Vyhláška o metodách zkoušení a způsobu odběru a přípravy kontrolních vzorků

— V souladu s ustanovením § 9 této vyhlášky by měly být laboratoře akreditovány pověřeným orgánem pracujícím podle pokynů Mezinárodní normalizační organizace č. 58, aby bylo zajištěno, že uplatňují systém zabezpečování jakosti. Laboratoře by měly být akreditovány podle normy ISO/IEC/17025:1999.

• 1. Požadavky, které musí splňovat analytická metoda pro stanovení dioxinů a polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem

Základní požadavky na přijatelnost analytických postupů:

— Vysoká citlivost a nízká mez detekce. V případě dibenzo-1,4-dioxinů a polychlorovaných dibenzofuranů musí být z důvodu extrémní toxicity některých těchto sloučenin možné detekovat množství na pikogramové úrovni toxického ekvivalentu (10^-12 g). Je známo, že se polychlorované bifenyly vyskytují ve vyšších koncentracích než dibenzo-1,4-dioxiny a polychlorované dibenzofurany. U většiny kongenerů polychlorovaných bifenylů je dostačující již nanogramová citlivost na úrovni (10^-9 g). Pro stanovení toxičtějších kongenerů polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem (zejména kongenerů nesubstituovaných chlorem v ortho-polohách) musí být dosaženo stejné citlivosti jako pro stanovení dibenzo-1,4-dioxinů a polychlorovaných dibenzofuranů.

— Vysoká specifičnost. Dibenzo-1,4-dioxiny, polychlorované dibenzofurany a polychlorované bifenyly s dioxinovým efektem je třeba rozlišit od ostatních sloučenin, které se extrahují společně s těmito látkami, mohou rušit při jejich stanovení a jsou přítomny v koncentracích až o několik řádů vyšších než koncentrace zájmových analytů. U metod založených na plynové chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrie je nezbytné rozlišit mezi různými kongenery, tj. mezi toxickými kongenery (např. sedmnácti dibenzo-1,4-dioxiny a polychlorovanými dibenzofurany substituovanými v polohách 2,3,7,8 a polychlorovanmi bifenyly s dioxinovým efektem) a ostatními kongenery. Biotesty by měly umožnit určit hodnoty toxického ekvivalentu selektivně pro sumu dibenzo-1,4-dioxinů, polychlorovaných dibenzofuranů a polychlorované bifenyly s dioxinovým efektem.

— Vysoká správnost (pravdivost a přesnost). Stanovení by mělo poskytnout správný odhad skutečné koncentrace ve vzorku. Vysoká správnost (správnost měření: těsnost souhlasu mezi jediným výsledkem měření a skutečnou hodnotou nebo dohodnutou hodnotou) je nezbytná k tomu, aby nebyl zamítnut výsledek zkoušky vzorku na základě nespolehlivosti odhadu toxického ekvivalentu. Správnost je vyjádřena pravdivostí (rozdílem mezi střední hodnotou získanou měřením pro analyt v certifikovaném materiálu a certifikovanou hodnotou vyjádřeným v procentech této certifikované hodnoty) a přesností (přesnost se obvykle počítá jako směrodatná odchylka včetně opakovatelnosti a reprodukovatelnosti a vyjadřuje těsnost souhlasu mezi výsledky získanými několikerým opakováním experimentálního postupu za předepsaných podmínek).

Screeningovými metodami mohou být biotesty a metody založené na založených na plynové chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrie. Potvrzujícími metodami jsou metody založené na plynové chromatografii s vysokým rozlišením s detekcí hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Stanovení hodnoty celkového toxického ekvivalentu musí splňovat následující kritéria:

	Screeningové metody	Potvrzující metody
Podíl falešně negativních výsledků	< 1 %	-
Pravdivost	-	-20 % až +20 %
Variační koeficient	< 30 %	< 15 %

• 1. Specifické požadavky, které musí splňovat metody založené na plynové chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrie určené pro účely screeningu nebo potvrzování

— S cílem validovat postup zkoušky musí být na samém začátku postupu, např. před extrakcí, přidány vnitřní standardy 2,3,7,8-tetrachlor-substituovaných dibenzo-1,4-dioxinů a polychlorovaných dibenzofuranů značených isotopem ^13C (a standard polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem značený isotopem ^13C při stanovení polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem). Musí být přidán alespoň jeden kongener pro každou skupinu od tetra- do oktachlor dibenzo-1,4-dioxinů a dibenzofuranů (a alespoň jeden kongener pro každou ze skupin pro polychlorované bifenyly s dioxinovým efektem při stanovení polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem), popřípadě k tomu alespoň jeden kongener pro každý ion detekovaný hmotnostní spektrometrií pro monitorování dibenzo-1,4-dioxinů a polychlorovaných dibenzofuranů a polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem. Zejména v případě potvrzující metody je výhodou použití všech 17 vnitřních standardů 2,3,7,8-substituovaných dibenzo-1,4-dioxinů a dibenzofuranů značených isotopem ^13C a všech 12 vnitřních standardů polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem značených isotopem ^13C při stanovení polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem.

Za použití vhodných kalibračních roztoků by měly být stanoveny také relativní odezvy kongenerů, pro něž nebyly přidány sloučeniny značené isotopem ^13C.

— U potravin rostlinného původu nebo potravin živočišného původu s obsahem tuku nižším než 10 % je přídavek vnitřního standardu před extrakcí povinný. U potravin živočišného původu s obsahem tuku vyšším než 10 % lze vnitřní standard přidat buď před extrakcí, nebo po extrakci. Vhodným způsobem by měla být provedena validace účinnosti extrakce, a to v závislosti na okamžiku přidání vnitřních standardů a podle toho, zda se výsledky vztahují na výrobek nebo na obsah tuku.

— Před zkouškou plynovou chromatografií s detekcí hmotnostní spektrometrií musí být přidán 1 nebo 2 standardy pro stanovení výtěžnosti.

— Kontrola výtěžnosti je nezbytná. U potvrzujících metod by měly výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy ležet v intervalu 60 % až 120 %. Nižší nebo vyšší výtěžnosti jednotlivých kongenerů, zejména některých hepta- a oktachlordibenzodioxinů a dibenzofuranů jsou přijatelné za podmínky, že jejich příspěvek k hodnotě toxického ekvivalentu nepřekračuje 10 % celkové hodnoty toxického ekvivalentu (založené pouze na dibenzo-1,4-dioxinech a polychlorovaných dibenzofuranech). U screeningových metod by měly výtěžnosti ležet v intervalu od 30 % do 140 %.

— Separace dioxinů od rušících chlorovaných sloučenin, jako jsou polychlorované bifenyly a chlorované ethery bifenylu, by měla být provedena vhodnými chromatografickými technikami (upřednostňují se adsorbenty florisil, oxid hlinitý nebo aktivní uhlí).

— Rozlišení isomerů plynovou chromatografií musí být dostatečné (poměr píků mezi 1,2,3,4,7,8-hexachlordibenzofuranem a 1,2,3,6,7,8-hexachlordibenzofuranem - < 25 %).

— Stanovení by mělo být provedeno revidovanou metodou EPA 1613/B nebo jinou metodou se srovnatelnými charakteristikami účinnosti.

— U potravin s úrovní kontaminace dioxiny přibližně 1 pg toxického ekvivalentu (podle Světové zdravotnické organizace na gram tuku - toxický ekvivalent založen pouze na dibenzo-1,4-dioxinech a polychlorovaných dibenzofuranech) by neměl rozdíl mezi horním odhadem a dolním odhadem překročit 20 %. U potravin s nízkým obsahem tuku musí být při úrovni kontaminace přibližně 1 pg toxického ekvivalentu (podle Světové zdravotnické organizace na gram produktu) dodrženy tytéž požadavky. Při nižších úrovních kontaminace, např. 0,50 pg toxického ekvivalentu podle Světové zdravotnické organizace na gram produktu může být rozdíl mezi horním a dolním odhadem v rozmezí 25 až 40 %.

• 1. Screeningové metody zkoušení

• 7.1 Úvod

Screeningové metody mohou být využity při různých přístupech k provádění zkoušky: k čistému screeningu a ke kvantitativnímu zkoušení.

Screeningový přístup

Odezva vzorku je porovnávána s odezvou referenčního vzorku o zájmové úrovni. Vzorky s odezvou nižší než referenční vzorek se prohlásí za negativní, vzorky s vyšší odezvou se považují za pozitivní. Požadavky:

— Slepé a referenční vzorky za zařadí do každé zkoušené série, která je extrahována a zkoušena současně a za stejných podmínek. Referenční vzorky musí vykazovat zřetelně vyšší odezvu ve srovnání se slepým vzorkem.

— Kromě toho se zařadí referenční vzorky o poloviční a dvojnásobné koncentraci než je zájmová úroveň, aby se prokázalo správné provádění zkoušky v rozsahu odpovídajícím zájmové úrovni.

— Při zkoušení jiných matric musí být prokázána vhodnost referenčního vzorku (referenčních vzorků), a to přednostně zařazením vzorků, u nichž byla metodou metody založené na plynové chromatografii s vysokým rozlišením s detekcí hmotnostní spektrometrie. Stanovením hodnoty plynovou chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrií musí být prokázána hodnota toxického ekvivalentu blízká hodnotě v referenčním vzorku, nebo také slepého vzorku uměle obohaceného na tuto hodnotu.

— Vzhledem k tomu, že v biotestech nelze použít žádné vnitřní standardy, jsou testy opakovatelnosti velmi důležité pro získání informací o směrodatné odchylce v rámci zkušební série. Variační koeficient by měl být nižší než 30 %.

— U biotestů musí být vymezeny cílové sloučeniny, možné rušivé vlivy a nejvyšší přípustná úroveň ve slepém vzorku.

Kvantitativní zkoušení

Kvantitativní zkoušení vyžaduje sériové ředění standardního roztoku, dvakrát nebo třikrát opakované čištění a měření a rovněž zařazení slepých vzorků a kontroly výtěžnosti. Výsledky mohou být vyjadřovány v toxických ekvivalentech, přičemž se vychází z toho, že sloučeniny, jež způsobily signál, vyhovují principu toxického ekvivalentu. To lze realizovat pomocí tetrachlordibenzodioxinů (nebo standardní směsi tetrachlordibenzodioxin/tetrachlordibenzofuran), přičemž se sestrojí kalibrační křivka pro výpočet toxického ekvivalentu extraktu a tedy i vzorku. Poté se provede korekce na toxický ekvivalent slepého pokusu (aby se zohlednily nečistoty v použitých rozpouštědlech a chemikáliích) a na výtěžnost (vypočítanou z toxického ekvivalentu vzorku určeného pro řízení jakosti s toxickým ekvivalentem na zájmové úrovni). Je nezbytné poznamenat, že snížení výtěžnosti může být částečně způsobeno matricovými jevy anebo rozdíly mezi hodnotami faktorů toxické rovnocennosti v biotestech a oficiálními hodnotami faktorů toxické rovnocennosti podle Světové zdravotnické organizace.

