Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Typ Vyhláška

Publikace 2004-04-29

Naposledy aktualizováno 2005-10-08

Stav Platný

Zdroj e-Sbírka

článků 4

U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to ihned po jejich přípravě a při obnovování. U zkoušek, u nichž není naměřená počáteční koncentrace zkoušené látky v rozsahu ±20 % nominální koncentrace, avšak u nichž lze dostatečně prokázat, že počáteční koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé, (tj. od 80 do 120 % počátečních koncentrací), by mohla být stanovení ve 2. a 3. týdnu zkoušky omezena na nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace. Ve všech případech je stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádoby.

U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření „starých“ roztoků). Doporučuje se však zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé. V těchto typech zkoušky se průtok ředicí vody a zkoušené látky kontroluje denně.

Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky uspokojivě udržována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než ±20 %, vyjádří se výsledky jako časově vážené průměry (viz dodatek 5).

XX.2 DATA A ZPRÁVY

XX.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Účelem této zkoušky je stanovit účinek zkoušené látky na celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. Celkový počet potomků na matečný organismus se vypočte pro každou zkušební nádobu (tj. pro každou paralelní nádobu). Jestliže v kterékoli paralelní nádobě matečný organismus během zkoušky uhyne nebo se zjistí, že jde o samečka, vyloučí se nádoba z experimentu. Analýza se poté provede se zmenšeným počtem paralelních nádob.

Pro odhad LOEC a tedy i NOEC vztahujících se k účinkům chemické látky na reprodukční schopnosti je nezbytné vypočíst střední hodnotu reprodukční schopnosti přes všechny paralelní nádoby pro každou koncentraci a spojený residuální rozptyl, a to lze provést analýzou rozptylu (ANOVA). Střední hodnota pro každou koncentraci musí být poté porovnána se střední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou mnohonásobného porovnání. Užitečnými mohou být Dunnettův nebo Williamsův test (14, 15, 16, 17). Je nezbytné ověřit, že je splněn předpoklad homogenity rozptylu nezbytný pro ANOVA. Doporučuje se provést ověření raději graficky než formálním testem významnosti (18); vhodnou alternativou je Bartlettův test. Není-li tento předpoklad splněn, měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylu, nebo by měla být provedena vážená ANOVA. Vypočte a uvede se velikost účinku zjistitelná pomocí ANOVA (tj. nejmenší významný rozdíl).

Pro odhad koncentrace, která způsobuje 50% snížení reprodukční schopnosti (tj. EC50), se daty proloží vhodná křivka (vhodné křivky), jako např. logaritmická křivka, a to statistickou metodou, např. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších čtverců. Křivka by měla být tak parametrizována, aby bylo možné přímo odhadnout EC50 a její směrodatnou odchylku. To značně usnadní výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnotu EC50. Pokud nejsou dobré důvody pro upřednostnění jiných intervalů spolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedostatků proložení. To lze provést graficky nebo rozdělením residuálního součtu čtverců na složku „chyby v proložení“ a „náhodné chyby“ a provedením testu významnosti chyby v proložení. Vzhledem k tomu, že u expozic, jejichž důsledkem je vyšší reprodukční schopnost, je větší rozptyl počtu vylíhnutých potomků než u expozic vedoucích k nejnižší reprodukční schopnosti, je třeba promyslet vážení pozorovaných hodnot s cílem zohlednit různé rozptyly u různě exponovaných skupin (viz výchozí informace (18)).

Při analýze dat z rozhodujícího okružního testu (2) byl použit následující model prokládající logaritmickou křivku; lze však použít i jiné modely:

Y=c1+xbx0

kde:

Y: celkový počet živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky (vypočteno pro každou nádobu)

x: koncentrace látky

c: očekávaný počet potomků při x = 0

x0: EC50 v populaci

b: směrnice.

Tento model bude pravděpodobně vhodný pro velký počet situací, budou však existovat zkoušky, pro něž bude nevhodný. Jak je uvedeno výše, je třeba ověřit validitu modelu. V některých případech může být vhodnější model předpokládající rozmezí, u něhož vedou nižší koncentrace k pozitivním účinkům (19).

Lze rovněž odhadnout další koncentrace s určitým účinkem, např. EC10 nebo EC20, může být však dobré použít jinou parametrizaci modelu, než je použita pro odhad EC50.

XX.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XX.2.2.1 Zkoušená látka:

— fyzikální povaha a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

— údaje o chemické identitě včetně údaje o čistotě.

XX.2.2.2 Testovací druhy:

— klon (byl-li geneticky popsán), dodavatel nebo zdroj (je-li znám) a použité kultivační podmínky. Byl-li použit jiný druh než Daphnia magna, musí to být uvedeno a zdůvodněno.

XX.2.2.3 Zkušební podmínky:

— použitý zkušební postup (např. semistatická nebo průtoková metoda, objem, velikost obsádky v počtu dafnií na litr),

— fotoperioda a intenzita světla,

— uspořádání zkoušky (např. počet paralelních nádob, počet matečných organismů na jednu paralelní nádobu),

— podrobnosti o použitém kultivačním médiu,

— byly-li použity, přídavky organických látek včetně jejich složení, zdroje, metody přípravy, TOC/CHSK výchozích preparátů, odhad výsledného TOC/CHSK ve zkušebním médiu,

— podrobné informace o krmení, včetně množství (v mg C na dafnii za den) a plánu (např. typ krmiva, včetně specifického názvu (druhu) u řas a kmene, je-li znám, kultivační podmínky),

— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jsou-li použity, uvedou se rozpouštědlo nebo dispergátor a jejich koncentrace),

XX.2.2.4 Výsledky:

— výsledky případných předběžných studií stálosti zkoušené látky,

— nominální zkušební koncentrace a výsledky všech analýz pro stanovení koncentrace zkoušené látky ve zkušebních nádobách (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 4); uvede se také výtěžek metody a mez stanovitelnosti,

— kvalita vody ve zkušebních nádobách (tj. pH, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku a TOC a/nebo CHSK a dále podle potřeby tvrdost) (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),

— celkový počet živých potomků na každý matečný organismus (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),

— počet uhynulých matečných organismů a den, kdy k úhynu došlo (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),

— variační koeficient kontrolní reprodukční schopnosti (založený na celkovém počtu živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky),

— křivka závislosti celkovém počtu živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky (pro každou paralelní nádobu), na koncentraci zkoušené látky

— nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (LOEC) na reprodukci včetně popisu použitých statistických metod a údaje o velikosti účinku, který by mohl být detekován, a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) na reprodukci; je-li k dispozici, uvede se LOEC/NOEC pro mortalitu matečných organismů,

— je-li k dispozici, ECx pro reprodukci a interval spolehlivosti, dále graf křivky modelu použitého pro její výpočet, směrnice křivky závislosti dávka-reakce a její směrodatná odchylka,

— jiné pozorované biologické účinky a jiná měření: uvedou se jakékoli jiné biologické účinky, které byly pozorovány nebo změřeny (např. růst matečných organismů) včetně přiměřeného zdůvodnění,

— vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.

XX.3 LITERATURA

(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20. – 21. březen 1993.

(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring. Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paříž 1997.

(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M., Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicol Environ. Safety, 21, str. 257 – 265.

(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25 – 33.

(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.

(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol, 47, str. 775 – 782.

(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 str.

(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C., Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), str. 144 – 148.

(9) Parkhurst B. R., Forte J. L., Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 26, str. 1 – 8.

(10) Cowgill U. M., Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), str. 185 –196.

(11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.

