Vyhláška, kterou se mění vyhláška Ministerstva zemědělství č. 124/2001 Sb., kterou se stanoví požadavky na odběr vzorků a principy metod laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů a způsob uchovávání vzorků

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu lasalocidu:

do 100 mg/kg	15 % relat. z vyššího výsledku
od 100 do 200 mg/kg	15 mg/kg
nad 200 mg/kg	7,5 % relat. z vyššího výsledku

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 30 mg/kg.

• 1. Chemoterapeutika

• 3.1. Stanovení obsahu dimetridazolu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu dimetridazolu v krmivech a premixech.

Obsah dimetridazolu se stanoví po extrakci vzorku 90 % methanolem. Následně se přečistí na pevné fázi a stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí při 309 nm.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu dimetridazolu:

od 3 do 30 mg/kg	15 % relat.
od 30 do 100 mg/kg	5 mg/kg
nad 100 mg/kg	5 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu dimetridazolu:

od 3 do 25 mg/kg	20 % relat.
od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
nad 50 mg/kg	10 % relat.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 3 mg/kg.

• 1. Vitaminy

• 4.1. Stanovení obsahu cholinu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu cholinu v krmivech a premixech.

Obsah cholinu se stanoví po hydrolýze vzorku hydroxidem barnatým a přečištění hydrolyzátu na ionexu na základě vzniku komplexu s reineckátem amonným v prostředí roztoku fosforečnanu sodného spektrofotometricky po rozpuštění komplexu v acetonu při vlnové délce 525 nm. Alternativně je možno provádět stanovení cholinu metodou ITP.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit 10 % relat.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 20 mg/kg.

• 4.2. Stanovení obsahu pantothenanu vápenatého

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu pantothenanu vápenatého v premixech.

Obsah pantothenanu vápenatého se stanoví na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu Saccharomyces carlsbergensis CCM 4288 (ATCC 9080) difúzním plotnovým Metodaem.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 4.3. Stanovení vitaminů B1, B2, B6

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminů B1, B2, B6 v krmných směsích.

Vitaminy B1 (thiamin), B2 (riboflavin) a B6 (pyridoxin) se extrahují ze vzorku krmiva vodou a po hydrolýze kyselinou chloristou se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s využitím iontových párů na reverzní fázi. Detekce vitaminu B2, a B6 se provádí přímo fluorescenční detekcí, zatímco vitamin B1 se před detekcí nejprve oxiduje derivatizačním činidlem v reakční smyčce postkolonové derivatizace.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 4.4. Stanovení obsahu vitaminu B2

Účel, rozsah a princip

Používají se dvě metody stanovení obsahu vitaminu B2 v premixech - metoda fluorometrická a metoda difúzně plotnová.

Obsah vitaminu B2 se stanoví fluorometricky v mírně okyseleném prostředí na základě fluorescence při vlnové délce 440 nm nebo difúzně plotnovou metodou na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 (ATCC 7469).

Opakovatelnost

Pro metodu fluorometrickou nestanovena.

Pro metodu difuzní plotnovou:

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí při obsahu vitaminu B2 500 000 mg/kg překročit hodnotu 40 500 mg/kg.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 4.5. Stanovení obsahu vitaminu B6

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu B6 v premixech.

Vitamin B6 ve všech jeho formách se stanoví na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu kvasinky Saccharomyces carlsbergensis CCM 4228 (ATCC 9080) difúzním plotnovým způsobem.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 4.6. Stanovení obsahu vitaminu A

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu A v krmivech a premixech. Vitamin A zahrnuje all-trans retinol a jeho cis izomery, které se touto metodou stanoví. Obsah vitaminu A se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) na kg. Mezinárodní jednotka odpovídá aktivitě 0,3 μg all-trans vitaminu A (alkohol) nebo 0,344 ug all-trans vitamin A (acetát) nebo 0,550 μg all-trans vitaminu A (palmitát).

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin A se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu A se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí. Chromatografické parametry jsou vybrány tak, aby nedocházelo k separaci all-trans vitaminu A (alkohol) a jeho cis izomerů.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 2000 m.j./kg

• 4.7. Stanovení obsahu vitaminu E

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu E v krmivech a premixech. Obsah vitaminu E se vyjadřuje jako mg DL-α-tokoferol acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol acetátu odpovídá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamin E).

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin E se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu E se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z vyššího výsledku.

Reprodukovatelnost

Je uvedena u metody.

Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je 2 mg/kg.

• 4.8. Stanovení obsahu vitaminu D

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu D v krmivech.