• 7.2 Požadavky na metody zkoušení použité pro screening

— Pro screening mohou být použity metody založené na plynové chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrií a biotesty. U metod založených na plynové chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrií platí požadavky uvedené v bodě 6. Specifické požadavky na biotesty na buňkách jsou uvedeny v bodě 7.3 a požadavky na biotesty se sadami jsou uvedeny v bodě 7.4.

— Je nezbyté uvést, jaký je počet falešně pozitivních a falešně negativních výsledků ve velkých sadách vzorků s hodnotami ležícími nad a pod maximálním limitem nebo zásahovou úrovní ve srovnání s výsledky toxického ekvivalentu získanými potvrzujícími metodami zkoušení. Skutečný podíl falešně negativních výsledků by měl být nižší než 1 %. Podíl falešně pozitivních výsledků by měl být dostatečně nízký, aby bylo použití screeningu výhodné.

— Pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny potvrzující metodou zkoušení založenou na plynové chromatografii s vysokým rozlišením s detekcí hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. Kromě toho musí být potvrzující metodou založenou na plynové chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením potvrzeny výsledky u vzorků s širokým rozmezím hodnot toxického ekvivalentu (přibližně 2 % až 10 % negativních vzorků). Měly by být k dispozici informace o shodě výsledků biotestů a metod založených na plynové chromatografii s vysokým rozlišením s detekcí hmotnostní spektrometrií s vysokým roslišením.

• 7.3 Specifické požadavky na biotesty na buňkách

— Při provádění biotestu je nezbytné použít pro každý test sérii referenčních koncentrací tetrachlordibenzodioxinů nebo směsi tetrachlordibenzodioxin/ tetrachlordibenzofuran (celá křivka závislosti odezvy na dávce s r^2 > 0,95). Pro účely screeningu však může být ke zkoušení vzorků s nízkými hodnotami použita křivka prodloužená do oblasti nízkých hodnot.

— Pro vyjadřování výsledků biotestů v rámci konstantního časového období může být použita referenční koncentrace tetrachlordibenzodioxinů (asi 3krát vyšší než mez stanovení) uvedená v protokolu řízení jakosti. Alternativou by mohla být relativní odezva referenčního vzorku vzhledem ke kalibrační křivce tetrachlordibenzodioxinů, neboť odezva buněk může záviset na mnoha faktorech.

— Pro každý typ referenčního materiálu by měly být zaznamenávány a ověřovány grafy řízení jakosti, aby se zajistilo, že výsledky jsou v souladu se stanovenými pokyny.

— Zejména při kvantitativních výpočtech musí být použito takové ředění vzorku, aby leželo v lineárním úseku křivky závislosti odezvy. Vzorky ležící nad lineárním úsekem křivky závislosti odezvy se musí zředit a znovu zkoušet. Doporučuje se tedy, aby byly současně zkoušeny alespoň tři nebo více stupňů ředění.

— Směrodatná odchylka vyjádřená v procentech nesmí být při třech stanoveních pro žádný stupeň ředění vyšší než 15 % a pro tři nezávislé experimenty nesmí být vyšší než 30 %.

— Mez detekce může být stanovena na úrovni trojnásobku směrodatné odchylky slepého vzorku rozpouštědla nebo odezvy pozadí. Jinou možností je použít odezvu, která leží nad odezvou pozadí vypočtenou z kalibrační křivky sestrojené v daný den (indukční faktor pětinásobek odezvy slepého vzorku rozpouštědla). Mez stanovení může být stanovena na úrovni pěti- až šestinásobku směrodatné odchylky odezvy slepého vzorku rozpouštědla nebo pozadí, nebo se použije odezva, která je nad odezvou pozadí vypočtenou z kalibrační křivky sestrojené v daný den (indukční faktor desetinásobek odezvy slepého vzorku rozpouštědla).

• 7.4 Specifické požadavky na sady biotestů

— Při přípravě vzorku a při zkouškách musí být dodrženy pokyny výrobce.

— Testovací sady nesmí být použity po datu použitelnosti.

— Neměly by se používat materiály nebo součásti určené pro použití s jinou sadou.

— Testovací sady by měly být uchovávány při daných skladovacích teplotách a měly by být používány při předepsané pracovní teplotě.

— Mez detekce imunotestů se stanoví jako podíl hodnoty odezvy trojnásobku směrodatné odchylky odezvy deseti opakovaných stanovení provedených se slepým vzorkem a hodnoty směrnice přímky získané lineární regresí.

— Pro kontrolu, zda odezva leží v přijatelném rozsahu, by měly při laboratorních testech použity referenční standardy.

• 1. Oznamování výsledků

Pokud to analytický postup umožňuje, měly by analytické výsledky obsahovat hodnoty pro jednotlivé kongenery dibenzo-1,4-dioxinů a dibenzofuranů a polychlorovaných bifenylů a mělo by být uvedeno, zda jde o horní, dolní nebo střední odhad, aby bylo ve zprávě o výsledcích uvedeno maximální množství informací a bylo tím umožněno interpretovat výsledky podle specifických požadavků.

Ve zprávě by měl být také uveden obsah lipidů ve vzorku a metoda extrakce lipidů.

Jestliže výtěžnost leží mimo rozmezí uvedené v bodě 6, nebo je-li překročen maximální limit, a dále na požádání, musí být k dispozici výtěžnost pro jednotlivé vnitřní standardy.

Příloha č. 11 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Stanovení obsahu kyseliny erukové v olejích a tucích určených jako takových k lidské spotřebě a v tukové nebo olejové složce potravin, do kterých byly oleje nebo tuky přidány

I. Úvod

• 1. Příprava vzorku

• 1.1 Všeobecně

Hmotnost vzorku dodaného laboratoři ke zkoušce je za normálních podmínek 50 g, pokud není požadováno větší množství.

• 1.2. Příprava vzorku ke zkoušce v laboratoři

Vzorek musí být před zkouškou homogenizován.

• 1.3. Skladovací nádoby

Takto připravený vzorek se skladuje ve vzduchotěsné a vodotěsné nádobě.

• 1. Činidla

• 2.1. Voda

• 2.1.1. K rozpouštění, ředění a promývání se použije destilovaná nebo demineralizovaná voda ekvivalentní čistoty.

• 2.1.2. Jestliže není při zmínce o rozpouštění nebo ředění uvedeno žádné jiné činidlo, jde o rozpouštění nebo ředění vodou.

• 2.2. Chemikálie

Používají se pouze chemikálie analytické čistoty (p. a.), pokud není uvedeno jinak.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 3.1. Seznam přístrojů

Tento seznam obsahuje pouze položky pro speciální účel a se specifikací.

• 3.2. Analytické váhy

Pojmem analytické váhy se rozumějí váhy s citlivostí 0,1 mg nebo větší.

• 1. Vyjádření výsledků

• 4.1. Výsledky

V protokolu o zkoušce se uvede střední hodnota nejméně ze dvou stanovení s uspokojivou opakovatelností.

• 4.2. Výpočet procentního obsahu

Pokud není stanoveno jinak, budou výsledky vyjádřeny v hmotnostních procentech z celkového obsahu mastných kyselin ve vzorku přijatém laboratoří.

• 4.3. Počet platných desetinných míst

Počet platných desetinných míst v takto vyjádřeném výsledku je určen přesností metody.

II. Stanovení kyseliny erukové

• 1. Předmět a rozsah použití

Touto metodou se stanoví obsah kyseliny erukové

• v olejích a tucích obsahujících kyselinu cetolejovou ( Z- izomer kyseliny dokosenové, který se vyskytuje v rybích olejích) a

• v hydrogenovaných olejích a tucích obsahujících E- a Z- izomery kyseliny dokosenové.

• 1. Definice

Pojmem obsah kyseliny erukové se rozumí obsah kyseliny erukové stanovený popsanou metodou.

• 1. Princip metody

Methylestery jednotlivých mastných kyselin oleje nebo tuku se rozdělí tenkovrstvou argentační chromatografií při nízké teplotě a kvantitativně stanoví plynovou chromatografií s kapalnou stacionární fází.

• 1. Reakční činidla

• 4.1. Čerstvě destilovaný diethylether bez peroxidů

• 4.2. n-hexan

• 4.3. Silikagel G pro chromatografii na tenké vrstvě

• 4.4. Silikagel pro kolonovou chromatografii

• 4.5. Roztok dusičnanu stříbrného o koncentraci 200 g/l. Ve vodě se rozpustí 24 g dusičnanu stříbrného a doplní se vodou na 120 ml.

• 4.6. Roztok methylesteru kyseliny erukové 5 mg/ml. V několika ml n-hexanu se rozpustí 50 mg methylesteru kyseliny erukové a doplní se n-hexanem do 10 ml.

• 4.7. Methylester kyseliny tetrakosanové jako vnitřní standardní roztok 0,25 mg/ml.

V několika ml n-hexanu se rozpustí 25 mg methylesteru kyseliny tetrakosanové (jako v bodě 4.6.) a doplní se n-hexanem do 100 ml.

• 4.8. Vyvíjecí rozpouštědlo: toluen: n-hexan v poměru 90:10 (objemově).

• 4.9. Roztok 2,7-dichlorfluoresceinu o koncentraci 0,5 g/l. Za současného zahřívání a míchání se rozpustí 50 mg 2,7-dichlorofluoresceinu ve 100 ml 50% vodného roztoku methanolu.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1. Zařízení pro chromatografii na tenké vrstvě a dále zejména:

• 5.1.1. Mrazící jednotka schopná udržet vyvíjecí komoru a její obsah při teplotě od -20 °C do -25 °C.

• 5.1.2. Skleněné desky 200×200 mm.

• 5.1.3. UV lampa

• 5.1.4. Skleněné kolony o délce asi 200 mm o vnitřním průměru asi 10 mm s filtrem ze skelné vaty nebo s fritou, případně malé nálevky s fritou.

• 5.1.5. Aplikátor pro nanášení roztoků do úzkého pásku nebo proužku na chromatografické (TLC) desky.

• 5.2. Plynový chromatograf s kapalnou stacionární fází s elektronickým integrátorem, jak je popsáno v oddílu III přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77.