(12) Sims I. R., Watson S., Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. Chem., 12, str. 2053 – 2058.

(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, str. 459 – 466.

(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, str. 1096 – 1121.

(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, str. 482 – 491.

(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, str. 103 – 117.

(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, str. 510 – 531.

(18) Draper N. R., Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.

(19) Brain P., Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, str. 93 – 96.

(20) Wilson E. O., Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population ****Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.

(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, str. 532.

(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L., Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, str. 1156 – 1166.

DODATEK 1

PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4

Aklimatizace na Elendtova média M7 M4

Některé laboratoře narazily na obtíže při přímém přenosu dafnií do médií M4 (1) a M7. Určitého úspěchu však bylo dosaženo postupnou aklimatizací, tj. přenesením z vlastního média do 30% Elendtova média, poté do 60% Elendtova média a nakonec do 100% Elendtova média. Délky doby aklimatizace mohou být až jeden měsíc.

PŘÍPRAVA

Stopové prvky

Ve vodě vhodné čistoty, např. v deionisované nebo destilované vodě nebo ve vodě přečištěné reverzní osmosou, se nejprve připraví samostatné zásobní roztoky (I) jednotlivých stopových prvků (I). Z těchto oddělených zásobních roztoků (I) se připraví jeden zásobní roztok (II) obsahující všechny stopové prvky (směsný roztok), tj.:

| Zásobní roztoky I (jednotlivá látka) | Množství přidané do vody (mg·l-1) | Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek) | Kombinovaný zásobní roztok II se připraví přidáním následujícího množství zásobního roztoku I do vody (ml·l-1) | | | M 4 | M 7 | | | | | --- | --- | --- | --- | --- | | H3BO3 | 57 190 | 20 000 | 1,0 | 0,25 | | MnCl2·4H2O | 7 210 | 20 000 | 1,0 | 0,25 | | LiCl | 6 120 | 20 000 | 1,0 | 0,25 | | RbCl | 1 420 | 20 000 | 1,0 | 0,25 | | SrCl2·6H2O | 3 040 | 20 000 | 1,0 | 0,25 | | NaBr | 320 | 20 000 | 1,0 | 0,25 | | Na2MoO4·2H2O | 1 260 | 20 000 | 1,0 | 0,25 | | CuCl2·2H2O | 335 | 20 000 | 1,0 | 0,25 | | ZnCl2 | 260 | 20 000 | 1,0 | 1,0 | | CoCl2·6H2O | 200 | 20 000 | 1,0 | 1,0 | | KI | 65 | 20 000 | 1,0 | 1,0 | | Na2SeO3 | 43,8 | 20 000 | 1,0 | 1,0 | | NH4VO3 | 11,5 | 20 000 | 1,0 | 1,0 | | Na2EDTA·2H2O | 5 000 | 2 000 | — | — | | FeSO4·7H2O | 1 991 | 2 000 n | — | — | | Jak roztok Na2EDTA, tak roztok FeSO4 se připraví samostatně, spojí se a ihned se autoklávují. Získají se: | | | | | | 2 litry roztoku Fe-EDTA | | 1 000 | 20,0 | 5,0 |

Média M4 a M7

Média M4 a M7 se připraví ze zásobního roztoku II, makroživin a vitaminů následujícím způsobem:

| | Množství přidané do vody (mg·l-1) | Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek) | Množství zásobního roztoku přidané za účelem přípravy média (ml·l-1) | | | M 4 | M 7 | | | | | Zásobní roztok II obsahující kombinaci stopových prvků | | 20 | 50 | 50 | | --- | --- | --- | --- | --- | | Zásobní roztok makroživin (jednotlivá látka) | | | | | | CaCl2·2H2O | 293 800 | 1 000 | 1,0 | 1,0 | | MgSO4·7H2O | 246 600 | 2 000 | 0,5 | 0,5 | | KCl | 58 000 | 10 000 | 0,1 | 0,1 | | NaHCO3 | 64 800 | 1 000 | 1,0 | 1,0 | | Na2SiO3·9H2O | 50 000 | 5 000 | 0,2 | 0,2 | | NaNO3 | 2 740 | 10 000 | 0,1 | 0,1 | | KH2PO4 | 1 430 | 10 000 | 0,1 | 0,1 | | K2HPO4 | 1 840 | 10 000 | 0,1 | 0,1 | | Kombinovaný vitaminový zásobní roztok | — | 10 000 | 0,1 | 0,1 | | Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se připraví přidáním 3 vitaminů do 1 litru vody takto: | | | | | | Thiamin-hydrochlorid | 750 | 10 000 | — | — | | Kyanokobalamin (B12) | 10 | 10 000 | — | — | | Biotin | 7,5 | 10 000 | — | — |

Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se uchovává v malých hluboce zmrazených podílech. Vitaminy se přidají do média krátce před použitím.

Poznámky: Aby nedošlo při přípravě kompletního média k vysrážení solí, přidají se podíly zásobních roztoků do asi 500 – 800 ml deionisované vody a objem se poté doplní na 1 litr.

Poprvé byly informace o médiu M4 uvedeny v práci Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25-33.

DODATEK 2

ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) A VYTVOŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC V KRMIVU NA BÁZI ŘAS

Je pochopitelné, že obsah uhlíku v krmivu na bázi řas se nebude normálně měřit přímo, ale stanoví se z korelací (tj. z nomogramů) se zástupnými ukazateli, jako jsou počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle.

TOC by měl být stanoven spíše vysokoteplotní oxidací než pomocí UV nebo persíranovou metodou. (Viz: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).

Pro účely vytvoření nomogramu se řasy oddělí od růstového média centrifugací a poté se resuspendují v destilované vodě. Zástupný ukazatel a koncentrace TOC se měří v každém vzorku trojmo.

Provede se analýza slepého pokusu s destilovanou vodou a jeho koncentrace TOC se odečte od koncentrace TOC ve vzorku s řasami.

Nomogram by měl být lineární v požadovaném rozsahu koncentrací uhlíku. Příklady jsou uvedeny níže.

Upozornění: Tyto příklady nelze pro účely přepočtu použít; je důležité, aby si laboratoře připravily vlastní nomogramy.

[image omitted]

DODATEK 3

PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH DAT, KRMENÍ, REPRODUKČNÍ SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSPĚLCŮ

[image omitted]

DODATEK 4

PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDKŮ CHEMICKÉ ANALÝZY

a) Naměřené koncentrace

| Nominální koncentrace | Vzorek z týdne 1 | Vzorek z týdne 2 | Vzorek z týdne 3 | | | | | Čerstvé médium | Staré médium | Čerstvé médium | Staré médium | Čerstvé médium | Staré médium | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | | | | | | | |

b) Naměřené koncentrace vyjádřené v procentech nominální koncentrace

DODATEK 5

VÝPOČET ČASOVĚ VÁŽENÉ STŘEDNÍ HODNOTY

Časově vážená střední hodnota

Vzhledem k tomu, že mezi výměnami média může koncentrace zkoušené látky klesat, je nezbytné zvážit, jaká koncentrace bude považována za reprezentativní pro rozsah koncentrací, jimž byly dospělé dafnie vystaveny. Výběr by měl být založen na biologických i statistických úvahách. Vychází-li se například z toho, že reprodukce je ovlivňována hlavně maximální koncentrací, jíž byl organismus vystaven, měla by být tedy použita maximální koncentrace. Považuje-li se však za významnější akumulované nebo dlouhodobé působení toxické látky, má větší opodstatnění průměrná koncentrace. V takovém případě je vhodným průměrem časově vážená střední koncentrace, neboť zohledňuje časové změny okamžité koncentrace.

