Vyhláška, kterou se stanoví analytické metody kontroly složení kosmetických prostředků

• 1. KALIBRAČNÍ GRAF

• 7.1 Pro plynovou chromatografii podle bodu 6.2.1 (náplň kolony Hallcomid M18) se použijí následující standardní směsi. Tyto směsi se připraví odměřením pomocí pipet, ale přesné množství se stanoví zvážením pipety nebo baňky po každém přidání.

Relativní koncentrace (% m/m):	Methanol (ml)	Ethanol nebo propan-2-ol (ml)	Doplněno chloroformem na objem
Přibližně 2,5 %	0,5	20	100 (ml)
Přibližně 5,0 %	1,0	20	100 (ml)
Přibližně 7,5 %	1,5	20	100 (ml)
Přibližně 10,0 %	2,0	20	100 (ml)

Do chromatografu se nastřikují 2 až 3 μl za podmínek uvedených v bodě 6.2.1.

Pro každou směs se vypočtou poměry ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/propan-2-ol). Sestrojí se kalibrační graf vynesením

na osu x: množství methanolu vzhledem k ethanolu nebo propan-2-olu v %

na osu y: poměr ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/ propan-2-ol).

• 7.2 Pro plynovou chromatografii podle bodu 6.2.2 (náplň kolony Porapak QS nebo Chromosorb 105) se použijí následující standardní směsi. Tyto směsi se připraví odměřením pomocí pipet, ale přesné množství se stanoví zvážením pipety nebo baňky po každém přidání.

Relativní koncentrace (% m/m):	Methanol (μl)	Ethanol nebo propan-2-ol (ml)	Doplněno vodou na objem
Přibližně 2,5 %	50	2	100 (ml)
Přibližně 5,0 %	100	2	100 (ml)
Přibližně 7,5 %	150	2	100 (ml)
Přibližně 10,0 %	200	2	100 (ml)

Do chromatografu se nastřikují 2 až 3 μl za podmínek uvedených v bodě 6.2.2.

Pro každou směs se vypočtou poměry ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/propan-2-ol) a sestrojí se kalibrační graf vynesením

na osu x: množství methanolu vzhledem k ethanolu nebo propan-2-olu v %

na osu y: poměr ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/propan-2-ol).

• 7.3 Kalibrační graf musí být lineární.

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující relativně asi 5 % (m/m) methanolu vzhledem k ethanolu nebo propan-2-olu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,25 %.

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ VOLNÉHO FORMALDEHYDU

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje kvalitativní stanovení a dva způsoby kvantitativního stanovení v závislosti na tom, zda jsou či nejsou přítomny donory formaldehydu. Je použitelná pro všechny kosmetické prostředky a skládá se ze tří částí:

• 1.1 Kvalitativní stanovení

• 1.2 Obecné kolorimetrické stanovení pomocí pentan-2,4-dionu (acetylaceton)

Tato metoda se používá v případě, je-li použit formaldehyd samotný nebo s konzervanty, které nejsou donory formaldehydu.

V opačném případě, a pokud výsledek přesáhne nejvyšší povolenou koncentraci, musí být použita následující metoda pro potvrzení.

• 1.3 Kvantitativní stanovení za přítomnosti donorů formaldehydu

Při použití výše uvedené metody (1.2) se při derivatizaci donory formaldehydu štěpí, což vede k příliš vysokým výsledkům (vázaný formaldehyd a formaldehyd v polymerní formě). Nejdříve se oddělí volný formaldehyd (vázaný nebo v polymerní formě) kapalinovou chromatografií.

• 1. DEFINICE

Obsah volného formaldehydu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.

• 1. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

• 3.1 Podstata metody

Volný a vázaný formaldehyd dává v prostředí kyseliny sírové za přítomnosti Schiffova činidla zbarvení růžové nebo do lila.

• 3.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a použije se demineralizovaná voda.

• 3.2.1 Fuchsin

• 3.2.2 Siřičitan sodný heptahydrát

• 3.2.3 Koncentrovaná kyselina chlorovodíková(d420 = 1,19)

• 3.2.4 Kyselina sírová, asi 1 mol/l

• 3.2.5 Schiffovo činidlo:

Do kádinky se naváží 100 mg fuchsinu (3.2.1) a rozpustí se v 75 ml vody o teplotě 80 °C. Po ochlazení se přidá 2,5 g siřičitanu sodného heptahydrátu (3.2.2) a 1,5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2.3). Objem se doplní do 100 ml.

Použitelnost do dvou týdnů.

• 3.3 Postup

• 3.3.1 Do kádinky na 10 ml se naváží 2 g vzorku.

• 3.3.2 Přidají se 2 kapky kyseliny sírové (3.2.4) a 2 ml Schiffova činidla (3.2.5). Toto činidlo musí být při použití naprosto bezbarvé.

Obsah se protřepe a nechá stát 5 minut.

• 3.2.3 Objeví-li se do 5 minut růžové zbarvení nebo barva lila, je přítomen formaldehyd v množství vyšším než 0,01 % a musí být stanoven volný a vázaný formaldehyd podle bodu 4. a v případě potřeby podle bodu 5.

• 1. OBECNÉ KOLORIMETRICKÉ STANOVENÍ FORMALDEHYDU POMOCÍ PENTAN-2,4-DIONU

• 4.1 Princip

Formaldehyd reaguje s pentan-2,4-dionem v přítomnosti octanu amonného za tvorby 3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidinu. Ten se extrahuje butan-1-olem a absorbance extraktu se měří při 410 nm.

• 4.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a použije se demineralizovaná voda.

• 4.2.1 Bezvodý octan amonný

• 4.2.2 Koncentrovaná kyselina octová,(d420 = 1,05)

• 4.2.3 Pentan-2,4-dion, čerstvě předestilovaný za sníženého tlaku 25 mm Hg při 25 °C – nesmí vykazovat žádnou absorpci při 410 nm

• 4.2.4 Butan-1-ol

• 4.2.5 Kyselina chlorovodíková, 1 mol/l

• 4.2.6 Kyselina chlorovodíková, asi 0,1 mol/l

• 4.2.7 Hydroxid sodný, 1 mol/l

• 4.2.8 Roztok škrobu, čerstvě připravený (1 g/50 ml vody) podle European Pharmacopoeia, 2. vydání 1980, část I-VI-1-1

• 4.2.9 37% až 40% (m/V) roztok formaldehydu

• 4.2.10 Odměrný roztok jodu, 0,05 mol/l

• 4.2.11 Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1 mol/l

• 4.2.12 Činidlo obsahující pentan-2,4-dion:

V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí:

— 150 g octanu amonného (4.2.1),

— 2 ml pentan-2,4-dionu (4.2.3),

— 3 ml kyseliny octové (4.2.2).

Doplní se na 1000 ml vodou (pH roztoku asi 6,4).

Toto činidlo musí být připraveno čerstvě.

• 4.2.13 Činidlo (4.2.12) bez přídavku pentan-2,4-dionu

• 4.2.14 Standardní roztok formaldehydu: zásobní roztok

5 g roztoku formaldehydu (4.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.

Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:

Odebere se 10,00 ml; přidá se 25,00 ml odměrného roztoku jodu (4.2.10) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (4.2.7).

Nechá se stát 5 minut.

Okyselí se 11,00 ml HCl (4.2.5) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (4.2.11), jako indikátor se použije roztok škrobu (4.2.8).

Spotřeba 1 ml 0,05 mol/l odměrného roztoku jodu (4.2.10) odpovídá 1,5 mg formaldehydu.

• 4.2.15 Standardní roztok formaldehydu: zředěný roztok

Zásobní roztok formaldehydu se zředí vodou nejprve v poměru 1/20 a poté v poměru 1/100. 1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 1 μg formaldehydu.

Přesný obsah se vypočte.

• 4.3 Přístroje a pomůcky

• 4.3.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 4.3.2 Filtr pro separaci fází, Whatman 1 PS (nebo ekvivalentní)

• 4.3.3 Odstředivka

• 4.3.4 Vodní lázeň nastavená na teplotu 60 °C

• 4.3.5 Spektrofotometr

• 4.3.6 Skleněné kyvety s délkou optické dráhy 1 cm

• 4.4 Postup

• 4.4.1 Roztok vzorku

Do odměrné baňky na 100 ml se s přesností na 0,001 g naváží množství zkušebního vzorku (v g) odpovídající očekávanému obsahu formaldehydu asi 150 μg. Doplní se po rysku vodou a zamíchá se (roztok S). (Je nutno ověřit, zda je hodnota pH asi 6; v opačném případě se přidá roztok kyseliny chlorovodíkové (4.2.6).)

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se odměří

— 10,00 ml roztoku S,

— 5,00 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.12),

— doplní se demineralizovanou vodou na konečný objem 30 ml.

• 4.4.2 Standardní roztok

Možný rušivý vliv základního zbarvení zkušebního vzorku se odstraní použitím tohoto referenčního roztoku:

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá

— 10,00 ml roztoku S,

— 5,00 ml činidla (4.2.13),

— demineralizovaná voda na konečný objem 30 ml.

• 4.4.3 Roztok pro slepý pokus

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá:

— 5,00 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.12),

— demineralizovaná voda na konečný objem 30 ml.

• 4.4.4 Stanovení

• 4.4.4.1 Směsi připravené podle bodů 4.4.1, 4.4.2 a 4.4.3 se protřepou. Erlenmeyerovy baňky se přesně na 10 minut vloží do vodní lázně vyhřáté na 60 °C. Nechají se vychladnout 2 minuty v lázni s ledovou vodou.

• 4.4.4.2 Obsah se převede do dělicí nálevky na 50 ml obsahující 10,00 ml butan-1-olu (4.2.4). Každá baňka se vypláchne 3 až 5 ml vody. Směs se přesně 30 sekund důkladně třepe. Fáze se nechají oddělit.

• 4.4.4.3 Obsah se přefiltruje do měřicích kyvet (4.3.2) přes filtr pro separaci fází. Fáze lze rovněž odstředit (při 3000 ot./min po dobu 5 minut).

• 4.4.4.4 Při 410 nm se změří absorbance (A1) extraktu roztoku vzorku (4.4.1) proti extraktu standardního roztoku (4.4.2).

• 4.4.4.5 Obdobně se změří absorbance (A2) extraktu roztoku slepého pokusu (4.4.3) proti butan-1-olu.

Poznámka: Všechny tyto operace musí být provedeny do 25 minut od okamžiku, kdy byly Erlenmeyerovy baňky vloženy do lázně vyhřáté na 60 °C.

• 4.4.5 Kalibrační křivka

• 4.4.5.1 Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá:

— 5,00 ml zředěného standardního roztoku podle bodu 4.2.15,

— 5,00 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.12),

— demineralizovaná voda na celkový objem 30 ml.

• 4.4.5.2 Postupuje se tak, jak je popsáno v bodě 4.4.4, a měří se absorbance proti butan-1-olu (4.2.4).

• 4.4.5.3 Postup se opakuje s 10, 15, 20 a 25 ml zředěného standardního roztoku (4.2.15).

• 4.4.5.4 Nulová hodnota (odpovídající zabarvení reakčních činidel) se získá postupem podle bodu 4.4.4.5.

• 4.4.5.5 Po odečtení nulové hodnoty od každé hodnoty absorbance získané podle bodů 4.4.5.1 a 4.4.5.3 se sestrojí kalibrační křivka. Beerův zákon platí až do 30 μg formaldehydu.

• 4.5 Výpočty

• 4.5.1 Od hodnoty A1 se odečte hodnota A2 a z kalibrační křivky (4.4.5.5) se odečte množství C formaldehydu v roztoku vzorku (4.4.1) v μg.

• 4.5.2 Obsah formaldehydu ve vzorku (% m/m) se vypočte pomocí vzorce:

obsah formaldehydu v % (m⁄m)=C103 · m

kde

m = je hmotnost zkušebního vzorku v g.

• 4.6 Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) formaldehydu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 % pro kolorimetrickou metodu s pentan-2,4-dionem.

Vede-li kolorimetrické stanovení volného formaldehydu k výsledkům vyšším než je nejvyšší přípustná koncentrace podle vyhlášky Ministerstva zdravotnictví č. 26/2001 Sb., o hygienických požadavcích na kosmetické prostředky, o náležitostech žádosti o neuvedení ingredience na obalu kosmetického prostředku a o požadavcích na vzdělání a praxi fyzické osoby odpovědné za výrobu kosmetického prostředku a hodnocení bezpečnosti kosmetického prostředku pro zdraví fyzických osob (o kosmetických prostředcích), tj.