Vitamin D se stanoví po alkalické hydrolýze vzorku hydroxidem draselným za studena, následné extrakci do hexanu, přečištění na semipreparativní koloně Silica metodou HPLC. Frakce vitaminu D se zachytí, odpaří se k suchu a odparek se rozpustí v methanolu. V extraktu se stanoví obsah vitaminu D vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na analytické koloně s reverzní fází C18 s UV detekcí při 265 nm.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 20 % relat.

Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit 30 % relat.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 1. Mikroprvky

• 5.1. Stanovení obsahu mědi, železa, manganu a zinku

Metoda stanovení obsahu mědi, železa, manganu a zinku je uveden v příloze č. 9, část 8.

• 5.2. Stanovení obsahu kobaltu

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu kobaltu v krmivech.

Obsah kobaltu se stanoví po mineralizaci vzorku v chloridovém výluhu metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS).

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 5.3. Stanovení obsahu selenu.

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení selenu v krmivech.

Ve vzorku se po rozkladu kyselinou dusičnou v uzavřeném systému stanoví obsah selenu metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS).

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 1. Výpočty

• 6.1. Vyhodnocování a výpočet výsledků stanovení obsahu doplňkových látek pro difúzně plotnové metody

Účel, rozsah a princip

Metoda uvádí a specifikuje uzančně závazný způsob pro vyhodnocování a výpočet výsledků při stanovení obsahu doplňkových látek v krmivech a premixech pro difúzně plotnové metody.

Průměry inhibičních resp. stimulačních zón, vzniklých při stanovení doplňkových látek difusně plotnovou metodou, se měří s přesností nejméně na 0,1 mm. Ze souboru takto získaných hodnot se vypočítá aritmetický průměr pro každou koncentraci zkoušeného vzorku i standardu.

• 1. Barviva

• 7.1. Stanovení β-karotenu spektrofotometrickou metodou

Účel, rozsah a princip

β-karoten je přírodní barvivo chemicky patřící do skupiny tetraterpenoidů a je provitaminem vitaminu A.

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu β-karotenu v krmivech.

Stanoví se po enzymatické hydrolýze směsí enzymů pepsin - trypsin (1:1) v alkalickém prostředí, rozpuštěním v acetonu a následnou extrakcí do hexanu, spektrofotometricky při vlnové délce 451 nm.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

Mez stanovitelnosti

Nestanovena.

• 1. Mikrobiotika

• 8.1. Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Enterococcus

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení počtu zárodků rodu Streptococcus skupiny D (Enterococcus) v krmivech a premixech.

Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Enterococcus se provádí na selektivních půdách podle Slanetze a Bartleye. Jako referenční půda se při stanovení používá další selektivní půda (např. KF agar) nebo u premixů vhodná neselektivní půda. Naočkované půdy jsou kultivovány při 37 °C ± 1 °C. Růst a počty kolonií se vyhodnocují po dvou a čtyřdenní kultivaci.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.

• 8.2. Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Bacillus

Účel, rozsah a princip

Metoda specifikuje podmínky pro stanovení počtu zárodků rodu Bacillus v krmivech.

Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Bacillus se provádí anaerobní kultivací na krevním agaru při 37 °C. Počty kolonií, charakteristické pro dané mikroorganismy, se vyhodnocují po 18 - 24 hodinách.

Opakovatelnost

Nestanovena.

Reprodukovatelnost

Nestanovena.“.

• 1. V příloze č. 11 se pod nadpisem „Seznam postupů fyzikálního zkoušení krmiv“ slova „Název postupu“, „Označení postupu“ a písmeno „A“ zrušují.

• 1. V příloze č. 12 se pod nadpisem „Seznam postupů smyslového zkoušení krmiv“ slova „Název postupu“, „Označení postupu“ a písmeno „A“ zrušují.

• 1. V příloze č. 13 se pod nadpisem „Seznam postupů speciálního zkoušení krmiv“ slova „Název postupu“, „Označení postupu“ a písmeno „A“ zrušují.

• 1. V příloze č. 13 body 5 a 6 znějí:

• „5. Stanovení botanické čistoty, nečistot a škodlivých nečistot u krmných surovin.

Princip

Mechanicky nebo ručně se z poměrné části konečného vzorku oddělí botanické nečistoty (přirozené neškodné nečistoty a škodlivé nečistoty a škodlivá olejnatá semena, tj. semena a plody plevelů uvedené v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb., kterou se provádí zákon č. 91/1996 Sb., o krmivech, ve znění zákona č. 244/2000 Sb., ve znění pozdějších předpisů) a cizí předměty a vyjadřují se jako procentní podíl.

