.nndc.bnl.gov/nndc/nudat/radform.html“.

V případě jiných zdrojů se upřednostňují novější hodnoty. Jejich zdroje jsou následující:

*	DAMRI (Département des Applications et de la Métrologie des Rayonnements Ionisants, CEA Gif-sur-Yvette, Francie).
**	PTB (Physikalisch-Technische Bundesanstalt, Braunschweig, SRN),
***	NPL (National Physical Laboratory, Teddington, Middlesex, UK).

Proměnlivost poločasů přeměny je uvedena v závorkách. V zásadě čísla v závorkách jsou standardem nejistoty odpovídající posledním číslům dané číselné hodnoty podle „Pokynů pro vyjádření nejistoty měření“, Mezinárodní organizace pro normalizaci (ISO), 1993, ISBN 92-67-10188-9.

Použité zkratky mají tento význam:

eA = Augerovy elektrony

ce = konverzní elektrony

β^- = elektrony

β^+ = pozitrony

γ = gama záření

rtg = rentgenové záření

| Radionuklid | Poločas přeměny | Emise elektronů | Emise fotonů | | | | | | Druh | Energie (MeV) | Pravděpo- dobnost emise na 100 přeměn | Druh | Energie (MeV) | Pravděpo- dobnost emise na 100 přeměn | | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | tritium (3H) | 12,33 (6) roků | β- | 0,0061) (max: 0,019) | 100 | | | | | uhlík-11 (11C) | 20,385 (20) minut | β+ | 0,3861) (max: 0,960) | 99,8 | γ | 0,511 | 199,52) | | dusík-13 (13a) | 9,965 (4) minut | β+ | 0,4921) (max: 1,198) | 99,8 | γ | 0,511 | 199,62) | | kyslík-15 (15O) | 122,24 (16) sekund | β+ | 0,7351) (max: 1,732) | 99,9 | γ | 0,511 | 199,82) | | fluor-18 (18F) | 109,77 (5) minut | β+ | 0,2501) (max: 0,633) | 96,7 | γ | 0,511 | 193,52) | | fosfor-32 (32P) | 14,26 (4) dnů | β- | 0,6951) (max: 1,71) | 100 | | | | | fosfor-33 (33P) | 25,34 (12) dnů | β- | 0,0761) (max: 0,249) | 100 | | | | | síra-35 (35S) | 87,51 (12) dnů | β- | 0,0491) (max: 0,167) | 100 | | | | | chrom-51 (51Cr) | 27,7025 (24) dnů | eA | 0,004 | 67 | rtg | 0,005 | 22,3 | | | | | | γ | 0,320 | 9,9 | | | kobalt-56 (56Co) | 77,27 (3) dnů | eA | 0,006 | 47 | rtg | 0,006 - 0,007 | 25 | | | β+ | 0,1791) | 0,9 | γ | 0,511 | 38,02) | | | | | 0,6311) | 18,1 | | 0,847 | 100,0 | | | | | | | | 1,038 | 14,1 | | | | | | | | 1,175 | 2,2 | | | | | | | | 1,238 | 66,1 | | | | | | | | 1,360 | 4,3 | | | | | | | | 1,771 | 15,5 | | | | | | | | 2,015 | 3,0 | | | | | | | | 2,035 | 7,8 | | | | | | | | 2,598 | 17,0 | | | | | | | | 3,202 | 3,1 | | | | | | | | 3,253 | 7,6 | | | kobalt-57 (57Co) | 271,79 (9) dnů | eA + ce | 0,006 - 0,007 | 177,4 | rtg | 0,006 - 0,007 | 57 | | | ce | 0,014 | 7,4 | γ | 0,014 | 9,2 | | | | | 0,115 | 1,8 | | 0,122 | 85,6 | | | | | 0,129 | 1,3 | | 0,136 | 10,7 | | | | | | | | 0,692 | 0,15 | | | kobalt-58 (58Co) | 70,86 (7) dnů | eA | 0,006 | 49,4 | rtg | 0,006 - 0,007 | 26,3 | | | β+ | 0,2011) | 14,9 | γ | 0,511 | 29,92) | | | | | | | | 0,811 | 99,4 | | | | | | | | 0,864 | 0,7 | | | | | | | | 1,675 | 0,5 | | | kobalt-60 (60Co) | 5,2714 (5) roků | β- | 0,0961) | 99,9 | γ | 1,173 | 100,0 | | | | (max: 0,318) | | | 1,333 | 100,0 | | | gallium-66 (66Ga) | 9,49 (7) hodin | eA | 0,008 | 21 | rtg | 0,009 - 0,010 | 19,1 | | | β+ | 0,1571) | 1 | γ | 0,511 | 1122) | | | | | 0,3311) | 0,7 | | 0,834 | 5,9 | | | | | 0,3971) | 3,8 | | 