Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

(25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in soil“. Pestic. Sci., 4, str. 247 – 258.

(26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Böden“. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, str. 143 – 154.

(27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque, V. H. Freed), str. 135 – 172, Plenum Press, NY.

(28) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 35, str. 732 – 210.

(29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, str. 49 – 143.

(30) Burkhard N., Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, str. 37 – 44.

(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., Enfield C.G., (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, str. 297 – 325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

(32) Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), str. 339 – 357.

(33) Leistra M., Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. Soil Sci., 28, str. 340 – 350.

(34) Bromilov R. H., Leistra M., (1980), „Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, str. 389 – 395.

(35) Green R. E., Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, str. 80 – 101,

(36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorption in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, str. 572 – 576.

(37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils“. J. Agri. Food Chem., 17, str. 667 – 668.

(38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and their sorption by soils“. Nature, 223, 1288. (39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050 – 1059.

(40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology“. J. Agric. Food Chem., 32, str. 243 – 246.

(41) Bailey G. W., White J. L., (1970), „Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, str. 29 – 92.

(42) Bailey G. W., J. L. White, Y. Rothberg., (1968), „Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32: str. 222 – 234.

(43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, str. 833 – 846.

(44) Paya-Perez A., Riaz M., Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxicol. Safety 21, str. 1 – 17.

(45) Hamaker J. W., Thompson J. M., (1972), „Adsorption in organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C. A. I., Hamaker J. W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, str. 49 – 143.

(46) Deli J., Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19: str. 67 – 69.

(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M., Santelmann, (1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Sci.,Vol.23,str.454 – 457.

(48) Haues M. H. B., Stacey M., Thompson J. M., (1968), „Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.

(49) Pionke H. B., Deangelis R. J., (1980), „Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.

(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).

(51) Scheffer F., Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.

(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., Clark F.E., eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 a 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.

(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.

(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.

(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality — Sampling — Part 3: Guidance on safety of sampling.

(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality — Sampling — Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.

(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality — Sampling — Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.

(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(59) Green R. E., Yamane V. K., (1970), „Precision in pesticide adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc., 34, str. 353 – 354.

(60) Grover R., Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., str. 109 – 138.

(61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. Pest. Sci. 1990, 30, str. 31 – 41.

(62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106,,. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26 – 29 April 1994.

(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C., (1980), „Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique“. Weed Res. 21, str. 227 – 231.

(64) Brown D. S., Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Environ.Qual, 10(3), str. 382 – 386.

(65) Chiou C. T., Porter P. E., Schmedding D. W., (1983), „Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), str. 227 – 231.

(66) Gerstl Z., Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic substances by soils and sediments“. J. Environ. Sci. Health, B19 (3), str. 297– 312.

(67) Vowles P. D., Mantoura R. F. C, (1987), „Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), str. 109 – 116.

(68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.

(69) Keniga E. E., Goring, C. A. I. (1980). „Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), str.78 – 115, ASTM STP 707, Philadelphia.

(70) Chiou C. T., Peters L. J., Freed V. H., (1979), „A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds“. Science, Vol. 206, str. 831 – 832.

(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., Means J. C., (1981), „Sorption of /-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, str. 38 – 42.

(72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere, Vol. 10(8), str. 833 – 846.

(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilitE-reactivitE“. Revue de l´Agric., 34 (4), str. 319 – 322.

(74) Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil“. Chemosphere, 32(12), str. 2493 – 2504.

(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC — screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil — results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), str. 1373 – 1384.

(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC — screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil — comparison of different stationary phases“. Chemosphere 27 (12), str. 2341 – 2352.

(77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Res., Vol. 7, str. 29 – 36.

(78) Koskinen W. C., Harper S. S., (1990), „The retention processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.

(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., Enfield C. G. (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural use“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, str.297 – 325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC. (80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isotherm“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, str. 14 – 32.

(81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N., Smith, D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soil“. J. Chem. Soc., str. 3973 – 93.

(82) Calvet R., TercE M., Arvien J. C., (1980), „Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. CaractEristiques gEnErales de l'adsorptio“. Ann. Agron. 31: str. 239 – 251.

(83) Bedbur E.; (1996), „Anomalies in the Freundlich equatio“, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13 –15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.

(84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorptio“, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1 – 3, Canterbury, UK. (85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

DODATEK 1

[image omitted]

DODATEK 2

VLIV SPRÁVNOSTI ANALYTICKÉ METODY A ZMĚNY KONCENTRACE NA SPRÁVNOST VÝSLEDKŮ ADSORPČNÍ STUDIE

Z následující tabulky (84) je zřejmé, že je-li rozdíl mezi počáteční hmotností zkoušené látky (m0 =110 µg) a její rovnovážnou hmotností v roztoku (m^ads aq (eq) =100 µg), je důsledkem 5% chyby měření rovnovážné koncentrace 50% chyba ve výpočtu hmotnosti zkoušené látky adsorbované na půdě (m^adss(eq)) a 52,4% chyba ve výpočtu Kd.

Množství půdy mpůda ^= 10 g

Objem roztoku V0 = 100 cm^3

[image omitted]

kde:

*mpadseq=m0-mvodadseq, Cpadseq=C0-CvodadseqV0mbodem, Kd=mpadseqmvodadseq V0mbodem

mpadseq^= množství zkoušené látky v půdě v rovnováze, µg

mvadseq = množství zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze, µg

Cpadseq^= množství zkoušené látky v půdě v rovnováze, µg·g^-1.

Cvadseq^= množství zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze, µg·cm^-3

R = analytická chyba stanovení mvadseq

[image omitted] = vypočtená chyba vyplývající z analytické chyby R.

DODATEK 3

METODY ODHADU Kd

• 1. Metody odhadu umožňují předpovědět Kd na základě korelací například s hodnotami Pov (12, 39, 63 – 68), s daty o rozpustnosti (12, 19, 21, 39, 68 − 73) nebo s daty o polaritě získanými při použití HPLC s obrácenou fází (74 −76). Jak je patrné z tabulky 1 a 2, vypočtou se z takových rovnic hodnoty Kou nebo Kom a poté nepřímo hodnoty Kd z rovnic:

Kou=Kd·100%ou cm3·g-1Kom=Kd1,724·100%ou cm3·g-1

• 1. Tyto korelace jsou založeny na dvou předpokladech: 1) adsorpci látky nejvíce ovlivňuje organický materiál v půdě a 2) mechanismus interakce je převážně nepolární. V důsledku toho tyto korelace 1) nejsou použitelné na polární látky (nebo jsou použitelné jen do určité míry) a 2) nejsou použitelné v případech, kdy je obsah organického materiálu v půdě velmi malý .(12). Kromě toho, ačkoli byla zjištěna uspokojivá korelace mezi Pov a adsorpcí (19), nelze totéž říci o korelaci mezi rozpustností ve vodě a mírou adsorpce (19, 21); v tomto ohledu jsou tyto studie protichůdné.

• 1. Některé příklady korelace mezi adsorpčním koeficientem a rozdělovacím poměrem oktanol/voda nebo rozpustností ve vodě jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

Tabulka 1. Příklady korelací mezi adsorpčním distribučním koeficientem a rozdělovacím koeficientem oktanol/voda; další příklady jsou uvedeny v literatuře (12, 68)

Látky	Korelace	Autoři
Substituovaná močovina	log⁡Kom=0,69+0,52log⁡Pov	Briggs (1981) (39)
Chlorované aromatické sloučeniny	log⁡Kou=-0,779+0,904log⁡Pov	Chiou et al. (1983) (65)
Různé pesticidy	log⁡Kom=4,4+0,72log⁡Pov	Gerstl a Mingelgrin (1984) (66)
Aromatické uhlovodíky	log⁡Kou=-2,53+1,15log⁡Pov	Vowles a Mantoura (1987) (67)

Tabulka 2. Příklady korelací mezi adsorpčním distribučním koeficientem a rozpustností ve vodě; další příklady jsou uvedeny v literatuře (68, 69)