• 1. Podmínky pro mikroskopické stanovení, identifikaci nebo určování složek živočišného původu v krmivech.

Účel, rozsah a princip

Tato metoda je určena pro stanovení složek živočišného původu (definovaných jako produkty zpracování těl nebo částí těl savců, ptáků a ryb) v krmivech, prováděné pomocí mikroskopického zkoušení v rámci systému koordinovaného inspekčního programu v oblasti výživy zvířat v souladu s § 16 zákona č. 91/1996 Sb., o krmivech, ve znění pozdějších předpisů.

Stanovení prováděná podle této metody jsou používána k provádění odborného dozoru a zkoušení krmiv. Ke zlepšení určování určitých typů živočišných konstituentů nebo určení původu živočišné složky mohou být použity v další zkoušce upravené nebo alternativní metody. Při zkoušení určitých specifických živočišných konstituentů jako např. plasma nebo kosti v tuku (viz také bod 9) mohou být také použity další metody za předpokladu, že tyto zkoušky budou provedeny jako doplněk ke zkouškám uváděným v koordinačním inspekčním programu.

Citlivost stanovení v krmivech může být v závislosti na původu složek živočišného původu velmi nízká – 0,01 %.

K identifikaci se použije vhodně upravený reprezentativní vzorek, odebraný podle postupu uvedeného v § 1 až 6. Dále uvedená metoda je vhodná pro krmiva s nízkým obsahem vlhkosti. Krmiva s vyšším obsahem vlhkosti než 14 % musí být předem předsušena. Zejména některá krmiva a krmné suroviny (např. tuky a oleje) vyžadují uvedenou úpravu. Složky živočišného původu jsou identifikovány na základě typických, mikroskopicky identifikovatelných charakteristik (např. svalových vláken nebo jiných částí masa, chrupavek, kostí, rohů, chlupů, štětin, krve, peří, vaječných skořápek, rybích kostí, šupin).

Identifikace musí být provedena jak v sítové frakci, tak v koncentrovaném sedimentu vzorku.“.

• 1. V příloze č. 16 se v bodu 2. slova „dimetridazol nebo“ zrušují.

• 1. V příloze č. 16 se v bodu 8. slova „a pro lasalocid pod bodem 2.16. a pro dimetridazol pod bodem 3.1.“ nahrazují slovy „pro lasalocid pod bodem 2.16.“.

• 1. V příloze č. 16 se v bodu 8. slova „Pro doplňkové látky dimetridazol a lasalocid, které jsou ustanoveny“ nahrazují slovy „Pro doplňkovou látku lasalocid, která je ustanovena“.

• 1. V příloze č. 16 tabulka zní:

„Doplňková látka	Obsah mg/kg	Opakovatelnost
Lasalocid	od 0,5 do 15	10 % relat.
	od 50 do 150	5 % relat.“.

• 1. V příloze č. 16 se v bodu 11. slovo „F0,05“ nahrazuje slovem „F0,1“.

• 1. Příloha č. 17 zní:

„Příloha č. 17 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Způsob hodnocení krmiv a premixů při křížové kontaminaci doplňkovými látkami

• 1. Při ověřování křížové kontaminace premixů doplňkovými látkami se údaje zjištěných hodnot považují za ještě vyhovující, pokud nepřekračují toleranci desetinásobku hodnoty meze stanovitelnosti uvedené v příloze č. 9 a 10.

• 1. Při ověřování křížové kontaminace krmiv doplňkovými látkami se údaje zjištěných hodnot považují za ještě vyhovující, pokud nepřekračují toleranci ve výši meze stanovitelnosti uvedené v příloze č. 9 a 10.“.

• 1. Příloha č. 18 zní:

„Příloha č. 18 k vyhlášce č. 124/2001 Sb.

Část 1:

Metody odběru vzorků pro odborný dozor a zkoušení obsahu dioxinů (PCDD/PCDF) a určování dioxinům podobných PCB v některých krmivech

• 1. Účel a oblast působnosti

Vzorky určené k provádění odborného dozoru a zkoušení obsahu dioxinů (PCDD/PCDF), jakož i obsahu dioxinům podobných polychlorovaných bifenylů (Tabulka Světové zdravotnické organizace) v krmivech se odebírají v souladu s § 1 až 6 vyhlášky č. 124/2001 Sb. Takto získané souhrnné vzorky se považují za reprezentativní pro vzorkovanou partii a subpartii, z nichž byly odebrány. Dodržení maximálních povolených hodnot se posuzuje na základě obsahů stanovených v laboratorních vzorcích.