1,039 | 37 | | | | | 0,7821) | 0,3 | | 1,333 | 1,2 | | | | | 1,901) | 50 | | 1,919 | 2,1 | | | | | | | | 2,190 | 5,6 | | | | | | | | 2,432 | 1,9 | | | | | | | | 2,752 | 23,4 | | | | | | | | 3,229 | 1,5 | | | | | | | | 3,381 | 1,5 | | | | | | | | 3,792 | 1,1 | | | | | | | | 4,086 | 1,3 | | | | | | | | 4,295 | 4,1 | | | | | | | | 4,807 | 1,8 | | | gallium-67 (67Ga) | 3,2612 (6) dnů | eA | 0,008 | 62 | rtg | 0,008 - 0,010 | 57 | | | ce | 0,082 - 0,084 | 30,4 | γ | 0,091 - 0,093 | 42,4 | | | | | 0,090 - 0,092 | 3,6 | | 0,185 | 21,2 | | | | | 0,175 | 0,3 | | 0,209 | 2,4 | | | | | | | | 0,300 | 16,8 | | | | | | | | 0,394 | 4,7 | | | | | | | | 0,888 | 0,15 | | | germanium-68 (68Ge) v rovnováze s galliem-68 (68Ga) | 270,82 (27) dnů | eA | 0,008 | 42,4 | rtg | 0,009 - 0,010 | 44,1 | | | | | | | | | | | (68Ga: 67,629 (24) | β+ | 0,3531) | 1,2 | γ | 0,511 | 178,3 | | | minut) | | 0,8361) | 88,0 | | 1,077 | 3,0 | | | | | | | | | | | | gallium-68 (68Ga) | 67,629 (24) minut | eA | 0,008 | 5,1 | rtg | 0,009 - 0,010 | 4,7 | | | | | | | | | | | | β+ | 0,3531) | 1,2 | γ | 0,511 | 178,3 | | | | | 0,8361) | 88,0 | | 1,077 | 3,0 | | | krypton-81m (81mKr) | 13,10 (3) sekund | ce | 0,176 | 26,4 | rtg | 0,012 - 0,014 | 17,0 | | | | 0,189 | 4,6 | | | | | | | | | | γ | 0,190 | 67,6 | | | rubidium-81 (81Rb) v rovnováze s kryptonem-81m (81mKr) | 4,576 (5) hodin | eA | 0,011 | 31,3 | rtg | 0,013 - 0,014 | 57,2 | | | ce | 0,176 | 25,0 | γ | 0,190 | 64 | | | | | 0,188 | 4,3 | | 0,446 | 23,2 | | | (81mKr: 13,10(3) | | | | | 0,457 | 3,0 | | | sekund) | β+ | 0,2531) | 1,8 | | 0,510 | 5,3 | | | | | 0,4471) | 25,0 | | 0,511 | 54,2 | | | | | | | | 0,538 | 2,2 | | | stroncium-89 (89Sr) v rovnováze s yttriem-89m (89mY) | 50,53 (7) dnů | β- | 0,5831) | 99,99 | γ | 0,909 | 0,01 | | | | (max: 1,492) | | | | | | | (89mY: | | | | | | | | | 16,06 (4) sekund) | | | | | | | | | stroncium-90 (90Sr) v rovnováze s yttriem-90 (90Y) | 28,74 (4) roků | β- | 0,1961) | 100 | | | | | (90Y: 64,10 (8) | | (max: 0,546) | | | | | | | hodin) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | yttrium-90 (90Y) | 64,10 (8) hodin | β- | 0,9341) | 100 | | | | | | | (max: 2,280) | | | | | | | molybden-99 (99Mo) v rovnováze s techneciem-99m (99mTc) | 65,94 1) hodin | β- | 0,1331) | 16,4 | rtg | 0,018 - 0,021 | 3,6 | | | | 0,2901) | 1,1 | | | | | | | | 0,4431) | 82,4 | γ | 0,041 | 1,1 | | | | | | | | 0,141 | 4,5 | | | | | | | | 0,181 | 6 | | | (99mTc: 6,01 (1) | | | | | 0,366 | 1,2 | | | hodin) | | | | | 0,740 | 12,1 | | | | | | | | 0,778 | 4,3 | | | technecium-99m (99mTc) | 6,01 (1) hodin | ce | 0,002 | 74 | rtg | 0,018 - 0,021 | 7,3 | | | | | | | | | | | | eA | 0,015 | 2,1 | γ | 0,141 | 89,1 | | | | ce | 0,120 | 9,4 | | | | | | | | 0,137-0,140 | 1,3 | | | | | | technecium-99 (99Tc) | 2,11 × 105 roků | β- | 0,0851) | 100 | | | | | | | (max: 0,294) | | | | | | | ruthenium-103 (103Ru) v rovnováze s rhodiem-103m (103mRh) | 39,26 (2) dnů | eA+ce | 0,017 | 12 | rtg | 0,020 - 0,023 | 9,0 | | | | | | | | | | | (103mRh: | ce | 0,030 - 0,039 | 88,3 | γ | 0,497 | 91 | | | 56,114 (20) minut) | | | | | 0,610 | 5,8 | | | | β- | 0,0311) | 