Sloučeniny	Korelace	Autoři
Různé pesticidy	log⁡Kom=3,8-0,561log⁡Sv	Gerstl a Mingelgrin (1984) (66)
Chlorované alifatické a aromatické látky	log⁡Kom=4,040±0,038-0,557±0,012log⁡Sv	Chiou et al. (1979) (70)
α-Naftol	log⁡Kou=4,273-0,686log⁡Sv	Hasset et al. (1981) (71)
Cyklické, alifatické a aromatické látky	log⁡Kou=-1,405-0,921log⁡Sv-0,00953mp-25	Karickhoff (1981) (72)
Různé látky	log⁡Kom=2,75-0,45log⁡Sv	Moreale van Blade (1982) (73)

DODATEK 4

VÝPOČTY PRO STANOVENÍ PARAMETRŮ CENTRIFUGACE

• 1. Centrifugační doba se za předpokladu, že jsou částice kulové, vypočte podle následující rovnice:

t=92ηω2rp2ρp-ρvodlnRbRt	(1)

Pro zjednodušení nejsou parametry uvedeny v základních jednotkách SI (ale v jednotkách soustavy CGS).

kde:

ω = úhlová rychlost (= 2π·(rpm)/60), rad·s^-1

rpm = počet otáček za minutu

η = viskozita roztoku, g·s^-1·cm^-1

rp = poloměr částic, cm

ρp = hustota půdy, g·cm^-3

ρvod = hustota roztoku, g·cm^-3

Rt = vzdálenost od středu rotoru centrifugy k hladině roztoku v centrifugační kyvetě, cm

Rb = vzdálenost od středu rotoru centrifugy ke dnu centrifugační kyvety, cm

Rb − Rt ^= výška sloupce směsi půda/roztok v centrifugační kyvetě, cm.

V praxi se k zajištění úplného oddělení volí dvojnásobek vypočteného času.

• 1. Rovnici (1) lze dále zjednodušit, jestliže se položí viskozita (η) a hustota (ρvod) roztoku rovny viskozitě a hustotě vody při 25 °C; tedy η = 8,95 × 10^-3 g·s^-1·cm^-1 a ρvod = 1,0 g·cm^-3.

Centrifugační doba je poté dána rovnicí (2):

t=3,7rpm2·rp2ρp-1lnRbRt	(2)

• 1. Z rovnice 2 vyplývá, že pro účely oddělení částic o určité velikosti (v našem případě o poloměru 0,1 µm) jsou pro stanovení parametrů centrifugace, tj. doby (t) a počtu otáček za minutu (rpm), důležité dvě charakteristiky: 1) hustota půdy a 2) výška sloupce směsi v centrifugační kyvetě (Rb − Rt), tj. vzdálenost, kterou půdní částice urazí mezi hladinou v kyvetě a jejím dnem; výška sloupce směsi v kyvetě bude při pevně stanoveném objemu samozřejmě záviset na druhé mocnině poloměru kyvety.

• 1. Na obrázku 1 jsou znázorněny změny centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (rpm) pro různé hustoty půdy (ρp) (obrázek 1a) a pro různé výšky sloupce směsi v centrifugačních kyvetách (obrázek 1b). Z obrázku 1a je zřejmý vliv hustoty půdy; např. při obvyklých 3 000 ot./min je centrifugační doba přibližně 240 min pro hustotu půdy 1,2 g·cm^-3, ale pouze 50 min pro 2,0 g·cm^-3. Podobně je podle obrázku 1b při obvyklých 3 000 ot./min centrifugační doba přibližně 50 min pro výšku sloupce směsi 10 cm a pouze 7 min pro výšku sloupce 1 cm. Je však důležité nalézt optimální poměr mezi centrifugací, která vyžaduje co nejmenší výšku sloupce, a snadností, s jakou může experimentátor oddělovat fáze po centrifugaci.

• 1. Kromě toho je při stanovování experimentálních podmínek při oddělování fází půda/roztok důležité počítat s možnou přítomností třetí „pseudofáze“, koloidu. Koloidní částice s velikostí menší než 0,2 µm mohou mít značný vliv na celý mechanismus adsorpce látky v půdní suspenzi. Při centrifugaci, jak je popsána výše, zůstanou koloidní částice ve vodné fázi a analyzují se společně s vodnou fází. Informace o jejich vlivu se tedy ztratí.

Má-li laboratoř, která studii provádí, zařízení pro ultracentrifugaci nebo ultrafiltraci, mohla by být adsorpce/desorpce studována hlouběji včetně informací o adsorpci látky na koloidních částicích. V takovém případě se k oddělení tří fází – půdy, koloidních částic a roztoku, použije ultracentrifugace při 60 000 ot./min nebo ultrafiltrace na filtru zachycujícím částice o velikosti 100 000 daltonů. Protokol o zkoušce by měl být také odpovídajícím způsobem pozměněn, mají-li být analyzovány všechny tři fáze.

[image omitted]

Obrázek 1a Změny centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé hustoty půdy (ρp). Rt = 10 cm, Rb − Rt = 10 cm, η = 8,95 × 10^-3 g·s^-1 cm^-1 a ρvod = 1,0 g·cm^-3 při 25 °C.

[image omitted]

Obrázek 1b Změna centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé výšky sloupce směsi v centrifugační kyvetě (Rb − Rt) = L; Rt = 10 cm, η = 8,95 × 10^-3 g·s^-1·cm^-1, ρvod = 1,0 g·cm^-3 při 25 °C a ρp = 2,0 g·cm^-3.

DODATEK 5

VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)

Časové schéma průběhu experimentu je následující:

[image omitted]

U všech výpočtů se předpokládá, že zkoušená látka je stálá a že se významně neadsorbuje na stěnách nádoby.

ADSORPCE (A%)

• a) Paralelní metoda

Procento adsorpce se vypočte pro každou zkušební nádobu (i) pro každý čas (ti) podle následující rovnice:

Ati=mpadsti·100m0 %	(1) 3

Veličiny v této rovnici lze vyčíslit takto:

m0=C0·V0 μg	(2)
mpadsti=m0-Cvodadsti·V0 μg	(3)
---	---

kde:

Ati = procento adsorpce (%) v čase ti

mpadsti^= množství zkoušené látky na půdě v čase ti, kdy je prováděna analýza (µg)

m0 = množství zkoušené látky v nádobě na začátku zkoušky (µg)

C0 = počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (µg·cm^-3)

Cvodadsti= hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase ti, kdy je prováděna analýza, (µg·cm^-3); Tato koncentrace se stanoví analyticky a koriguje se na hodnoty ze slepých pokusů

V0 = počáteční objem zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (cm^3).

Hodnoty adsorpčního procenta Ati nebo Cvodadsti se vynesou proti času a zjistí se doba, po níž se ustavila sorpční rovnováha. Příklady takových křivek jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2.

Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy

[image omitted]

Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase

[image omitted]

• b) Sériová metoda

V následujících rovnicích je zohledněno, že se při studii adsorpce provádějí měření zkoušené látky v malých podílech vodné fáze v určitých časových intervalech.

— Pro každý časový interval se množství látky adsorbované na půdě vypočte takto:

— pro první časový interval ∆t1=t1-t0

mpads∆t1=m0-mmadst1·V0vaA	(4)

— pro druhý časový interval ∆t2=t2-t1

mpads∆t2=mmadst1·V0vaA-mmadst2·V0-vaAvaA	(5)

— pro třetí časový interval ∆t3=t3-t2

mpads∆t3=mmadst2·V0-vaAvaA-mmadst3·V0-2·vaAvaA	(6)

— pro n-tý časový interval ∆tn=tn-tn-1

mpads∆tn=mmadstn-1·V0-n-2·vaAvaA-mmadstn·V0-n-1·vaAvaA	(7)

— Procento adsorpce v každém časové intervalu A∆ti se vypočte z následující rovnice:

A∆ti=mpads∆tim0·100%	(8) 4

zatímco procento adsorpce (Ati) v čase ti je dáno rovnicí:

Ati=∑j=∆ti ∆timpadsjm0·100%	(9) 4

Hodnoty procenta adsorpce Ati nebo A∆ti (podle potřeb studie) se vynesou proti času a stanoví se doba, po níž se ustavila sorpční rovnováha.