• 1. Shoda partie nebo subpartie s povolenými hodnotami

Pokud je výsledek prvního stanovení o méně než 20 % vyšší nebo nižší než je povolená maximální hodnota, musí kontrolní laboratoř pro potvrzení výsledku provést v laboratorním vzorku opakované stanovení a vypočítat průměr z obou výsledků. Partie se uznává, jestliže je výsledek prvního stanovení o více než 20 % nižší než maximální povolená hodnota a nebo pokud bylo nutno provést opakované stanovení, jestliže průměr vypočtený z obou stanovení odpovídá maximální povolené hodnotě stanovené v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb.

Tabulka Světové zdravotnické organizace (WHO) pro hodnocení nebezpečnosti dioxinů a dioxinům podobných polychlorovaných bifenylů pro člověka vyjářených pomocí TEF (Toxic Equivalency Factors), vycházející ze závěrů kongresu WHO ve Stockholmu, Švédsko, 15. až 18. června 1997 (Van den Berg a jiní, (1998) Toxic Equivalency Factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for Humans and for Wildlife. Environmental Health Perspectives, 106(12), 775).

Kongener	Hodnota TEF	Kongener	Hodnota TEF
Dibenzo-p-dioxiny (PCDD)		„Dioxinům podobné“ PCB: non-ortho PCB + mono-ortho PCB
2,3,7,8-TCDD	1	Non-ortho PCB
1,2,3,7,8-PeCDD	1	PCB 77	0,0001
1,2,3,4,7,8-HxCDD	0,1	PCB 81	0,0001
1,2,3,6,7,8-HxCDD	0,1	PCB 126	0,1
1,2,3,7,8,9-HxCDD	0,1	PCB 169	0,01
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	0,01
OCDD	0,0001
Dibenzofurany (PCDF)		Mono-ortho PCB
2,3,7,8-TCDF	0,1	PCB 105	0,0001
1,2,3,7,8-PeCDF	0,05	PCB 114	0,0005
2,3,4,7,8-PeCDF	0,5	PCB 118	0,0001
1,2,3,4,7,8-HxCDF	0,1	PCB 123	0,0001
1,2,3,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 156	0,0005
1,2,3,7,8,9-HxCDF	0,1	PCB 157	0,0005
2,3,4,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 167	0,00001
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	0,01	PCB 189	0,0001
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	0,01
OCDF	0,0001
Použité zkratky: T = tetra; Pe = penta; Hx = hexa; Hp = hepta; O = okta; CDD = chlorodibenzo-p-dioxin; CDF = chlorodibenzofuran; CB = chlorobifenyl.

Část 2:

Příprava vzorků a požadavky na metody analytického zkoušení používané při provádění odborného dozoru a zkoušení obsahu dioxinů (pcdd/pcdf) a stanovení dioxinům podobných pcb v některých krmivech

• 1. Cíl a oblast použití

Tyto požadavky na metody analytického zkoušení se používají pro stanovení dioxinů (polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů (PCDD) a polychlorovaných dibenzofuranů (PCDF)) a dioxinům podobných polychlorovaných bifenylů (PCB) v krmných surovinách a krmivech.

Sledování přítomnosti dioxinů v krmivech se provádí pomocí strategie zahrnující vyhledávací metodu pro výběr vzorků s obsahem dioxinů a dioxinům podobných PCB o méně než 30 až 40 % nižším nebo vyšším než je množství, které je předmětem zájmu. Koncentrace dioxinů ve vzorcích s významným obsahem se stanoví/potvrdí ověřovací metodou.

Vyhledávací metody jsou metody, které se používají ke zjišťování přítomnosti dioxinů a dioxinům podobných PCB v množství, které je předmětem zájmu. Tyto metody jsou schopné rychle zpracovat velký objem vzorků a používají se k prověření velkého množství vzorků z hlediska možných pozitivních výsledků. Jsou speciálně navrženy tak, aby vyloučily falešně negativní výsledky.

Ověřovací metody jsou metody, které poskytují úplné nebo doplňkové informace umožňující jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci dioxinů a dioxinům podobných PCB na uvažované úrovni, která je předmětem zájmu.