[image omitted]

Obrázek 1: Příklad časově vážené střední hodnoty

Na obrázku 1 je znázorněn příklad (zjednodušené) zkoušky trvající sedm dní s obnovou média v den 0, 2 a 4.

— Tenká klikatá čára znázorňuje koncentraci v kterémkoli okamžiku. Má se za to, že pokles koncentrace sleduje proces exponenciálního rozkladu buněk.

— Šest vyznačených bodů představuje koncentrace naměřené na začátku a na konci období mezi obnoveními média.

— Silná plná čára vyznačuje hodnotu časově vážené střední hodnoty.

Časově vážená střední hodnota je vypočtena tak, aby se plocha pod čarou pro časově váženou střední hodnotu rovnala ploše pod čarou průběhu koncentrace. Výpočet pro výše uvedený příklad je ilustrován v tabulce 1.

Tabulka 1: Výpočet časově vážené střední hodnoty

Obnovení média č.	Dny	Konc0	Konc1	ln(Konc0)	ln(Konc1)	Plocha
1	2	10 000	4,493	2,303	1,503	13,767
2	2	11 000	6,037	2,398	1,798	16,544
3	3	10 000	4,066	2,303	1,403	19,781
Celkový počet dnů: 7	Celková plocha	50,091
ČV střední hodnota	7,156

„Dny“ se rozumí počet dnů mezi obnoveními média.

„Konc0“ je naměřená koncentrace na začátku období mezi obnoveními média.

„Konc1“ je naměřená koncentrace na konci období mezi obnoveními média.

„ln (Konc0)“ je přirozený logaritmus Konc0.

„ln (Konc1)“ je přirozený logaritmus Konc1.

„Plocha“ je plocha pod exponenciální křivkou pro každé období mezi obnoveními média.

Vypočte se z rovnice:

Plocha=Konc0-Konc1ln⁡Konc0-ln⁡Konc1×Dny

Časově vážená střední hodnota („ČV střední hodnota“) se vypočte jako podíl „celkové plochy“ a „celkového počtu dnů“.

Pro zkoušku toxicity pro reprodukci na dafniích se tabulka pochopitelně rozšíří tak, aby pokrývala 21 dnů.

Je zřejmé, že provádí-li se měření pouze na začátku a na konci období mezi obnoveními média, není možné potvrdit, že proces rozkladu je skutečně exponenciální. Jiná křivka by vedla k jinému způsobu výpočtu „Plochy“. Exponenciální rozklad však není nepřijatelný a jemu odpovídající křivka je pravděpodobně nejideálnější, chybí-li jiné informace.

Je však nezbytné postupovat opatrně, není-li v médiu na konci období mezi jeho obnoveními zjištěno žádné množství zkušební látky. Není-li možné odhadnout, jak rychle látka z roztoku zmizela, není možné získat realistickou plochu pod křivkou a není tedy možné získat rozumnou časově váženou střední hodnotu.

XXI. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI DUSÍKU

(metoda C.21 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)

XXI.1. METODA

Tato zkušební metoda odpovídá metodě OECD TG 216 (2000).

XXI.1.1 ÚVOD

Tato zkušební metoda popisuje laboratorní postup pro vyšetřování dlouhodobých účinků chemických látek po jednorázové expozici na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci dusíku. Je založena na podkladech a doporučeních národních i mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 7). Při posuzování a hodnocení toxických vlastností zkoušených látek může být nezbytné stanovit účinky na aktivitu půdních mikroorganismů, např. jsou-li požadovány údaje o vedlejších účincích přípravků na ochranu rostlin na půdní mikroflóru nebo očekává-li se expozice půdních mikroorganismů chemickým látkám jiným než přípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkoušky na transformaci dusíku je zjistit účinky takových chemických látek na půdní mikroflóru. Pokud se zkoušejí agrochemikálie (např. přípravky na ochranu rostlin, hnojiva, chemické přípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouška na transformaci dusíku, tak zkouška na transformaci uhlíku. Pokud se zkoušejí jiné chemické látky než agrochemikálie, postačuje zkouška na transformaci dusíku. Nacházejí-li se však u těchto chemických látek hodnoty EC50 pro transformaci dusíku v rozpětí hodnot nacházených pro komerčně dostupné inhibitory nitrifikace (např. nitrapyrin), lze pro získání dalších informací provést zkoušku na transformaci uhlíku.

Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve formě složitých a heterogenních směsí. Mikroorganismy hrají důležitou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných půdách, přičemž různé druhy přispívají k různým aspektům úrodnosti půdy. Jakékoli dlouhodobé porušení těchto biochemických procesů by mohlo porušit koloběh živin a to by mohlo mít vliv na úrodnost půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u všech úrodných půd. Ačkoliv se populace mikroorganismů odpovědných za tyto procesy u jednotlivých půd liší, jedná se v podstatě o totéž schéma transformace.

Popsaná zkušební metoda slouží ke zjištění dlouhodobých nepříznivých účinků látky na proces transformace dusíku v aerobních povrchových půdách. Tato metoda rovněž umožňuje odhadnout účinky látek na transformaci uhlíku půdní mikroflórou. K tvorbě dusičnanů dochází po rozpadu vazeb uhlík-dusík. Pokud je tedy u zkušebních a kontrolních půd zjištěna stejná rychlost tvorby dusičnanů, je vysoce pravděpodobné, že hlavní schéma odbourávání uhlíku je neporušené a funkční. Substrát zvolený pro zkoušku (prášková vojtěšková moučka) má příznivý poměr uhlíku a dusíku (obvykle od 12/1 do 16/1). Je tedy snížen nedostatek uhlíku v průběhu zkoušky, a dojde-li k poškození populace mikroorganismů chemickou látkou, může k jejich obnově dojít opět do 100 dnů.

Zkouška, na níž je založena tato zkušební metoda, byla zprvu vyvinuta pro látky, u nichž lze předvídat množství, které pronikne do půdy. Příkladem jsou přípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní aplikační dávka známá. U agrochemikálií postačuje provést zkoušku se dvěma úrovněmi dávky, které odpovídají předpokládané nebo odhadované aplikační dávce. U agrochemikálií lze zkoušet účinné složky nebo přípravky v komerční úpravě. Použití zkoušky však není omezeno pouze na agrochemikálie. Změnou množství zkoušené látky aplikované na půdu a způsobu vyhodnocení dat lze zkoušku využít také pro chemické látky, u nichž není známo, v jakém množství proniknou do půdy. U jiných chemických látek než agrochemikálií se tedy stanovuje účinek řady koncentrací na transformaci dusíku. Data z těchto zkoušek se použijí k sestrojení křivky závislosti odezvy na dávce a k výpočtu hodnot ECx, kde x je procentuální účinek.

XXI.1.2 DEFINICE

Transformace dusíku: je konečný rozklad dusíkaté organické látky mikroorganismy cestou amonifikace a nitrifikace na příslušný konečný anorganický produkt – dusičnan.

ECx (Účinná koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k x-procentní inhibici transformace dusíku na dusičnan.

EC50 (Medián účinné koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k 50% inhibici transformace dusíku na dusičnan.

XXI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Žádné.