• 1. Postup

• 6.1. Příprava methylesterů mastných kyselin

Z přibližně 400 mg olejové nebo tukové složky zkoušeného vzorku se připraví roztok obsahující asi 20 až 50 mg/ml methylesterů mastných kyselin v n-hexanu metodou popsanou v oddílu II odst. 3 přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77.

• 6.2 Chromatografie na tenké vrstvě

• 6.2.1. Příprava desek

Do 500 ml baňky s kulatým dnem se vsype 60 g silikagelu (4.3.), přidá se 120 ml roztoku dusičnanu stříbrného (4.5.) a třepe se 1 min do vytvoření zcela homogenní suspenze. Tato suspenze se poté nanese obvyklým způsobem na desky. Tloušťka vrstvy musí být přibližně 0,5 mm. Toto množství suspenze je dostatečné pro přípravu pěti desek o rozměrech 200×200 mm. Desky se nechají částečně vyschnout na vzduchu (nejlépe v temnu po dobu asi 30 min). Desky se úplně vysuší a aktivují v sušárně po dobu 2,5 h při teplotě 100 °C. Po aktivaci se desky co nejdříve použijí nebo se přechovávají v temnu a před použitím se znovu aktivují. Dostačující je aktivace při 110 °C po dobu 1 h, pokud ovšem přitom deska neztmavne. Před použitím se v nanesené vrstvě sorbentu vyryjí rýhy 10 mm od postranních okrajů a od horního okraje každé desky, aby se v průběhu vyvíjení snížily okrajové efekty.

• 6.2.2. Nanášení methylesterů

Aplikátorem (5.1.5.) se nanese do úzkého, asi 50 mm dlouhého proužku, nejméně 40 mm od okraje desky a 10 mm od spodního okraje desky 50 μl roztoku methylesterů (6.1.) připravených ze vzorku. Podobným způsobem se nanese 100 ul směsného roztoku obsahujícího stejné objemy připraveného roztoku methylesterů (6.1.) a roztoku methylesteru kyseliny erukové (4.6.). Vzhledem ke křehkosti nanesené vrstvy sorbentu se postupuje při nanášení roztoků zvláště opatrně. Na desku lze případně nanést také 50 μl roztoku methylesteru kyseliny erukové (4.6.), který po vyvíjení pomůže při identifikaci proužku methylesteru kyseliny erukové. Po nanesení methylesterů se spodní okraj desky postaví do diethyletheru na dobu, než ether dostoupí asi 5 mm nad zónu nanesených vzorků. Tak se methylestery koncentrují v úzkém proužku.

• 6.2.3. Vyvíjení desek

Do vyvíjecí komory se nalije vyvíjecí rozpouštědlo do výšky asi 5 mm (4.8.) a komora uzavřená víčkem se uloží do mrazící jednotky (5.1.1.) udržované při teplotě -25° C nebo co nejblíže této teploty. V některých případech může být vhodné vyvíjecí komoru obložit. Po dvou hodinách se deska opatrně umístí do komory a rozpouštědlo se nechá stoupat asi do jedné poloviny až dvou třetin výšky desky. Deska se vyjme a rozpouštědlo se z ní jemně odpaří v proudu dusíku. Deska se znovu vloží do komory a rozpouštědlo se ponechá stoupat až k vrchnímu okraji desky. Deska se vyjme a jako v předchozím případě se vysuší v proudu dusíku a poté se opatrně postříká roztokem 2,7-dichlorfluoresceinu (4.9.). Deska se prohlédne pod ultrafialovým světlem a pruh obsahující methylester kyseliny erukové ve vzorku se určí zvýrazněným pruhem vzorku, ke kterému byl přidán methylester kyseliny erukové.

• 6.2.4. Rozdělení methylesterů

Proužek methylesteru kyseliny erukové pocházející ze vzorku se seškrábne do 50 ml kádinky tak, aby nedošlo ke ztrátám. Obdobně se do jiné 50 ml kádinky přenese silikagel umístěný nad a pod proužkem methylesteru kyseliny erukové. Tento pruh obsahuje všechny ostatní frakce methylesterů mastných kyselin. Do každé kádinky se přidá 1,0 ml standardního roztoku methylesteru kyseliny tetrakosanové (4.7.) a 10 ml diethyletheru (4.1.). Obsah kádinek se promíchá a přenese se na separační kolony či nálevky (5.1.4.), z nichž každá obsahuje asi 1 g silikagelu (4.4.). Methylestery se extrahují třemi nebo čtyřmi 10 ml dávkami diethyletheru a eluáty se zachycují do malých baněk. Každý filtrát se odpaří na malý objem v proudu dusíku a methylestery se přelijí do malých zkumavek s kónickým dnem. Zbytek rozpouštědla se odpaří v proudu dusíku tak, aby se methylestery zkoncentrovaly na dně zkumavek. Methylestery se rozpustí v 25 - 50 μl n-hexanu (4.2.).

• 6.3. Plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází

• 6.3.1. Provede se postup popsaný v oddílu III přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77 a zkouší se 1 - 2 μl roztoků methylesterů získaných z frakce obsahující methylester kyseliny erukové a z frakcí obsahujících zbytek methylesterů mastných kyselin.

• 6.3.2. Elektronickým integrátorem se stanoví následující plochy píků:

• z chromatogramu frakce obsahující methylester kyseliny erukové plochy píků methylesteru kyseliny erukové (E), vnitřního standardu (L1), celkových methylesterů s výjimkou vnitřního standardu (EF),

• z chromatogramu frakcí obsahujících zbytek methylesterů mastných kyselin plochy píků celkových methylesterů mimo vnitřního standardu (RF) a vnitřního standardu (L2).

• 1. Vyjádření výsledků

• 7.1. Metoda výpočtu a vzorec

• 7.1.1. Obsah kyseliny erukové ve vzorku vyjádřený jako procentní podíl methylesteru kyseliny erukové z celkových methylesterů mastných kyselin připravených ze vzorku je dán vzorcem:

EL1EFL1 + RFL2 × 100

kde

E, EF, RF, L1 a L2 jsou plochy píků podle 6.3.2., v případě nutnosti korigované kalibračními faktory.

Obsah methylesteru kyseliny erukové daný výše uvedeným vzorcem odpovídá obsahu kyseliny erukové vyjádřenému v procentech z celkového množství mastných kyselin ve vzorku.

• 7.1.2. Jestliže jsou plochy píků vyjádřeny v procentech, pak lze hodnoty EF a RF vypočítat následovně:

EF = 100 – L1

RF = 100 – L2

• 7.1.3. Metoda výpočtu podle odstavce 7.1.1. předpokládá, že množství kyseliny tetrakosanové ve vzorku je zanedbatelné. Jestliže se ukáže, že ve vzorku je významné množství této kyseliny, hodnota pro kyselinu tetrakosanovou (L2) získaná z chromatogramu frakcí obsahujících zbylé methylestery mastných kyselin musí být snížena takto:

L2 – T2

kde

T2 = T0P2P0

kde

T2 je plocha píku methylesteru kyseliny tetrakosanové pocházející ze vzorku, tvořící část plochy píku vnitřního standardu v chromatogramu zbývající frakce methylesterů mastných kyselin,

P2 je plocha píku methylesteru kyseliny palmitové z chromatogramu zbylé frakce,

T0 je plocha píku methylesteru kyseliny tetrakosanové z chromatogramu methylesterů celkových mastných kyselin stanovených metodou zkoušení podle článku 2 Směrnice Komise 80/891/EHS,

P0 je plocha píku methylesteru kyseliny palmitové z chromatogramu methylesterů celkových mastných kyselin stanovených metodou zkoušení podle článku 2 směrnice Komise č. 80/891/EHS.

• 7.1.4. Odvození vzorce

Podíl mastných kyselin ve frakci obsahující methylester kyseliny erukové vyjádřený v procentech z celkového obsahu mastných kyselin ve vzorku je dán vzorcem:

EFL1EFL1 + RFL2 × 100 nebo EFL1EFL1 + RFL2 × 100

Podíl kyseliny erukové ve frakci obsahující methylester kyseliny erukové je dán vztahem:

EEF

Odtud obsah kyseliny erukové ve vzorku vyjádřený v procentech z celkového obsahu mastných kyselin je dán vztahem:

EFL1EFL1 + RFL2 × EEF × 100 nebo EL1EFL1 + RFL2 × 100

• 7.1.5. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky získanými ze dvou stanovení provedených současně nebo rychle po sobě ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 10 % výsledné hodnoty nebo 0,5 g na 100 g vzorku. Rozhodující je vyšší hodnota.

Příloha č. 12 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metody zkoušení k ověření složení některých cukrů určených k lidské spotřebě

• 1. Příprava vzorků ke zkoušce

Vzorek doručený do laboratoře se důkladně promíchá.

Pro zkoušku se ze vzorku oddělí množství nejméně 200 g a okamžitě přenese do čisté, suché, vodotěsné nádobky opatřené vzduchotěsným uzávěrem.

• 1. Reakční činidla, přístroje a pomůcky

Při popisu přístrojů a pomůcek jsou uváděny odkazy pouze pro speciální zařízení a přístrojů, nebo přístroje, které musí odpovídat zvláštním požadavkům.

Pokud je zmiňována voda, rozumí se destilovaná voda nebo demineralizovaná voda se srovnatelnou čistotou.

Veškerá činidla musí být analytické čistoty, pokud není stanoveno jinak.

Pokud je odkazováno na roztok činidla bez dalšího upřesnění, jde o vodný roztok.

• 1. Vyjádření výsledků

V protokolu o zkoušce se uvede výsledek získaný jako průměrná hodnota ze dvou stanovení s uspokojivou opakovatelností.

Pokud není uvedeno jinak, jsou výsledky vyjádřeny v procentech hmotnostních původního laboratorního vzorku tak, jak byl do laboratoře doručen.

Počet platných číslic v takto vyjádřeném výsledku je určen přesností metody.

Příloha č. 13 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení ztráty hmotnosti sušením pro některé cukry určené k lidské spotřebě

• 1. Předmět a oblast použití

Metoda slouží ke stanovení ztráty hmotnosti sušením

• v cukru polobílém,

• v cukru nebo v cukru bílém,

• v cukru extra bílém.

• 1. Definice

Ztrátou hmotnosti sušením se rozumí hodnota ztráty hmotnosti sušením stanovená popsanou metodou.

• 1. Podstata metody

Ztráta hmotnosti sušením se stanoví sušením při teplotě (103 ± 2) °C.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 4.1. Analytické váhy vážící s přesností 0,1 mg.

• 4.2. Sušárna s vhodnou ventilací, řízená termostatem, umožňující udržovat teplotu (103 ± 2) °C.