• 1. Obecně

Protože vzorky z životního prostředí a biologické vzorky (včetně vzorků krmných surovin/krmiv) obvykle obsahují složité směsi různých dioxinových kongenerů, byla pro usnadnění hodnocení jejich nebezpečnosti vyvinuta koncepce koeficientů toxické ekvivalence (TEF). Tyto TEF byly stanoveny, aby vyjádřily koncentraci směsí 2,3,7,8-substituovaných PCDD a PCDF, a později také u některých non-ortho a mono-ortho-chlór substituovaných PCB, které vykazují aktivitu podobnou dioxinům, v toxických ekvivalentech (TEQ) 2,3,7,8-TCDD (viz. Tabulka Světové zdravotnické organizace)

Koncentrace jednotlivých látek v daném vzorku se násobí jejich příslušným TEF a tyto násobky se následně sčítají, aby se dospělo k celkové koncentraci dioxinům podobných sloučenin, vyjádřených v TEQ.

Koncepce „horní hranice“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítaly mezní hodnoty kvantifikace každého nekvantifikovaného kongeneru.

Koncepce „dolní hranice“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítala za každý nekvantifikovaný kongener nulová hodnota.

Koncepce „střední hodnoty“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítala polovina mezní hodnoty kvantifikace pro každý nekvantifikovaný kongener.

• 1. Příprava vzorků

Pro přípravu vzorků k laboratornímu zkoušení jsou použitelné postupy uvedené v příloze č. 7 této vyhlášky. Kromě toho musí být splněny tyto požadavky:

• vzorky musí být skladovány a přepravovány ve skleněných, hliníkových, polypropylénových nebo polyethylenových nádobách. Z nádoby na vzorky musí být odstraněny stopy papírového prachu. Skleněné nádobí musí být vypláchnuto rozpouštědly předem zkontrolovanými z hlediska přítomnosti dioxinů,

• musí být provedena slepá zkouška, která spočívá v provedení celého analytického postupu s vynecháním vzorku,

• hmotnost vzorku použitá k extrakci musí být dostatečná vzhledem k citlivosti.

• 1. Požadavky kladené na laboratoře

• laboratoře musí prokázat účinnost metody v rozsahu koncentrace, která je předmětem zájmu, například polovina, jedno a dvojnásobek koncentrace, která je předmětem zájmu, s přijatelným variačním koeficientem výsledků opakované analýzy. Podrobnosti kritérií přijatelnosti viz bod 5;

• mezní hodnota stanovitelnosti pro ověřovací metodu musí být v rozsahu asi jedné pětiny úrovně, která je předmětem zájmu, aby byla jistota, že v rozsahu úrovně, která je předmětem zájmu, se dosahuje přijatelných variačních koeficientů;

• jako opatření v rámci vnitřní kontroly jakosti se provádějí pravidelné slepé zkoušky, stanovení se standardním přídavkem nebo stanovení kontrolních vzorků (nejlépe certifikovaného referenčního materiálu, je-li k dispozici);

• úspěšná účast v mezilaboratorních studiích, které hodnotí způsobilost laboratoře, je nejlepším způsobem, jak prokázat schopnost provádět určitá stanovení. Avšak úspěšná účast v mezilaboratorních studiích, například pro půdní vzorky nebo vzorky odpadních vod, nezbytně neprokazuje též schopnost v oblasti vzorků potravin nebo krmiv, kde jde o nižší úrovně znečištění. Proto je povinná trvalá účast v mezilaboratorních studiích stanovení dioxinů a dioxinům podobných PCB v příslušných matricích krmiv /potravin;

• laboratoře musí být akreditovány uznávaným subjektem působícím v souladu s ISO Guide 58, aby bylo zajištěno, že uplatňují zabezpečování jakosti při analýzách. Laboratoře by měly být akreditovány podle normy ISO/IEC 17025:1999.

• 1. Požadavky kladené na analytické metody zkoušení dioxinů a dioxinům podobných PCB

Základní požadavky pro uznání analytických metod:

• vysoká citlivost a nízké mezní hodnoty detekce. Pro PCDD a PCDF musí být detekovatelná množství v řádu pikogramů TEQ (10^-12 g), kvůli mimořádné toxicitě některých z těchto sloučenin. Je známo, že PCB se vyskytují ve vyšších koncentracích než PCDD a PCDF. Pro většinu kongenerů PCB již postačuje citlivost v řádu nanogramů (10^-9 g). Avšak pro měření jedovatějších dioxinům podobných kongenerů PCB (zejména non-ortho substituovaných forem) musí být dosaženo stejné citlivosti jako pro PCDD a PCDF;