— V čase ustavení rovnováhy teq:

— je množství zkoušené látky adsorbované na půdě:

mpadseq=∑∆tinmpads∆ti	(10) 4

— množství zkoušené látky v roztoku:

mvodadseq=m0-∑∆ti=1nmpads∆ti	(11) 4

— a procento adsorpce v rovnováze:

Aeq=mpadseqm0·100%	(12) 4

Výše uvedené veličiny jsou definovány takto:

mpads∆t1, mpads∆t2,..., mpads∆tn = množství látky adsorbované na půdě za časový interval ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)

mmadst1, mmadst2,..., mmadstn = množství látky naměřené v podílu (va^A) v okamžiku t1, t2, ...,tn, (µg)

mpadseq = množství zkoušené látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze, (µg)

mvodadseq = množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze, (µg)

vaA = objem podílu, ve kterém je látka stanovována, (cm^3)

A∆ti = procento adsorpce odpovídající časovému intervalu ∆ti, (%)

Aeq= procento adsorpce v adsorpční rovnováze

DESORPCE (%)

Časem t0, v němž se zahájí experiment pro studium desorpční kinetiky, je okamžik, kdy je co největší objem roztoku zkoušené látky (po dosažení adsorpční rovnováhy) nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2.

• a) Paralelní metoda

V čase ti se změří množství zkoušené látky ve vodné fázi odebrané ze zkušební nádoby i Vri a desorbované množství se vypočte z rovnice:

mvoddesti=mmdesti·V0Vri-mvodA	(13)

V desorpční rovnováze platí, že ti = teq, a tedy mvodadsti = mvodadseq.

Množství zkušební látky desorbované během časového intervalu (∆ti) je dáno rovnicí:

mvoddes∆ti=mvoddesti-∑j=1i-1mvoddesj	(14)

Procento desorpce se vypočte takto:

— v čase ti z rovnice:

Dti=mvoddestimpadseq·100%	(15)

— a během časového intervalu (∆ti) z rovnice:

D∆ti=mvoddes∆timpadseq·100%	(16)

kde:

Dti = procento desorpce v čase ti, (%)

D∆ti ^= procento desorpce za časový interval ∆ti, (%)

^mvoddesti = množství zkoušené látky desorbované v čase ti, (µg)

mvoddes∆ti= množství zkoušené látky desorbované během časového intervalu ∆ti, (µg)

mmdesti= množství zkoušené látky analyticky změřené v čase ti v roztoku o objemu Vr^i, který byl odebrán k analýze, (µg)

mvodA = množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze, (µg)

mvodAeq·V0-VRV0	(17)

mvadseq= množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze, (µg)

VR = objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (cm^3)

Vri = objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby (i) ke stanovení zkoušené látky v experimentu pro studium desorpční kinetiky (cm^3).

Hodnoty procenta desorpce Dti nebo D∆ti (podle potřeb studie) se vynesou proti času a stanoví se doba, po níž se ustavila desorpční rovnováha.

• b) Sériová metoda

V následujících rovnicích je zohledněno, že byla při předcházející studii adsorpce prováděna měření zkoušené látky v malých podílech vaA vodné fáze (sériová metoda v bodě 1.9 Provedení zkoušky) Předpokládá se, že a) objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po experimentu pro studium adsorpční kinetiky byl nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (VR) a b) celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou (VT) během experimentu pro studium desorpční kinetiky zůstává konstantní a je dán rovnicí:

VT=V0-∑i=1nvaAi	(18)

V čase ti:

— množství zkoušené látky se měří v malých podílech vaD a desorbované množství se vypočte z následující rovnice:

mvoddesti=mmdesti·VTvaD-mvodA·VT-i-1·vaDVT	(19)

— v desorpční rovnováze platí, že ti = teq, a tedy mvoddesti = mvoddeseq

— procento desorpce Dti se vypočte z následující rovnice:

Dti=mvoddestimpadseq·100%	(20)

Za časový interval (∆ti):

Pro každý časový interval se. desorbované množství látky vypočte takto:

— pro první časový interval ∆t1=t1-t0

mvoddes∆ti=mmdest1·VTvaD-mvodA a mpdest1=mpvodeq-mvoddes∆t1	(21)

— pro druhý časový interval ∆t2=t2-t1

mvoddest2=mmdest2·VTvaD-mvoddes∆ti·VT-vaDVT-mvodA·VT-vaDVT

a

mpdest2=mpadseq-mvoddes∆t1+mvoddes∆t2	(22)

pro n-tý časový interval ∆tn=tn-tn-1

mvoddes∆tn=mmdestn·VTvaD-mvodA·VT-n-1·vaDVT-∑i=1,n≠1n-1VT-n-1·vaDVT·mvoddes∆ti

a

mpdestn=mpadseq-∑i=1,n≠1n-1mvoddes∆ti	(23)

Procento desorpce za každý časový interval D∆ti se nakonec vypočte z následující rovnice:

D∆ti=mvoddes∆timpadseq·100%	(24)

zatímco procento desorpce (Dti) v čase ti je dáno rovnicí:

Dti=∑j=∆ti∆timvoddesjmpadseq·100=mvoddestimpadseq·100%	(25)

přičemž jsou výše použité veličiny definovány takto:

mpdes∆t1,mpdes∆t2,...,mpdes∆tn = množství látky, která zůstala adsorbovaná na půdě po časových intervalech ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)

mvoddes∆t1, mvoddes∆t2,..., mvoddes∆tn = množství látky desorbované za časové intervaly ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)

mmdest1, mmdest2,..., mmdestn = množství látky naměřené v podílu va^D v okamžicích t1, t2, ...., tn (µg)

VT = celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou během experimentu pro studium desorpční kineticky provedeného sériovou metodou (cm^3)

mvodA = množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze,(µg)

mvodAV0-∑i=1nvaAi-VRV0-∑i=1nvaAi·mvodadseq	(26)

VR = objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0;01M roztoku CaCl2 (cm^3)

vaD = objem alikvotu odebraného k analýze ze zkušební nádoby (i) během experimentu pro studium desorpční kineticky provedeného sériovou metodou

vaD≤0,02·VT	(27)

DODATEK 6

ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT

[image omitted]

XIX. METODA PRO STANOVENÍ ODHADU ADSORPČNÍHO KOEFICIENTU (KOU) PRO PŮDY A ČISTÍRENSKÉ KALY VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ (HPLC) – metoda C.19 podle přílohy směrnice 2001/59/ES

XIX.1 METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG121 (2000).

XIX.1.1 ÚVOD

Sorpční chování látek v půdách a v čistírenských kalech může být popsáno parametry experimentálně stanovenými zkušební metodou C.18. Důležitým parametrem je adsorpční koeficient, který je definován jako poměr koncentrace látky v půdě nebo kalu a koncentrace látky ve vodné fázi v rovnováze. Adsorpční koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku v půdě Kou je užitečným ukazatelem schopnosti chemické látky vázat se na organické látky v půdě a v čistírenském kalu a umožňuje porovnat různé chemické látky. Tento parametr lze odhadnout z korelace s rozpustností ve vodě a s rozdělovacím koeficientem oktanol/voda (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

Experimentální metoda popsaná v této zkoušce používá k odhadu adsorpčního koeficientu Kou v půdě a v čistírenských kalech vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (8). Tyto odhady jsou spolehlivější než odhady z výpočtů pomocí metodiky QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) (9). Jako metoda založená na odhadu nemůže plně nahradit násadové experimenty stanovení adsorpční/desorpční rovnováhy podle metody C.18. Odhady Kou však mohou být užitečné pro volbu vhodných parametrů pro adsorpční/desorpční studie podle zkušební metody C.18, a to vypočtením Kd (distribučního koeficientu) nebo KF (Freundlichova adsorpčního koeficientu) z rovnice 3 (viz bod 1.2).

XIX.1.2 DEFINICE

Kd: Distribuční koeficient je definován jako poměr rovnovážných koncentrací C rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému skládajícím se ze sorbentu (půda nebo čistírenský kal) a vodné fáze; je bezrozměrný, jsou-li koncentrace v obou fázích vyjádřeny jako hmotnostní podíly. Je-li koncentrace ve vodné fázi vyjádřena v jednotce hmotnosti na jednotku objemu, je jednotkou ml·g^-1. Kd se může měnit s vlastnostmi sorbentu a může záviset na koncentraci.