• a) 0,05 % až 0,2 % ve výrobku, u něhož není obsah formaldehydu uveden na etiketě,

• b) více než 0,2 % ve výrobku s uvedením obsahu formaldehydu, nebo bez něho,

musí být použito postupu podle bodu 5.

• 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ZA PŘÍTOMNOSTI DONORŮ FORMALDEHYDU

• 5.1 Princip

Oddělený formaldehyd se převede na žlutý derivát lutidinu reakcí s pentan-2,4-dionem v reaktoru za kolonou a absorbance vzniklého derivátu se měří při 420 nm.

• 5.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 5.2.1 Voda čistoty pro HPLC nebo voda ekvivalentní kvality

• 5.2.2 Bezvodý octan amonný

• 5.2.3 Koncentrovaná kyselina octová

• 5.2.4 Pentan-2,4-dion (uchovává se při 4 °C)

• 5.2.5 Bezvodý hydrogenfosforečnan sodný

• 5.2.6 Kyselina trihydrogenfosforečná, 85%(d420 = 1,7)

• 5.2.7 Methanol čistoty pro HPLC

• 5.2.8 Dichlormethan

• 5.2.9 Formaldehyd, 37% až 40% (m/V)

• 5.2.10 Hydroxid sodný, 1 mol/l

• 5.2.11 Kyselina chlorovodíková, 1 mol/l

• 5.2.12 Kyselina chlorovodíková, 0,002 mol/l

• 5.2.13 Roztok škrobu čerstvě připravený podle European Pharmacopoeia (viz 4.2.8)

• 5.2.14 Odměrný roztok jodu, 0,05 mol/l

• 5.2.15 Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1 mol/l

• 5.2.16 Mobilní fáze:

Vodný roztok hydrogenfosforečnanu sodného (5.2.5), 0,006 mol/l, upravený na pH 2,1 kyselinou trihydrogenfosforečnou (5.2.6)

• 5.2.17 Činidlo do reaktoru za kolonou:

V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí:

— 62,5 g octanu amonného (5.2.2),

— 7,5 ml kyseliny octové (5.2.3),

— 5 ml pentan-2,4-dionu (5.2.4).

Objem se doplní po rysku vodou (5.2.1).

Roztok se uchovává ve tmě.

Skladovatelnost: nejvýše tři dny při 25 °C.

Barva roztoku by se neměla měnit.

• 5.2.18 Standardní roztok formaldehydu: zásobní roztok

10 g roztoku formaldehydu (5.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.

Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:

Odebere se 5,00 ml; přidá se 25,00 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (5.2.10).

Nechá se stát 5 minut.

Okyselí se 11,00 ml HCl (5.2.11) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (5.2.15), jako indikátor se použije roztok škrobu (5.2.13).

Spotřeba 1 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) odpovídá 1,5 mg formaldehydu.

• 5.2.19 Standardní roztok formaldehydu: zředěný roztok

Zásobní roztok formaldehydu se zředí v poměru 1/100 mobilní fází (5.2.16). 1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 37 μg formaldehydu. Přesný obsah se vypočte.

• 5.3 Přístroje a pomůcky

• 5.3.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.3.2 Bezpulzní čerpadlo pro HPLC

• 5.3.3 Nízkotlaké bezpulzní čerpadlo pro činidlo (případně druhé čerpadlo pro HPLC)

• 5.3.4 Nastřikovací ventil se smyčkou o objemu 10 μl

• 5.3.5 Reaktor za kolonou obsahující následující prvky:

• jednolitrová tříhrdlá baňka,

• jednolitrové topné hnízdo,

• dvě kolony Vigreux o minimálně 10 patrech, vzduchem chlazené,

• trubice z nerezové oceli (sloužící jako výměník tepla) 1,6 mm, vnitřní průměr 0,23 mm, délka 400 mm,

• teflonová trubice 1,6 mm, vnitřní průměr 0,23 mm, délka 5 m (francouzské pletivo – viz příloha 1),

• jeden díl ve tvaru T bez mrtvého objemu (Valco nebo ekvivalentní),

• tři spojky bez mrtvého objemu,

nebo: jeden modul za kolonou Applied Biosystems PCRS 520 nebo ekvivalentní s reaktorem o objemu 1 ml.

• 5.3.6 Membránový filtr, velikost pórů 0,45 μm

• 5.3.7 Patrona SEP-PAK® C18 nebo ekvivalentní

• 5.3.8 Hotové kolony:

— Bischoff Hypersil RP 18 (typ NC číslo C 25.46 1805), (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm),

— nebo DuPont, Zorbax ODS (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm),

— nebo Phase SEP, spherisorb ODS 2 (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm).

• 5.3.9 Předkolona

Bischoff K1 hypersil RP 18 (typ K1 G 6301 1805) (5 μm, délka 10 mm) nebo ekvivalentní.

• 5.3.10 Kolona a předkolona se spojí systémem Ecotube (typ A 15020508 Bischoff) nebo ekvivalentním.

• 5.3.11 Aparatura (5.3.3) se sestaví podle blokového schématu v příloze 2.

Spoje za nastřikovacím ventilem musí být co nejkratší. V tomto případě má trubka z nerezové oceli mezi výstupem z reaktoru a vstupem do detektoru ochladit směs před detekcí; teplota detektoru není známa, ale je konstantní.

• 5.3.12 Detektor pro viditelnou a UV oblast

• 5.3.13 Zapisovač

• 5.3.14 Odstředivka

• 5.3.15 Ultrazvuková lázeň

• 5.3.16 Vibrační míchadlo (Vortex nebo ekvivalentní)

• 5.4 Postup

• 5.4.1 Kalibrační křivka

Sestrojí se vynesením výšek píků jako funkce koncentrace zředěných formaldehydových kalibračních roztoků.

Kalibrační roztoky se připraví zředěním standardního roztoku formaldehydu (5.2.19) mobilní fází (5.2.16):

— 1,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 185 μg/100 ml)

— 2,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 370 μg/100 ml)

— 5,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 25,00 ml (asi 740 μg/100 ml)

— 5,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 925 μg/100 ml).

Kalibrační roztoky se ponechají asi jednu hodinu stát při pokojové teplotě a musí být čerstvě připraveny. Kalibrační křivka je lineární pro koncentrace od 1,00 do 15,00 μg/ml.

• 5.4.2 Příprava vzorků

• 5.4.2.1 Emulze (krémy, make-up, oční stíny)

Do odměrné baňky na 100 ml s uzávěrem se s přesností na 0,001 g naváží zkušební vzorek (m gramů) odpovídající očekávanému obsahu 100 μg formaldehydu. Přidá se přesně 20,00 ml dichlormethanu (5.2.8) a 20,00 ml kyseliny chlorovodíkové (5.2.12). Promíchá se pomocí vibračního míchadla (5.3.16) a v ultrazvukové lázni (5.3.15). Fáze se oddělí odstředěním (2 minuty při 3000 g). Mezitím se promyje patrona (5.3.7) 2 ml methanolu (5.2.7) a kondicionuje se 5 ml vody (5.2.1). Kondicionovanou patronou se nechají protéci 4 ml vodné fáze extraktu, první dva mililitry se odstraní a následující podíl se zachytí.

• 5.4.2.2 Pleťové lotiony, šampony

Do odměrné baňky na 100 ml s uzávěrem se s přesností na 0,001 g naváží zkušební vzorek (m gramů) odpovídající očekávanému obsahu 500 μg formaldehydu.

Doplní se po rysku mobilní fází (5.2.16).

Roztok se zfiltruje přes filtr (5.3.6) a nastříkne, nebo se nechá protéci patronou předem kondicionovanou podle bodu 5.4.2.1. Všechny roztoky musí být nastříknuty ihned po přípravě.

• 5.4.3 Chromatografické podmínky

— Průtok mobilní fáze: 1,0 ml/min,

— Průtok činidla: 0,5 ml/min,

— Celkový průtok na výstupu z detektoru: 1,5 ml/min,

— Objem nástřiku: 10 μl,

— Eluční teplota: u obtížných separací se kolona ponoří do ledové lázně a vyčká se do ustálení teploty (15 až 20 minut),

— Teplota reakce za kolonou: 100 °C,

— Detekce: při 420 nm.

Poznámka: Celý chromatografický systém a systém za kolonou je nutno po použití propláchnout vodou (5.2.1). Nepoužije-li se systém do dvou dnů, musí po tomto proplachu následovat ještě propláchnutí methanolem (5.2.7). Před novým kondicionováním se systémem nechá protéci voda, aby se zabránilo rekrystalizaci.

• 5.5 Výpočet

Emulze: (5.4.2.1):

Obsah formaldehydu v % (m/m):

C·10-6·1005 m=C·10-45m

Pleťové lotiony a šampony:

V tomto případě platí vzorec:

C·10-6·100 m=C·10-4m

kde

m = hmotnost analyzovaného vzorku v g (5.4.2.1),

C = koncentrace formaldehydu v μg/100 ml odečtená z kalibrační křivky (5.4.1).

• 5.6 Opakovatelnost

Pro výrobky obsahující asi 0,05 % (m/m) formaldehydu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,001 %.

Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) formaldehydu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.

Příloha 1

POKYNY PRO ZHOTOVENÍ „FRANCOUZSKÉHO PLETIVA“

NEZBYTNÉ PŘÍSLUŠENSTVÍ

— Dřevěná navíjecí cívka:

vnější průměr 5 cm s otvorem o průměru 1,5 cm uprostřed. Cívka se opatří čtyřmi ocelovými hřebíky (podle obrázků 7 a 8). Vzdálenost mezi dvěma hřebíky musí být 1,8 cm a musí být ve vzdálenosti 0,5 cm od středového otvoru;

— jedna pevná zahnutá jehla (háček) k protahování teflonové kapiláry;

— 5 m teflonové kapiláry o průměru 1,6 mm, vnitřního průměru 0,3 mm.

POSTUP:

Před zhotovením „francouzského pletiva“ musí být teflonová kapilára protažena středovým otvorem od horního konce cívky k dolnímu konci (asi 10 cm kapiláry se nechá vyčnívat z dolního konce cívky, což umožní protáhnout řetízek během pletení); poté se kapilára ovine kolem čtyř hřebíků, jak je znázorněno na obrázku 9.

Horní a dolní část pletiva bude chráněna kovovými kroužky a stahovacími šrouby; při utahování je třeba dbát na to, aby se teflon nepoškodil. Kapilára se podruhé ovine kolem každého hřebíku a následujícím způsobem se vytvoří „steh“:

— spodní část kapiláry se háčkem přetáhne přes horní část kapiláry (obrázek 10). Toto se postupně opakuje u každého hřebíku (1, 2, 3 a 4 proti směru hodinových ručiček), dokud se nezhotoví 5 m nebo požadovaná délka pletiva.

Je nutno ponechat asi 10 cm kapiláry k uzavření řetízku. Kapilára se provlékne každou ze čtyř smyček a lehce se utáhne tak, aby se řetízek uzavřel.

Poznámka: Francouzské pletivo pro reaktory za kolonou je komerčně dostupné (Supelco).

[image omitted]

Obrázek 7

Schématické vyobrazení cívky

[image omitted]

Obrázek 8

[image omitted]

Obrázek 9

První řada

[image omitted]

Obrázek 10

Druhá řada

„Steh“ se vytvoří tak, že se spodní kapilára (znázorněná plnou čarou) přetáhne přes druhou kapiláru (znázorněná čárkovaně)

[image omitted]

Obrázek 11

Příloha 2

1	= čerpadlo pro HPLC
2	= nastřikovací ventil
3	= kolona s předkolonou
4	= čerpadlo pro činidla
5	= díl ve tvaru T bez mrtvého objemu
5'	= díl ve tvaru T (Vortex)
6 - 6'	= spojka bez mrtvého objemu
7	=„francouzské pletivo“
7	= reaktor
8	= tříhrdlá baňka s vroucí vodou
9	= topné hnízdo
10	= chladič
11	= výměník tepla z nerezové trubky
11'	= výměník tepla
12	= detektor pro viditelnou a UV oblast
13	= modul za kolonou PCRS 520

• 1.

[image omitted]

• 2.