• vysoká selektivita. Je nutné rozlišovat PCDD, PCDF a dioxinům podobné PCB od velkého množství jiných, společně extrahovaných a eventuálně rušivých sloučenin přítomných v koncentracích až o několik řádů vyšších než koncentrace látek, které jsou předmětem zájmu. Pro plynovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií (GC/MS) je nezbytné rozlišení mezi různými kongenery, tj. mezi toxickými (např. sedmnáct 2,3,7,8-substituovaných PCDD a PCDF a dioxinům podobných PCB) a ostatními kongenery. Biologické zkoušky sloučenin musí být schopny selektivně určit hodnoty TEQ jako součet PCDD, PCDF a dioxinům podobných PCB;

• vysoká přesnost (správnost a shodnost). Stanovení musí poskytnovat platný a spolehlivý odhad skutečné koncentrace ve vzorku. Je nezbytná vysoká přesnost (přesnost měření: velká shoda výsledku měření a skutečné nebo přisuzované hodnoty měření), aby se předešlo zamítnutí analýzy vzorku na základě špatné spolehlivosti odhadu TEQ. Přesnost se vyjadřuje jako správnost (rozdíl mezi střední naměřenou hodnotou analytu v certifikovaném referenčním materiálu a jeho certifikovanou hodnotou, vyjádřený jako procento této hodnoty) a shodnost (shodnost se obvykle počítá jako standardní odchylka zahrnující opakovatelnost a reprodukovatelnost a označuje míru shody mezi výsledky získanými několikanásobným použitím experimentálního postupu za předepsaných podmínek).

Vyhledávací metody mohou zahrnovat metody biologických zkoušek a metody GC/MS; ověřovací metody jsou metody plynové chromatografie s vysokým rozlišením/ hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRGC/HRMS). Celková hodnota TEQ musí vyhovovat těmto kritériím

	Vyhledávací metody	Ověřovací metody
Falešně negativní koncentrace	< 1 %
Správnost		-20 až +20 %
Variační koeficient	< 30 %	< 15 %

• 1. Zvláštní požadavky, které musí splňovat metody GC/MS, aby vyhovovaly pro účely vyhledávání nebo ověřování

• při validaci metody musí být hned na počátku analytické metody, například před extrakcí, provedeno přidání vnitřních standardů 2,3,7,8-chlór substituovaných PCDD/F značených pomocí ^13C (a vnitřních standardů dioxinům podobných PCB značených pomocí ^13C, pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB). Alespoň jeden kongener musí být přidán pro každou z tetra nebo okta-chlorovaných homologických skupin PCDD/F (a alespoň jeden kongener pro každou z homologických skupin dioxinům podobných PCB, pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB) (nebo alespoň jeden kongener pro každou skupinu vybraných iontů při použití hmotnostní spektrometrie v režimu registrace vybraných iontů, použitou pro sledování PCDD/F a dioxinům podobných PCB). Jednoznačně se dává přednost, zejména v případě ověřovacích metod, použití všech 17 vnitřních standardů 2,3,7,8-substituovaných PCDD/F značených pomocí ^13C a všech 12 vnitřních standardů dioxinům podobných PCB značených pomocí ^13C (pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB).

Pro ty kongenery, k nimž není přidán žádný analog značený pomocí ^13C, se určí relativní koeficienty odezvy při použití vhodných kalibračních roztoků.

• Pro krmiva rostlinného původu a krmiva živočišného původu obsahující méně než 10 % tuku je přidání vnitřních standardů před extrakcí povinné. Pro krmiva živočišného původu obsahující více než 10 % tuku se vnitřní standardy přidávají buď před, nebo po extrakci tuku. Vhodná validace účinnosti extrakce se provádí v závislosti na tom, kdy je vnitřní standard přidáván a na tom, zda jsou výsledky uváděny v produktu nebo v tuku.

• Před analýzou GC/MS musí být přidán jeden nebo dva standardy pro stanovení výtěžnosti.

• Kontrola výtěžnosti je nezbytná. U ověřovacích metod se výtěžnost jednotlivých vnitřních standardů pohybuje v rozsahu 60 až 120 %. Nižší nebo vyšší hodnota výtěžnosti jednotlivých kongenerů zejména některých hepta- a okta-chlorovaných dibenzodioxinů a dibenzofuranů, je přípustná pod podmínkou, že jejich příspěvek k hodnotě TEQ nepřesáhne 10 % celkové hodnoty TEQ (jen na základě PCDD/F). Hodnota výtěžnosti u vyhledávacích metod se pohybuje mezi 30 a 140 %.

• Oddělení dioxinů od rušivých chlorovaných sloučenin, jako jsou PCB a chlorované difenylethery, se provádí vhodnými chromatografickými technikami (nejlépe na florisilové, aluminové a/nebo uhlíkové koloně).