Kd=CpůdaCvod	nebo	CkalCvod	(1)

kde:

Cpůda = koncentrace zkoušené látky v půdě v rovnováze (µg·g^-1)

Ckal = koncentrace zkoušené látky v kalu v rovnováze (µg·g^-1)

Cvod = koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg·g^-1, µg·ml^-1).

KF: Freundlichův adsorpční koeficient je definován jako koncentrace zkoušené látky v půdě nebo v čistírenském kalu (x/m), je-li rovnovážná koncentrace Cvod ve vodné fázi rovna jedné; vyjadřuje se v µg na gram sorbentu. Hodnota se může měnit s vlastnostmi sorbentu.

log xm=log KF+1n·log Cvod	(2)

kde:

x/m = množství zkoušené látky x (µg) adsorbované v rovnováze na určitém množství sorbentu m (g)

1/n = směrnice Freundlichovy adsorpční isothermy

Cvod ^= koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg·ml^-1)

Při Cvod=1: log⁡KF=log⁡xm

Kou: Distribuční koeficient (Kd) nebo Freundlichův adsorpční koeficient (KF) normalizovaný na obsah organického uhlíku (fou) v sorbentu; zejména u nedisociujících chemických látek je přibližným ukazatelem míry adsorpce látky na sorbentu a umožňuje provést porovnání různých chemických látek. V závislosti na rozměru Kd a KF může být Kou bezrozměrný nebo může být jeho jednotkou ml . g^-1 nebo µg . g^-1 organického materiálu.

Kou=Kdfou bezrozměrný nebo v ml·g-1 nebo KFfou μg·g-1	(3)

Vztah mezi Kou a Kd není vždy lineární, hodnoty Kou se mohou pro jednotlivé půdy měnit, avšak jejich kolísání je ve srovnání s hodnotami Kd nebo KF silně omezeno.

Adsorpční koeficient (Kou) lze odečíst pomocí kapacitního faktoru (k´) z kalibrační křivky log k´ versus log Kou pro vybrané referenční sloučeniny.

k´=tR-t0t0	(4)

kde:

tR: retenční časy zkoušené a referenční látky pro HPLC (min)

t0: mrtvá doba HPLC (min) (viz bod 1.8.2).

Pov: Rozdělovací koeficient oktanol/voda je definován jako poměr koncentrací rozpuštěné látky v n-oktanolu a ve vodě; je bezrozměrný.

Pov=CoktanolCvoda =Kov	(5)

XIX.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Pře použitím metody by měly být známy strukturní vzorec, čistota a disociační konstanta (podle potřeby). Užitečné jsou informace o rozpustnosti ve vodě a v organických rozpouštědlech, o rozdělovacím koeficientu oktanol-voda a o chování při hydrolýze.

Mají-li být uvedena do korelace naměřená retenční data z HPLC pro zkoušenou látku a její adsorpční koeficient, musí být vytvořen kalibrační graf log Kou versus log k´. Použije se minimálně šest referenční bodů, alespoň po jednom nad a pod očekávanou hodnotou pro zkoušenou látku. Správnost metody se významně zlepší, budou-li použity referenční látky strukturně příbuzné se zkoušenou látkou. Nejsou-li taková data známa, ponechává se na experimentátorovi, aby vybral vhodné kalibrační látky. V takovém případě by měla být vybrána obecnější sada strukturně heterogenních látek. Látky a hodnoty Kou, které mohou být použity, jsou uvedeny v dodatku, a to v tabulce 1 pro čistírenský kal a v tabulce 3 pro půdu. Volba jiných kalibračních látek by měla být zdůvodněna.

XIX.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

HPLC se provádí na analytických kolonách plněných komerčně dostupným kyanopropylem jako pevnou fází, obsahujícím lipofilní a polární složky. Použije se mírně polární stacionární fáze na silikagelové matrici:

− O − Si	− CH2 − CH2 − CH2	− CN
silikagel	nepolární spacer	polární složka

Podstata zkušební metody je obdobná jako ve zkušební metodě A.8 (rozdělovací koeficient, metoda HPLC). Při průchodu kolonou v mobilní fázi zkoušená látka interaguje se stacionární fází. V důsledku rozdělování mezi mobilní a stacionární fází se postup zkoušené látky zpomaluje. Dvojí složení stacionární fáze s polárními a nepolárními skupinami umožňuje, aby polární a nepolární skupiny molekuly interagovaly podobným způsobem, jako je tomu u organického materiálu v půdě nebo čistírenském kalu. To umožňuje stanovit vztah mezi retenčním časem na koloně a adsorpčním koeficientem na organickém materiálu.

Na sorpční chování zejména u polárních látek má významný vliv pH. V případě zemědělských půd nebo nádrží s čistírenskými kaly se pH normálně pohybuje od pH 5,5 do 7,5. U disociujících látek se ve vhodném pufračním roztoku provedenou dvě zkoušky, a to jak s disociovanou formou, tak s nedisociovanou formou, avšak pouze v případě, že v rozmezí pH 5,5 až 7,5 disociuje alespoň 10 % zkoušené sloučeniny.

Vzhledem k tomu, že se k hodnocení použije pouze vztah mezi retencí na koloně HPLC a adsorpčním koeficientem, není nutná žádná kvantitativní metoda, nýbrž pouze stanovení retenčního času. Je-li k dispozici vhodná sada referenčních látek a lze-li realizovat standardní experimentální podmínky, je metoda rychlým a účinným způsobem odhadu adsorpčního koeficientu Kou.

XIX.1.5 POUŽITELNOST ZKOUŠKY

Metoda HPLC je použitelná pro chemické látky (radioizotopově značené i neznačené), pro něž je k dispozici vhodný detekční systém (např. spektrofotometr, detektor radioaktivního záření) a jež jsou po dobu experimentu dostatečně stabilní. Může být zvláště užitečná pro chemické látky, jejichž studium je v jiných experimentálních systémech obtížné (tj. pro těkavé látky, které nejsou rozpustné ve vodě v koncentraci, kterou lze analyticky měřit, pro látky s vysokou afinitou k povrchu inkubačních systémů). Metoda může být použita pro směsi, které dávají nerozlišitelný eluční pás. V takovém případě se stanoví horní a dolní meze hodnot log Kou pro sloučeniny přítomné ve směsi.

Při interpretaci výsledků HPLC mohou někdy působit problémy nečistoty. Jejich vliv je však malý, neboť zkoušené látky lze jasně analyticky identifikovat a od nečistot oddělit.

Metoda je validována pro látky uvedené v tabulce 1 v dodatku a byla rovněž použita u řady jiných chemických látek z následujících chemických tříd:

— aromatické aminy (např. trifluralin (1-(dipropylamino)-2,6-dinitro-4-(trifluormethyl)benzen), 4-chloranilin, 3,5-dinitroanilin, 4-methylanilin, N-methylanilin, 1-nafylamin),

— estery aromatických karoxylových kyselin (např. methyl-benzoát, ethyl-3,5-dinitrobenzoát),

— aromatické uhlovodíky (např. toluen, xylen, ethylbenzen, nitrobenzen),

— estery aryloxyfenoxypropanové kyseliny (např. diklofop-methyl, fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-P-ethyl),

— benzimidazolové a imidazolové fungicidy (např. karbendazim, fuberidazol, triazoxid),

— amidy karboxylových kyselin (např. 2-chlorbenzamid, N,N-dimethylbenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-methylbenzamid, 2-nitrobenzamid, 3-nitrobenzamid),

— chlorované uhlovodíky (např. endosulfan, DDT, hexachlorbenzen, kvintozen, 1,2,3-trichlorbenzen),

— organofosforové insekticidy (např. azinfos-methyl, disulfoton, fenamifos, isofenfos, pyrazofos, sulprofos, triazofos),

— fenoly (např. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlorfenol, 2,4,6-trichlorfenol, 1-naftol),

— deriváty fenylmočoviny (např. isoproturon, monolinuron, pencykuron),

— pigmentová barviva (např. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81),

— polyaromatické uhlovodíky (např. acenaften, naftalen),

— 1,3,5-triazinové herbicidy (např. prometryn, propazin, simazin, terbutryn),

— triazolové deriváty (např. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, triapenthenol).