• 4.3. Kovová váženka s plochým dnem, odolná vůči působení vzorku a testovacím podmínkám, s průměrem nejméně 100 mm a s hloubkou nejméně 30 mm.

• 4.4. Exsikátor s čerstvě aktivovaným silikagelem nebo s rovnocenným sušidlem s indikátorem obsahu vlhkosti.

• 1. Postup

Poznámka:

Operace popsané v bodě 5.1 až 5.7 musí být provedeny okamžitě po otevření nádoby se vzorkem.

• 5.1. Miska (4.3.) se vysuší do konstantní hmotnosti v sušárně (4.2.) při teplotě (103 ± 2) °C.

Miska se nechá v exsikátoru (4.4.) vychladnout nejméně po dobu 30 až 35 min a poté se zváží s přesností na 0,1 mg.

Do misky se naváží přibližně 20 až 30 g vzorku s přesností na 0,1 mg.

Miska se vloží do sušárny (4.2.) o teplotě (103 ± 2 °C), kde se ponechá 3 h.

Miska se nechá vychladnout v exsikátoru (4.4.) a zváží se s přesností na 0,1 mg.

Miska se znovu vloží na 30 minut do sušárny o teplotě (103 ± 2) °C.

Nechá se vychladnout v exsikátoru (4.4.) a zváží se s přesností na 0,1 mg. Pokud je rozdíl mezi dvěma váženími větší než 1 mg, postup se opakuje. Zvýší-li se hmotnost, použije se k výpočtu nejnižší zaznamenaná hodnota.

Celkový čas sušení nesmí být delší než čtyři hodiny.

• 1. Vyjádření výsledků

• 6.1. Vzorec a postup výpočtu

Ztráta hmotnosti sušením v hmotnostních procentech vzorku je dána vzorcem:

m0 - m1m0 × 100

kde:

m0 je počáteční hmotnost zkušebního vzorku (g),

m1 je hmotnost zkušebního vzorku po vysušení (g).

• 6.2. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou z téhož vzorku týmž pracovníkem za totožných podmínek nesmí být větší než 0,02 g na 100 g vzorku.

Příloha č. 14 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení sušiny pro některé cukry určené k lidské spotřebě

I. Metoda sušení ve vakuové sušárně

• 1. Předmět a oblast použití

Metoda slouží ke stanovení obsahu sušiny

• ve škrobovém sirupu,

• v sušeném škrobovém sirupu,

• v monohydrátu glukosy,

• v glukose bezvodé.

• 1. Definice

Obsahem sušiny se rozumí obsah sušiny stanovený popsanou metodou.

• 1. Podstata metody

Sušina se stanoví při teplotě (70 ± 1) °C ve vakuové sušárně při tlaku nejvýše 3,3 kPa (34 mbar). Zkušební vzorky škrobového sirupu nebo sušeného škrobového sirupu se před sušením upraví smícháním s vodou a s křemelinou.

• 1. Reakční činidla

• 4.1. Křemelina: přečistí se v Büchnerově nálevce opakovaným promýváním zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (1 ml koncentrované kyseliny o hustotě 1,19 g/ml na litr vody při 20 °C), dokud filtrát nevykazuje zřetelně kyselou reakci. Křemelina na filtru se pak promývá vodou tak dlouho, dokud hodnota pH filtrátu nevystoupí nad 4; pak se křemelina vysuší v sušárně při (103 ± 2) °C a uloží se do vzduchotěsné nádoby.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1. Vakuová sušárna, utěsněná, řízená termostatem, vybavená teploměrem a vakuovým manometrem. Musí být konstruována tak, aby byl zajištěn rychlý přestup tepla do váženek uložených na policích.

• 5.2. Aparaturu k vysoušení vzduchu tvoří skleněná kolona naplněná čerstvě aktivovaným silikagelem nebo rovnocenným vysoušedlem, s indikátorem obsahu vlhkosti. Tato kolona obsahující koncentrovanou kyselinu sírovou je sériově propojena s pračkou plynů připojenou na vstup vzduchu do sušárny.

• 5.3. Vývěva umožňující udržovat v sušárně tlak 3,3 kPa (34 mbar) nebo nižší.

• 5.4. Kovová váženka s plochým dnem odolná vůči působení vzorků a podmínkám zkoušky s průměrem nejméně 100 mm a s hloubkou nejméně 300 mm.

• 5.5. Skleněná tyčinka o takové délce, aby nemohla zcela zapadnout do váženky.

• 5.6. Exsikátor s čerstvě aktivovaným silikagelem nebo s rovnocenným vysoušedlem s indikátorem obsahu vlhkosti.

• 5.7. Analytické váhy vážící s přesností na 0,1 mg.

• 1. Postup

• 6.1. Do váženky (5.4.) se skleněnou tyčinkou (5.5.) se převede přibližně 30 g křemeliny (4.1.), vše vloží se do sušárny (5.1.) s teplotou (70 ± 1) °C a tlak se sníží nejméně na 3,3 kPa (34 mbar).

Suší se po dobu nejméně 5 h, přičemž se přes aparaturu pro vysoušení vzduchu do sušárny zavádí pomalý proud vzduchu. Občas se zkontroluje tlak a podle potřeby se upraví.

• 6.2. Atmosférický tlak v sušárně se opět dosáhne opatrným zvýšením přívodu suchého vzduchu. Miska i se skleněnou tyčinkou se okamžitě přemístí do exsikátoru (5.6.), kde se nechá vychladnout, a pak se zváží.

• 6.3. Do kádinky o obsahu 100 ml se s přesností na 1 mg naváží přibližně 10 g zkoušeného vzorku.

• 6.4. Zkušební vzorek se zředí 10 ml teplé vody a roztok se pomocí skleněné tyčinky (5.5.) kvantitativně převede do váženky.

• 6.5. Miska se zkušebním vzorkem a skleněnou tyčinkou se vloží do sušárny a tlak se sníží nejméně na 3,3 kPa (34 mbar). Suší se při (70 ± 1) °C, přičemž se sušárnou nechá procházet pomalý proud suchého vzduchu.

Sušení se provádí po dobu 20 hodin; k největšímu úbytku vlhkosti má dojít ke konci prvního dne. Je nezbytné udržovat vývěvu v chodu při nastaveném tlaku a nechat pomalu proudit do sušárny suchý vzduch tak, aby se během noci tlak udržoval přibližně na hodnotě 3,3 kPa (34 mbar) nebo nižší.

• 6.6. Atmosférického tlaku v sušárně se opět dosáhne opatrným zvýšením přívodu suchého vzduchu. Váženka i s obsahem se okamžitě přemístí do exsikátoru, kde se nechá vychladnout, a poté se zváží s přesností na 1 mg.

• 6.7. Operace (6.5.) se opakuje po další 4 hodiny. V sušárně se obnoví atmosférický tlak a miska se ihned vloží do exsikátoru. Nechá se vychladnout a vážením se zjistí, zda již bylo dosaženo konstantní hmotnosti. Za konstantní hmotnost se považuje takový výsledek, kdy rozdíl mezi dvěma váženími téže misky není větší než 2 mg. V opačném případě se opakuje operace 6.7.

• 6.8. Pro stanovení sušiny ve vzorcích bezvodé glukosy nebo v monohydrátu glukosy není použití křemeliny a vody zapotřebí.

• 1. Vyjádření výsledků

• 7.1. Vzorec a postup výpočtu

Obsah sušiny vyjádřený v procentech hmotnosti vzorku se vypočítá podle tohoto vzorce:

m1 - m2 × 100m0

kde:

m0 je počáteční hmotnost zkušebního vzorku (g),

m1 je hmotnost váženky s křemelinou, skleněnou tyčinkou a zbytkem zkušebního vzorku po sušení (g),

m2 je hmotnost váženky s křemelinou a skleněnou tyčinkou (g).

• 7.2. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,12 g na 100 g vzorku.

Příloha č. 15 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení celkové sušiny pro některé cukry určené k lidské spotřebě

(Refraktometrická metoda)

• 1. Předmět a oblast použití

Metoda stanoví obsah sušiny

• v tekutém cukru,

• v tekutém bílém cukru,

• v tekutém invertním cukru,

• v tekutém bílém invertním cukru,

• v sirupu z invertního cukru,

• v sirupu z bílého invertního cukru.

• 1. Definice

Obsahem sušiny se rozumí obsah sušiny stanovený popsanou metodou.

• 1. Podstata metody

Stanoví se index lomu zkušebního vzorku při 20 °C a podle tabulek v uvedených v příloze č. 39 se převede na obsah sušiny.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 4.1 Refraktometr s přesností odečtu na čtyři desetinná místa, vybavený teploměrem a oběhovým vodním čerpadlem spojeným s vodní lázní, která je udržována termostatem na teplotě (20 ± 0,5) °C.

• 4.2 Světelný zdroj sestávající ze sodíkové výbojky.

• 1. Postup

• 5.1 Pokud jsou ve vzorku přítomny krystaly, rozpustí se zředěním vzorku v hmotnostním poměru 1:1.

• 5.2 Refraktometrem (4.1.) se změří index lomu vzorku při 20 °C.

• 1. Vyjádření výsledků a jejich výpočet

Obsah sušiny se vypočte z indexů lomu pro roztoky sacharosy při 20° C podle uvedené tabulky a jako korekce na přítomnost invertního cukru v e zkoušeném vzorku se k výsledku z tabulek přičte na každé 1 % invertního cukru hodnota 0,022.

Pokud byl vzorek zředěn vodou v hmotnostním poměru 1:1, musí se obsah vypočtené sušiny vynásobit dvěma.

• 1. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,2 g sušiny na 100 g vzorku.

Příloha č. 16 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukry

(Metoda podle výzkumného ústavu Berlin Institut)

• 1. Předmět a oblast použití

Metoda slouží ke stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr v cukru polobílém.

• 1. Definice

Redukujícími cukry vyjádřenými jako invertní cukr se rozumí obsah redukujících cukrů stanovený popsanou metodou.

• 1. Podstata metody

Roztok vzorku s obsahem redukujících cukrů se použije pro redukci roztoku měďnatého komplexu. Vzniklý oxid měďný se pak oxiduje roztokem jódu o známé koncentraci, jehož přebytek se stanoví zpětnou titrací odměrným roztokem thiosíranu sodného o známé koncentraci.

• 1. Reakční činidla

• 4.1. Měďnatý roztok (Müllerův roztok)

• 4.1.1. Ve 400 ml vroucí vody se rozpustí 35 g síranu měďnatého pentahydrátu (CuSO4·5H2O) a nechá se vychladnout.