• Oddělení isomerů pomocí plynové chromatografie musí být dostatečné (< 25 % mezi píky 1,2,3,4,7,8-HxCDF a 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

• Stanovení se provádí podle metody EPA 1613 revize B: tetra- až okta-chlorované dioxiny a furany pomocí izotopického zřeďování HRGC/HRMS nebo jinou metodou se shodnými pracovními charakteristikami (performance criteria).

• u krmiv kontaminovaných dioxiny v rozsahu maximální úrovně nebo nad ní by rozdíl mezi horní a dolní mezní úrovní neměl překročit 20 %. U krmiv s úrovní kontaminace výrazně pod maximální úrovní se může rozdíl pohybovat v rozmezí 25 a 40 %.

• 1. Vyhledávací analytické metody

• 7.1 Úvod

Vyhledávací metody mohou být použity k různým přístupům: čistě vyhledávací přístup a nebo kvantitativní přístup.

Vyhledávací přístup

Odezva vzorků se porovnává s odezvou srovnávacího vzorku na úrovni, která je předmětem zájmu. Vzorky s odezvou nižší než srovnávací vzorek se považují za negativní, vzorky s vyšší odezvou se považují za pozitivní. Požadavky:

• do každé zkušební série se zařazují alespoň jeden slepý a jeden srovnávací vzorek, které se extrahují a zkouší současně za shodných podmínek. Odezva srovnávacího vzorku musí být zřetelně vyšší ve srovnání se slepým vzorkem,

• zařazují se další srovnávací vzorky s poloviční a dvojnásobnou koncentrací, která je předmětem zájmu, aby se prokázala řádná účinnost zkoušky pro kontrolu koncentrace, která je předmětem zájmu,

• při zkoušení jiných matric se musí prokázat vhodnost referenčního vzorku(ů), nejlépe zařazením vzorků, u nichž bylo pomocí HRGC/HRMS zjištěno, že obsahují množství TEQ přibližně odpovídající referenčnímu vzorku nebo jinému slepému vzorku obohacenému na tuto úroveň,

• protože při biologických zkouškách sloučenin nemohou být použity žádné vnitřní standardy, jsou pro získání informací o standardní odchylce v rámci jedné zkušební série velmi důležité testy opakovatelnosti. Variační koeficient musí být nižší než 30 %,

• pro biologické zkoušky jsou definovány cílové (stanovované) sloučeniny, možné rušivé vlivy a maximální přípustné slepé hodnoty.

Kvantitativní přístup

Kvantitativní přístup vyžaduje standardní sérii ředění, dvojnásobné nebo trojnásobné čištění a měření, jakož i slepé stanovení a kontrolu výtěžnosti. Výsledek se vyjadřuje jako TEQ, čímž se předpokládá, že sloučeniny odpovědné za signál odpovídají principu TEQ. Toto může být provedeno pomocí TCDD (nebo standardní dioxin/furanové směsi) za účelem vytvoření kalibrační křivky pro výpočet hodnoty TEQ v extraktu a tedy i vzorku. Tato hodnota se následně koriguje podle hodnoty TEQ vypočtené pro slepý vzorek (aby se zohlednily nečistoty z použitých rozpouštědel a chemikálií) a výtěžnost (vypočtená z hodnoty TEQ ve vzorku pro kontrolu jakosti v blízkosti mezní koncentrace, která je předmětem zájmu). Je nezbytné poznamenat, že část zřejmé ztráty výtěžnosti může být způsobena matricovými jevy a/nebo rozdíly mezi hodnotami TEF v biologických zkouškách sloučenin a úředními hodnotami TEF stanovenými WHO.

• 7.2. Požadavky kladené na analytické metody používané pro vyhledávání

• pro vyhledávání se používají analytické metody GC/MS a biologické metody zkoušení. Pro metody GC/MS se uplatňují požadavky stanovené v bodu 6. Pro buněčné biologické zkoušky sloučenin platí zvláštní požadavky stanovené v bodu 7.3 a pro biologické zkoušky sloučenin prováděné pomocí setů platí zvláštní požadavky stanovené v bodu 7.4;

• jsou nezbytné informace o počtu falešně pozitivních a falešně negativních výsledků velkého souboru vzorků pod a nad maximální úrovní nebo účinnou úrovní ve srovnání s obsahem TEQ určeným ověřovací analytickou metodou. Skutečný podíl falešně negativních výsledků musí být nižší než 1 %. Podíl falešných pozitivních výsledků musí být natolik nízký, aby se použití vyhledávacího nástroje stalo výhodným;

• pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny ověřovací analytickou metodou (HRGC/HRMS). Kromě toho se pomocí HRGC/HRMS potvrzují vzorky z širokého rozmezí hodnot TEQ (přibližně 2 až 10 % negativních vzorků) a předkládají se informace o souladu výsledků biologické zkoušky a HRGC/HRMS.