Metoda není použitelná u látek, které reagují s eluentem nebo stacionární fází. Není rovněž použitelná u látek, které interagují specifickým způsobem s anorganickými složkami (např. tvoří klastrové komplexy s minerály jílu). Metoda nemusí být použitelná u povrchově aktivních látek, anorganických látek a mírných nebo silných organických kyselina a zásad. Lze stanovit Kou s hodnotami log Kou od 1,5 do 5,0. Disociující látky musí být měřeny s pufrovanou mobilní fázi, avšak je třeba dbát na to aby nedošlo ke srážení složek pufru nebo zkoušené látky.

XIX.1.6 KRITÉRIA JAKOSTI

XIX.1.6.1 Správnost

Obvykle lze adsorpční koeficient zkoušené látky stanovit v rozmezí ±0,5 řádu hodnoty stanovené násadovou rovnovážnou metodou (viz tabulka 1 v dodatku). Vyšší míry správnosti lze dosáhnout, jsou-li použité referenční látky strukturně příbuzné se zkoušenou látkou.

XIX.1.6.2 Opakovatelnost

Stanovení se provedou alespoň dvojmo. Hodnoty log Kou získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,1.

XIX.1.6.3 Reprodukovatelnost

Dosud získané zkušenosti s použitím metody svědčí o její validitě. Ověřování metody HPLC za použití 48 látek (převážně pesticidů), u nichž byla k dispozici spolehlivá data o Kou v půdě, vedlo ke korelačnímu koeficientu R = 0,95 (10, 11).

Pro zlepšení a validaci metody bylo proveden mezilaboratorní test za účasti 11 laboratoří (12). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 v dodatku.

XIX.1.7 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XIX.1.7.1 Předběžný odhad adsorpčního koeficientu

Rozdělovací poměr oktanol-voda Pov (= Kow) a do určité míry i rozpustnost ve vodě mohou být použity jako indikátory rozsahu adsorpce zejména u nedisociujících látek a mohou tedy být použity pro jeho předběžné nalezení. Pro různé skupiny chemických látek byla publikována řada užitečných korelací (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

XIX.1.7.2 Přístroje a pomůcky

Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulsním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat nástřikový ventil se vstřikovací smyčkou. Použije se komerční kyanopropylové chemicky vázané pryskyřice na silikagelu (např. Hypersil a Zorbax CN). Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona ze stejného materiálu. Kolony od různých dodavatelů se mohou podstatně lišit, pokud jde o účinnost. Pro orientaci by měly být dosaženy následující kapacitní faktory: log k´ > 0,0 pro log Kou = 3,0 a log k´> 0,4 pro log Kou = 2,0 při použití směsi methanol/voda 55/45 % jako mobilní fáze.

XIX.1.7.3 Mobilní fáze

Bylo testováno několik mobilních fází a doporučují se následující dvě mobilní fáze:

— methanol/voda (55/45 % obj.),

— methanol/0,01M citrátový pufr pH 6,0 (55/45 % obj.).

K přípravě elučního rozpouštědla se použije methanol a voda nebo citrátový pufr čistoty pro HPLC. Směs se před použitím odplyní. Měla by být provedena isokratická eluce. Nevyhovuje-li směs methanol/voda, lze vyzkoušet směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. ethanol/voda nebo acetonitril/voda. U disociujících sloučenin se doporučuje použití pufračního roztoku ke stabilizaci pH. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Nesmí být použity žádné přísady, jako jsou iontově párová činidla, neboť mohou ovlivnit sorpční vlastnosti stacionární fáze. Takové změny stacionární fáze mohou být nevratné. Z tohoto důvodu musí být experimenty s použitím přísad prováděny na zvláštních kolonách.

XIX.1.7.4 Rozpouštěné látky

Zkušební a referenční látky se rozpustí v mobilní fázi.

XIX.1.8 PROVEDENÍ ZKOUŠKY

XIX.1.8.1 Zkušební podmínky

Během měření se zaznamenává teplota. Pro zajištění konstantních podmínek během kalibrace a předběžných měření a během měření zkoušené látky se velmi doporučuje použití kolony s regulací teploty.

XIX.1.8.2 Stanovení mrtvé doby t0

Pro stanovení mrtvé doby lze použít dvě různé metody (viz také bod 1.2).

XIX.1.8.2.1 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí homologické řady

Je ověřeno, že tato metoda poskytuje spolehlivé a standardisované hodnoty t0. Podrobnosti viz zkušební metoda A.8: Rozdělovací koeficient (n-oktanol/voda) metodou za použití HPLC.

XIX.1.8.2.2 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí inertních látek, které nejsou kolonou zadržovány

Tato technika je založena na nástřiku roztoků formamidu, močoviny nebo dusičnanu sodného. Měření se provedou alespoň dvojmo.

XIX.1.8.3 Stanovení retenčních časů tR

Referenční látky se vyberou tak, jak je uvedeno v bodě 1.3. Pro stanovení jejich retenčních časů mohou být nastříknuty jako směsný standard za předpokladu, že je ověřeno, že retenční čas žádného referenčního standardu není ovlivňován přítomností jiných referenčních standardů. Kalibrace by měla být prováděna pravidelně, alespoň dvakrát denně, aby se zachytily nečekané změny účinnosti kolony. Nástřiky pro kalibraci by měly být prováděny nejlépe před nástřikem zkoušené látky a po něm, aby se ověřilo, že nedošlo ke změně retenčních časů. Zkoušené látky se nastříknou odděleně v co nejmenších množstvích (aby se kolona nezahltila) a stanoví se jejich retenční časy.

S cílem zvýšit důvěryhodnost měření musí být provedena alespoň opakovaná stanovení. Hodnoty log Kou získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,25.

XIX.1.8.4 Hodnocení

Kapacitní faktory k´ se vypočtou z mrtvé doby t0 a retenčních časů tR vybraných referenčních látek podle rovnice 4 (viz bod 1.2). Hodnoty log k´referenčních látek se poté vynesou proti jejich hodnotám log Kou z násadových rovnovážných experimentů uvedených v tabulkách 1 a 3 v dodatku. Z této křivky se poté pomocí hodnoty log k´ zkoušené látky odečte její hodnota log Kou. Je-li z aktuálních výsledků zřejmé, že hodnota log Kou leží mimo obor kalibrační křivky, zkouška se opakuje s vhodnějšími referenčními látkami.

XIX.2 DATA A ZPRÁVY

Zpráva musí obsahovat následující informace:

— identita zkoušené látky a referenčních látek, jejich čistota a podle potřeby hodnoty pKa,

— popis zařízení a pracovních podmínek, např. typ a velikost analytické (a ochranné) kolony, detekční zařízení, mobilní fáze (poměr složek a pH), rozpětí teploty během měření,

— mrtvá doba a použité metody jejího stanovení,

— množství zkoušené látky a referenčních látek zavedených do kolony,

— retenční časy referenčních sloučenin použitých ke kalibraci,

— charakteristiky proložené regresní křivky (log k´ versus log Kou) a graf regresní křivky,

— průměrná retenční data a odhad hodnoty log Kou zkoušené sloučeniny.

— chromatogramy.

XIX.3 LITERATURA

(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed.). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, kap. 4, McGraw-Hill, New York.

(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Kou) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.

(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050 – 1059.

(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, str. 227 – 231.

(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, str. 297 – 312.

(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, str. 831 – 832.

(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, str. 833 – 846.

(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121 – 128.

(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), str. 2493 – 2504.

(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), str. 2341 – 2352.

(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, str. 285 – 304.

(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373 – 1384.