[image omitted]

• 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ DICHLORMETHANU A 1,1,1-TRICHLORETHANU

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení dichlormethanu (methylenchloridu) a 1,1,1-trichlorethanu (methylchloroformu) ve všech kosmetických prostředcích, které by mohly obsahovat tato rozpouštědla.

• 1. DEFINICE

Obsah dichlormethanu a 1,1,1-trichlorethanu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.

• 1. PRINCIP

Tato metoda využívá plynové chromatografie s chloroformem jako vnitřním standardem.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.1 Chloroform (CHCl3)

• 4.2 Tetrachlormethan (CCl4)

• 4.3 Dichlormethan (CH2Cl2)

• 4.4 1,1,1-Trichlorethan (CH3CCl3)

• 4.5 Aceton

• 4.6 Dusík

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 5.1 Obvyklé laboratorní zařízení

• 5.2 Plynový chromatograf vybavený tepelně vodivostním detektorem.

• 5.3 Láhev na převedení vzorku na 50 až 100 ml (viz kapitola „Příprava vzorků v laboratoři“)

• 5.4 Tlaková injekční stříkačka, na 25 nebo 50 μl (viz kapitola „Příprava vzorků v laboratoři“)

• 1. POSTUP

• 6.1 Vzorek bez přetlaku: vzorek se přesně naváží do Erlenmeyerovy baňky se zátkou. Přidá se přesně zvážené množství chloroformu (4.1) jako vnitřní standard, odpovídající předpokládanému množství dichlormethanu a 1,1,1-trichlorethanu obsaženému ve vzorku. Důkladně se promíchá.

• 6.2 Vzorek v obalu na aerosoly: Použije se postup odběru vzorků, popsaný v kapitole „Příprava vzorků v laboratoři“, avšak s následujícími úpravami:

• 6.2.1 Po převedení vzorku do lahve (5.3) se dále do lahve přidá jako vnitřní standard objem chloroformu (4.1), odpovídající předpokládanému množství dichlormethanu a/nebo 1,1,1-trichlorethanu obsaženému ve vzorku. Důkladně se promíchá. Mrtvý objem ventilu se vypláchne 0,5 ml tetrachlormethanu (4.2). Po vysušení se z rozdílu přesně stanoví přidaná hmotnost vnitřního standardu.

• 6.2.2 Po naplnění stříkačky vzorkem by se měla špička stříkačky vypláchnout dusíkem (4.6), aby v ní nezůstal před vstříknutím do chromatografu žádný zbytek vzorku.

• 6.2.3 Po odebrání každého vzorku by se měl povrch ventilu a spojky několikrát opláchnut acetonem (4.5) (v případě potřeby se použije injekční stříkačka) a poté důkladně vysušit dusíkem (4.6).

• 6.2.4 Při každé analýze se pro měření použijí dvě různé lahve pro převádění vzorku a pro každou láhev se provede pět měření.

• 1. CHROMATOGRAFICKÉ PODMÍNKY

• 7.1 Předkolona

Materiál kolony:	nerezová ocel.
Délka:	300 mm.
Průměr:	3 nebo 6 mm.
Náplň:	stejný materiál jako u analytické kolony.

• 7.2 Kolona

Stacionární fáze je připravena z Hallcomidu M 18 na chromosorbu. Kolona musí poskytovat rozlišení „R“ rovné nebo lepší než 1,5, kde:

R = 2 d'r2 – r1W1 + W2

kde:

r1 a r2 =	retenční časy dvou píků (v min.),
W1 a W2 -	šířky píkůu v polovině výšky píků(v mm),
d' =	rychlost posuvu papíru (v mm/min.).

• 7.3 Jako příklady jsou uvedeny kolony, které poskytují hledané výsledky:

Kolona	I	II
Materiál kolony:	nerezová ocel	nerezová ocel
Délka:	350 cm	400 cm
Průměr:	3 mm	6 mm
Náplň:
chromosorb:	WAW	WAW-DMCS-HP
zrnitost:	100 až 120 mesh	60 až 80 mesh
Stacionární fáze:	Hallcomid M 18, 10 %	Hallcomid M 18, 20%

Teplotní podmínky se mohou měnit v závislosti na přístroji. V příkladech byly nastaveny takto:

Kolona	I	II
Teploty:
kolona:	65 °C	75 °C
nástřik:	150 °C	125 °C
detektor:	150 °C	200 °C
Nosný plyn:
průtok helia:	45 ml/min	60 ml/min
vstupní tlak:	2,5 bar	2,0 bar
Nástřik:	15 μl	15 μl

• 1. SMĚS PRO STANOVENÍ FAKTORŮ ODEZVY

Do Erlenmeyerovy baňky se zátkou se přesně naváží směs:

Dichlormethan (4.3), 30% (m/m),

1,1,1-trichlorethan (4.4), 35% (m/m),

Chloroform (4.1), 35% (m/m).

• 1. VÝPOČTY

• 9.1 Výpočet koeficientu úměrnosti látky „p“ vzhledem k látce „a“ vybrané jako vnitřní standard

Označí-li se první látka jako „p“, tak je

kp =	její koeficient úměrnosti,
mp =	její hmotnost ve směsi,
Ap =	její plocha píku.

Označí-li se druhá látka jako „a“, tak je

ka = její koeficient úměrnosti (=1),

Ma = její hmotnost ve směsi,

Aa = její plocha píku,

potom

kp = mp × AaMa × Ap

Byly získány například následující koeficienty úměrnosti (pro chloroform: k = 1):

Dichlormethan:	k1 = 0,78 ± 0,03
1,1,1-trichlorethan:	k2 = 1,00 ± 0,03

• 9.2 Výpočet % (m/m) dichlormethanu a 1,1,1-trichlorethanu přítomného ve vzorku, který má být analyzován

Označí-li se:

ma =	hmotnost použitého chloroformu (v g),
Ms =	hmotnost vzorku k analýze (v g),
Aa =	plocha píku chloroformu,
A1 =	plocha píku dichlormethanu,
A2 =	plocha píku 1,1,1 -trichlorethanu,

potom

% m/m CH2Cl2 = ma × A1 × k1 × 100Aa × Ms

% m/m CH3CCl3 = ma × A2 × k2 × 100Aa × Ms

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující asi 25 % (m/m) dichlormethanu a 1,1,1-trichlorethanu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 2,5 %.

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ CHINOLIN-8-OLU A BIS(CHINOLIN-8-OL)-SULFÁTU

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje kvalitativní a kvantitativní stanovení chinolin-8-olu a jeho sulfátu.

• 1. DEFINICE

Obsah chinolin-8-olu a bis(chinolin-8-ol)-sulfátu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech chinolin-8-olu.

• 1. PRINCIP

• 3.1 Kvalitativní stanovení

Ke kvalitativnímu stanovení se využívá chromatografie na tenké vrstvě.

• 3.2 Kvantitativní stanovení

Kvantitativní stanovení se provede pomocí spektrofotometrie komplexu vzniklého reakcí s Fehlingovým roztokem při 410 nm.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.1 Chinolin-8-ol

• 4.2 Benzen. Vzhledem k jeho toxicitě je třeba s benzenem pracovat opatrně.

• 4.3 Chloroform

• 4.4 Vodný roztok hydroxidu sodného, 50% roztok (m/m)

• 4.5 Síran měďnatý pentahydrát

• 4.6 Vinan draselno-sodný

• 4.7 Kyselina chlorovodíková, 1M

• 4.8 Kyselina sírová, 0,5M

• 4.9 Roztok hydroxidu sodného, 1M.

• 4.10 Ethanol

• 4.11 Butan-1-ol

• 4.12 Ledová kyselina octová

• 4.13 Kyselina chlorovodíková, 0,1M

• 4.14 „Celit 545“ nebo ekvivalent

• 4.15 Standardní roztoky

• 4.15.1 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 100 mg chinolin-8-olu (4.1). Rozpustí se v malém množství kyseliny sírové (4.8). Doplní se kyselinou sírovou (4.8) po rysku.

• 4.15.2 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 100 mg chinolin-8-olu. Rozpustí se v ethanolu (4.10). Doplní se po rysku ethanolem (4.10) a promíchá.

• 4.16 Fehlingův roztok

Roztok A

Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 7 g síranu měďnatého pentahydrátu (4.5). Rozpustí se v malém množství vody. Doplní se po rysku vodou a promíchá.

Roztok B

Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 35 g vinanu draselného-sodného (4.6). Rozpustí se v 50 ml vody. Přidá se 20 ml hydroxidu sodného (4.4). Doplní se po rysku vodou a promíchá. Bezprostředně před použitím se do odměrné baňky na 100 ml odpipetuje 10 ml roztoku A a 10 ml roztoku B. Doplní se po rysku a promíchá.

• 4.17 Vyvíjecí rozpouštědla pro chromatografii na tenké vrstvě

I: Butan-1-ol (4.11)/kyselina octová (4.12)/voda (80:20:20, V/V/V).

II: Chloroform (4.13)/kyselina octová (4.12) (95:5, V/V).

• 4.18 2,6-dichlor-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienon, 1% (m/V) roztok v ethanolu (4.10)

• 4.19 Uhličitan sodný, 1% (m/V) roztok ve vodě

• 4.20 Ethanol (4.10), 30% (V/V) roztok ve vodě

• 4.21 Dinatrium-dihydrogen-ethylendiamintetraacetát, 5% (m/V) roztok ve vodě

• 4.22 Tlumivý roztok, pH 7

Do odměrné baňky na 1 litr se naváží 27 g bezvodého dihydrogenfosforečnanu draselného a 70 g hydrogenfosforečnanu didraselného trihydrátu. Doplní se vodou po rysku.

• 4.23 Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě

Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě o tloušťce 0,25 mm (např. Merck Kieselgel 60 nebo ekvivalentní). Před použitím se deska postříká 10 ml činidla (4.21) a usuší se při 80 °C.

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 5.1 Baňka se zábrusem na 100 ml s kulatým dnem

• 5.2 Odměrné baňky

• 5.3 Dělené pipety na 10 a 5 ml

• 5.4 Nedělené pipety na 20, 15, 10 a 5 ml

• 5.5 Dělicí nálevky na 100, 50 a 25 ml

• 5.6 Skládaný papírový filtr, průměr 90 mm

• 5.7 Rotační odparka

• 5.8 Zpětný chladič se zábrusem

• 5.9 Spektrofotometr

• 5.10 Kyvety s optickou dráhou o délce 10 mm

• 5.11 Míchačka s vyhříváním

• 5.12 Skleněná chromatografická kolona o těchto rozměrech: 160 mm dlouhá s průměrem 8 mm, na spodním, zúženém konci se zátkou ze skelné vaty, a s nástavcem pro aplikaci tlaku na horním konci.

• 1. POSTUP

• 6.1 Kvalitativní stanovení

• 6.1.1 Kapalné vzorky

• 6.1.1.1 U části testovaného vzorku se upraví pH na 7,5 a 10 μl se nanese na startovací linii předem upravené silikagelové desky pro chromatografii na tenké vrstvě (4.23).

• 6.1.1.2 Do dvou dalších bodů startovací linie se nanese 10 a 30 μl standardního roztoku (4.15.2), poté se chromatogram vyvíjí v jednom z vyvíjecích rozpouštědel (4.17).

• 6.1.1.3 Když čelo postoupí o 150 mm, deska se suší při 110 °C (15 minut). Pod UV lampou (366 nm) skvrny chinolin-8-olu žlutě fluoreskují.

• 6.1.1.4 Deska se postříká roztokem uhličitanu sodného (4.19). Usuší se a postříká se roztokem 2,6-dichlor-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu (4.18). Skvrny chinolin-8-olu se zbarví modře.

• 6.1.2 Pevné vzorky nebo krémy

• 6.1.2.1 1 g vzorku se rozptýlí v 5 ml tlumivýho roztoku (4.22). Potom se pomocí 10 ml chloroformu (4.3) převede do dělicí nálevky a protřepe se. Po oddělení vrstvy chloroformu se vodná vrstva ještě dvakrát extrahuje 10 ml chloroformu (4.3). Spojené a přefiltrované chloroformové extrakty se v baňce s kulatým dnem na 100 ml (5.1) odpaří téměř do sucha na rotační odparce (5.7). Odparek se rozpustí ve 2 ml chloroformu (4.3) a 10 a 30 μl získaného roztoku se nanese na silikagelovou desku pro chromatografii na tenké vrstvě (4.23) podle postupu popsaného v bodě 6.1.1.1 a dále.