XXI.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Do proseté půdy se vpraví prášková rostlinná moučka a na půdu se poté aplikuje zkoušená látka, nebo se půda ponechá nedotčená (jako kontrola). Při zkoušení agrochemikálií se doporučuje provést zkoušku s nejméně dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly v určitém vztahu k nejvyšší předpokládané koncentrací na poli. Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy vyluhují vhodným rozpouštědlem a stanoví se obsah dusičnanů. Rychlost tvorby dusičnanů v exponovaných vzorcích se porovnává s rychlostí v kontrolních vzorcích a vypočte se procentuální odchylka hodnot experimentálních vzorků od kontrolních vzorků. Všechny zkoušky musí probíhat alespoň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi experimentální a kontrolní půdou 25 % nebo větší, v měření se pokračuje až do 100 dnů. Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se do vzorků půdy přidá řada koncentrací zkoušené látky a množství vzniklých dusičnanů v experimentálních a kontrolních vzorcích se měří po 28denní inkubaci. Výsledky zkoušek s více koncentracemi se analyzují za použití regresního modelu a vypočtou se hodnoty ECx (tj. EC50, EC25 a/nebo EC10). Viz definice.

XXI.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY

Vyhodnocení výsledků zkoušek u agrochemikálií se provádí s relativně malými rozdíly (tj. průměrná hodnota ±25 %) mezi koncentracemi dusičnanů v kontrolní a exponovaných vzorcích, takže velké kolísání u kontrolních vzorků může vést k nesprávným výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto měly být menší než ±15 %.

XXI.1.6 POPIS METODY

XXI.1.6.1 Zkušební zařízení

Nádoby použité ve zkoušce musí být z chemicky inertního materiálu. Měly by mít vhodný objem, která by měl odpovídat postupu použitému pro inkubaci půdy, tzn. buď inkubace celého množství půdy, nebo inkubace jednotlivých vzorků půdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je třeba, aby během zkoušky došlo k co nejmenším ztrátám vody a aby byla umožněna výměna plynů (např. tím, že se nádoby zakryjí perforovanou polyethylenovou fólií). Při zkoušení těkavých látek se použijí uzavřené plynotěsné nádoby. Měly by být tak velké, aby přibližně jedna čtvrtina jejich objemu byla zaplněna vzorkem půdy.

Použije se standardní laboratorní vybavení, které zahrnuje

— třepačku: mechanickou třepačku nebo rovnocenné vybavení;

— odstředivku (3 000 g) nebo filtrační zařízení (za použití filtračního papíru bez dusičnanů);

— měřicí zařízení pro stanovení dusičnanů s vhodnou citlivostí a reprodukovatelností.

XXI.1.6.2 Výběr a počet půd

Použije se jedna půda. Půda by měla mít tyto charakteristiky:

— obsah písku: nejméně 50 % a nejvýše 75 %;

— pH: 5,5 – 7,5;

— obsah organického uhlíku: 0,5 – 1,5 %;

— stanoví se mikrobiální biomasa (viz literatura 8, 9) a její uhlík by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě.

Ve většině případů představuje půda s těmito charakteristikami nejkonzervativnější případ, neboť adsorpce zkoušené chemické látky je minimální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkoušení s dalšími půdami zbytečné. Za určitých okolností však může být použití další půdy nezbytné, např. při zamýšleném hlavním použití zkoušené látky na určité druhy půd, jako jsou kyselé lesní půdy nebo v případě elektrostaticky nabitých chemikálií.

XXI.1.6.3 Odběr a skladování vzorků půd

XXI.1.6.3.1 Odběr

K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Mezi těmito informacemi musí být přesná poloha, vegetace, údaje o ošetřování přípravky na ochranu rostlin, použití organických a minerálních hnojiv, přídavky biologického materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odběr půdy by mělo být zvoleno místo, které umožňuje dlouhodobé používání. Vhodnými místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými kulturními plodinami (kromě kukuřice) nebo hustě oseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná pro odběr vzorků by neměla být minimálně jeden rok před odběrem ošetřována přípravky na ochranu rostlin. Rovněž by neměla být alespoň šest měsíců použita organická hnojiva. Použití minerálních hnojiv je přípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, a vzorky půdy by neměly být odebírány dříve než po třech měsících po aplikaci. Neměly by být používány půdy s hnojivy, o nichž je známo, že mají biocidní účinky (např. kyanamid vápenatý).

Vzorky by neměly být odebírány při dlouhých obdobích sucha nebo zavodnění (delších než 30 dnů) nebo po nich. Vzorky orných půd se odebírají z hloubky 0 až 20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných půd, u nichž po delší dobu (alespoň po jedno vegetační období) nebyla prováděna orba, může maximální hloubka odběru nepatrně překračovat 20 cm (např. až 25 cm).

Vzorky půd by měly být přepravovány v takových nádobách a za takové teploty, aby bylo zaručeno, že se původní vlastnosti půdy významně nezmění.

XXI.1.6.3.2 Skladování

Upřednostňuje se použití čerstvě odebrané půdy. Pokud je skladování půdy v laboratoři nevyhnutelné, může být skladována v temnu při (4 ± 2) °C maximálně po dobu tří měsíců. Během skladování půd musí být zajištěny aerobní podmínky. Pokud jsou půdy odebírány z oblastí, v nichž jsou po dobu alespoň tří měsíců v roce zmrzlé, lze zvážit šestiměsíční skladování při -18 °C až -22 °C. Před každým experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných půd a uhlík pocházející z biomasy by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě (viz oddíl 1.6.2).

XXI.1.6.4 Zacházení s půdou a její příprava pro zkoušku

XXI.1.6.4.1 Předběžná inkubace

Pokud byla půda skladována (viz oddíl 1.6.3.2), doporučuje se provést předběžnou inkubaci v délce 2 až 28 dnů. Teplota a vlhkost půdy během předběžné inkubace by měly být podobné podmínkám při zkoušce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3).

XXI.1.6.4.2 Fyzikálně-chemické charakteristiky

Z půdy se ručně odstraní velké kusy (např. kameny, části rostlin atd.) a poté se za vlhka, aniž je půda nadměrně vysoušena, prosejí částice o velikosti 2 mm a menší. Vlhkost vzorku půdy se upraví destilovanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až 60 % maximální vodní kapacity.

XXI.1.6.4.3 Obohacení organickým substrátem

Půda by měla být obohacena vhodným organickým substrátem, např. zelenou travní moučkou s vojtěškou (hlavní složka: Medicago sativa) s poměrem C/N od 12/1 do 16/1. Doporučená dávka vojtěškové moučky je 5 g vojtěšky na kilogram půdy (vztaženo na sušinu).

XXI.1.6.5 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu

Zkoušená látka se obvykle aplikuje pomocí nosiče. Nosičem může být voda (u látek rozpustných ve vodě) nebo inertní tuhá látka, např. jemný křemičitý písek (velikost zrna: 0,1 – 0,5 mm). Jiné kapalné nosiče než voda (např. organická rozpouštědla jako aceton, chloroform) by neměly být používány, neboť mohou zničit mikroflóru. Použije-li se jako nosič písek, může být obalen zkoušenou látkou rozpuštěnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpouštědle. V takovém případě se rozpouštědlo před smísením s půdou odstraní odpařením. Pro optimální distribuci zkoušené látky v půdě se doporučuje použít 10 g písku na kilogram půdy (vztaženo na sušinu). Do kontrolních vzorků se aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku.

Při zkoušení těkavých chemických látek je třeba pokud možno zabránit ztrátám při aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v půdě (látka se např. nastříkne do půdy na více místech).