• 4.1.2. V 500 ml vroucí vody se rozpustí 173 g vinanu sodnodraselného tetrahydrátu (Rochellova nebo Seignettova sůl, KNaC4H4O6·4H2O) a 68 g bezvodého uhličitanu sodného a nechá se vychladnout.

• 4.1.3. Oba roztoky (4.1.1. a 4.1.2.) se převedou do litrové odměrné baňky a doplní se vodou do 1 litru. Po přidání 2 g aktivního uhlí se obsah protřepe, nechá se několik hodin stát a poté se přefiltruje přes hustý papírový nebo membránový filtr.

Pokud se v průběhu skladování roztoku objeví malá množství oxidu měďného, je třeba roztok znovu přefiltrovat.

• 4.2. Kyselina octová, roztok 5 mol/l.

• 4.3. Roztok jódu o koncentraci 0,01665 mol/l (4,2258 g/l).

• 4.4. Roztok thiosíranu sodného o koncentraci 0,0333 mol/l.

• 4.5. Roztok škrobu: do litru vroucí vody se přilije směs 5 g rozpustného škrobu rozmíchaného ve 30 ml vody, povaří se 3 min a nechá vychladnout. V případě potřeby se přidá 10 mg jodidu rtuťnatého jako konzervačního činidla.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1. Erlenmeyerova baňka, 300 ml; přesné byrety a pipety.

• 5.2. Vodní lázeň, vroucí.

• 1. Postup

• 6.1. Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se naváží část vzorku (10 g nebo méně), který neobsahuje více než 30 mg invertního cukru, a rozpustí se v cca 100 ml vody.

Do baňky s roztokem vzorku se odpipetuje 10 ml měďnatého roztoku (4.1.), obsah se krouživým pohybem zamíchá a baňka se vloží do vroucí vodní lázně (5.2.) na dobu přesně 10 min.

Hladina roztoku v Erlenmeyerově baňce musí být nejméně 20 mm pod úrovní hladiny ve vodní lázni. Baňka se rychle ochladí proudem studené vody, přičemž se roztok nesmí promíchávat, aby nedošlo k opětovné oxidaci vysráženého oxidu měďného vzdušným kyslíkem.

Bez protřepávání obsahu se pipetou přidá 5 ml roztoku kyseliny octové (4.2.) o koncentraci 5 mol/l a ihned poté se byretou přidá přebytek (20 až 40 ml) roztoku jódu (4.3.) o koncentraci 0,01665 mol/l.

Sraženina mědi se mícháním rozpustí a přebytek jódu se titruje roztokem thiosíranu sodného (4.4.) o koncentraci 0,0333 mol/l při použití roztoku škrobu (4.5.) jako indikátoru. Indikátor se přidává ke konci titrace.

• 6.2. S vodou se provede slepý pokus, která se opakuje vždy při použití nového měďnatého roztoku (4.4.). Titrační spotřeba nepřekročí 0,1 ml.

• 6.3. S cukerným roztokem se za chladu provede kontrolní zkouška. Roztok se nechá stát při laboratorní teplotě po dobu 10 min, aby mohlo dojít k reakci jiných, eventuálně přítomných redukujících látek, jako je například oxid siřičitý.

• 1. Vyjádření výsledků

• 7.1. Vzorec a postup výpočtu

Objem spotřebovaného roztoku jódu se rovná objemu (ml) přebytku přidaného roztoku jódu (0,01665 mol/l) minus objem (ml) roztoku thiosíranu sodného (0,0333 mol/l) spotřebovaného při titraci.

Objem (ml) spotřebovaného roztoku jódu (0,01665 mol/l) se upraví odečtením:

• 7.1.1. počtu ml spotřebovaných při slepém pokusu s vodou (6.2.),

• 7.1.2. počtu ml spotřebovaných při kontrolní zkoušce s cukerným roztokem za chladu (6.3.),

• 7.1.3. objemu 2,0 ml na každých 10 g sacharosy přítomné v použitém alikvotním podílu nebo úměrného množství, obsahuje-li vzorek méně než 10 g sacharosy (korekce na sacharosu).

Po provedení těchto korekcí odpovídá spotřeba 1 ml jodového roztoku (4.3.) 1 mg invertního cukru.

Obsah invertního cukru v procentech vzorku se vypočítá podle vzorce:

V110 × m0

kde:

V1 - počet ml jodového roztoku (4.3.) po korekci,

m0 - hmotnost použitého vzorku (g).

• 7.2. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,02 g na 100 g vzorku.

Příloha č. 17 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr

(Metoda podle Knighta a Allena)

• 1. Předmět a oblast použití

Metoda slouží ke stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr

• v cukru nebo v cukru bílém,

• v cukru extra bílém.

• 1. Definice

Redukujícími cukry vyjádřenými jako invertní cukr se rozumí obsah redukujících cukrů stanovený popsanou metodou.

• 1. Podstata metody

K roztoku vzorku se přidá v přebytku činidlo a jeho zredukovaný a nezredukovaný podíl se pak stanoví zpětnou titrací roztokem měďnaté disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctvé.

• 1. Reakční činidla

• 4.1. Disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové, roztok 0,0025 mol/l: rozpustí se 0,930 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové ve vodě a doplní se vodou do jednoho litru.

• 4.2. Roztok indikátoru murexidu: 0,25 g murexidu se přidá do 50 ml vody a smíchá se s 20 ml vodného roztoku methylenové modři o koncentraci 0,2 g/100 ml.

• 4.3. Měďnaté činidlo: v 600 ml vody obsahující 40 ml hydroxidu sodného o koncentraci 1,0 mol/l se rozpustí 25 g bezvodého uhličitanu sodného a 25 g tetrahydrátu vinanu sodnodraselného. V cca 100 ml vody se rozpustí 6,0 g pentahydrátu síranu měďnatého, vzniklý roztok se přidá k roztoku vinanu a doplní vodou do jednoho litru.

Poznámka: Roztok má omezenou trvanlivost (jeden týden).

• 4.4 Standardní roztok invertního cukru: v odměrné baňce o objemu 250 ml se rozpustí 23,750 g čisté sacharosy (4.5.) v cca 120 ml vody. Přidá se 9 ml kyseliny chlorovodíkové (ρ20 = 1,16) a nechá se stát při laboratorní teplotě po dobu 8 dní. Roztok se doplní do 250 ml a ukončení hydrolýzy se zkontroluje odečtem na polarimetru nebo sacharometru při použití trubice o délce 200 mm. Zjištěná hodnota se má rovnat (11,80 ± 0,05) °S (viz poznámka). 200 ml tohoto roztoku se odpipetuje do odměrné baňky o objemu 2000 ml, zředí se vodou a za stálého protřepávání (aby nedošlo k nadměrnému místnímu zalkalizování roztoku) se přidá 71,4 ml roztoku hydroxidu sodného (1 mol/l), ve kterém jsou rozpuštěny 4 g kyseliny benzoové. Roztok se doplní na 2000 ml, tj. aby obsahoval 1 g invertního cukru ve 100 ml; hodnota pH roztoku se má pohybovat kolem 3.

Tento stálý zásobní roztok se ředí pouze bezprostředně před použitím.

• 4.5. Čistá sacharosa: vzorek čisté sacharosy s obsahem invertního cukru nejvýše 0,001 g/100 g.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1 Zkumavky 150 × 20 mm.

• 5.2 Bílá porcelánová miska.

• 5.3 Analytické váhy vážící s přesností na 0,1 mg.

• 1. Postup

• 6.1 Ve zkumavce (5.1.) se rozpustí 5 g vzorku cukru v 5 ml studené vody, přidají se 2,0 ml měďnatého činidla (4.3.) a obsah se promíchá. Zkumavka se ponoří do lázně s vroucí vodou na dobu 5 min a poté se ve studené vodě ochladí.

• 6.2. Roztok se ze zkumavky kvantitativně, s použitím co nejmenšího množství vody, převede do bílé porcelánové misky (5.2.), přidají se tři kapky indikátoru (4.2.) a titruje se roztokem disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (4.1.). Titrační spotřeba v ml se označí jako Vo.

Těsně před ukončením titrace se barva roztoku změní ze zelené přes šedou na purpurovou v bodě ekvivalence. Purpurová barva pomalu mizí v důsledku oxidace oxidu měďného na oxid měďnatý; rychlost oxidace závisí na koncentraci přítomné zredukované mědi. Proto je při titraci nutné dosáhnout bodu ekvivalence co možná nejrychleji.

• 6.3. Sestrojí se kalibrační křivka na základě přídavku známého množství invertního cukru (příslušně zředěný roztok 4.4.) k 5 g čisté sacharosy (4.5.) a odpovídajícího množství studené vody tak, aby celkový objem přidaného roztoku činil 5 ml. Titrační spotřeba (ml) se vynese do grafu proti procentnímu obsahu invertního cukru přidaného k 5 g sacharosy; výslednou křivkou je přímka v rozmezí 0,001 až 0,019 g na 100 g invertního cukru, resp. 100 g vzorku.

• 1. Vyjádření výsledků

• 7.1 Postup výpočtu

Z kalibrační křivky se odečte obsah invertního cukru (v procentech) odpovídající spotřebě Vo v ml disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové při zkoušení vzorku.

• 7.2. Pokud se předpokládá vyšší koncentrace než 0,017 g invertního cukru ve 100 g zkoušeného vzorku, musí se příslušně snížit množství vzorku v bodě 6.1., zkoušený vzorek se však musí doplnit do 5 g čistou sacharosou (4.5.).

• 7.3. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,005 g na 100 g vzorku.

• 1. Poznámka

Při převodu hodnoty ve °S na polarimetrické úhlové stupně se hodnota uvedená v °S dělí 2,889 (polarimetrická trubice o délce 200 mm; sodíková výbojka jako světelný zdroj; přístroj umístěný v místnosti, ve které je možné udržovat teplotu kolem 20 °C).

Příloha č. 18 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr nebo glukosový ekvivalent

(Metoda podle Luffa a Schoorla)

• 1. Předmět a oblast použití

Metoda slouží ke stanovení

• 1.1. obsahu redukujících cukrů vyjádřený jako invertní cukr

• v tekutém cukru,

• v tekutém bílém cukru,

• v tekutém invertním cukru,

• v tekutém bílém invertním cukru,

• v sirupu z invertního cukru,

• v sirupu z invertního cukru bílého.

• 1.2. obsahu redukujících cukrů vyjádřeného a vypočteného (vztaženo na sušinu) jako glukosový ekvivalent

• ve škrobovém sirupu,

• v sušeném škrobovém sirupu.