• 6.1.2.2 Na desku se nanese 10 a 30 μl standardního roztoku (4.15.2) a pokračuje se podle postupu popsaného v bodech 6.1.1.2 až 6.1.1.4.

• 6.2 Kvantitativní stanovení

• 6.2.1 Kapalné vzorky

• 6.2.1.1 Do baňky s kulatým dnem se naváží 5 g vzorku. Přidá se 1 ml roztoku kyseliny sírové (4.8) a směs se odpaří téměř do sucha za sníženého tlaku při teplotě 50 °C.

• 6.2.1.2 Tento zbytek se rozpustí ve 20 ml teplé vody. Převede se do odměrné baňky na 100 ml. Vypláchne se třikrát 20 ml vody. Doplní se na 100 ml vodou a promíchá.

• 6.2.1.3 5 ml tohoto roztoku se odpipetuje do dělicí nálevky na 50 ml (5.5). Přidá se 10 ml Fehlingova roztoku (4.16). Měďnatý komplex chinolin-8-olu se třikrát extrahuje 8 ml chloroformu (4.3).

• 6.2.1.4 Chloroformové vrstvy se zfiltrují a shromáždí v odměrné baňce na 25 ml (5.2). Doplní se po rysku chloroformem (4.3) a protřepou se. Absorbance žlutého roztoku se měří při 410 nm proti chloroformu.

• 6.2.2 Pevné vzorky a krémy

• 6.2.2.1 Do baňky na 100 ml s kulatým dnem (5.1) se naváží 0,500 g vzorku. Přidá se 30 ml benzenu (4.2) a 20 ml kyseliny chlorovodíkové (4.7). Roztok se za míchání 30 minut vaří pod zpětným chladičem.

• 6.2.2.2 Obsah se převede do dělicí nálevky na 100 ml (5.5). Vypláchne se 5 ml 1 mol/l HCl (4.7). Vodná fáze se převede do baňky s kulatým dnem (5.1), benzenová fáze se promyje 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.7).

• 6.2.2.3 V případě emulzí, které brání dalšímu postupu, se smísí 0,500 g vzorku s 2 g Celitu 545 (4.14), čímž vznikne sypký prášek. Směs se v malých dávkách převede do skleněné chromatografické kolony (5.12).

Po každém přídavku se náplň kolony stlačí. Jakmile se celý vzorek převede do kolony, eluuje se kyselinou chlorovodíkovou (4.13) takovým způsobem, aby se získalo 10 ml eluátu asi za 10 minut (pokud je to nutné, eluce může probíhat za mírného přetlaku dusíku). Během eluce je třeba zajistit, aby nad vrstvou náplně kolony bylo stále trochu kyseliny chlorovodíkové. Prvních 10 ml eluátu se podrobí dalšímu postupu popsanému v bodě 6.2.2.4.

• 6.2.2.4 Spojené vodné fáze (6.2.2.2) nebo eluát z kolony (6.2.2.3) se v rotační odparce za sníženého tlaku odpaří téměř do sucha.

• 6.2.2.5 Zbytek se rozpustí v 6 ml roztoku hydroxidu sodného (4.9). Přidá se 20 ml Fehlingova roztoku (4.16) a obsah se převede do dělicí nálevky na 50 ml (5.5). Baňka se vypláchne 8 ml chloroformu (4.3). Protřepe se a chloroformová fáze se zfiltruje do odměrné baňky na 50 ml (5.2).

• 6.2.2.6 Extrakce s 8 ml chloroformu (4.3) se třikrát opakuje. Chloroformové fáze se shromáždí v odměrné baňce na 50 ml. Doplní se po rysku chloroformem (4.3) a protřepou. Měří se absorbance žlutého roztoku při 410 nm proti chloroformu (4.3).

• 1. KALIBRAČNÍ KŘIVKA

Do čtyř baněk na 100 ml s kulatým dnem (5.1), z nichž každá obsahuje 3 ml 30% vodného roztoku ethanolu (4.20), se odpipetuje 5, 10, 15 a 20 ml standardního roztoku (4.15.1), což odpovídá 5, 10, 15 a 20 mg chinolin-8-olu. Pokračuje se tak, jak je popsáno v bodě 6.2.1.

• 1. VÝPOČET

• 8.1 Kapalné vzorky

Obsah chinolin-8-olu (v % (m/m)) = am × 100

kde:

a = množství chinolin-8-olu odečtené z kalibrační křivky (7) v mg,

m = hmotnost (v mg) zkušebního vzorku (6.2.1.1).

• 8.2 Pevné vzorky nebo krémy

Obsah chinolin-8-olu (v % (m/m)) = 2 am × 100

kde:

a = množství chinolin-8-olu odečtené z kalibrační křivky (7) v mg,

m = hmotnost (v mg) zkušebního vzorku (6.2.1.1).

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující asi 0,3 % (m/m) chinolin-8-olu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,02 %.

• 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ AMONIAKU

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

V této metodě je popsáno stanovení volného amoniaku v kosmetických prostředcích.

• 1. DEFINICE

Obsah amoniaku ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech amoniaku.

• 1. PRINCIP

Ke zkušebnímu vzorku kosmetického prostředku zředěného vodným

roztokem methanolu se přidá roztok chloridu barnatého. Případná sraženina se odfiltruje nebo odstředí. Tímto postupem se zabrání ztrátám amoniaku, ke kterým dochází při destilaci s vodní parou u některých amonných solí, jako je uhličitan a hydrogenuhličitan a soli mastných kyselin, s výjimkou octanu amonného.

Z filtrátu nebo supernatantu se amoniak oddestiluje s vodní parou a stanoví se potenciometrickou nebo jinou titrací.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.1 Methanol

• 4.2 Chlorid barnatý dihydrát, 25 % roztok (m/V)

• 4.3 Kyselina trihydrogenboritá, 4 % roztok (m/V)

• 4.4 Kyselina sírová, 0,25 mol/l odměrný roztok

• 4.5 Kapalný odpěňovač

• 4.6 Hydroxid sodný, 0,5 mol/l odměrný roztok

• 4.7 Indikátor, podle potřeby: smísí se 5 ml 0,1% roztoku (m/V) methylové červeně v ethanolu s 2 ml 0,1% roztoku (m/V) methylenové modři ve vodě.

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.2 Odstředivka s uzavíratelnými kyvetami na 100 ml

• 5.3 Přístroj na destilaci s vodní parou

• 5.4 Potenciometr

• 5.5 Měrná skleněná elektroda a referentní kalomelová elektroda.

• 1. POSTUP

• 6.1 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží vzorek o hmotnosti (m) odpovídající maximálně 150 mg amoniaku.

• 6.2 Přidá se 10 ml vody, 10 ml methanolu (4.1) a 10 ml roztoku chloridu barnatého (4.2). Doplní se na 100 ml methanolem (4.1).

• 6.3 Roztok se promíchá a nechá stát přes noc v lednici (5 °C).

• 6.4 Poté se chladný roztok zfiltruje nebo odstředí 10 minut v uzavřených kyvetách, aby se získal čirý filtrát nebo vrstva supernatantu.

• 6.5 40 ml tohoto čirého roztoku se odpipetuje do přístroje na destilaci s vodní parou (5.3) a eventuelně se přidá 0,5 ml kapalného odpěňovače (4.5).

• 6.6 Destiluje se a 200 ml destilátu jímá se do kádinky na 250 ml obsahující 10 ml odměrného roztoku kyseliny sírové (4.4) a 0,1 ml indikátoru (4.7).

• 6.7 Nadbytek kyseliny se zpětně titruje odměrným roztokem hydroxidu sodného (4.6).

• 6.8 Poznámka: Pro potenciometrické stanovení se jímá 200 ml destilátu do kádinky na 250 ml obsahující 25 ml roztoku trihydrogenborité kyseliny (4.3) a titruje se odměrným roztokem kyseliny sírové (4.4), zaznamená se neutralizační křivka.

• 1. VÝPOČTY

• 7.1 Výpočet v případě zpětné titrace

Označí-li se

V1 =	objem použitého roztoku hydroxidu sodného (4.6) (v ml),
M1 =	skutečná koncentrace roztoku hydroxidu sodného (4.6),
M2 =	skutečná koncentrace roztoku kyseliny sírové (4.4),
m =	hmotnost odebraného zkušebního vzorku (6.1) (v mg),

potom:

%amoniaku m/m = 20 M2 - V1 M1 × 17 × 1000,4 m = 20 M2 - V1 M1 × 4250m

• 7.2 Výpočet v případě přímé potenciometrické titrace

Označí-li se

V2 =	objem použitého roztoku kyseliny sírové (4.4) (v ml),
M2 =	skutečná koncentrace roztoku kyseliny sírové (4.4),
m =	hmotnost odebraného zkušebního vzorku (6.1) (v mg),

potom:

amoniak % m/m = V2 × M2 × 17 × 1000,4 m = 4250 V2 M2m

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující asi 6 % (m/m) amoniaku nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,6 %.

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ NITROMETHANU

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda je vhodná pro kvalitativní a kvantitativní stanovení nitromethanu až do obsahu asi 0,3 % v kosmetických prostředcích v obalech na aerosoly.

• 1. DEFINICE

Obsah nitromethanu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjadřuje v hmotnostních procentech nitromethanu, vztažených na celkový obsah aerosolového prostředku.

• 1. PODSTATA METODY

Nitromethan se kvalitativně stanoví na základě barevné reakce. Nitromethan se kvantitativně stanoví plynovou chromatografií po přidání vnitřního standardu.

• 1. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

• 4.1 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.1.1 Hydroxid sodný, 0,5 mol/l roztok

• 4.1.2 Folinovo činidlo

Ve vodě se rozpustí 0,1 g 3,4-dihydro-3,4-dioxonaftalen-1-sulfonátu sodného a doplní se na 100 ml.

• 4.2 Postup

K 1 ml vzorku se přidá 10 ml roztoku 4.1.1 a 1 ml roztoku 4.1.2. Fialové zbarvení indikuje přítomnost nitromethanu.

• 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

• 5.1 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 5.1.1 Chloroform (vnitřní standard 1)

• 5.1.2 2,3-Dimethylheptan (vnitřní standard 2)

• 5.1.3 Ethanol, 95 %

• 5.1.4 Nitromethan

• 5.1.5 Referenční roztok chloroformu

Do vytárované odměrné baňky na 25 ml se přidá asi 650 mg chloroformu (5.1.1). Baňka a obsah se znovu přesně zváží. Doplní se na 25 ml 95% ethanolem (5.1.3). Zváží se a vypočtou se hmotnostní procenta chloroformu v tomto roztoku.

• 5.1.6 Referenční roztok 2,4-dimethylheptanu

Připraví se obdobně jako referenční roztok chloroformu, ale naváží se 270 mg 2,4-dimethylheptanu (5.1.2) do odměrné baňky na 25 ml.

• 5.2 Přístroje a pomůcky

• 5.2.1 Plynový chromatograf s plamenovým ionizačním detektorem

• 5.2.2 Pomůcky pro odběr vzorků aerosolů (láhev pro převedení vzorku, spojky, mikrostříkačky, atd.), jak jsou popsány v kapitole „Příprava vzorků v laboratoři“.

• 5.2.3 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.3 Postup

• 5.3.1 Příprava vzorku

Do vytárované lahve na převedení vzorku na 100 ml, propláchnuté nebo evakuované podle postupu popsaného v bodě 5.4 kapitoly „Příprava vzorků v laboratoři“, se přidá asi 5 ml jednoho z roztoků vnitřních standardů (5.1.5 nebo 5.1.6). Použije se 10 ml nebo 20 ml skleněná stříkačka bez jehly uzpůsobená k připojení ke spojce podle postupu popsaného v bodě 5 kapitoly „Příprava vzorků v laboratoři“. Znovu se zváží, aby se stanovilo přidané množství. Stejným postupem se do této lahve převede asi 50 g obsahu aerosolového prostředku. Znovu se zváží, aby se stanovilo množství převedeného vzorku. Dobře se promíchá.

Nastřikuje se asi 10 μl pomocí speciální mikrostříkačky (5.2.2). Provádí se pět nástřiků.