6,6 | | | | | | | | 0,0641) | 92,2 | | | | | | indium-110 (110In) | 4,9 (1) hodin | eA | 0,019 | 13,4 | rtg | 0,023 - 0,026 | 70,5 | | | | | | | | | | | | | | | γ | 0,642 | 25,9 | | | | | | | | 0,658 | 98,3 | | | | | | | | 0,885 | 92,9 | | | | | | | | 0,938 | 68,4 | | | | | | | | 0,997 | 10,5 | | | indium-110m (110mIn) | 69,1 (5) minut | eA | 0,019 | 5,3 | rtg | 0,023 - 0,026 | 27,8 | | | | | | | | | | | | β+ | 1,0151) | 61 | γ | 0,511 | 123,42) | | | | | | | | 0,658 | 97,8 | | | | | | | | 2,129 | 2,1 | | | indium-111 (111In) | 2,8047 (5) dnů | eA | 0,019 | 15,6 | rtg | 0,003 | 6,9 | | | | | | | 0,023 - 0,026 | 82,3 | | | | ce | 0,145 | 7,8 | γ | | | | | | | 0,167 - 0,171 | 1,3 | | 0,171 | 90,2 | | | | | 0,219 | 4,9 | | 0,245 | 94,0 | | | | | 0,241 - 0,245 | 1,0 | | | | | | indium-114m (114mIn) v rovnováze s indiem-114 (114In) | 49,51(1) dnů | ce | 0,162 | 40 | rtg | 0,023 - 0,027 | 36,3 | | | | 0,186 - 0,190 | 40 | | | | | | (114In: 71,9(1) | β- | | | γ | 0,190 | 15,6 | | | sekund) | | 0,7771) | 95 | | 0,558 | 3,2 | | | | | (max: 1,985) | | | 0,725 | 3,2 | | | tellur-121m (121mTe) v rovnováze s tellurem-121 (121Te) | 154,0 (7) dnů | eA | 0,003 | 88,0 | rtg | 0,026 - 0,031 | 50,5 | | | | 0,022 - 0,023 | 7,4 | | | | | | (121Te: 19,16(5) | ce | | | γ | 0,212 | 81,4 | | | dnů) | | 0,050 | 33,2 | | 1,102 | 2,5 | | | | | 0,077 | 40,0 | | | | | | | | 0,180 | 6,1 | | | | | | tellur-121 (121Te) | 19,16(5) dnů | eA | 0,022 | 11,6 | rtg | 0,026 - 0,030 | 75,6 | | | | | | γ | 0,470 | 1,4 | | | | | | | | 0,508 | 17,7 | | | | | | | | 0,573 | 80,3 | | | jod-123 (123I) | 13,27 (8) hodin | eA | 0,023 | 12,3 | rtg | 0,004 | 9,3 | | | | | | | 0,027 - 0,031 | 86,6 | | | | ce | 0,127 | 13,6 | | | | | | | | 0,154 | 1,8 | γ | 0,159 | 83,3 | | | | | 0,158 | 0,4 | | 0,346 | 0,1 | | | | | | | | 0,440 | 0,4 | | | | | | | | 0,505 | 0,3 | | | | | | | | 0,529 | 1,4 | | | | | | | | 0,538 | 0,4 | | | jod-125 (125I) | 59,402 (14) dnů | eA + ce | 0,004 | 80 | rtg | 0,004 | 15,5 | | | | 0,023 - 0,035 | 33 | | 0,027 | 114 | | | | | | | | 0,031 | 26 | | | | | | | γ | 0,035 | 6,7 | | | jod-126(126I) | 13,11 (5) dnů | eA | 0,023 | 6 | rtg | 0,027 - 0,031 | 42,2 | | | ce | 0,354 | 0,5 | γ | 0,388 | 34 | | | | | 0,634 | 0,1 | | 0,491 | 2,9 | | | | | | | | 0,511 | 2,32) | | | | β- | 0,1091) | 3,6 | | 0,666 | 33 | | | | | 0,2901) | 32,1 | | 0,754 | 4,2 | | | | | 0,4591) | 8,0 | | 0,880 | 0,8 | | | | β+ | | | | 1,420 | 0,3 | | | | | 0,5301) | 1 | | | | | | jod-131 (131I) | 8,020 70 (11) dnů | ce | 0,46 | 3,5 | rtg | 0,029 - 0,030 | 3,9 | | | | 0,330 | 1,6 | | | | | | | | | | γ | 0,080 | 2,6 | | | | β- | 0,0691) | 2,1 | | 0,284 | 6,1 | | | | | 0,0971) | 7,3 | | 0,365 | 81,7 | | | | | 0,1921) | 89,9 | | 0,637 | 7,2 | | | | | | | | 0,723 | 1,8 | | | xenon-131m (131mXe) | 11,84 (7) dnů | eA | 0,025 | 6,8 | rtg | 0,004 | 8,3 | | | | | | | 0,030 | 44,0 | | | | ce | 0,129 | 61 | | 0,034 | 10,2 | | | | | 0,159 | 28,5 | | | | | | | | 0,163 | 8,3 | γ | 0,164 | 2,0 | | | jod-133 (133I) (přeměna na radioaktiní xenon-133 | 20,8(1) hodin | β- | 0,1401) | 3,8 | γ | 0,530 | 87 | | | | 0,1621) | 3,2 | | 0,875 | 4,5 | | | | | 0,2991) | 4,2 | | 1,298 | 2,4 | | | | | 0,4411) | 83 | | | | | | xenon-133 (133Xe) | 5,243 (1) dnů | eA | 0,026 | 5,8 | rtg | 0,004 | 6,3 | | | | | | | 0,031 | 40,3 | | | | ce | 0,045 | 55,1 | | 0,035 | 9,4 | | | | | 0,075 - 0,080 | 9,9 | | | | | | | β- | | | γ | 0,080 | 38,3 | | | | | 0,1011) | 99,0 | | | | | | xenon-133m (133mXe) (přeměna na radioaktivní xenon-133) | 2,19 (1) dnů | eA | 0,025 | 7 | rtg | 0,004 | 7,8 | | | | | | | 0,030 | 45,9 | | | | | 0,199 | 64,0 | | 0,034 | 10,6 | | | | ce | 0,228 | 20,7 | | | | | | | | 0,232 | 4,6 | γ | 0,233 | 10,0 | | | jod-135 (135I) (přeměna na radioaktivní xenon-135 | 6,57 (2) hodin | β- | 0,1401) | 7,4 | γ | 0,527 | 13,8 | | | | 0,2371) | 8 | | 0,547 | 7,2 | | | | | 0,3071) | 8,8 | | 0,837 | 6,7 | | | | | 0,3521) | 21,9 | | 1,039 | 8,0 | | | | | 0,3991) | 8 | | 1,132 | 22,7 | | | | | 0,4441) | 7,5 | | 1,260 | 28,9 | | | | | 0,5291) | 23,8 | | 1,458 | 8,7 | | | | | | | | 1,678 | 9,6 | | | | | | | | 1,791 | 7,8 | | | xenon-135 (135Xe) | 9,14 (2) hodin | ce | 0,214 | 5,5 | rtg | 0,031 - 0,035 | 5,0 | | | | | | | | | | | | β- | 0,171 | 3,1 | γ | 0,250 | 90,2 | | | | | 0,308 | 96,0 | | 0,608 | 2,9 | | | cesium-137 (137Cs) v rovnováze s baryem-137m (137mBa) | 30,04 (3) roků | eA | 0,026 | 0,8 | rtg | 0,005 | 1 | | | | | | | 0,032 - 0,036 | 7 | | | (137mBa: 2,552 (1) | ce | 0,624 | 8,0 | | | | | | minut | | 0,656 | 1,4 | γ | 0,662 | 85,1 | | | | β- | 0,1741) | 94,4 | | | | | | | | 0,4161) | 5,6 | | | | | | thallium-200 (200Tl) | 26,1 (1) hodin | ce | 0,285 | 3,4 | rtg | 0,010 | 32,0 | | | | 0,353 | 1,4 | | 0,069 - 0,071 | 63,3 | | | | | | | | 0,08 | 17,5 | | | | β+ | 0,4951) | 0,3 | | | | | | | | | | γ | 0,368 | 87,2 | | | | | | | | 0,579 | 13,8 | | | | | | | | 0,828 | 10,8 | | | | | | | | 1,206 | 29,9 | | | | | | | | 1,226 | 3,4 | | | | | | | | 1,274 | 3,3 | | | | | | | | 1,363 | 3,4 | | | | | | | | 1,515 | 4,0 | | | olovo-201 (201Pb) (přeměna na radioaktivní thallium-201) | 9,33 (3) hodin | eA | 0,055 | 3 | rtg | 0,070 - 0,073 | 69 | | | | | | | 0,083 | 19 | | | | ce | 0,246 | 8,5 | | | | | | | | 0,276 | 2 | γ | 0,331 | 79 | | | | | 0,316 | 2,3 | | 0,361 | 9,9 | | | | | | | | 0,406 | 2,0 | | | | | | | | 0,585 | 3,6 | | | | | | | | 0,692 | 4,3 | | | | | | | | 0,767 | 3,2 | | | | | | | | 0,826 | 2,4 | | | | | | | | 0,908 | 5,7 | | | | | | | | 0,946 | 7,9 | | | | | | | | 1,099 | 1,8 | | | | | | | | 1,277 | 1,6 | | | thallium-201 (201Tl) | 72,912 (17) hodin | ce | 0,016 - 0,017 | 17,7 | rtg | 0,010 | 46,0 | | | | 0,027 - 0,029 | 4,1 | | 0,069 - 0,071 | 73,7 | | | | | 0,052 | 7,2 | | 0,080 | 20,4 | | | | | 0,084 | 15,4 | | | | | | | | 0,153 | 2,6 | γ | 0,135 | 2,6 | | | | | | | | 0,167 | 10,0 | | | thallium-202 (202Tl) | 12,23 (2) dnů | eA | 0,054 | 2,8 | rtg | 0,010 | 31,0 | | | | | | | 0,069 - 0,071 | 61,6 | | | | | 0,357 | 2,4 | | 0,080 | 17,1 | | | | ce | | | γ | 0,440 | 91,4 | | | olovo-203 (203Pb) | 51,873 (9) hodin | eA | 0,055 | 3,0 | rtg | 0,010 | 37,0 | | | | | | | 0,071 - 0,073 | 69,6 | | | | | 0,194 | 13,3 | | 0,083 | 19,4 | | | | ce | | | | | | | | | | | | γ | 0,279 | 80,8 | | | | | | | | 0,401 | 3,4 | |