• 1.3. obsahu redukujících cukrů vyjádřeného jako D-glukosa

• v glukosy monohydrátu,

• v bezvodé glukose.

• 1. Definice

Redukujícími cukry vyjádřenými jako invertní cukry, D-glukosa nebo jako glukosový ekvivalent se rozumí obsah redukujících cukrů vyjádřený nebo vypočtený jako invertní cukr, D-glukosa nebo glukosový ekvivalent stanovený popsanou metodou.

• 1. Podstata metody

Vzorek s redukujícími cukry se zahřeje (a v případě potřeby vyčeří) za standardních podmínek k bodu varu s měďnatým roztokem, která se částečně redukuje na Cu (I). Přebytek Cu (II) se poté stanoví jodometricky.

• 1. Reakční činidla

• 4.1. Carrezův roztok I: 21,95 g dihydrátu octanu zinečnatého, nebo 24 g trihydrátu octanu zinečnatého, se spolu s přidanými 3 ml ledové kyseliny octové rozpustí ve vodě a doplní vodou do 100 ml.

• 4.2. Carrezův roztok II: 10,6 g trihydrátu hexakyanoželeznatanu draselného se rozpustí ve vodě a doplní vodou do 100 ml.

• 4.3. Luff-Schoorlovo činidlo: připraví se tyto roztoky:

• 4.3.1. Roztok síranu měďnatého: 25 g pentahydrátu síranu měďnatého neobsahujícího železo se rozpustí ve 100 ml vody.

• 4.3.2. Roztok kyseliny citronové: 50 g monohydrátu kyseliny citronové se rozpustí v 50 ml vody.

• 4.3.3. Roztok uhličitanu sodného: 143,8 g bezvodého uhličitanu sodného se rozpustí v cca 300 ml horké vody a nechá se vychladnout.

• 4.3.4. K roztoku uhličitanu sodného (4.3.3.) v litrové odměrné baňce se za mírného promíchávání krouživým pohybem přidává roztok kyseliny citronové (4.3.2.). Obsah se míchá, dokud se nepřestane vyvíjet plyn, pak se přidá roztok síranu měďnatého (4.3.1.) a vodou se doplní do 1000 ml. Roztok se nechá stát přes noc, v případě potřeby se potom přefiltruje. Provede se kontrola koncentrace roztoku činidla podle metody popsané v bodě 6.1. (Cu 0,1 mol/l; uhličitan sodný 1 mol/l).

• 4.4. Roztok thiosíranu sodného, 0,1 mol/l.

• 4.5. Roztok škrobu: do jednoho litru vroucí vody se přilije 5 g rozpustného škrobu rozmíchaného ve 30 ml vody. Povaří se 3 minuty a nechá se vychladnout; je-li třeba, přidá se 10 mg jodidu rtuťnatého jako konzervační činidlo.

• 4.6. Kyselina sírová, 3 mol/l.

• 4.7. Roztok jodidu draselného, 30 % hmot.

• 4.8. Úlomky pemzy, vyvařené v kyselině chlorovodíkové, promyté vodou do vymizení kyselé reakce a vysušené.

• 4.9. Isopentylalkohol.

• 4.10. Hydroxid sodný, 0,1 mol/l.

• 4.11. Kyselina chlorovodíková, 0,1 mol/l.

• 4.12. Fenolftalein, 1%ní roztok v ethanolu.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1. Erlenmeyerova baňka o objemu 300 ml se zpětným chladičem.

• 5.2. Stopky.

• 1. Postup

• 6.1. Stanovení titru Luff-Schoorlova činidla (4.3.):

• 6.1.1. Ke 25 ml Luff-Schoorlova činidla (4.3.) se přidají 3 g jodidu draselného a 25 ml kyseliny sírové o koncentraci 3 mol/l (4.6.).

Titruje se roztokem thiosíranu sodného o koncentraci 0,1 mol/l (4.4.) za použití škrobového roztoku (4.5.) jako indikátoru, který se přidá až ke konci titrace. Pokud není spotřeba roztoku thiosíranu o koncentraci 0,1 mol/l rovna 25 ml, musí být činidlo připraveno znovu.

• 6.1.2. Odpipetuje se 10 ml činidla do 100 ml odměrné baňky a doplní se vodou po rysku.

10 ml takto zředěného činidla se odpipetuje do Erlenmeyerovy baňky obsahující 25 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,1 mol/l (4.11.) a zahřívá se po dobu jedné hodiny na vroucí vodní lázni. Pak se roztok ochladí, doplní se na původní objem čerstvě převařenou vodou a titruje roztokem hydroxidu sodného o koncentraci 0,1 mol/l (4.10.) za použití fenolftaleinu (4.12.) jako indikátoru.

Spotřeba roztoku hydroxidu sodného, 0,1 mol/l (4.10.) musí být mezi 5,5 a 6,5 ml.

• 6.1.3. 10 ml zředěného činidla (6.1.2.) se titruje kyselinou chlorovodíkovou, 0,1 mol/l (4.11.) za použití fenolftaleinu (4.12.) jako indikátoru. Bod ekvivalence při titraci je charakterizován ztrátou fialového zbarvení.

Spotřeba roztoku kyseliny chlorovodíkové, 0,1 mol/l (4.11.) musí být mezi 6,0 a 7,5 ml.

• 6.1.4. Hodnota pH Luff-Schoorlova činidla musí být mezi 9,3 a 9,4 při 20 °C.

• 6.2. Příprava roztoku

• 6.2.1. Naváží se 5 g vzorku s přesností na 1 mg a kvantitativně se převede do odměrné baňky o objemu 250 ml obsahující 200 ml vody. V případě potřeby se vyčeří přidáním 5 ml Carrezova roztoku I (4.1.), pak se přidá 5 ml Carrezova roztoku II (4.2.). Po přídavku každého roztoku se obsah zamíchá. Roztok se doplní vodou do 250 ml a dobře promíchá. V případě potřeby se roztok přefiltruje.

• 6.2.2. Roztok (6.2.1.) se zředí v takovém poměru, aby obsah redukujících cukrů vyjádřených jako glukosa se v 25 ml roztoku pohyboval v rozmezí 15 až 60 mg.

• 6.3. Titrace podle Luff-Schoorlovy metody

Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky (5.1.) se odpipetuje 25 ml Luff-Schoorlova činidla (4.3.), do baňky se pak pipetou odměří 25 ml roztoku cukru (6.2.2.) a vloží se dva úlomky pemzy (4.8.). K baňce (5.1.) se připojí zpětný chladič a aparatura se ihned umístí na drátěnou azbestovou síťku nad plamen Bunsenova kahanu. Síťka má v azbestové části vyříznutý kruhový otvor o stejném průměru, jako je dno baňky. Kapalina se přibližně během dvou minut uvede do varu a nechá se mírně vařit po dobu 10 min. Pak se ihned ochladí ve studené vodě a po 5 min se titruje podle tohoto postupu:

Přidá se 10 ml roztoku jodidu draselného (4.7.), bezprostředně poté se přidá opatrně (s ohledem na bouřlivý vývoj plynu) 25 ml kyseliny sírové o koncentraci 3 mol/l (4.6.). Titruje se roztokem thiosíranu sodného o koncentraci 0,1 mol/l (4.4.), dokud se roztok téměř neodbarví, pak se přidá jako indikátor několik ml roztoku škrobu (4.5.) a pokračuje se v titraci až do vymizení modrého zbarvení.

Provede se slepý pokus s 25 ml vody místo 25 ml roztoku cukru (6.2.2.).

• 1. Vyjádření výsledků

• 7.1. Vzorec a postup výpočtu

Z níže uvedené tabulky se odečte nebo se stanoví interpolací hmotnost glukosy nebo invertního cukru v mg, odpovídající rozdílu mezi oběma titračními spotřebami, vyjádřenými v ml roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,1 mol/l.

Výsledek se vyjádří v hmotnostních procentech invertního cukru nebo D-glukosy, vztažených na sušinu.

• 7.2. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,2 ml.

• 1. Poznámka

Před okyselením kyselinou sírovou se může přidat malé množství isopentylalkoholu (4.9.), aby se omezila tvorba pěny.

Tabulka hodnot pro Luff-Schoorlovo činidlo

| 0,1 mol/l thiosíranu sodného | Glukosa, fruktosa, invertní cukr C6H12O6 | | | ml | mg | rozdíl | | --- | --- | --- | | 1 | 2,4 | | | 2 | 4,8 | 2,4 | | 3 | 7,2 | 2,4 | | 4 | 9,7 | 2,5 | | 5 | 12,2 | 2,5 | | 6 | 14,7 | 2,5 | | 7 | 17,2 | 2,5 | | 8 | 19,8 | 2,6 | | 9 | 22,4 | 2,6 | | 10 | 25,0 | 2,6 | | 11 | 27,6 | 2,6 | | 12 | 30,3 | 2,7 | | 13 | 33,0 | 2,7 | | 14 | 35,7 | 2,7 | | 15 | 38,5 | 2,8 | | 16 | 41,3 | 2,8 | | 17 | 44,2 | 2,9 | | 18 | 47,1 | 2,9 | | 19 | 50,0 | 2,9 | | 20 | 53,0 | 3,0 | | 21 | 56,0 | 3,0 | | 22 | 59,1 | 3,1 | | 23 | 62,2 | 3,1 |

Příloha č. 19 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr

(Metoda podle Lanea a Eynona – modifikace s konstantním objemem)

• 1. Předmět a oblast použití

Metoda slouží ke stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr

• v tekutém cukru,

• v tekutém cukru bílém,

• v tekutém invertním cukru,

• v tekutém bílém invertním cukru,

• v sirupu z invertního cukru,

• v sirupu z invertního cukru bílého.

• 1. Definice

Redukujícími cukry vyjádřenými jako invertní cukr se rozumí obsah redukujících cukrů stanovený popsanou metodou.

• 1. Podstata metody

Roztokem zkušebního vzorku se titruje za bodu varu určité množství Fehlingova roztoku s použitím methylenové modři jako indikátoru.

• 1. Reakční činidla

• 4.1. Fehlingův roztok:

• 4.1.1. Roztok A:

69,3 g pentahydrátu síranu měďnatého se rozpustí ve vodě a doplní se na 1 000 ml.

• 4.1.2. Roztok B:

346,0 g tetrahydrátu vinanu sodnodraselného a 100 g hydroxidu sodného se rozpustí ve vodě a doplní na 1 000 ml. Čirý roztok se oddělí dekantací od usazeniny, která se může někdy vytvořit.

Poznámka: Tyto dva roztoky je třeba skladovat v hnědých nebo jantarově žlutě zbarvených lahvích.