• 5.3.2 Příprava standardu

Do odměrné baňky na 50 ml se naváží asi 500 mg nitromethanu přesně (5.1.4) a buď 500 mg chloroformu (5.1.1), nebo 210 mg 2,4-dimethylheptanu (5.1.2). Doplní se na objem 95% ethanolem (5.1.3). Dobře se promíchá. 5 ml tohoto roztoku se převede do odměrné baňky na 20 ml. Doplní se na objem 95% ethanolem (5.1.3).

Nastřikuje se asi 10 μl pomocí speciální mikrostříkačky (5.2.2). Provádí se pět nástřiků.

• 5.3.3 Podmínky plynové chromatografie

• 5.3.3.1 Kolona

Skládá se ze dvou částí; první obsahuje jako náplň didecylftalát na Gas Chromu Q, druhá UCON 50 HB 280X na Gas Chromu Q. Připravená kombinovaná kolona musí zaručit rozlišení „R“ rovné nebo lepší než 1,5, kde:

R = 2 d' r2 - r1W1 + W2

kde

r1 a r2 =	retenční časy dvou píků v min.,
W1 a W2 =	šířka píků v polovině výšky píků (v mm),
d'=	rychlost posuvu papíru (v mm/min.).

Kolona A:

Materiál: nerezová ocel.

Délka: 1,5 m.

Průměr: 3 mm.

Náplň: 20% didecylftalát na Gas Chromu Q (100 až 120 mesh).

Kolona B:

Materiál: nerezová ocel.

Délka: 1,5 m.

Průměr: 3 mm.

Náplň: 20% UCON 50 HB 280X na Gas Chromu Q (100 až 120 mesh).

• 5.3.3.2 Detektor

Vhodné nastavení citlivosti elektrometru plamenového ionizačního detektoru je 8 x 10^-10 A.

• 5.3.3.3 Teplotní podmínky

Jako vhodné se ukázaly následující podmínky:

Nástřik: 150 °C

Detektor: 150 °C

Kolona: mezi 50 a 80 °C, v závislosti na použitých kolonách a přístroji.

• 5.3.3.4 Plyny

Nosný plyn: dusík.

Tlak: 2,1 bar.

Průtok: 40 ml/min.

Plyny pro detektor: podle specifikací výrobce detektoru.

• 1. VÝPOČTY

• 6.1 Koeficient úměrnosti nitromethanu vypočtený vzhledem k použitému vnitřnímu standardu

Označí-li se nitromethan jako „n“,

přičemž

kn =	jeho koeficient úměrnosti,
m'n =	jeho hmotnost ve směsi (v gramech),
S'n =	plocha jeho píku,

a označí-li se vnitřní standard, chloroform nebo 2,4-dimethylheptan, jako „c“,

přičemž

m'c = jeho hmotnost ve směsi (v g),

S'c = plocha jeho píku,

potom:

kn = m'nm'c × S'cS'n

(kn je funkcí přístroje).

• 6.2 Koncentrace nitromethanu ve vzorku

Označí-li se nitromethan jako „n“,

přičemž

kn =	jeho koeficient úměrnosti,
S'n =	plocha jeho píku,

a označí-li se vnitřní standard, chloroform nebo 2,4-dimethylheptan, jako „c“,

přičemž

mc =	jeho hmotnost ve směsi (v g),
Sc =	plocha jeho píku,
M =	hmotnost převedeného aerosolového prostředku (v g),

potom % (m/m) nitromethanu ve vzorku je

mcM × kn × SnSc × 100

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující asi 0,3 % (m/m) nitromethanu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,03 %.

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY THIOGLYKOLOVÉ (SULFANYLOCTOVÉ) V PROSTŘEDCÍCH K TRVALÉ ONDULACI, K ROVNÁNÍ VLASŮ A V PROSTŘEDCÍCH K DEPILACI

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

V této metodě je popsáno kvalitativní a kvantitativní stanovení kyseliny thioglykolové v prostředcích k trvalé ondulaci, k rovnání vlasů a v prostředcích k depilaci.

• 1. DEFINICE

Obsah thioglykolové kyseliny ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří ve hmotnostních procentech kyseliny thioglykolové.

• 1. PRINCIP

Kvalitativní stanovení kyseliny thioglykolové se provede buď barevnou reakcí, nebo pomocí chromatografie na tenké vrstvě, a kvantitativní stanovení se provede jodometricky nebo plynovou chromatografií.

• 1. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

• 4.1 Kvalitativní stanovení barevnou reakcí

• 4.1.1 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.1.1.1 Papírek s octanem olovnatým

• 4.1.1.2 Roztok kyseliny chlorovodíkové (1:1)

• 4.1.2 Postup

• 4.1.2.1 Kvalitativní stanovení kyseliny thioglykolové pomocí barevné reakce s papírkem s octanem olovnatým

Kapka vzorku se umístí na papírek s octanem olovnatým (4.1.1.1). Pokud se objeví intenzivní žluté zbarvení, je kyselina thioglykolová pravděpodobně přítomna.

Citlivost: 0,5 %.

• 4.1.2.2 Kvalitativní stanovení anorganických sulfidů vznikem sirovodíku po okyselení

Do zkumavky se převede několik miligramů analyzovaného vzorku. Přidají se 2 ml destilované vody a 1 ml kyseliny chlorovodíkové (4.1.1.2). Uvolní se sirovodík, který lze rozpoznat podle zápachu, a na papírku s octanem olovnatým (4.1.1.1) vzniká černá sraženina sulfidu olovnatého.

Citlivost: 50 ppm.

• 4.1.2.3 Kvalitativní stanovení siřičitanů vznikem oxidu siřičitého po okyselení

Postupuje se podle bodu 4.1.2.2. Obsah se přivede k varu. Oxid siřičitý lze rozpoznat podle jeho zápachu a jeho schopnosti redukovat například manganisté ionty.

• 4.2 Kvalitativní stanovení chromatografií na tenké vrstvě

• 4.2.1 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Není-li uvedeno jinak, použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.2.1.1 Kyselina thioglykolová, minimální čistota 98 %, stanovena jodometricky

• 4.2.1.2 2,2'-dithiodi(octová kyselina), minimální čistota 99 %, stanovena jodometricky

• 4.2.1.3 Kyselina 2-merkaptopropionová (thiomléčná kyselina), minimální čistota 95 %, stanovena jodometricky

• 4.2.1.4 Kyselina 3-merkaptopropionová, minimální čistota 98 %, stanovena jodometricky

• 4.2.1.5 3-merkaptopropan-1,2-diol (1-thioglycerol), minimální čistota 98 %, stanovena jodometricky

• 4.2.1.6 Hotové silikagelové desky pro chromatografii na tenké vrstvě o tloušťce 0,25 mm

• 4.2.1.7 Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě s oxidem hlinitým, Merck F 254 E nebo ekvivalentní

• 4.2.1.8 Kyselina chlorovodíková, koncentrovaná,(d420 = 1,19 g/ml)

• 4.2.1.9 Ethyl-acetát

• 4.2.1.10 Chloroform

• 4.2.1.11 Diisopropylether

• 4.2.1.12 Tetrachlormethan

• 4.2.1.13 Ledová kyselina octová

• 4.2.1.14 Jodid draselný, 1% roztok (m/V) ve vodě

• 4.2.1.15 Chlorid platičitý, 0,1% roztok (m/V) ve vodě

• 4.2.1.16 Mobilní fáze

• 4.2.1.16.1 Ethyl-acetát (4.2.1.9), chloroform (4.2.1.10), diisopropylether (4.2.1.11), kyselina octová (4.2.1.13) (20:20:10:10, V/V/V/V)

• 4.2.1.16.2 Chloroform (4.2.1.10), kyselina octová (4.2.1.13) (90:20, V/V)

• 4.2.1.17 Detekční činidla

• 4.2.1.17.1 Bezprostředně před použitím se smísí stejné objemy roztoku 4.2.1.14 a roztoku 4.2.1.15.

• 4.2.1.17.2 Roztok bromu, 5 % (m/V):

Rozpustí se 5 g bromu ve 100 ml tetrachlormethanu (4.2.1.12).

• 4.2.1.17.3 Roztok fluoresceinu, 0,1 % (m/V):

100 mg fluoresceinu se rozpustí ve 100 ml ethanolu.

• 4.2.1.17.4 Heptamolybdenan hexaamonný, 10% roztok (m/V) ve vodě.

• 4.2.1.18 Standardní roztoky

• 4.2.1.18.1 Kyselina thiglykolová (4.2.1.1), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.

• 4.2.1.18.2 2,2'-dithiodi(octová kyselina) (4.2.1.2), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.

• 4.2.1.18.3 Kyselina 2-merkaptopropionová (4.2.1.3), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.

• 4.2.1.18.4 Kyselina 3-merkaptopropionová (4.2.1.4), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.

• 4.2.1.18.5 3-merkaptopropan-1,2-diol (4.2.1.5), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.

• 4.2.2 Přístroje a pomůcky

Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě

• 4.2.3 Postup

• 4.2.3.1 Příprava vzorků

Vzorek se okyselí několika kapkami kyseliny chlorovodíkové (4.2.1.8) na pH 1 a v případě potřeby zfiltruje.

V některých případech může být účelné vzorek zředit. V tomto případě se okyselení kyselinou chlorovodíkovou provede před zředěním.

• 4.2.3.2 Vyvíjení

Na desku se nanese 1 μl roztoku vzorku (4.2.3.1) a 1 μl každého z pěti referenčních roztoků (4.2.1.18). Pečlivě se vysuší v mírném proudu dusíku a deska se vyvíjí rozpouštědly (4.2.1.16.1 nebo 4.2.1.16.2). Deska se usuší co nejrychleji pod dusíkem, aby nedošlo k oxidaci thiolů.

• 4.2.3.3 Detekce

Deska se postříká jedním ze tří činidel (4.2.1.17.1, 4.2.1.17.3 nebo 4.2.1.17.4). Pokud se deska postříká činidlem (4.2.1.17.3), vystaví se poté parám bromu (např. v nádobě obsahující malou kádinku činidla (4.2.1.17.2)), dokud se skvrny nezviditelní. Detekce postřikem činidlem (4.2.1.17.4) bude úspěšná jen tehdy, nepřekročí-li doba sušení desky 30 minut.

• 4.2.3.4 Interpretace

Hodnoty Rf a barvy referenčních roztoků se porovnají s roztoky vzorků. Průměrné hodnoty Rf uváděné dále jako hrubé vodítko slouží pouze pro srovnání. Závisí na:

— úrovni aktivace tenké vrstvy v době vyvíjení chromatogramu,

— teplotě ve vyvíjecí komoře.

Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě

	Vyvíjecí rozpouštědla
4.2.1.16.1	4.2.1.16.2
Kyselina thioglykolová	0,25	0,80
Kyselina 2-merkaptopropionová	0,40	0,95
2,2'-dithiodi(octová kyselina)	0,00	0,35
Kyselina 3-merkaptopropionová	0,45	0,95
3-merkaptopropan-1,2-diol	0,45	0,35

• 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

(Stanovení kyseliny thioglykolové se provádí s dosud nepoužitým výrobkem z čerstvě otevřeného obalu, aby se zamezilo oxidaci.)

Stanovení musí vždy začínat jodometrií.

• 5.1 Jodometrie

• 5.1.1 Princip

Stanovení se provádí oxidací skupiny „-SH“ jodem v kyselém prostředí podle rovnice:

2 HOOC − CH2SH + I2 → (HOOC − CH2 − S)2 + 2I^- + 2H^+

• 5.1.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Jod, 0,05 mol/l odměrný roztok

• 5.1.3 Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.1.4 Postup

Do Erlenmeyerovy baňky na 150 ml s uzávěrem, obsahující 50 ml destilované vody, se přesně naváží 0,5 až 1 g vzorku. Přidá se 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.1.1.2) (pH roztoku asi 0) a titruje se roztokem jodu (5.1.2), dokud se neobjeví žluté zabarvení. Lze použít také indikátor (např. roztok škrobu nebo tetrachlormethan).

• 5.1.5 Výpočet

Obsah kyseliny thioglykolové se vypočte podle vzorce:

% m/m = 92 × n × 1001000 × 10 ×m = 0,92 nm

kde:

m =	hmotnost zkušebního vzorku (v g),
n =	objem spotřebovaného roztoku jodu (5.1.2).

• 5.1.6 Poznámky

Je-li vypočtený výsledek pro kyselinu thioglykolovou nejméně o 0,1 % nižší než nejvyšší povolená koncentrace, není další stanovení nutné. Jestliže se výsledek rovná nebo je vyšší než povolená maximální koncentrace a kvalitativní stanovení odhalilo přítomnost několika redukčních činidel, je nezbytné provést stanovení plynovou chromatografií.