^1) střední energie spektra beta

^2) pravděpodobnost maximální emise odpovídající úplné anihilaci ve zdroji na 100 přeměn

“

• 1. V příloze části 5 Všeobecné dodatky, Tabulka č. I zní:

„

Tabulka I: Omamné a psychotropní látky^1) N

Obsahuje pouze lékopisné látky podléhající ustanovení zákona č. 117/2000 Sb. ze dne 6. dubna 2000, kterým se mění zákon č. 167/1998 Sb., o návykových látkách a o změně některých dalších zákonů (dále jen „zákon č. 117/2000 Sb.“). Omamnými látkami a psychotropními látkami se ve smyslu zákona č. 167/1998 Sb. rozumí návykové látky uvedené v příloze č. 1 až 7 tohoto zákona. Zákon o návykových látkách upravuje též zacházení s prekursory a pomocnými látkami, tj. s látkami používanými při výrobě nebo zpracování omamných a psychotropních látek. Prekursorem se ve smyslu zákona 167/1998 Sb. rozumí látka uvedená v příloze č. 9 tohoto zákona a pomocnou látkou se rozumí látka uvedená v příloze č. 10 nebo v příloze č. 11 zákona č. 117/2000 Sb. U pomocných látek zákon stanoví jen povinnost jejich výrobců, vývozců, dovozců a prodejců zaregistrovat se u Ministerstva zdravotnictví a výrobci, vývozci a dovozci těchto pomocných látek mají ještě ohlašovací povinnost.