• 4.2. Roztok hydroxidu sodného, 1 mol/l.

• 4.3. Standardní roztok invertního cukru: 23,750 g čisté sacharosy se rozpustí v cca 120 ml vody v 250 ml odměrné baňce, přidá se 9 ml kyseliny chlorovodíkové (hustota 1,16 g/ml) a nechá se stát při laboratorní teplotě po dobu 8 dní. Roztok se doplní do 250 ml a ukončení hydrolýzy se zkontroluje polarimetrem nebo sacharometrem s délkou trubice 200 mm. Odečtená hodnota se má rovnat (11,80 ± 0,05) °S (viz poznámka 8). 200 ml tohoto roztoku se odpipetuje do 2000 ml odměrné baňky, zředí se vodou a za stálého protřepávání (aby nedošlo k nadměrné místní alkalizaci roztoku) se přidá 71,4 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 1 mol/l (4.2.), ve kterém jsou rozpuštěny 4 g kyseliny benzoové. Baňka se doplní do 2000 ml, aby výsledný roztok obsahoval 1 g invertního cukru ve 100 ml. Hodnota pH roztoku má být přibližně rovna 3.

Tento stabilní zásobní roztok by se měl ředit až těsně před použitím.

Při přípravě roztoku invertního cukru o koncentraci 0,25 g/100 ml se 250 ml odměrná baňka naplní po rysku zásobním roztokem o koncentraci 1 g/100 ml při 20 °C. Obsah se kvantitativně převede do 1000 ml odměrné baňky a doplní se vodou po rysku při 20 °C.

• 4.4. Roztok methylenové modři, 1 g/100 ml.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1. Varné baňky s úzkým hrdlem o objemu 500 ml.

• 5.2. Byreta o objemu 50 ml, dělená po 0,05 ml, s postranním kohoutem.

• 5.3. Pipety s ryskami na 20, 25 a 50 ml.

• 5.4. Odměrné baňky o objemu 250, 1 000 a 2 000 ml.

• 5.5. Zařízení k ohřevu, vhodné pro udržování varu za podmínek uvedených v bodě 6.1. a umožňující sledovat barevnou změnu v bodě ekvivalence, aniž se varná baňka (5.1.) musí přemísťovat.

• 5.6. Stopky ukazující s přesností nejméně na 1 s.

• 1. Postup

• 6.1. Stanovení titru Fehlingova roztoku

• 6.1.1. Do čisté a suché kádinky se odpipetuje 50 ml roztoku B (4.1.2.), poté 50 ml roztoku A (4.1.1.) a dobře se promíchá.

• 6.1.2. Byreta se propláchne a naplní 0,25 % (0,25 g/100 ml) standardním roztokem invertního cukru (4.3.).

• 6.1.3. Do 500 ml varné baňky (5.1.) se odpipetuje alikvotní podíl 20 ml směsného roztoku A a B (6.1.1.) a přilije se 15 ml vody. Z byrety se do baňky odměří 39 ml roztoku invertního cukru, přidá se několik varných kamínků a obsah se jemným krouživým pohybem promíchá.

• 6.1.4. Obsah baňky se zahřeje k varu a nechá se vařit po dobu přesně 2 min. Během dalšího postupu se baňka nesmí sejmout ze zdroje tepla a přerušit var.

Na konci dvouminutového varu se přidají tři nebo čtyři kapky roztoku methylenové modři (4.4.). Barva roztoku musí být výrazně modrá.

• 6.1.5. Pokračuje se v přidávání standardního roztoku invertního cukru z byrety, zpočátku po 0,2 ml, pak po 0,1 ml a nakonec po kapkách, až se dosáhne bodu ekvivalence. Ten je indikován vymizením modrého zbarvení přítomné methylenové modři. Barva roztoku je načervenalá následkem přítomnosti suspenze oxidu měďného.

• 6.1.6. Bodu ekvivalence při titraci by mělo být dosaženo do tří minut od začátku varu roztoku. Konečná spotřeba V0 se musí pohybovat v rozmezí 39,0 až 41,0 ml. Je-li hodnota V0 mimo hranice toto rozmezí, upraví se koncentrace mědi ve Fehlingově roztoku A (4.1.1.) a stanovení titru se opakuje.

• 6.2. Příprava roztoku vzorku

Koncentrace roztoku zkušebního vzorku se má pohybovat v rozmezí 250 až 400 mg invertního cukru ve 100 ml.

• 6.3. Orientační zkouška

• 6.3.1. Je nutné provést orientační zkoušku ke zjištění potřebného přídavku vody k 20 ml směsného roztoku A a B, který zajistí, že konečný objem po titraci bude činit 75 ml.

Postupuje se shodně s návodem v bodě 6.1.4., pouze místo standardního roztoku invertního cukru se použije roztok vzorku, tj. do baňky se byretou odměří 25 ml roztoku vzorku, přidá se 15 ml vody, nechá se 2 min povařit a roztok se pak titruje až do dosažení bodu ekvivalence, jak je popsáno v bodě 6.1.5.

• 6.3.2. Pokud po přídavku roztoku methylenové modři přetrvává načervenalé zbarvení, je použitý roztok vzorku příliš koncentrovaný. V tomto případě se zkouška přeruší a provede se opakované stanovení s nižší koncentrací roztoku vzorku.

Je-li k dosažení načervenalého zbarvení zapotřebí více než 50 ml roztoku vzorku, musí se použít roztok vzorku s vyšší koncentrací.

Množství vody, které se má přidat, se vypočítá odečtením objemu směsného Fehlingova roztoku (20 ml) a objemu roztoku vzorku od 75 ml.

• 6.4. Konečná zkouška roztoku vzorku

• 6.4.1. Do varné baňky se odpipetuje 20 ml směsného Fehlingova roztoku a množství vody stanovené podle bodu 6.3.

• 6.4.2. Z byrety se odměří roztok vzorku v množství stanoveném podle bodu 6.3., sníženém o 1 ml. Přidá se několik varných kamínků, obsah baňky se krouživým pohybem promíchá, povaří a titruje jako v předchozím stupni (6.3.). Bodu ekvivalence při titraci musí být dosaženo během 1 min od přidání roztoku methylenové modři. Spotřeba při konečné titraci se rovná V1.

• 1. Vyjádření výsledků

• 7.1. Vzorec a postup výpočtu

Obsah redukujících cukrů ve vzorku vyjádřený jako invertní cukr se vypočítá podle vzorce:

% redukujících cukrů (jako invertní cukr):

V0 × 25 × fC × V1

kde:

C - koncentrace roztoku zkušebního vzorku (g/100 ml),

V0 - spotřeba standardního roztoku invertního cukru (ml) při stanovení titru,

V1 - spotřeba roztoku zkušebního vzorku (ml) při přesné zkoušce (6.4.2.),

f - korekční faktor zohledňující koncentraci sacharosy přítomné v roztoku zkušebního vzorku; hodnoty jsou uvedeny v níže uvedené tabulce:

Sacharosa (g ve směsi)	Korekční faktor f
0,0	1,000
0,5	0,982
1,0	0,971
1,5	0,962
2,0	0,954
2,5	0,946
3,0	0,939
3,5	0,932
4,0	0,926
4,5	0,920
5,0	0,915
5,5	0,910
6,0	0,904
6,5	0,898
7,0	0,893
7,5	0,888
8,0	0,883
8,5	0,878
9,0	0,874
9,5	0,869
10,0	0,864

Korekce pro jiná množství sacharosy v roztoku zkušebního vzorku se mohou vypočítat z tabulkových hodnot interpolací.

Poznámka: Přibližná koncentrace sacharosy se může stanovit odečtením koncentrace rozpuštěných tuhých látek z invertního cukru (pro tento výpočet je použitá hodnota f rovna 1,0) od koncentrace veškerých rozpuštěných látek vyjádřených jako sacharosa a stanovených na základě indexu lomu podle přílohy č. 15 k této vyhlášce.

• 7.2. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 1,0 % jejich aritmetického průměru.

• 1. Poznámka

Při převodu hodnoty ve °S na polarimetrické úhlové stupně se tato hodnota udaná v °S dělí faktorem 2,889 (polarimetrická trubice o délce 200 mm; sodíková výbojka jako zdroj světla; přístroj umístěný v místnosti, ve které je možno udržovat teplotu blízkou 20 °C).

Příloha č. 20 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení glukosového ekvivalentu pro některé cukry určené k lidské spotřebě

(Metoda podle Lanea a Eynona s konstantním titrem)

• 1. Předmět a oblast použití

Tato metoda slouží ke stanovení glukosového ekvivalentu

• ve škrobovém sirupu,

• v sušeném škrobovém sirupu,

• v monohydrátu glukocsy,

• v glukose bezvodé.

• 1. Definice

• 2.1. Redukční sílou se rozumí obsah redukujících cukrů stanovený popsanou metodou, vyjádřených jako bezvodá D-glukosa a udávaný v procentech hmotnosti vzorku.

• 2.2. Glukosovým ekvivalentem se rozumí redukční síla vypočtená v procentech hmotnosti sušiny vzorku.

• 1. Podstata metody

Roztokem zkušebního vzorku se za přesně určených podmínek titruje za bodu varu určitý objem směsného Fehlingova roztoku s použitím methylenové modři jako indikátoru.

• 1. Reakční činidla

• 4.1. Fehlingův roztok:

• 4.1.1. Roztok A:

Ve vodě se rozpustí 69,3 g pentahydrátu síranu měďnatého a v odměrné baňce o objemu 1 000 ml se doplní po rysku.

• 4.1.2. Roztok B:

Ve vodě se rozpustí 346,0 g tetrahydrátu vinanu sodno-draselného a 100 g hydroxidu sodného a v odměrné baňce o objemu 1000 ml doplní vodou po rysku. Čirý roztok se dekantací oddělí od usazeniny, který se někdy může vytvořit.

Poznámka: Tyto dva roztoky (4.1.1. a 4.1.2.) je třeba skladovat v hnědých nebo jantarově žlutě zbarvených lahvích.

• 4.1.3. Příprava směsného Fehlingova roztoku

Do čisté kádinky se odpipetuje 50 ml roztoku B (4.1.2.) a poté 50 ml roztoku A (4.1.1.) a dobře se promíchají.

Poznámka: Směsný Fehlingův roztok se nesmí uchovávat, nýbrž se musí každý den připravovat čerstvý a standardizovaný (6.1.).

• 4.2. Bezvodá D-glukosa (C6H12O6)

Tento materiál je nutno před použitím 4 h sušit ve vakuové sušárně při teplotě 100 ± 1 °C nebo nižší a při tlaku asi 10 kPa (103 mbar).