• 5.2 Plynová chromatografie

• 5.2.1 Princip

Kyselina thioglykolová se oddělí od pomocných látek vysrážením roztokem octanu kademnatého. Po methylaci diazomethanem, který se buď připraví in situ nebo předem jako roztok v diethyletheru, se methylderivát kyseliny thioglykolové stanoví chromatografií plyn/kapalina s methyl-oktanoátem jako vnitřním standardem.

• 5.2.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 5.2.2.1 Kyselina thioglykolová, 98 %

• 5.2.2.2 Kyselina chlorovodíková,(d420 = 1,19 g/ml)

• 5.2.2.3 Methanol

• 5.2.2.4 Octan kademnatý, dihydrát, 10% roztok (m/V) ve vodě

• 5.2.2.5 Methyl-oktanoát, 2% roztok (m/V) v methanolu

• 5.2.2.6 Acetátový tlumivý roztok (pH 5):

Octan sodný, trihydrát, 77 g.

Kyselina octová (ledová), 27,5 g.

Demineralizovaná voda do konečného objemu jeden litr.

• 5.2.2.7 Kyselina chlorovodíková, čerstvě připravený 3M roztok v methanolu (5.2.2.3)

• 5.2.2.8 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin

• 5.2.2.9 Hydroxid sodný, 5M roztok

• 5.2.2.10 Jod, 0,05M odměrný roztok

• 5.2.2.11 Diethylether

• 5.2.2.12 Roztok diazomethanu připravený z N-methyl-N-nitrosotoluen-4-sulfonamidu (Fieser, Reagents for Organic Synthesis (Wiley), 1967)

Získaný roztok obsahuje asi 1,5 g diazomethanu ve 100 ml diethyletheru. Protože diazomethan je toxický a velmi nestabilní plyn, je třeba všechny operace provádět v dobře táhnoucí digestoři, a je třeba se vyvarovat použití zábrusové aparatury (pro tento účel jsou k dispozici speciální soupravy).

• 5.2.3 Přístroje a pomůcky

• 5.2.3.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.2.3.2 Aparatura pro přípravu diazomethanu pro methylaci in situ (viz Fales, H.M., Jaouni, T.M. a Babashak, J.F., Analyt. Chem. 1973, 45, 2302)

• 5.2.3.3 Přístroj pro přípravu diazomethanu předem (podle Fiesera)

• 5.2.4 Příprava vzorku

Do centrifugační kyvety na 50 ml se přesně naváží dostatek vzorku, aby obsahoval předpokládané množství 50 až 70 mg kyseliny thioglykolové. Okyselí se několika kapkami kyseliny chlorovodíkové (5.2.2.2), aby se dosáhlo pH asi 3.

Přidá se 5 ml demineralizované vody a 10 ml acetátového tlumivýho roztoku (5.2.2.6).

Pomocí pH papírku se ověří, zda je hodnota pH asi 5. Poté se přidá 5 ml roztoku octanu kademnatého (5.2.2.4).

Vyčká se 10 minut a poté se odstřeďuje nejméně 15 minut při 4000 g. Odstraní se supernatant, který může obsahovat nerozpustný tuk (v případě krémových prostředků). Tento tuk nelze zaměňovat s thioly, které se hromadí jako kompaktní hmota na dně nádobky. Ověří se, že se po přidání několika kapek roztoku octanu kademnatého (5.2.2.4) k supernatantu netvoří sraženina.

Jestliže předchozí kvalitativní stanovení neodhalilo přítomnost jiných redukčních činidel než thiolů, ověří se jodometricky, že množství thiolu přítomného v supernatantu nepřekračuje 6 až 8 % původního množství.

Do centrifugační zkumavky obsahující sraženinu se přidá 10 ml methanolu (5.2.2.3) a sraženina se jemně rozptýlí tyčinkou. Znovu se odstřeďuje nejméně 15 minut při 4000 g. Supernatant se slije a ověří se, že neobsahuje thioly.

Sraženina se ještě jednou stejným postupem promyje.

Do téže centrifugační kyvety se přidá

— 2 ml roztoku methyl-oktanoátu (5.2.2.5),

— 5 ml kyseliny chlorovodíkové v methanolu (5.2.2.7).

Thioly se úplně rozpustí (může zbývat malé množství nerozpustného zbytku pomocných látek).Toto je roztok „S“.

Na alikvotním podílu tohoto roztoku se jodometricky ověří, že obsah thiolů činí alespoň 90 % hodnoty získané v bodě 5.1.

• 5.2.5 Methylace

Methylace se provádí buď pomocí přípravy in situ (5.2.5.1), nebo předem připraveným roztokem diazomethanu (5.2.5.2).

• 5.2.5.1 Methylace in situ

Do methylační aparatury (5.2.3.2) obsahující 1 ml diethyletheru (5.2.2.11) se převede 50 μl roztoku „S“ a methyluje se postupem (5.2.3.2) s asi 300 mg 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidinu (5.2.2.8). Po 15 minutách (etherický roztok by měl být žlutý, což indikuje nadbytek diazomethanu) se roztok vzorku převede do nádobky na 2 ml opatřené vzduchotěsnou zátkou. Ponechá se v ledničce přes noc. Methylují se dva vzorky současně.

• 5.2.5.2 Methylace předem připraveným roztokem diazomethanu

Do nádobky na 5 ml opatřené zátkou se převede 1 ml roztoku diazomethanu (5.2.2.12) a poté 50 μl roztoku „S“. Ponechá se v ledničce přes noc.

• 5.2.6 Příprava standardu

Připraví se standardní roztok kyseliny thioglykolové (5.2.2.1) o známé koncentraci, obsahující asi 60 mg čisté kyseliny thioglykolové (5.2.2.1) ve 2 ml.

Toto je roztok „E“.

Vysrážení, zkouška a methylace se provedou tak, jak je popsáno v bodech 5.2.4 a 5.2.5.

• 5.2.7 Podmínky pro plynovou chromatografii

• 5.2.7.1 Kolona

Typ: nerezová ocel.

Délka: 2 m.

Průměr: 3 mm.

• 5.2.7.2 Náplň

20 % didecylftalát/Chromosorb WAW, 80 až 100 mesh.

• 5.2.7.3 Detektor

Plamenový ionizační. Vhodné nastavení citlivosti elektrometru plamenového ionizačního detektoru je 8 x 10^-10 A.

• 5.2.7.4 Plyny

Nosný plyn: dusík.

tlak: 2,2 bar,

průtok: 35 ml/min.

Pomocný plyn: vodík.

tlak: 1,8 bar,

průtok: 15 ml/min.

Plyny pro detektor: podle specifikace výrobce přístroje.

• 5.2.7.5 Teplotní podmínky

Nástřik: 200 °C

Detektor: 200 °C

Kolona: 90 °C.

• 5.2.7.6 Rychlost posuvu papíru v zapisovači

5 mm/min.

• 5.2.7.7 Nastřikované množství

3 μl. Provede se pět nástřiků.

• 5.2.7.8 Chromatografické podmínky jsou uvedeny pouze jako vodítko. Umožní dosáhnout rozlišení „R“ rovné nebo lepší než 1,5, kde:

R = 2 d' r2 - r1W1 + W2

kde

r1 a r2 =	retenční časy dvou píků (v min.),
W1 a W2 =	šířka píků v polovině výšky píků (v mm),
d' =	rychlost posuvu papíru (v mm/min.).

Doporučuje se zvyšovat na závěr chromatografického měření teplotu z 90 °C na 150 °C rychlostí 10 °C za minutu, aby se vyloučily látky, které by mohly rušit následující měření.

• 5.2.8 Výpočty

• 5.2.8.1 Koeficient úměrnosti pro kyselinu thioglykolovou

Počítá se vzhledem k methyloktanoátu na základě standardní směsi.

Označí-li se kyselina thioglykolová jako „t“,

přičemž

kt =	její koeficient úměrnosti,
m't =	její hmotnost ve směsi (v mg),
S't =	plocha jejího píku,

a označí-li se methyloktanoát jako „c“,

přičemž

m'c =	jeho hmotnost ve směsi (v mg),
S'c=	plocha jeho píku,

potom

kt = m'tm'c × S'cS't

Tento koeficient se liší podle použitého přístroje.

• 5.2.8.2 Koncentrace kyseliny thioglykolové přítomné ve vzorku

Označí-li se kyselina thioglykolová jako „t“,

přičemž

kt =	její koeficient úměrnosti,
St =	plocha jejího píku,

a označí-li se methyloktanoát jako „c“,

přičemž

mc =	jeho hmotnost ve směsi (v mg),
Sc =	plocha jeho píku,
M =	hmotnost původního zkušebního vzorku (v mg),

potom % (m/m) kyseliny thioglykolové přítomné ve vzorku je:

mcM × kt × StSc × 100

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující asi 8 % (m/m) kyseliny thioglykolové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,8 %.

• 1. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HEXACHLOROFENU (INN)

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda je vhodná pro všechny kosmetické prostředky.

• 1. PRINCIP

Hexachlorofen ve vzorku se extrahuje ethylacetátem a kvalitativně se stanoví chromatografií na tenké vrstvě.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Kyselina sírová, 4 mol/l

• 3.2 Celit AW

• 3.3 Ethylacetát

• 3.4 Mobilní fáze: Benzen obsahující 1 % (V/V) ledové kyseliny octové.

• 3.5 Detekční činidlo I:

Roztok rhodaminu B: Rozpustí se 100 mg rhodaminu B ve směsi 150 ml diethyletheru, 70 ml absolutního ethanolu a 16 ml vody.

• 3.6 Detekční činidlo II:

Roztok 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu: 400 mg 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu se rozpustí ve 100 ml methanolu (připravuje se čerstvý každý den).

Roztok uhličitanu sodného: 10 g uhličitanu sodného se rozpustí ve 100 ml demineralizované vody.

• 3.7 Standardní roztok:

Hexachlorofen, 0,05% roztok (m/V) v ethylacetátu

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 4.1 TLC desky Kieselgel 254, 200 x 200 mm (nebo ekvivalentní)

• 4.2 Obvyklé vybavení pro TLC

• 4.3 Lázeň pro temperaci chromatografické komory udržovaná na teplotě 26 °C

• 1. PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍHO VZORKU

• 5.1 1 g homogenizovaného vzorku se důkladně promíchá s 1 g Celitu AW (3.2) a 1 ml kyseliny sírové (3.1).

• 5.2 Suší se 2 hodiny při 100 °C.

• 5.3 Nechá se vychladnout a vysušený zbytek se rozdrtí na jemný prášek.

• 5.4 Dvakrát se extrahuje vždy 10 ml ethylacetátu (3.3), po každé extrakci se odstředí a ethylacetátové vrstvy se sloučí.

• 5.5 Odpaří se při 60 °C.

• 5.6 Odparek se rozpustí ve 2 ml ethylacetátu (3.3).

• 1. POSTUP

• 6.1 2 μl roztoku zkušebního vzorku (5.6) a 2 μl standardního roztoku (3.7) se nanesou na desku pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1).

• 6.2 Komora (4.3) se nasytí mobilní fází (3.4).

• 6.3 Deska pro chromatografii na tenké vrstvě se vloží do komory a vyvíjí se do vzdálenosti čela 150 mm.

• 6.4 Deska pro chromatografii na tenké vrstvě se vyjme z komory a suší se v sušárně s nuceným oběhem vzduchu při teplotě asi 105 °C.

• 6.5 Detekce

Skvrny hexachlorofenu na desce pro chromatografii na tenké vrstvě se detekují způsobem popsaným v bodě 6.5.1 nebo 6.5.2.

• 6.5.1 Deska se rovnoměrně postříká detekčním činidlem I (3.5). Po 30 minutách se deska pozoruje v UV světle při 254 nm.

• 6.5.2 Deska se rovnoměrně postříká roztokem 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu detekčního činidla II (3.6). Následně se deska postříká roztokem uhličitanu sodného (3.6). Deska se po 10 minutách sušení při pokojové teplotě pozoruje v denním světle.

• 1. INTERPRETACE

• 7.1 Detekční činidlo I (3.5):

Hexachlorofen se detekuje jako namodralá skvrna na žluto-oranžovém fluoreskujícím pozadí a má Rf přibližně 0,5.