DODATEK

TABULKA 1

Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC ^1,2

Látka	Číslo CAS	Log Kou pro čistírenské kaly	Log Kou pomocí HPLC	∆	Log Kou pro půdy	Log Kou pomocí HPLC	∆
Atrazin	1912-24-9	1,66	2,14	0,48	1,81	2,20	0,39
Linuron	330-55-2	2,43	2,96	0,53	2,59	2,89	0,30
Fenthion	55-38-9	3,75	3,58	0,17	3,31	3,40	0,09
Monuron	150-68-5	1,46	2,21	0,75	1,99	2,26	0,27
Fenanthren	85-01-8	4,35	3,72	0,63	4,09	3,52	0,57
Fenyl-benzoát	93-99-2	3,26	3,03	0,23	2,87	2,94	0,07
Benzamid	55-21-0	1,60	1,00	0,60	1,26	1,25	0,01
4-Nitrobenzamid	619-80-7	1,52	1,49	0,03	1,93	1,66	0,27
Acetanilid	103-84-4	1,52	1,53	0,01	1,26	1,69	0,08
Anilin	62-53-3	1,74	1,47	0,27	2,07	1,64	0,43
2,5-Dichloranilin	95-82-9	2,45	2,59	0,14	2,55	2,58	0,03

^1 W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121-128.

^2 W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), str. 107-119.

TABULKA 2

Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepšení a validace metody s HPLC (11 zúčastněných laboratoří)^1

| Látka | Číslo CAS | Log Kou (OECD 106) | Kou | Log Kou | | Metoda založená na HPLC | | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | | Atrazin | 1912-24-9 | 1,81 | 78 ± 16 | 1,89 | | Monuron | 150-68-5 | 1,99 | 100 ± 8 | 2,00 | | Triapenthenol | 77608-88-3 | 2,37 | 292 ± 58 | 2,47 | | Linuron | 330-55-2 | 2,59 | 465 ± 62 | 2,67 | | Fenthion | 55-38-9 | 3,31 | 2062 ± 648 | 3,31 |

^1 W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373-1384.

TABULKA 3

Referenční látky doporučené pro skreeningovou metodu s HPLC na základě adsorpčních dat pro půdu

Referenční látka	Číslo CAS	Logaritmy středních hodnot z násadové rovnovážné metody	Počet hodnot Kou	Logaritmus směrodatné odchylky	Zdroj
Acetanilid	103-84-4	1,25	4	0,48	a)
Fenol	108-95-2	1,32	4	0,70	a)
2-Nitrobenzamid	610-15-1	1,45	3	0,90	b)
N,N-Dimethylbenzamid	611-74-5	1,52	2	0,45	a)
4-Methylbenzamid	619-55-6	1,78	3	1,76	a)
Methylbenzoát	93-58-3	1,80	4	1,08	a)
Atrazin	1912-24-9	1,81	3	1,08	c)
Isoproturon	34123-59-6	1,86	5	1,53	c)
3-Nitrobenzamid	645-09-0	1,95	3	1,31	b)
Anilin	62-53-3	2,07	4	1,73	a)
3,5-Dinitrobenzamid	121-81-3	2,31	3	1,27	b)
Karbendazim	10605-21-7	2,35	3	1,37	c)
Triadimenol	55219-65-3	2,40	3	1,85	c)
Triazoxide	72459-58-6	2,44	3	1,66	c)
Triazofos	24017-47-8	2,55	3	1,78	c)
Linuron	330-55-2	2,59	3	1,97	c)
Naftalen	91-20-3	2,75	4	2,20	a)
Endosulfan-diol	2157-19-9	3,02	5	2,29	c)
Methiokarb	2032-65-7	3,10	4	2,39	c)
Acid Yellow 219	63405-85-6	3,16	4	2,83	a)
1,2,3-Trichlorbenzen	87-61-6	3,16	4	1,40	a)
γ-HCH (lindan)	58-89-9	3,23	5	2,94	a)
Fenthion	55-38-9	3,31	3	2,49	c)
Direct Red 81	2610-11-9	3,43	4	2,68	a)
Pyrazofos	13457-18-6	3,65	3	2,70	c)
a-Endosulfan	959-98-8	4,09	5	3,74	c)
Diklofop-methyl	51338-27-3	4,20	3	3,77	c)
Fenanthren	85-01-8	4,09	4	3,83	a)
Basic Blue 41 (směs)	26850-47-5	4,89	4	4,46	a)
	12270-13-2
DDT	50-29-3	5,63	1	—	b)

XX. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO REPRODUKCI U DAPHNIA MAGNA – metoda C.20 podle přílohy směrnice 2001/59/ES

XX.1 METODA

Tato zkouška toxicity pro reprodukci je replikou metody OECD TG 211 (1998).

XX.1.1 ÚVOD

Hlavním cílem zkoušky je posoudit účinky chemických látek na reprodukční schopnost druhu Daphnia magna.

XX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Matečné organismy: dafnie samičího pohlaví, které jsou přítomné na začátku zkoušky a jejich reprodukční schopnost je předmětem studie.

Potomstvo: mladé dafnie pocházející z matečných organismů v průběhu zkoušky.

Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace, při níž je pro danou expoziční dobu pozorován statisticky významný účinek látky na reprodukci a na mortalitu matečných organismů (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou, v průběhu stanovené expoziční doby. Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dvě podmínky splnit, musí podrobně vysvětleno jak byla LOEC (a tedy i NOEC) zvolena.

Koncentrace bez pozorovaných účinků (no observed effect concentration, NOEC): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC, která při srovnání s kontrolní skupinou nemá pro danou expoziční dobu statisticky významný účinek (p < 0,05).

ECx: je koncentrace zkoušené látky rozpuštěné ve vodě, která pro danou expoziční dobu vede k x% snížení reprodukce dafnií Daphnia magna.

Imanentní růst populace: je míra růstu populace, v níž je zahrnuta reprodukční schopnost a mortalita specifická z hlediska stáří (20, 21, 22). V ustáleném stavu bude nulový. Pro rostoucí populaci bude kladný a pro snižující se populaci bude záporný. Je zřejmé, že při záporném růstu nelze druh zachovat a nakonec dojde k jeho vyhynutí.

Mez detekovatelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku detekovat, nikoli však stanovit.

Mez stanovitelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku kvantitativně naměřit.

Mortalita: organismus se zaznamená jako mrtvý, je-li nepohyblivý, tj. není-li schopen plavat nebo není-li u končetin (přívěsků) nebo u postabdomen pozorován pohyb do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádobou. (Použije-li se jiná definice, musí být uvedena společně s literární odkazem.)

XX.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Mladé samičí dafnie (matečné organismy) na začátku zkoušky mladší než 24 h se exponují zkoušené látce přidané do vody v určitém rozsahu koncentrací. Zkouška trvá 21 dní. Na konci zkoušky se odhadne celkový počet vylíhnutých živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. To znamená, že nedospělé dafnie pocházející z dospělých dafnií, které v průběhu zkoušky uhynuly, se z odhadů vyloučí. Reprodukční schopnost matečných organismů lze vyjádřit jiným způsobem (např. jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu za den, a to od prvního dne, kdy bylo potomstvo pozorováno), který se však uvede doplňkově vedle celkového počtu nedospělých dafnií pocházejících z jedné matečné dafnie živé na konci zkoušky. Reprodukční schopnost organismů exponovaných zkoušené látce se porovná s reprodukční schopností kontrolní skupiny (kontrolních skupin) s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC). Kromě toho se data pokud možno analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% snížení reprodukční schopnosti, (tj. EC50, EC20 nebo EC10).

Musí být rovněž uvedeno přežití matečných organismů a okamžik narození vylíhnutí prvních potomků. Zkoumány mohou být také jiné účinky vyvolané látkou, které mají vliv na charakteristiky, jako jsou růst (např. vliv na délku) a případně imanentní růst populace.

XX.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

Měly by být k dispozici výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.2, část I) provedené u Daphnia magna. Výsledky mohou být užitečné pro volbu vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkouškách toxicity pro reprodukci. Měly by být známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a měla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to s doloženým výtěžkem a mezí stanovitelnosti.

Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pKa, Pov a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).

XX.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY

Má-li být zkouška platná, musí být u kontrolní skupiny (kontrolních skupin) splněna následující kriteria reprodukční schopnosti:

— mortalita matečných organismů (dafnií samičího pohlaví) nesmí na konci zkoušky překročit 20 %,

— střední hodnota počtu živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu živého na konci zkoušky je ≥ 60.

XX.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XX.1.6.1 Přístroje a pomůcky

Zkušební nádoby nebo jiné přístroje a pomůcky, které přijdou do styku se zkušebními roztoky, by měly být skleněné nebo z jiného chemicky inertního materiálu. Zkušebními nádobami jsou obvykle skleněné kádinky.