• 4.3. Standardní roztok glukosy, 0,600 g/100 ml

S přesností na 0,1 mg se naváží 0,6 g bezvodé glukosy (4.2.), rozpustí se ve vodě, kvantitativně převede do odměrné baňky o objemu 100 ml (5.4.), doplní vodou po rysku a promíchá.

Tento roztok je nutno připravit čerstvý každý den, kdy bude používán.

• 4.4. Roztok methylenové modři, 0,1 g/100 ml vody

Rozpustí se 0,1 g methylenové modři ve 100 ml vody.

• 1. Přístroje a pomůcky

• 5.1. Varné baňky s úzkým hrdlem o objemu 250 ml.

• 5.2. Byreta o objemu 50 ml, s postranním kohoutem a dělená po 0,05 ml.

• 5.3. Pipety nedělené s ryskami 25 ml a 50 ml.

• 5.4. Odměrné baňky o objemu 100 a 500 ml.

• 5.5. Zařízení k ohřevu, vhodné pro udržování varu v souladu s podmínkami popsanými v bodě 6.1. a umožňující sledovat barevnou změnu v bodě ekvivalence, aniž se varná baňka (5.1.) odstraní ze zdroje tepla (viz bodě 6.1. poznámka 1).

• 5.6. Stopky ukazující s přesností nejméně na 1 s.

• 1. Postup

• 6.1. Standardizace Fehlingova roztoku

• 6.1.1. Do čisté suché varné baňky (5.1.) se odpipetuje 25 ml Fehlingova roztoku (4.1.3.).

• 6.1.2. Byreta (5.2.) se naplní standardním roztokem glukosy (4.3.) a meniskus se nastaví na nulovou rysku.

• 6.1.3. Do varné baňky (5.1.) se z byrety napustí 18 ml standardního roztoku glukosy (4.3.) a obsah se krouživým pohybem promíchá.

• 6.1.4. Varná baňka se umístí na zařízení k ohřevu (5.5.), předem nastavené tak, aby var nastal za (120 ± 15) s.

V celém průběhu titrace nesmí být zařízení k ohřevu nastavováno jinak (viz poznámka 1)

• 6.1.5. Jakmile se roztok začne vařit, spustí se stopky.

• 6.1.6. Obsah baňky se povaří 120 sekund (podle stopek). Ke konci se přidá 1 ml roztoku methylenové modři (4.4.).

• 6.1.7. Po 120 s, měřeno stopkami, od začátku varu se začne z byrety (6.1.2.) do varné baňky (5.1.) přidávat standardní roztok glukosy po 0,5 ml dávkách, dokud se methylenová modř neodbarví (viz poznámky 2 a 3).

Zaznamená se celkový objem přidaného standardního roztoku glukosy (X ml) včetně předposlední 0,5 ml dávky.

• 6.1.8. Stupně v bodech 6.1.1. a 6.1.2. se zopakují.

• 6.1.9. Z byrety se do varné baňky (5.1.) napustí (X - 0,3) ml standardního roztoku glukosy.

• 6.1.10. Stupně v bodech 6.1.4., 6.1.5. a 6.1.6. se zopakují.

• 6.1.11. Po 120 s, měřeno stopkami, od počátku varu se začne z byrety do varné baňky (5.1.) přidávat standardní roztok glukosy, zpočátku po 0,2 ml dávkách a nakonec po kapkách, dokud se methylenová modř právě neodbarví.

Ke konci tohoto postupu musí být doba mezi dvěma po sobě následujícími přídavky standardního roztoku glukosy 10 až 15 s.

Toto přidávání musí být provedeno během 60 s a celková doba varu tedy nesmí překročit 180 s.

K tomuto účelu může být zapotřebí provést třetí titraci s poněkud větší, příslušně upravenou počáteční dávkou standardního roztoku glukosy (6.1.9.).

• 6.1.12. Zaznamená se celková spotřeba (V0 ml) standardního roztoku při závěrečné titraci (viz poznámka 4).

• 6.1.13. Hodnota V0 musí být v rozmezí 19,0 - 21,0 ml standardního roztoku glukosy (4.3.).

Pokud se hodnota V0 nachází mimo toto rozmezí, příslušně se upraví koncentrace Fehlingova roztoku A (4.1.1.) a standardizační proces se zopakuje.

• 6.1.14. Vzhledem k tomu, že hodnota V0 je přesně známa, je třeba pro každodenní standardizaci provést jednu titraci s počátečním přídavkem standardního roztoku glukosy V0 – 0,5.

Poznámka 1: Tímto je zajištěno, že jakmile nastane var, je vývin páry rychlý a nepřerušovaný během celé titrační procedury a v co nejvíc se zabrání vniknutí vzduchu do titrační baňky a opětovné oxidaci jejího obsahu.

Poznámka 2: Odbarvení roztoku methylenové modři je nejlépe pozorovatelné v horních vrstvách obsahu titrační baňky a v oblasti menisku, tj. v místech, které v podstatě neobsahují sražený červený oxid měďnatý. Odbarvení je snadněji pozorovatelné za nepřímého osvětlení. Je výhodné použít stínítko za titrační baňkou.

Poznámka 3: Byreta by měla být během stanovení co nejlépe chráněna před zdrojem tepla.

Poznámka 4: Vzhledem k tomu, že nelze zcela vyloučit subjektivní faktor, musí každý pracovník provádět svou vlastní standardizační titraci a při výpočtu musí použít svou vlastní hodnotu V0 (7.1.).

• 6.2. Orientační zkouška připraveného vzorku

• 6.2.1. Pokud není známa přibližná hodnota redukční síly (2.1.) připraveného vzorku, je nutno provést předběžnou zkoušku, aby se získala tato přibližná hodnota, a mohla tak být vypočtena hmotnost zkušebního vzorku (6.3.).

Tato zkouška se provádí takto:

• 6.2.2. Připraví se Z % (m/V) roztok vzorku, „Z” má přibližnou hodnotu.

• 6.2.3. Postupuje se jako v bodě 6.1.2. s použitím roztoku vzorku (6.2.2.) namísto standardního roztoku glukosy.

• 6.2.4. Postupuje se jako v bodě 6.1.1.

• 6.2.5. Postupuje se jako v bodě 6.1.3. s použitím 10 ml roztoku vzorku namísto 18,0 ml standardního roztoku glukosy.

• 6.2.6. Postupuje se jako v bodě 6.1.4.

• 6.2.7. Obsah baňky se zahřeje k varu. Přidá se 1 ml roztoku methylenové modři (4.4.).

• 6.2.8. Jakmile začne var, spustí se stopky (5.6.) a začne se přidávat roztok vzorku z byrety do baňky po 1,0 ml dávkách s odstupem asi 10 sekund, a to až do odbarvení methylenové modři.

Zaznamená se celková spotřeba standardního roztoku glukosy (Y ml) včetně předposlední 0,5 ml dávky.

• 6.2.9. Hodnota Y nesmí přesáhnout 50 ml. Pokud se to stane, je třeba zvýšit koncentraci roztoku vzorku a titraci zopakovat.

• 6.2.10. Přibližná hodnota redukční síly připraveného vzorku v % je přibližně dána výrazem:

60 × V0Y × Z

• 6.3 Zkušební vzorek

S přesností na 0,1 mg se odváží takové množství připraveného vzorku (mg), které obsahuje 2,85 až 3,15 g redukujících cukrů vyjádřených jako bezvodá dextrosa (D-glukosa). Při výpočtu se použije buď známá přibližná hodnota redukční síly (2.1.), nebo přibližná hodnota získaná v bodě 6.2.10.

• 6.4 Zkušební roztok

Zkušební vzorek se v odměrné baňce o objemu 500 ml rozpustí ve vodě a vodou doplní po rysku.

• 6.5 Stanovení

• 6.5.1 Postupuje se jako v bodě 6.1.1.

• 6.5.2 Byreta (5.2.) se naplní zkušebním roztokem (6.4.) a meniskus se nastaví na nulu.

• 6.5.3 Z byrety se do varné baňky napustí 18,5 ml roztoku zkušebního roztoku. Kroužením se obsah baňky zamíchá.

• 6.5.4 Postupuje se jako v bodě 6.1.4.

• 6.5.5 Postupuje se jako v bodě 6.1.5.

• 6.5.6 Postupuje se jako v bodě 6.1.6.

• 6.5.7 Postupuje se jako v bodě 6.1.7., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.

• 6.5.8 Postupuje se jako v bodě 6.1.8.

• 6.5.9 Postupuje se jako v bodě 6.1.9., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.

• 6.5.10 Postupuje se jako v bodě 6.1.10.

• 6.5.11 Postupuje se jako v bodě 6.1.11., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.

• 6.5.12 Zaznamená se objem (V1) spotřebovaného zkušebního roztoku při závěrečné titraci.

• 6.5.13 Hodnota V1 musí být v rozmezí 19,0 až 21,0 ml zkušebního roztoku.

Pokud se hodnota V1 nachází mimo toto rozmezí, upraví se koncentrace zkušebního roztoku a stupně 6.5.1. až 6.5.12. se zopakují.

• 6.5.14 Provedou se dvě stanovení s použitím téhož zkušebního roztoku.

• 6.6 Obsah sušiny

Metodou 2 se stanoví obsah sušiny připraveného vzorku.

• 1. Vyjádření výsledků

• 7.1. Vzorce a postup výpočtu

• 7.1.1. Redukční síla

Redukční síla vyjádřená v hmotnostních procentech připraveného vzorku je dána výrazem:

300 × V0V1 × M

kde

V0 - objem (ml) standardního roztoku glukosy (4.3.) spotřebovaný při standardizační titraci (6.1.),

V1 - objem (ml) zkušebního roztoku (6.4.) spotřebovaného při titraci v postupu stanovení (6.5.),

M - hmotnost zkušebního vzorku (g) (6.3.) použitého k přípravě 500 ml zkušebního roztoku.

• 7.1.2. Glukosový ekvivalent

Glukosový ekvivalent vypočtený v hmotnostních procentech sušiny připraveného vzorku je dán výrazem:

RP × 100D

kde

RP - redukční síla vypočtená v hmotnostních procentech připraveného vzorku (7.1.1.),

D - obsah sušiny připraveného vzorku v hmotnostních procentech.

• 7.1.3. Výsledkem je aritmetický průměr výsledků dvou stanovení za předpokladu, že je splněn požadavek kladený na opakovatelnost (7.2.).

• 7.2. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 1,0 % jejich aritmetického průměru.

Příloha č. 21 k vyhlášce č. 211/2004 Sb.

Metoda stanovení síranového popela pro některé cukry určené k lidské spotřebě