• 7.2 Detekční činidlo II (3.6):

Hexachlorofen se detekuje jako blankytně modrá až tyrkysově zbarvená skvrna na bílém pozadí a má Rf přibližně 0,5.

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda je vhodná pro všechny kosmetické prostředky.

• 1. DEFINICE

Obsah hexachlorofenu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech hexachlorofenu.

• 1. PRINCIP

Hexachlorofen se stanovuje po přeměně na methylderivát plynovou chromatografií s detektorem elektronového záchytu.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.1 Ethylacetát

• 4.2 N-methyl-N-nitroso-p-toluensulfonamid (diazald)

• 4.3 Diethylether

• 4.4 Methanol

• 4.5 2-(2-ethoxyethoxy)ethanol (karbitol)

• 4.6 Kyselina mravenčí

• 4.7 Hydroxid draselný, 50% vodný roztok (m/m) (připravuje se vždy čerstvý)

• 4.8 Hexan pro spektroskopii

• 4.9 Bromchlorofen (standard č. 1)

• 4.10 4,4',6,6'-tetrachlor-2,2'-thiodifenol (standard č. 2)

• 4.11 2,4,4'-trichlor-2-hydroxydifenylether (standard č. 3)

• 4.12 Aceton

• 4.13 Kyselina sírová, 4M

• 4.14 Celit AW

• 4.15 Kyselina mravenčí v ethylacetátu, 10% roztok (V/V)

• 4.16 Hexachlorofen

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 5.1 Obvyklé laboratorní sklo

• 5.2 Miniaparatura pro přípravu diazomethanu (Analyt. Chem. 1973, 45, 2302-2)

• 5.3 Plynový chromatograf vybavený detektorem elektronového záchytu se zdrojem ^63Ni

• 1. POSTUP

• 6.1 Příprava standardního roztoku

Standard se zvolí tak, aby neinterferoval se žádnou látkou obsaženou v analyzovaném výrobku jako pomocná látka. Obvykle je nejvhodnější standard č. 1 (4.9).

• 6.1.1 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 50 mg standardu č. 1, 2 nebo 3 přesně (4.9, 4.10 nebo 4.11) a 50 mg hexachlorofenu (4.16). Doplní se na objem ethylacetátem (4.1) (roztok A). 10 ml roztoku A se zředí ethylacetátem (4.1) na 100 ml (roztok B).

• 6.1.2 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 50 mg standardu č. 1, 2 nebo 3 přesně (4.9, 4.10 nebo 4.11). Doplní se na objem ethylacetátem (4.1) (roztok C).

• 6.2 Příprava vzorku

Naváží se asi 1 g homogenizovaného vzorku přesně a důkladně se promíchá s 1 ml kyseliny sírové (4.13), 15 ml acetonu (4.12) a 8 g Celitu AW (4.14). Směs se 30 minut suší vzduchem na vodní lázni, poté se jeden a půl hodiny suší v sušárně s nuceným oběhem vzduchu. Nechá se vychladnout, zbytek se rozdrtí na jemný prášek a převede do skleněné kolony. Eluuje se ethylacetátem (4.1) a jímá se 100 ml. Přidají se 2 ml roztoku vnitřního standardu (roztok C) (6.1.2).

(Vzhledem k tomu, že hexachlorofen je obsažen v celé řadě typů výrobků, je důležité před definitivním zaznamenáním výsledků stanovit výtěžek hexachlorofenu při stanovení v dotyčném vzorku tímto postupem. Jsou-li výtěžky nízké, mohou být se souhlasem zúčastněných stran provedeny změny, například změna rozpouštědla (benzen místo ethylacetátu) apod.)

• 6.3 Methylace vzorku

Všechna reakční činidla a aparatura se 2 hodiny chladí na teplotu 0 až 4 °C. Do vnějšího zásobníku diazomethanové aparatury se převede 1,2 ml roztoku připraveného podle bodu 6.2 a 0,1 ml methanolu (4.4). Do středního zásobníku se převede asi 200 mg diazaldu (4.2), přidá se 1 ml karbitolu (4.5) a 1 ml diethyletheru (4.3) a nechá se rozpustit. Aparatura se sestaví, z poloviny se ponoří do lázně o teplotě 0 °C a do středního zásobníku se injekční stříkačkou zavede asi 1 ml vychlazeného roztoku hydroxidu draselného (4.7). Je třeba se přesvědčit, že žluté zbarvení způsobené vzniklým diazomethanem přetrvává. Pokud žluté zbarvení nepřetrvává, methylace se opakuje s dalšími 200 mg diazaldu (4.2).

(Přetrvávání tohoto žlutého zbarvení je známkou přebytku diazomethanu, který je nezbytný pro zajištění úplné methylace vzorku.)

Aparatura se po 15 minutách vyjme z lázně a ponechá se uzavřená při laboratorní teplotě 12 hodin. Aparatura se otevře, přebytek diazomethanu se odstraní přídavkem několika kapek 10% (V/V) roztoku kyseliny mravenčí v ethylacetátu (4.15), organický roztok se převede do odměrné baňky na 25 ml. Doplní se na objem hexanem (4.8).

1,5 μl tohoto roztoku se nastříkne do chromatografu.

• 6.4 Methylace standardu

Všechna reakční činidla a aparatura se 2 hodiny chladí na teplotu 0 až 4 °C. Do vnějšího zásobníku diazomethanové aparatury se umístí:

0,2 ml roztoku B (6.1.1),

1 ml ethylacetátu (4.1),

0,1 ml methanolu (4.4).

V methylaci se pokračuje tak, jak je popsáno v bodě 6.3. 1,5 μl výsledného roztoku se nastříkne do chromatografu.

• 1. PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE

Kolona musí zaručit rozlišení „R“ rovné nebo lepší než 1,5, kde:

R = 2 d' r2 - r1W1 + W2

kde

r1 a r2 =	retenční časy dvou píků (v min.),
W1 a W2 =	šířky píků v polovině výšky píků (v mm),
d' =	rychlost posuvu papíru (v mm/min.).

Jako vhodné se ukázaly následující chromatografické podmínky:

Kolona: nerezová ocel.

Délka: 1,7 m.

Průměr: 3 mm.

Nosič:

Chromosorb WAW

zrnitost: 80 až 100 mesh.

Stacionární fáze: 10% OV 17.

Teploty:

kolona: 280 °C,

nástřik: 280 °C,

detektor: 280 °C.

Nosný plyn: dusík zbavený kyslíku.

Tlak: 2,3 bar.

Průtok: 30 ml/min.

• 1. VÝPOČET

• 8.1 Koeficient úměrnosti hexachlorofenu

Bude odpovídat zvolenému standardu a jeho poměru ve standardní směsi.

Označí-li se

h = hexachlorofen,

kh = jeho koeficient úměrnosti,

m'h = jeho hmotnost ve směsi (v g),

A'h = plocha jeho píku,

s = vybraný standard,

m's = jeho hmotnost ve směsi (v g),

A's = plocha jeho píku,

potom:

kh = m'hm's × A'sA'h

• 8.2 Množství hexachlorofenu ve vzorku

Označí-li se

h = hexachlorofen,

kh = jeho koeficient úměrnosti,

Ah = plocha jeho píku,

s = vybraný standard,

ms = jeho hmotnost ve směsi (v g),

As = plocha jeho píku,

M = hmotnost odebraného vzorku (v g),

potom % (m/m) hexachlorofenu ve vzorku je

ms × kh × Ah × 100M × As

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující asi 0,1 % (m/m) hexachlorofenu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.

• 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ TOSYLCHLORAMIDU SODNÉHO, (CHLORAMINU-T)(INN)

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení tosylchloramidu sodného (chloraminu-T) v kosmetických prostředcích chromatografií na tenké vrstvě.

• 1. DEFINICE

Obsah chloraminu-T ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (m/m).

• 1. PRINCIP

Chloramin-T se kvantitativně hydrolyzuje na 4-toluensulfonamid varem s kyselinou chlorovodíkovou.

Množství vzniklého 4-toluensulfonamidu se po chromatografii na tenké vrstvě stanoví fotodenzitometricky.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.1 Tosylchloramid sodný (chloramin-T)

• 4.2 Standardní roztok 4-toluensulfonamidu: 50 mg 4-toluensulfonamidu ve 100 ml ethanolu (4.5)

• 4.3 Kyselina chlorovodíková, 37% (m/m),d420 = 1,18 g/ml

• 4.4 Diethylether

• 4.5 Ethanol, 96% (V/V)

• 4.6 Mobilní fáze

• 4.6.1 Butan-1-ol/ethanol (4.5)/voda (40:4:9, V/V/V), nebo

• 4.6.2 Chloroform/aceton (6:4, V/V)

• 4.7 Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě, silikagel 60, bez fluorescenčního indikátoru

• 4.8 Manganistan draselný

• 4.9 Kyselina chlorovodíková, 15% (m/m)

• 4.10 Detekční činidlo: 2-toluidin, 1% roztok (m/V) v ethanolu (4.5)

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.2 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě

• 5.3 Fotodenzitometr

• 1. POSTUP

• 6.1 Hydrolýza

Do baňky na 50 ml s kulatým dnem se naváží asi 1 g vzorku přesně (m). Přidá se 5 ml vody a 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.3) a vaří se jednu hodinu pod zpětným chladičem. Horká suspenze se okamžitě převede vodou do odměrné baňky na 50 ml. Nechá se vychladnout a doplní po rysku vodou. Odstřeďuje se 5 minut alespoň při 3000 ot./min a supernatant se zfiltruje.

• 6.2 Extrakce

• 6.2.1 Odebere se 30 ml filtrátu a extrahuje se třikrát 15 ml diethyletheru (4.4). V případě potřeby se etherové fáze vysuší a shromáždí v 50 ml odměrné baňce. Doplní se na objem diethyletherem (4.4).

• 6.2.2 Odebere se 25 ml vysušeného etherického extraktu a odpaří se do sucha v proudu dusíku. Odparek se rozpustí v 1 ml ethanolu (4.5).

• 6.3 Chromatografie na tenké vrstvě

• 6.3.1 20 μl ethanolického roztoku odparku (6.2.2) se nanese na desku pro chromatografii na tenké vrstvě (4.7).

Současně a stejným způsobem se nanese 8, 12, 16 a 20 μl standardních roztoků 4-toluensulfonamidu (4.2).

• 6.3.2 Nechá se vyvíjet v mobilní fázi (4.6.1 nebo 4.6.2) až čelo dosáhne vzdálenosti asi 150 mm.

• 6.3.3 Po úplném odpaření mobilní fáze se deska umístí na 2 až 3 minuty do atmosféry par chloru, vzniklých nalitím asi 100 ml kyseliny chlorovodíkové (4.9) na asi 2 g manganistanu draselného (4.8) v uzavřené nádobě. Přebytek chloru se odstraní zahřátím desky na 100 °C po dobu 5 minut. Poté se deska postříká detekčním činidlem (4.10).

• 6.4 Měření

Přibližně po jedné hodině se fialové skvrny proměří fotodenzitometrem při 525 nm.

• 6.5 Vynesení kalibračních křivek

Hodnoty maximálních výšek píků stanovených pro čtyři skvrny 4-toluensulfonamidu se vynesou proti odpovídajícím množstvím 4-toluensulfonamidu (tj. 4, 6, 8 a 10 μg 4-toluensulfonamidu na skvrnu).

• 1. POZNÁMKA

Metodu je možno ověřit pomocí 0,1 nebo 0,2% roztoku (m/V) chloraminu-T (4.1), který se podrobí stejnému postupu jako vzorek (6).

• 1. VÝPOČET

Obsah chloraminu-T ve vzorku vyjádřený v hmotnostních procentech se vypočte takto

% (m/m) tosylchloramid sodný = 1,33 × a60 × m

kde

1,33 =	přepočítávací faktor 4-toluensulfonamid/Chloramin-T,
a =	množství 4-toluensulfonamidu ve vzorku, odečtené z kalibračních křivek (v μg),
m =	hmotnost odebraného vzorku (v g).

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) chloraminu-T nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,03 %.

• 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ CELKOVÉHO FLUORU V ZUBNÍCH PASTÁCH

• 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda je určena ke kvantitativnímu stanovení celkového fluoru v zubních pastách. Je vhodná pro obsah nepřesahující 0,25 %.

• 1. DEFINICE

Obsah fluoru ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.