XXI.1.6.6 Zkušební koncentrace

Při zkoušení agrochemikálií se použijí alespoň dvě koncentrace. Nižší koncentrace by měla odpovídat přinejmenším maximálnímu očekávanému množství látky, které se v reálných podmínkách dostane do půdy, zatímco vyšší koncentrace by měla být násobkem nižší koncentrace. Výpočet koncentrace zkoušené látky přidávané do půdy se provede za předpokladu rovnoměrného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu půdy 1,5. U agrochemikálií, které se aplikují přímo do půdy, nebo u chemikálií, u nichž lze množství, které se dostane do půdy, předpovědět, jsou doporučenými zkušebními koncentracemi maximální předpokládané koncentrace v životním prostředí (Predicted Environmental Concentration, PEC) a jejich pětinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do půdy několikrát za sezónu, se zkušební koncentrace odvodí ze součinu PEC a očekávaného maximálního počtu aplikací. Horní koncentrace by však neměla překročit desetinásobek maximální jednorázově aplikované dávky. U jiných látek než agrochemikálií se použije geometrická řada nejméně pěti koncentrací. V rozpětí těchto zkušebních koncentrací by se měly nacházet stanovované hodnoty ECx.

XXI.1.7 PROVEDENÍ ZKOUŠKY

XXI.1.7.1 Podmínky expozice

XXI.1.7.1.1 Expozice a kontrola

Při zkoušení agrochemikálií se půda rozdělí na tři díly o stejné hmotnosti. Dva díly se smísí s nosičem obsahujícím látku a třetí díl se smísí pouze s nosičem (kontrola). Doporučuje se, aby byla zkouška provedena s minimálně třemi duplikátními vzorky exponovaných i neexponovaných půd. Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se půda rozdělí na šest dílů o stejné hmotnosti. Pět vzorků se smísí s nosičem obsahujícím zkoušenou látku a šestý vzorek se smísí pouze s nosičem bez chemické látky. Doporučuje se použít tři duplikátní vzorky exponované i neexponované půdy. Je třeba věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkoušené látky v exponovaných vzorcích půdy. Při míšení by nemělo docházet k hutnění nebo shlukování půdy.

XXI.1.7.1.2 Inkubace vzorků půd

Inkubaci vzorků půd lze provést dvěma způsoby: se souhrnným vzorkem exponované půdy a souhrnným vzorkem neexponované půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejně velkých dílčích vzorků jak exponované, tak neexponované půdy. U těkavých látek se však zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. Pokud se inkubují souhrnné vzorky, připraví se velká množství exponované a neexponované půdy a během zkoušky se podle potřeby odebírají dílčí vzorky k analýze. Výchozí množství připravené pro exponované vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti dílčích vzorků, počtu duplikátních vzorků použitých pro analýzu a na předpokládaném počtu intervalů, v nichž se odeberou vzorky. Půdy inkubované jako souhrnný vzorek se před odběrem dílčích vzorků důkladně promísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzorků půd, rozdělí se souhrnný vzorek exponované půdy a souhrnný vzorek neexponované půdy na požadovaný počet dílčích vzorků a ty se použijí podle potřeby. U experimentů, kdy lze předpokládat více než dva intervaly odběru, by měl být připraven dostatečný počet dílčích vzorků s ohledem na všechny duplikátní vzorky a všechny intervaly odběru. Alespoň tři duplikátní vzorky zkušební půdy měly být inkubovány za aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U všech zkoušek by měly být použity vhodné nádoby s dostatečným prostorem pod víkem, aby nenastaly anaerobní podmínky. U těkavých látek se zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků.

XXI.1.7.1.3 Podmínky zkoušky a její trvání

Zkouška se provádí v temnu při pokojové teplotě (20 ± 2) °C. Vlhkost vzorku půdy se udržuje po dobu zkoušky v rozmezí 40 % až 60 % (±5 %) maximální vodní kapacity půdy (viz oddíl 1.6.4.2). Podle potřeby se přidává destilovaná nebo deionizovaná voda.

Zkoušky trvají nejméně 28 dnů. Při zkouškách agrochemikálií se porovnávají rychlosti tvorby dusičnanů v exponovaných a kontrolních vzorcích. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liší o více než 25 %, pokračuje se ve zkoušce do doby, než rozdíl klesne na 25 % a méně, nebo do 100 dnů, podle toho, co nastane dříve. U jiných látek než agrochemikálií se zkouška ukončí po 28 dnech. 28. den se stanoví množství dusičnanů v exponovaných a kontrolních vzorcích a vypočítají se hodnoty ECx.

XXI.1.7.2 Odběry vzorků a analýzy půd

XXI.1.7.2.1 Intervaly odběru vzorků

Při zkoušení agrochemikálií se obsah dusičnanů ve vzorcích analyzuje v 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouška prodlužuje, provede se další měření ve 14-denních intervalech po 28. dni.

Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se použije alespoň pět zkušebních koncentrací a obsah dusičnanů se ve vzorcích půd analyzuje na začátku expoziční doby (den 0) a na jeho konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nezbytné, lze provést další mezilehlé měření, např. v 7. den. Data získaná 28. den se použijí pro stanovení ECx chemické látky. Podle potřeby lze data ze dne 0 u kontrolních vzorků použít ve zprávě jako výchozí koncentraci dusičnanů v půdě.

XXI.1.7.2.2 Analýza vzorků půd

Pro každý čas odběru vzorků se v exponovaných i kontrolních vzorcích stanoví obsah dusičnanů. Dusičnany se extrahují ze vzorků třepáním s vhodným extrakčním roztokem, např. s 0,1 M roztokem chloridu draselného. Doporučuje se použít 5 ml roztoku KCl na gram sušiny půdy. Při optimální extrakci by měly být nádoby s půdou a extrakčním roztokem naplněny nejvýše z jedné poloviny. Směsi se extrahují třepáním při 150 ot./min. po dobu 60 minut. Směsi se odstředí nebo zfiltrují a kapalná fáze se analyzuje na dusičnany. Kapalný extrakt zbavený pevných částic lze před analýzou skladovat při (-20 ±5) °C po dobu šesti měsíců.

XXI.2. DATA

XXI.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Při zkoušení agrochemikálií se zaznamená množství vytvořených dusičnanů v každém duplikátním vzorku a průměrné hodnoty se zaznamenají do tabulky. Rychlost přeměny dusíku se vyhodnotí vhodnými všeobecně uznávanými statistickými metodami (např. F-testem na 5 % hladině významnosti). Množství vzniklých dusičnanů se vyjádří v mg dusičnanů na kg sušiny půdy za den. Rychlost tvorby dusičnanů se pro každou expozici porovná s rychlostí získanou pro kontrolní vzorky a vypočte se odchylka od kontrolních vzorků v procentech.

Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se stanoví množství dusičnanů v každém duplikátním vzorku a pro účely odhadu hodnot ECx se sestrojí křivka závislosti odezvy na dávce. Množství dusičnanů (tj. množství dusičnanů v mg na kg sušiny půdy) zjištěná v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjištěnými u kontrolních vzorků. Z těchto údajů se pro každou zkušební koncentraci vypočte velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty v procentech se vynesou do grafu proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypočítají hodnoty ECx. Standardními metodami (viz literatura 10 až 12) se rovněž vypočítají intervaly spolehlivosti (p = 0,95) pro vypočtené hodnoty ECx.

Zkoušené látky s vysokým obsahem dusičnanů mohou přispívat k množství dusičnanu vytvořeného při zkoušce. Pokud se zkouší vysoké koncentrace těchto látek (např. chemikálie, u nichž se očekává opakované použití), musí být součástí zkoušky vhodné kontrolní vzorky (tj. půda a zkoušená látka bez rostlinné moučky). Data z těchto kontrol musí být zohledněna při výpočtech ECx.