Kromě toho bude nezbytné některé nebo veškeré následující zařízení:

— přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),

— vhodný přístroj pro regulaci teploty,

— pH-metr,

— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,

— zařízení pro stanovení celkového organického uhlíku (TOC) ve vodě nebo zařízení pro stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK),

— vhodné zařízení pro ovládání režimu osvětlení a pro měření intenzity světla.

XX.1.6.2 Testovací organismy

Ke zkoušce se použije druh Daphnia magna Straus. Jiné druhy dafnií mohou být použity, pokud splňují případná kritéria validity (kriterium validity týkající se reprodukční schopnosti kontrolních skupin by mělo být relevantní pro daný druh dafnií). Použijí-li se jiné druhy dafnií, musí být jasně identifikovány a jejich použití musí být zdůvodněno.

Klon by měl být identifikován nejlépe uvedením genotypu. Výzkum ukázal (1), že reprodukční schopnost klonu A (který pochází z institutu IRCHA ve Francii) (3) stabilně splňuje kriterium validity, jímž je ≥ 60 potomků na přeživší matečný organismus při kultivaci za podmínek popsaných v této metodě. Splňuje-li kultura dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku jsou přijatelné i jiné klony.

Na začátku zkoušky musí být dafnie 24 h staré a nesmí být první generací. Musí pocházet ze zdravé kultury (tj. nesmí vykazovat známky stresu projevující se vysokou mortalitou, přítomnost jedinců samčího pohlaví a epifií, zpoždění produkce prvních potomků, přítomnost jinak zbarvených jedinců atd.). Organismy ze zásobní kultury musí být chovány v podmínkách podobných těm, které mají být použity při zkoušce (osvětlení, teplota, médium, krmení a počet dafnií na jednotku objemu). Liší-li se kultivační médium pro dafnie, které má být použito při zkoušce, od média používaného k rutinní kultivaci dafnií, doporučuje se zařadit před zkouškou obvykle třítýdenní aklimatizační období (tj. v délce odpovídající jedné generaci), aby nedošlo u matečných organismů ke stresu.

XX.1.6.3 Zkušební médium

Doporučuje se, aby bylo v této zkoušce použito přesně definované médium. Tím se lze vyhnout použití přísad, které je obtížné charakterizovat (např. mořských řas, půdy, extraktu atd.) a zvýšit vyhlídky mezilaboratorní standardizace. Jako vyhovující pro tento účel byla shledána Elendtova média M4 (4) a M7. Přijatelná jsou však i jiná média (např. (5, 6)), splňuje-li při jejich použití reprodukční schopnost kultury dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku.

Použije-li se médium, které obsahuje nedostatečně charakterizovatelné přísady, měly by být tyto přísady jasně specifikovány a v protokolu o zkoušce se uvedou informace o jejich složení, to zejména o obsahu organického uhlíku, neboť může přispívat k dodávané stravě. Doporučuje se, aby byl stanoven celkový organický uhlík (TOC) a/nebo chemická spotřeba kyslíku (CHSK) výchozí formy organické přísady a aby byl odhadnut výsledný příspěvek k TOC nebo CHSK ve zkušebním médiu. Doporučuje se, aby byly úrovně TOC v médiu (tj. před přidáním řas) nižší než 2 mg·l^-1 (7).

Při zkoušení látek obsahujících kovy je důležité si uvědomit, že vlastnosti zkušebního média (např. tvrdost, chelatační schopnosti) mohou mít vliv na toxicitu látky. Z tohoto důvodu je žádoucí, aby bylo médium přesně definováno. V současnosti jsou však jedinými přesně definovanými médii, o nichž je známo, že jsou vhodná pro dlouhodobou kultivaci kultury druhu Daphnia magna, Elendtova média M4 a M7. Obě média obsahují chelatační činidlo EDTA. Práce (2) ukázala, že provádí-li se zkouška v médiích M4 a M7, je „zdánlivá toxicita“ kadmia zpravidla nižší než v médiu, které neobsahuje EDTA. Média M4 a M7 se tedy nedoporučují pro zkoušení látek obsahujících kovy a neměla by se používat ani jiná média obsahující činidla známá svojí chelatační schopností. V případě látek obsahujících kovy se doporučuje používat jiné médium, například rekonstituovanou tvrdou sladkou vodu podle ASTM (7), která neobsahuje EDTA a do níž je přidán extrakt z řas (8). Tato kombinace rekonstituované tvrdé sladké vody podle ASTM a extraktu z řas je také vhodná pro dlouhodobou kultivaci druhu Daphnia magna (2) a pro zkoušení na tomto druhu, přestože vykazuje slabé chelatační účinky způsobené organickými složkami přidaného extraktu z řas.

Na začátku zkoušky a v jejím průběhu by měla být koncentrace rozpuštěného kyslíku vyšší než 3 mg·l^-1. pH by mělo být v rozmezí 6 až 9 a zpravidla by se nemělo v žádné zkoušce měnit o více než 1,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg·l^-1 (jako CaCO3). Ve zkouškách při této a vyšší tvrdosti reprodukční schopnost prokazatelně vyhovovala kritériím validity (9, 10).

XX.1.6.4 Zkušební roztoky

Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se obvykle připraví ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky se připraví nejlépe rozpuštěním látky ve zkušebním médiu.

Pro přípravu vhodně koncentrovaného zásobního roztoku může být někdy nezbytné použití organických rozpouštědel nebo dispergátorů, měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, 0,01% methylcellulosa a HCO-40. V žádném případě by však neměl být obsah zkušební látky ve zkušebních roztocích vyšší než je její rozpustnost ve zkušebním médiu.

K přípravě zásobního roztoku, který lze přesně dávkovat do vody, se použijí rozpouštědla. Při doporučené koncentraci rozpouštědla v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml·l^-1) nejsou výše uvedená rozpouštědla toxická a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.

Dispersanty mohou usnadnit přesné dávkování a dispergaci. Při doporučené koncentraci v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml·l^-1) nejsou výše uvedené dispergátory toxické a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.

XX.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY

Expozice se rozvrhne pro jednotlivé zkušební nádoby a veškeré další obsluhování zkušebních nádob se provádí náhodně. Nedodržení této zásady může vést k jednostrannému vychýlení, které může být považováno za účinek koncentrace. Jsou-li například experimentální jednotky obsluhovány v pořadí zahájení expozice nebo v pořadí koncentrací, mohl by nějaký časově podmíněný efekt, např. únava obsluhy nebo jiné pochybení, vést k vyšším účinkům při vyšších koncentracích. Mohou-li být dále výsledky ovlivněny počátečními podmínkami zkoušky nebo okolními podmínkami, jako je např. umístění v laboratoři, mělo by být zváženo blokové uspořádání zkoušky.

XX.1.8 POSTUP

XX.1.8.1 Podmínky expozice

XX.1.8.1.1 Délka expozice

Zkouška trvá 21 dní.

XX.1.8.1.2 Nasazování

Matečné organismy se umístí po jednom do zkušebních nádob s 50 až 100 ml média.

Aby bylo možné splnit požadavky analytické metody použité pro stanovení koncentrace zkoušené látky, může být v některých případech nezbytné použít větší objemy, přípustné je rovněž sdružování paralelních vzorků k chemické analýze. Jsou-li použity objemy větší než 100 ml, může být nezbytné zvýšit krmné dávky podávané dafniím, aby se zajistila odpovídající dostupnost stravy a splnila kritéria validity. U průtokových zkoušek mohou být z technických důvodů zvážena jiná uspořádání (např. čtyři skupiny po 10 organismech ve větším zkušebním objemu), avšak jakékoli změny uspořádání zkoušky musí být ale uvedeny v závěrečné zprávě.

XX.1.8.1.3 Počet organismů

U semistatických zkoušek se nasadí jednotlivě alespoň 10 organismů pro každou zkušební koncentraci a alespoň 10 organismů jednotlivě do zkušebních skupin.