• 7.3. Zvláštní požadavky kladené na biologické zkoušky sloučenin

• při biologickém zkoušení vyžaduje každá zkouška řadu srovnávacích koncentrací TCDD nebo dioxin/furanových směsí (úplná křivka dávka/odezva s R^2 > 0,95). Avšak pro účely vyhledávání se používá rozšířená nízkoúrovňová křivka pro analyzování vzorků s nízkým obsahem;

• aby bylo výsledku biologické zkoušky sloučenin dosaženo během konstantní doby, používá se srovnávací koncentrace TCDD (asi trojnásobek meze detekce) uvedená na listu kontroly jakosti. Jinou možností je relativní odezva srovnávacího vzorku vztažená ke kalibrační křivce TCDD, protože odezva buněk může záviset na mnoha faktorech;

• pro každý srovnávací materiál se zaznamenávají a kontrolují grafy kontroly jakosti, aby byl zajištěn soulad výsledku se směrnicemi;

• zejména v případě kvantitativního vyhodnocování musí být výsledek ředění vzorků uvnitř lineárního části úseku křivky odezvy. Vzorky nad lineární částí křivky odezvy musí být znovu zředěny a přezkoušeny. Proto se doporučuje zkoušet alespoň tři nebo více různě ředěných vzorků najednou;

• variační koeficient nesmí být vyšší než 15 % při trojnásobném stanovení pro každé ředění vzorku a pro tři nezávislé pokusy by neměl přesáhnout 30 %;

• mezní hodnota detekce se stanovuje jako trojnásobek směrodatné odchylky slepého pokusu s rozpouštědlem nebo z odezvy pozadí. Dalším přístupem je použití odezvy, která je nad pozadím (indukční koeficient rovnající se pětinásobku slepého pokusu s rozpouštědlem) vypočteným z kalibrační křivky dne. Mez stanovitelnosti se stanovuje jako pětinásobek standardní odchylky odezvy slepého pokusu s rozpouštědlem nebo pozadí nebo pomocí odezvy, která je jasně nad pozadím (indukční koeficient rovnající se desetinásobku odezvy slepého rozpouštědla) vypočteným z kalibrační křivky dne.

• 7.4. Zvláštní požadavky kladené na biologické zkoušky sloučenin prováděné pomocí souprav (kitů)

Poznámka: Dosud nebyly předloženy žádné důkazy o tom, že komerčně dostupné biologické zkoušky sloučenin prováděné pomocí souprav jsou dostatečně citlivé a spolehlivé na to, aby mohly být používány k vyhledávacímu zjišťování přítomnosti dioxinů v požadovaných koncentracích ve vzorcích potravin a krmiv.

• musí být dodržovány pokyny výrobce pro přípravu vzorků,

• nepoužívají se zkušební soupravy po uplynutí doby použitelnosti,

• nepoužívají materiály a součásti navržené pro použití s jinými soupravami,

• zkušební soupravy se uchovávají v předepsaném rozsahu skladovacích teplot a používají se při předepsané provozní teplotě,

• mezní hodnota detekce pro imunologickou zkoušku se určuje jako součet střední hodnoty a trojnásobku standardní odchylky, vycházejících z deseti opakovaných analýz slepého vzorku, jenž se dělí směrnicí přímky, získané lineární regresí;

• pro zkoušky v laboratořích se doporučuje požívat srovnávací standardy, aby byla jistota, že citlivost standardu je v přijatelném rozsahu.

• 1. Oznamování výsledků

Pokud to používaný analytický postup umožňuje, analytické výsledky uvádí množství jednotlivých kongenerů PCDD/F a PCB jako dolní, horní a střední odhady, aby oznamované výsledky obsahovaly maximum informací. Dále se uvádí také obsah lipidů ve vzorku a metoda použitá pro extrakci lipidů.

Výtěžnost vnitřních standardů se uvádí, pokud jsou výsledky mimo povolený rozsah maximálních hodnot uvedených v bodu 6 a v ostatních případech na vyžádání.“.

Čl. II

Účinnost

Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem 1. října 2004.

Ministr:

Ing. Palas v. r.