XXI.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pokud je při hodnocení výsledků zkoušek s agrochemikáliemi při jakémkoli odběru po 28 dnech rozdíl rychlosti tvorby dusičnanů při nižší expozici (tj. při maximální očekávané koncentraci) a rychlosti tvorby v kontrolách roven 25 % nebo nižší, lze konstatovat, že zkoušená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci dusíku v půdách. Pro hodnocení výsledků zkoušek jiných látek než agrochemikálií se použijí hodnoty EC50, EC25 a/nebo EC10.

XXI.3. ZPRÁVY

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

Úplnou identifikaci použité půdy zahrnující tyto údaje:

— zeměpisná poloha místa (zeměpisná šířka a délka);

— informace a historii místa (tj. vegetační kryt, ošetření přípravky na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.);

— způsob využití (např. zemědělská půda, les atd.);

— hloubka odběru vzorků (cm);

— obsah písku/prachu/jílu (v % sušiny);

— pH (ve vodě);

— obsah organického uhlíku (v % sušiny);

— obsah dusíku (v % sušiny);

— výchozí koncentrace dusičnanů (mg dusičnanů na kg sušiny);

— kapacita iontové výměny (mmol/kg);

— mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku;

— odkaz na metody použité pro stanovení každého z parametrů;

— všechny informace týkající se odběru a skladování vzorků půd;

— podrobné údaje o případné předběžné inkubaci půdy.

Zkoušená látka:

— fyzikální povaha a případně fyzikálně-chemické vlastnosti;

— případně údaje o chemické identitě, včetně strukturního vzorce, čistoty (tj. procentuální obsah účinné složky u přípravků na ochranu rostlin), obsahu dusíku.

Substrát:

— zdroj substrátu;

— složení (tj. vojtěšková moučka, zelená travní moučka s vojtěškou);

— obsah uhlíku, dusíku (v % sušiny);

— velikost síta (mm).

Zkušební podmínky:

— podrobné údaje o obohacení půdy organickým substrátem;

— počet použitých koncentrací zkoušené látky, popřípadě zdůvodnění volby koncentrací;

— podrobné údaje o aplikaci zkoušené látky na půdu;

— inkubační teplota;

— vlhkost půdy na začátku zkoušky a v jejím průběhu;

— použitá metoda inkubace půdy (tj. inkubace souhrnného vzorku, nebo inkubace jednotlivých dílčích vzorků půdy);

— počet duplikátních vzorků;

— doby odběru vzorků;

— metoda použitá pro extrakci dusičnanů z půdy.

Výsledky:

— postup analýzy a zařízení použité pro stanovení dusičnanů;

— jednotlivé naměřené hodnoty obsahu dusičnanů a jejich průměrné hodnoty v tabulkové formě;

— rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních vzorků půd;

— podle potřeby vysvětlení oprav provedených při výpočtech;

— procentuální odchylka v rychlosti tvorby dusičnanů pro každou dobu odběru vzorků, popřípadě hodnota EC50 s 95% intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty ECx (tj. EC25 nebo EC10) s intervaly spolehlivost a graf křivky závislosti odpovědi na dávce;

— statistické zpracování výsledků;

— všechny informace a pozorování užitečné pro interpretaci výsledků.

XXI.4. LITERATURA

(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 – 16, 1994.

(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1 – 1 (2. vyd., 1990).

(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. 28. září, 1987.

(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, (vyd. M. R. Lynch), Pub. SETAC-Europe, Brussels.

(5) ISO 14238 (1997). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4.

(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. ledna 1995.

(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.

(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.

(10) Litchfield, J. T., Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. Exper. Ther., 96, 99 – 113.

(11) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3. vyd., Cambridge, London, New York.

(12) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

XXII. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI UHLÍKU

(metoda C.22 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)

XXII.1. METODA

Tato metoda odpovídá metodě OECD TG 217 (2000).

XXII.1.1 ÚVOD

Tato zkušební metoda popisuje laboratorní postup pro vyšetřování možných dlouhodobých účinků jednorázové expozice přípravkům na ochranu rostlin a popřípadě jiným chemický látkám na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci uhlíku. Je založena na pokladech a doporučeních národních i mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 6). Při posuzování a hodnocení toxických vlastností zkoušených látek může být nezbytné stanovit účinky na aktivitu půdních mikroorganismů, např. jsou-li požadovány údaje o vedlejších účincích přípravků na ochranu rostlin na půdní mikroflóru nebo očekává-li se expozice půdních mikroorganismů chemickým látkám jiným než přípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkoušky na transformaci uhlíku je zjistit účinky takových chemických látek na půdní mikroflóru. Pokud se zkoušejí agrochemikálie (např. přípravky na ochranu rostlin, hnojiva, chemické přípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouška na transformaci uhlíku, tak zkouška na transformaci dusíku. Pokud se zkoušejí jiné chemické látky než agrochemikálie, postačuje zkouška na transformaci dusíku. Nacházejí-li se však u těchto chemických látek hodnoty EC50 pro transformaci dusíku v rozpětí hodnot nacházených pro komerčně dostupné inhibitory nitrifikace (např. nitrapyrin), lze pro získání dalších informací provést zkoušku na transformaci uhlíku.

Popsaná zkušební metoda slouží ke zjištění dlouhodobých nepříznivých účinků látky na proces transformace uhlíku v aerobních povrchových půdách. Zkouška je citlivá na změny ve velikosti a aktivitě mikrobiální populace, která je odpovědná za transformaci uhlíku, neboť tyto populace budou vystaveny jak chemickému stresu, tak nedostatku uhlíku. Použijí se písčité půdy s nízkým obsahem organického materiálu. Tyto půdy se exponují zkoušené látce a inkubují se za podmínek, které umožňují rychlý mikrobiální metabolismus. Za těchto podmínek se zdroje snadno dostupného uhlíku rychle vyčerpají. To způsobí nedostatek uhlíku, který vede k nejen k odumření mikrobiálních buněk, ale také indukuje klidové stadium a/nebo tvorbu sporů. Pokud se zkouška provádí déle než 28 dnů, lze souhrn těchto reakcí měřit v kontrolních vzorcích (neexponovaná půda) jako postupnou ztrátu metabolicky aktivní mikrobiální biomasy (viz literatura 7). Pokud je biomasa v půdě s nedostatkem uhlíku za podmínek zkoušky ovlivněna přítomností chemické látky, pravděpodobně se nevrátí do téhož stavu jako kontrolní vzorek. Porušení stavu způsobené zkoušenou látkou kdykoliv během zkoušky tedy často přetrvává až do konce zkoušky.

Zkouška, na níž je založena tato zkušební metoda, byla zprvu vyvinuta pro látky, u nichž lze předvídat množství, které pronikne do půdy. Příkladem jsou přípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní aplikační dávka známá. U agrochemikálií postačuje provést zkoušku se dvěma úrovněmi dávky, které odpovídají předpokládané nebo odhadované aplikační dávce. U agrochemikálií lze zkoušet účinné složky nebo přípravky v komerční úpravě. Zkouška však není omezena na chemické látky, jejichž koncentraci v životním prostředí lze předpovědět. Změnou množství zkoušené látky aplikované na půdu a způsobu vyhodnocení dat lze zkoušku využít také pro chemické látky, u nichž není známo, v jakém množství proniknou do půdy. U jiných chemických látek než agrochemikálií se proto stanovuje účinek řady koncentrací na transformaci uhlíku. Data z těchto zkoušek se použijí k sestrojení křivky závislosti odezvy na dávce a k výpočtu hodnot ECx, kde x je procentuální účinek.