U průtokových zkoušek se ukázalo vhodným rozdělit pro každou koncentraci 40 organismů do čtyř skupin po 10 organismech (1). Může být použit menší počet zkušebních organismů, přičemž se doporučuje na jednu koncentraci rozdělit minimálně 20 organismů do dvou nebo více paralelních skupin o stejném počtu organismů (např. čtyři paralelní skupiny po pěti dafniích). Je třeba poznamenat, že u zkoušek, při níž se organismy nasazují jako skupiny, nebude možné vyjádřit reprodukční schopnost jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky v případě, že matečný organismus uhyne. V takovém případě se reprodukční schopnost vyjádří jako „celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu přítomného na začátku zkoušky“.

XX.1.8.1.4 Krmení

U semistatických zkoušek se dafnie krmí nejlépe denně, alespoň však třikrát týdně (tj. s výměnou média). Odchylky od této praxe (např. u průtokových zkoušek) se uvedou ve zprávě.

Strava matečných organismů během zkoušky by měla sestávat nejlépe z živých buněk řas jednoho nebo více následujících druhů: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (nyní Pseudokirchneriella subcapitata (11)) a Scenedesmus subspicatus. Množství dodávané stravy by mělo vycházet z množství organického uhlíku (C) dodávaného na jeden matečný organismus. Výzkum (12) ukázal, že u druhu Daphnia magna je postačující pro dosažení dostatečného potomstva nezbytného pro splnění kritérií validity množství stravy od 0,1 do 0,2 mg C na dafnii za den. Strava může být dodávána buď ve stejných dávkách po celou dobu zkoušky, nebo podle požadavku v nižších dávkách na začátku zkoušky a poté ve zvyšujících se dávkách s ohledem na růst matečných organismů. V takovém případě by mělo množství stravy po celou dobu zůstat v doporučeném rozmezí 0,1 až 0,2 mg C na dafnii za den.

Použije-li se k určení potřebného množství stravy zástupný ukazatel, jako je počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle, musí každá laboratoř vytvořit vlastní nomogram vztahu zástupného ukazatele a obsahu uhlíku v kultuře řas (viz dodatek 2 s návodem na vytvoření nomogramu). Nomogramy by měly být ověřovány jednou ročně a častěji v případě, že se změní podmínky kultivace řas. Absorbance ve viditelném světle byla shledána lepším zástupným ukazatelem celkového obsahu uhlíku, než počet buněk (13).

Dafniím by měla být dodávána koncentrovaná suspenze řas, aby se minimalizoval objem kultivačního média řas uváděný do zkušební nádoby. Zkoncentrování řas lze dosáhnout centrifugací a následnou resuspenzí v destilované vodě, v deionisované vodě nebo v kultivačním médiu dafnií.

XX.1.8.1.5 Osvětlení

16 hodin světla při intenzitě nepřekračující 15 až 20 µE m^-2·s^-1.

XX.1.8.1.6 Teplota

Teplota zkušebního média by se měla pohybovat v rozmezí 18 až 22 °C. V žádné zkoušce by však teplota neměla v těchto mezích kolísat o více než 2 °C (např. 18 až 20, 19 až 21 nebo 20 až 22 °C). Pro účely sledování teploty může být vhodné použít další zkušební nádobu.

XX.1.8.1.7 Provzdušňování

Zkušební nádoby nesmí být v průběhu zkoušky provzdušňovány.

XX.1.8.2 Zkušební koncentrace

Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2 a přiměřený počet paralelních zkušebních skupin v rámci každé zkušební koncentrace (viz bod 1.8.1.3). Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušebním médiu.

Při volbě rozsahu koncentrací by měly být zohledněny následující zásady:

ii) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejvyšší zkušební koncentrace dostatečně vysoká, aby byla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se zvýšenou nejvyšší koncentrací;

iii) má-li být pro účinky na reprodukci odhadnuta ECx, doporučuje se, aby byl použit dostatečný počet koncentrací s cílem zjistit ECx s přijatelným intervalem spolehlivosti. Je-li znám odhad EC50 pro účinky na reprodukci, doporučuje se, aby byla nejvyšší zkušební koncentrace vyšší než tato EC50. Jinak sice bude stále možné odhadnout EC50, interval spolehlivosti však bude velmi široký a nemusí být možné uspokojivé posouzení přiměřenosti navrženého modelu;

iv) do rozsahu zkušebních koncentrací by nejlépe neměly spadat koncentrace, které mají statisticky významný účinek na přežití dospělců, neboť by mohl být změněn charakter zkoušky z pouhé zkoušky toxicity pro reprodukci na kombinovanou zkoušku toxicity pro reprodukci a mortality, která vyžaduje daleko složitější statistickou analýzu.

Předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií) by měla pomoci při volbě vhodných zkušebních koncentrací.

Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku rozpouštědlo nebo dispergátor (viz bod 1.6.4), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádobě vyšší než 0,1 ml·l^-1 a měla by být ve všech zkušebních nádobách stejná.

XX.1.8.3 Kontrolní skupiny

Kromě zkušební série se nasadí jedna série kontrolních skupin pro kontrolu zkušebního média a podle potřeby jedna série kontrolních skupin obsahujících rozpouštědlo nebo dispergátor. Použije-li se rozpouštědlo nebo dispergátor, měla by být jejich koncentrace stejná jako koncentrace v nádobách se zkoušenou látkou. Použije se vhodný počet paralelních skupin (viz oddíl 1.8.1.3).

V dobře vedených zkouškách by měl být variační koeficient středního počtu živých potomků narozených každému matečnému organismu v kontrolní skupině (kontrolních skupinách) zpravidla ≤ 25 %, a to by mělo být uvedeno v plánu zkoušek s oddělenými jedinci.

XX.1.8.4 Obnovování zkušebního média

Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, médium se však obnovuje alespoň třikrát týdně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky po maximální dobu mezi obnoveními média (tj. po tři dny) stálá (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měl by být zváženo častější obnovování média nebo průtoková zkouška.

Při obnovování média v semistatických zkouškách se připraví druhá série zkušebních nádob a matečné organismy se do nich přenesou např. skleněnou pipetou o vhodném průměru. Objem média přeneseného s dafniemi by měl být co nejmenší.

XX.1.8.5 Pozorování

Výsledky pozorování prováděných během zkoušky se zaznamenávají do přehledu dat (viz příklady v dodatcích 3 a 4). Jsou-li požadována další měření (viz body 1.3 a 1.8.8), může být nezbytné provádět další pozorování.

XX.1.8.6 Potomstvo

Potomstvo pocházející z každého matečného organismu se od jeho prvního výskytu nejlépe denně vybírá a počítá, aby nespotřebovávalo potravu určenou pro dospělého jedince. Pro účely této metody je třeba započítat pouze živé potomstvo, avšak zaznamenává se i přítomnost potracených vajíček nebo mrtvého potomstva.

XX.1.8.7 Mortalita

Mortalita matečných organismů se zaznamenává nejlépe denně, alespoň současně s počítáním potomstva.

XX.1.8.8 Další parametry

Třebaže je tato metoda navržena hlavně k posouzení účinků na reprodukci, je možné, aby byly v míře dostatečné pro statistickou analýzu kvantifikovány i jiné účinky. Užitečné je zvláště měření růstu, neboť poskytuje informaci o možných subletálních účincích. Tato pozorování mohou být užitečnější než samotné měření reprodukce. Doporučuje se změřit na konci zkoušky délku matečných organismů (tj. délku těla bez zadečkového hrotu). K parametrům, které lze měřit nebo vypočítávat patří dále doba do narození prvních plůdků (a následně dalších potomků), počet a velikost potomků na jeden organismus, počet potracených plůdků, přítomnost jedinců samčího pohlaví nebo efipií a imanentní růst populace.

XX.1.8.9 Častost analytických stanovení a měření

Alespoň jednou týdně se měří koncentrace kyslíku, teplota, tvrdost a pH v čerstvém a ve starém médiu, v kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace.

Během zkoušky se v pravidelných intervalech stanoví koncentrace zkoušené látky stanovují

U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ±20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 % – viz body 1.4 a 1.4.8), se doporučuje analyzovat alespoň nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a při obnovování, a to jednou během prvního týdne zkoušky (tj. analýzy se provedou na vzorku z téhož roztoku – při jeho přípravě a při obnovování). Tato stanovení se poté opakují alespoň v týdenních intervalech.