XXII.1.2 DEFINICE

Transformace uhlíku: je rozklad organického materiálu působením mikroorganismů, jehož výsledkem je anorganický konečný produkt oxid uhličitý.

ECx (Účinná koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k x-procentní inhibici transformace uhlíku na oxid uhličitý.

EC50 (Medián účinné koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k 50% inhibici transformace uhlíku na oxid uhličitý.

XXII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Žádné.

XXII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Prosetá půda se buď exponuje zkušební látce, nebo se ponechá neexponovaná (kontrola). Při zkoušení agrochemikálií se doporučuje provést zkoušku s nejméně dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly v určitém vztahu k nejvyšší předpokládané koncentraci na poli. Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy smísí s glukosou a po následujících 12 h se měří respirační rychlost vyvolaná glukosou. Respirační rychlost se vyjádří jako uvolněný oxid uhličitý (v mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu) nebo jako spotřebovaný kyslík (v mg kyslíku na kg půdy za hodinu). Průměrná respirační rychlost u exponovaných vzorků půd se porovná s rychlostí u kontrolních vzorků a vypočte se procentuální odchylka exponovaných vzorků od kontrolních vzorků. Všechny zkoušky musí probíhat alespoň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi experimentální a kontrolní půdou rovné 25 % nebo větší, v měření se pokračuje ve 14-denních intervalech nejdéle do 100 dnů. Při zkoušení jiných chemických látek než agrochemikálií se do vzorků půdy přidá řada koncentrací zkoušené látky a respirační rychlost vyvolaná glukosou (tj. průměrné množství uvolněného oxidu uhličitého nebo spotřebovaného kyslíku) se změří po 28 dnech. Výsledky zkoušek s řadou koncentrací se analyzují za použití regresního modelu a vypočtou se hodnoty ECx (tj. EC50, EC25 a/nebo EC10). Viz definice.

XXII.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY

Vyhodnocení výsledků zkoušek u agrochemikálií se provádí s relativně malými rozdíly (tj. průměrná hodnota ±25 %) mezi uvolněným oxidem uhličitým nebo spotřebovaným kyslíkem u kontrolních a exponovaných vzorků, takže velké kolísání u kontrolních vzorků může vést k nesprávným výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto měly být menší než ±15 %.

XXII.1.6 POPIS METODY

XXII.1.6.1 Zkušební zařízení

Nádoby použité ve zkoušce musí být z chemicky inertního materiálu. Měly by mít vhodný objem, který by měl odpovídat postupu použitému pro inkubaci půdy, tzn. buď inkubace souhrnného vzorku půdy, nebo inkubace jednotlivých vzorků půdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je třeba, aby během zkoušky došlo k co nejmenším ztrátám vody a aby byla umožněna výměna plynů (např. tím, že se nádoby zakryjí perforovanou polyethylenovou fólií). Při zkoušení těkavých látek se použijí uzavřené plynotěsné nádoby. Měly by být tak velké, aby přibližně jedna čtvrtina jejich objemu byla zaplněna vzorkem půdy.

Pro stanovení respirace vyvolané glukosou jsou nezbytné inkubační systémy a přístroje pro měření uvolňovaného oxidu uhličitého nebo spotřeby kyslíku. Příklady takových systémů lze nalézt v literatuře 8 až 11.

XXII.1.6.2 Výběr a počet půd

Použije se jedna půda. Půda by měla mít tyto charakteristiky:

— obsah písku: nejméně 50 % a nejvýše 75 %;

— pH: 5,5 – 7,5;

— obsah organického uhlíku: 0,5 – 1,5 %;

— stanoví se mikrobiální biomasa (viz literatura 12 a 13) a její obsah uhlíku by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě.

Ve většině případů představuje půda s těmito charakteristikami nejkonzervativnější případ, neboť adsorpce zkoušené chemické látky je minimální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkoušení s dalšími půdami zbytečné. Za určitých okolností může být nezbytné nasazení další půdy, např. při zamýšleném hlavním použití zkoušené látky na určité druhy půd, jako jsou kyselé lesní půdy nebo v případě elektrostaticky nabitých chemikálií.

XXII.1.6.3 Odběr a skladování vzorků půd

XXII.1.6.3.1 Odběr

XXII.1.6.3.2 Skladování

Upřednostňuje se použití čerstvě odebrané půdy. Pokud je skladování půdy v laboratoři nevyhnutelné, může být skladována v temnu při (4 ± 2) °C po dobu maximálně tří měsíců. Během skladování půd musí být zajištěny aerobní podmínky. Pokud jsou půdy odebírány z oblastí, v nichž jsou po dobu alespoň tří měsíců v roce zmrzlé, lze zvážit šestiměsíční skladování při -18 °C. Před každým experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných půd a uhlík pocházející z biomasy by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě (viz oddíl 1.6.2).

XXII.1.6.4 Zacházení s půdou a její příprava pro zkoušku

XXII.1.6.4.1 Předběžná inkubace

Pokud byla půda skladována (viz oddíl 1.6.3.2 a 1.7.1.3), doporučuje se provést předběžnou inkubaci v délce 2 až 28 dnů. Teplota a vlhkost půdy během předběžné inkubace by měly být podobné podmínkám při zkoušce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3).

XXII.1.6.4.2 Fyzikálně-chemické charakteristiky

XXII.1.6.5 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu

Při zkoušení těkavých chemických látek je třeba zabránit ztrátám při aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v půdě (látka se např. nastříkne do půdy na více místech).

XXII.1.6.6 Zkušební koncentrace

Při zkoušení přípravků na ochranu rostlin nebo jiných chemických látek, u nichž lze předpovědět koncentraci v životním prostředí, se použijí alespoň dvě koncentrace. Nižší koncentrace by měla odpovídat přinejmenším maximálnímu očekávanému množství látky, které v reálných podmínkách pronikne do půdy, zatímco vyšší koncentrace by měla být násobkem nižší koncentrace. Výpočet koncentrace zkoušené látky přidávané do půdy se provede za předpokladu rovnoměrného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu půdy 1,5. U agrochemikálií, které se aplikují přímo do půdy, nebo u chemikálií, u nichž lze množství, které se dostane do půdy, předpovědět, jsou doporučenými zkušebními koncentracemi předpokládané koncentrace v životním prostředí (Predicted Environmental Concentration, PEC) a jejich pětinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do půdy několikrát za sezónu, se zkušební koncentrace odvodí ze součinu PEC a očekávaného maximálního počtu aplikací. Horní koncentrace by však neměla překročit desetinásobek maximální jednorázově aplikované dávky.

U jiných látek než agrochemikálií se použije geometrická řada nejméně pěti koncentrací. V rozpětí těchto zkušebních koncentrací by se měly nacházet stanovované hodnoty ECx.

XXII.1.7 PROVEDENÍ ZKOUŠKY

XXII.1.7.1 Podmínky expozice

XXII.1.7.1.1 Expozice a kontrola

XXII.1.7.1.2 Inkubace vzorků půd

XXII.1.7.1.3 Podmínky zkoušky a její trvání

Zkoušky trvají nejméně 28 dnů. Při zkouškách agrochemikálií se porovnávají množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u exponovaných a kontrolních vzorků. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liší o více než 25 %, pokračuje se ve zkoušce do doby, než rozdíl klesne na 25 % a méně, nebo do 100 dnů, podle toho, co nastane dříve. U jiných chemických látek než agrochemikálií se zkouška ukončí po 28 dnech. 28. den se stanoví množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u exponovaných a kontrolních vzorků a vypočítají se hodnoty ECx.

XXII.1.7.2 Odběry vzorků a analýzy půd

XXII.1.7.2.1 Intervaly odběru vzorků

Při zkoušení agrochemikálií se rychlost respirace vyvolané glukosou ve vzorcích analyzuje 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouška prodlužuje, provede se další měření ve 14denních intervalech po 28. dni.

Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se použije alespoň pět zkušebních koncentrací a obsah respirace vyvolané glukosou se ve vzorcích půd analyzuje na začátku expoziční doby (den 0) a na jeho konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nezbytné, lze provést další mezilehlé měření, např. 7. den. Data získaná 28. den se použijí pro stanovení ECx chemické látky. V případě potřeby lze data ze dne 0 u kontrolních vzorků použít k odhadu výchozího množství metabolicky aktivní mikrobiální biomasy v půdě.

XXII.1.7.2.2 Měření rychlostí respirace vyvolané glukosou

Pro každý čas odběru vzorků se v exponovaných i kontrolních vzorcích stanoví rychlost respirace vyvolané glukosou. Vzorky půd se smísí s dostatečným množstvím glukosy, aby se ihned vyvolala maximální respirační odezva. Množství glukosy potřebné pro vyvolání maximální respirační odezvy u dané půdy lze stanovit v orientační zkoušce se sérií koncentrací glukosy (viz literatura 14). U písčitých půd s obsahem organického uhlíku od 0,5 do 1,5 % obvykle stačí 2 000 mg až 4 000 mg glukosy na kg sušiny. Glukosu lze rozmělnit na prášek s čistým křemenným pískem (10 g písku na kg sušiny) a homogenně smísit s půdou.

Vzorky půdy obohacené glukosou se inkubují ve vhodné aparatuře, která umožňuje měřit respirační rychlosti při (20 ± 2) °C buď kontinuálně, nebo každou hodinu, nebo každé dvě hodiny (viz oddíl 1.6.1). Měření uvolněného oxidu uhličitého nebo spotřebovaného kyslíku se provádí nepřetržitě po dobu 12 h a měření se zahájí co nejdříve, tj. do 1 až 2 h po přidání glukosy. Změří se celkové množství uvolněného oxidu uhličitého nebo celkové množství spotřebovaného kyslíku za 12 h a stanoví se průměrná respirační rychlost.

XXII.2. DATA

XXII.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Při zkoušení agrochemikálií se zaznamená množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u každého duplikátního vzorku a průměrné hodnoty se zaznamenají do tabulky. Výsledky se vyhodnotí vhodnými všeobecně uznávanými statistickými metodami (např. F-testem při 5% hladině významnosti). Rychlosti respirace vyvolané glukosou se vyjádří v mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu nebo v mg kyslíku na kg sušiny za hodinu. Průměrná rychlost uvolňování oxidu uhličitého nebo průměrná rychlost spotřeby kyslíku u každé expozice se porovná s odpovídajícími hodnotami u kontrolních vzorků a vypočte se procentuální odchylka exponovaných vzorků od kontrolních vzorků.

Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se stanoví množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku v každém duplikátním vzorku a pro účely odhadu hodnot ECx se sestrojí křivka závislosti odezvy na dávce. Rychlosti respirace vyvolané glukosou (tj. mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu nebo mg kyslíku na kg sušiny za hodinu) zjištěné v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjištěnými u kontrolních vzorků. Z těchto údajů se pro každou zkušební koncentraci vypočte velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty v procentech se vynesou proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypočítají hodnoty ECx. Standardními metodami (viz literatura 15 až 17) se rovněž vypočítají intervaly spolehlivosti (p = 0,95) pro vypočtené hodnoty ECx.

XXII.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pokud je při hodnocení výsledků zkoušek s agrochemikáliemi při kterémkoli odběru po 28 dnech rozdíl respiračních rychlostí při nižší expozici (tj. při maximální očekávané koncentraci) a rychlosti u kontroly roven 25 % nebo nižší, lze konstatovat, že zkoušená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci uhlíku v půdách. Pro hodnocení výsledků zkoušek jiných látek než agrochemikálií se použijí hodnoty EC50, EC25 a/nebo EC10.

XXII.3. ZPRÁVY

PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

Úplnou identifikaci použité půdy zahrnující tyto údaje:

— zeměpisná poloha místa (zeměpisná šířka a délka);

— informace o historii místa (tj. vegetační kryt, ošetření přípravky na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.);

— způsob využití (např. zemědělská půda, les atd.);

— hloubka odběru vzorků (cm);

— obsah písku/prachu/jílu (v % sušiny);

— pH (ve vodě);

— obsah organického uhlíku (v % sušiny hmotnosti);

— obsah dusíku (v % sušiny);

— kapacita iontové výměny (mmol/kg);

— výchozí mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku;

— odkaz na metody použité pro stanovení každého z parametrů;

— všechny informace týkající se odběru a skladování vzorků půd;

— podrobné údaje o případné předběžné inkubaci půdy.

Zkoušená látka:

— fyzikální povaha a případně její fyzikálně-chemické vlastnosti;

— případně údaje o chemické identitě, včetně strukturního vzorce, čistoty (tj. procentuální obsah účinné složky u přípravků na ochranu rostlin), obsahu dusíku.

Zkušební podmínky:

— podrobné údaje o obohacení půdy organickým substrátem;

— počet použitých koncentrací zkoušené látky, popřípadě zdůvodnění volby koncentrací;

— podrobné údaje o aplikaci zkoušené látky na půdu;

— inkubační teplota;

— vlhkost půdy na začátku zkoušky a v jejím průběhu;

— použitá metoda inkubace (tj. buď inkubace souhrnného vzorku půdy, nebo inkubace jednotlivých dílčích vzorků půdy);

— počet duplikátních vzorků;

— doby odběru vzorků.

Výsledky:

— metoda a zařízení použité pro měření respiračních rychlostí;

— data včetně jednotlivých hodnot a průměrných hodnot množství oxidu uhličitého nebo kyslíku zpracovaná v tabulkové formě;

— rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních vzorků půd;

— v případě potřeby vysvětlení oprav provedených při výpočtech;

— procentuální odchylka v rychlostech respirace vyvolané glukosou pro každou dobu odběru vzorků, popřípadě hodnota EC50 s 95% intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty ECx (tj. EC25 nebo EC10) s intervaly spolehlivosti a graf křivky závislosti odpovědi na dávce;

— případné statistické vyhodnocení výsledků;

— všechny informace a pozorování užitečné pro interpretaci výsledků.

XXII.4 LITERATURA

(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 – 16, 1994.

(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1 – 1 (2. vyd., 1990).

(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.

(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, vyd. M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.

(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. ledna, 1995.

(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(7) Anderson, J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments. In: Pesticide Effects on Soil Microflora. Vyd. L. Somerville, M. P. Greaves, Chap. 3: 45 – 60.

(8) Anderson, J. P. E. (1982). Soil Respiration. In: Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties. Agronomy Monograph N° 9. Vyd. A. L. Page, R. H. Miller a D. R. Keeney. 41: 831 – 871.

(9) ISO 11266-1 (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.

(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

(11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E. A., Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77 – 81.

(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.

(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.

(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113 – 120.

(15) Litchfield, J. T., Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. Exper. Ther., 96, 99 – 113.

(16) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3. vyd., Cambridge, London, New York.

(17) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

XXIII. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE CHEMICKÉ LÁTKY V PŮDĚ

(metoda C.23 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)

XXIII.1. METODA

Tato zkušební metoda odpovídá metodě OECD TG 307 (2002).

XXIII.1.1 ÚVOD

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)