• 1. PRINCIP

Stanovení se provádí plynovou chromatografií. Fluor se ze sloučenin obsahujících fluor převede na triethylfluorsilan (TEFS) přímou reakcí s chlortriethylsilanem (TECS) v kyselém prostředí a současně se extrahuje xylenem obsahujícím cyklohexan jako vnitřní standard.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 4.1 Fluorid sodný, sušený při 120 °C do konstantní hmotnosti

• 4.2 Voda, dvakrát destilovaná nebo ekvivalentní kvality

• 4.3 Kyselina chlorovodíková,d420 = 1,19 g/ml

• 4.4 Cyklohexan (C6H12)

• 4.5 Xylen nevykazující na chromatogramu při chromatografii za stejných podmínek jako vzorek (6.1) žádné píky před píkem rozpouštědla. V případě potřeby se čistí destilací (5.8).

• 4.6 Chlortriethylsilan (TECS Merck nebo ekvivalentní)

• 4.7 Standardní roztoky fluoru

• 4.7.1 Zásobní roztok, 0,250 mg F^- /ml. Naváží se přesně 138,1 mg fluoridu sodného (4.1) a rozpustí se ve vodě (4.2). Roztok se kvantitativně převede do odměrné baňky na 250 ml (5.5). Zředí se po rysku vodou (4.2) a promíchá.

• 4.7.2 Zředěný zásobní roztok, 0,050 mg F^- /ml. Do odměrné baňky na 100 ml (5.5) se pipetou převede 20 ml zásobního roztoku (4.7.1). Zředí se po rysku vodou a promíchá.

• 4.8 Roztok vnitřního standardu

Smíchá se 1 ml cyklohexanu (4.4) a 5 ml xylenu (4.5).

• 4.9 Roztok chlortriethylsilan/vnitřní standard

Do odměrné baňky na 10 ml se pipetou (5.7) převede 0,6 ml TECS (4.6) a 0,12 ml roztoku vnitřního standardu (4.8). Zředí se xylenem po rysku a promíchá. Připravuje se čerstvý každý den.

• 4.10 Kyselina chloristá, 70% (m/V)

• 4.11 Kyselina chloristá, 20% (m/V) ve vodě (4.2)

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 5.2 Plynový chromatograf vybavený plamenovým ionizačním detektorem

• 5.3 Míchačka Vortex nebo ekvivalentní

• 5.4 Třepačka Bühler, typ SMB1 nebo ekvivalentní

• 5.5 Odměrné baňky na 100 a 250 ml z polypropylenu

• 5.6 Centrifugační kyvety (skleněné) na 20 ml se šroubovacími uzávěry potaženými teflonem, Sovirel typ 611-56 nebo ekvivalentní. Kyvety a uzávěry se čistí louhováním v kyselině chloristé (4.11) několik hodin, poté se pětkrát vypláchnou vodou (4.2) a nakonec se suší při 100 °C.

• 5.7 Pipety s nastavitelným objemem na 50 až 200 μl, se špičkami z plastu na jedno použití.

• 5.8 Destilační přístroj s třídílnou Schneiderovou kolonou nebo ekvivalentní kolonou Vigreux.

• 1. POSTUP

• 6.1 Analýza vzorku

• 6.1.1 Vybere se dosud neotevřená tuba se zubní pastou, rozřízne se a veškerý obsah se vyjme. Převede se do nádoby z plastu, důkladně se promíchá a uchovává se za podmínek, při nichž nedojde ke znehodnocení vzorku.

• 6.1.2 Do centrifugační zkumavky (5.6) se naváží přesně 150 mg vzorku (m), přidá se 5 ml vody (4.2) a zhomogenizuje se (5.3).

• 6.1.3 Přidá se 1 ml xylenu (4.5).

• 6.1.4 Po kapkách se přidá 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.3) a zhomogenizuje se (5.3).

• 6.1.5 Do centrifugační kyvety (5.6) se pipetou přidá 0,5 ml roztoku chlortriethylsilan/vnitřní standard (4.9).

• 6.1.6 Kyveta se uzavře šroubovacím uzávěrem (5.6) a důkladně se třepe 45 minut na třepačce (5.4) nastavené na 150 kmitů za minutu.

• 6.1.7 Odstřeďuje se 10 minut při takové rychlosti, aby došlo ke zřetelné separaci fází, kyveta se otevře, organická vrstva se oddělí a 3 μl organické fáze se nastříknou do kolony plynového chromatografu (5.2).

Poznámka:

Eluce všech složek trvá asi 20 minut.

• 6.1.8 Nástřik se opakuje, vypočte se průměrný poměr ploch píků (ATEFS/ACH), a odpovídající obsah fluoru (v mg (m1)) se odečte z kalibrační křivky (6.3).

• 6.1.9 Celkový obsah fluoru ve vzorku (v hmotnostních procentech fluoru) se vypočte způsobem popsaným v bodě 7.

• 6.2 Chromatografické podmínky

• 6.2.1 Kolona: nerezová ocel.

Délka: 1,8 m.

Průměr: 3 mm.

Nosič: Gaschrom Q, 80 až 100 mesh.

Stacionární fáze: silikonový olej DC 200 nebo ekvivalentní, 20 %. Kolona se kondicionuje přes noc při 100 °C (při průtoku nosného plynu 25 ml dusíku za minutu), což se opakuje každou noc. Po každém čtvrtém nebo pátém nástřiku se kolona znovu kondicionuje zahřátím na 100 °C na dobu 30 minut.

Teplotní režim:

kolona: 70 °C,

nástřik: 150 °C,

detektor. 250 °C.

Průtok nosného plynu: 35 ml dusíku za minutu.

• 6.3 Kalibrační křivka

• 6.3.1 Do řady šesti centrifugačních kyvet (5.6) se pipetou odměří 0, 1, 2, 3, 4 a 5 ml zředěného standardního roztoku fluoridu (4.7.2). Každá zkumavka se doplní vodou (4.2) na objem 5 ml.

• 6.3.2 Pokračuje se tak, jak je popsáno v bodech 6.1.3 až 6.1.6 včetně.

• 6.3.3 Do kolony plynového chromatografu (5.2) se nastříknou 3 μl organické fáze.

• 6.3.4 Nástřik se opakuje a vypočítá se průměrný poměr ploch píků (ATEFS/ACH).

• 6.3.5 Vynese se kalibrační křivka závislosti hmotnosti fluoru (v mg) ve standardních roztocích (6.3.1) a poměr ploch píku (ATEFS/ACH) změřených podle bodu 6.3.4. Pomocí regresní analýzy se provede nejlepší proložení bodů křivky přímkou.

• 1. VÝPOČET

Koncentrace celkového fluoru ve vzorku (v hmotnostních procentech fluoru) (% (m/m) F) je dána vztahem

% F = m1m × 100 %

kde

m =	zkušební vzorek (6.1.2) (v mg),
m1 =	množství F (v mg) odečtené z kalibrační křivky (6.1.8).

• 1. OPAKOVATELNOST

Pro výrobky obsahující asi 0,15 % (m/m) fluoru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,012 %.

• 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ORGANICKÝCH SLOUČENIN RTUTI

ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

Dále popsanou metodu lze použít pro kvalitativní a kvantitativní stanovení organických derivátů rtuti používaných jako konzervační přísady v kosmetických prostředcích k líčení a odličování očí. Metodu lze použít pro thiomersal (INN), merthiolát a fenylrtuťnaté soli.

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. PRINCIP

Organické sloučeniny rtuti se převedou na komplex s 1,5-difenyl-3-thiokarbazonem. Po extrakci dithizonátu tetrachlormethanem se provede chromatografie na tenké vrstvě na silikagelu. Dithizonáty se na chromatogramu projeví jako oranžově zbarvené skvrny.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 2.1 Kyselina sírová, 25% (V/V)

• 2.2 1,5-difenyl-3-thiokarbazon (dithizon): 0,8 mg ve 100 ml tetrachlormethanu (2.4)

• 2.3 Dusík

• 2.4 Tetrachlormethan

• 2.5 Mobilní fáze: hexan/aceton, 90:10 (V/V)

• 2.6 Standardní roztok, 0,001 % ve vodě:

2-(ethylmercuriothio)benzoátu sodného,

chloridu ethylrtuti nebo chloridu methylrtuti,

dusičnanu fenylrtuti nebo octanu fenylrtuti,

chloridu rtuťnatého nebo octanu rtuťnatého.

• 2.7 Hotové silikagelové desky (např. Merck 5721 nebo ekvivalentní)

• 2.8 Chlorid sodný

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 3.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 3.2 Obvyklé vybavení pro TLC

• 3.3 Filtr pro separaci fází

• 1. POSTUP

• 4.1 Extrakce

• 4.1.1 1 g vzorku se zředí v centrifugační kyvetě 20 ml destilované vody. Co nejvíce se rozptýlí a zahřeje na vodní lázni na 60 °C. Přidají se 4 g chloridu sodného (2.8). Protřepe se. Nechá se vychladnout.

• 4.1.2 Odstřeďuje se alespoň 20 minut při 4500 ot./min, aby se oddělila větší část pevné fáze od kapaliny. Přefiltruje se do dělicí nálevky a přidá se 0,25 ml roztoku kyseliny sírové (2.1).

• 4.1.3 Několikrát se extrahuje 2 až 3 ml roztoku dithizonu (2.2), dokud nezůstane poslední organická fáze zelená.

• 4.1.4 Všechny organické fáze se postupně přefiltrují přes filtr pro separaci fází (3.3).

• 4.1.5 Odpaří se do sucha v proudu dusíku (2.3).

• 4.1.6 Rozpustí se v 0,5 ml tetrachlormethanu (2.4). Roztok se okamžitě použije způsobem popsaným v bodě 4.2.1.

• 4.2 Separace a kvalitativní stanovení

• 4.2.1 Na silikagelovou desku (2.7) se ihned nanese 50 μl roztoku v tetrachlormethanu, připraveného podle bodu 4.1.6. Současně se 10 ml standardního roztoku (2.6) podrobí postupu popsanému v bodě 4.1 a 50 μl získaného roztoku se nanese na tutéž desku.

• 4.2.2 Deska se umístí do mobilní fáze (2.5) a mobilní fáze se nechá vystoupit do výšky 150 mm. Organické sloučeniny rtuti se objeví jako oranžové skvrny, jejichž barva je stálá, jestliže se okamžitě po odpaření rozpouštědla přikryjí skleněnou deskou.

Lze získat například následující hodnoty Rf:

	Rf	Barva
Thiomersal	0,33	Oranžová
Chlorid ethylrtuti	0,29	Oranžová
Chlorid methylrtuti	0,29	Oranžová
Soli fenylrtuti	0,21	Oranžová
Rtuťnaté soli	0,10	Oranžová
Octan rtuťnatý	0,10	Oranžová
1,5-difenyl-3-thiokarbazon	0,09	Růžová

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. DEFINICE

Obsah organických sloučenin rtuti stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (m/m) rtuti ve vzorku.

• 1. PRINCIP

Metoda je založena na měření celkového obsahu přítomné rtuti. Je proto nezbytné se nejprve ujistit, že není přítomna anorganická rtuť, a identifikovat organické sloučeniny rtuti přítomné ve vzorku. Po mineralizaci se uvolněná rtuť stanoví bezplamenovou atomovou absorpcí.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

• 3.1 Koncentrovaná kyselina dusičná,d420 = 1,41 g/ml

• 3.2 Koncentrovaná kyselina sírová,d420 = 1,84 g/ml

• 3.3 Redestilovaná voda

• 3.4 Manganistan draselný, 7% roztok (m/V)

• 3.5 Hydroxylamoniumchlorid, 1,5% roztok (m/V)

• 3.6 Peroxodisíran draselný, 5% roztok (m/V)

• 3.7 Chlorid cínatý, 10% roztok (m/V)

• 3.8 Koncentrovaná kyselina chlorovodíková,d420 = 1,18 g/ml

• 3.9 Skelná vata impregnovaná chloridem palladnatým, 1% (m/m)

• 1. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

• 4.1 Obvyklé laboratorní vybavení

• 4.2 Přístroj pro stanovení rtuti bezplamenovou atomovou absorpční spektrometrií (technika generování studených par) včetně potřebného skleněného nádobí. Optická dráha kyvety alespoň 100 mm.

• 1. POSTUP

Zachovávají se všechna bezpečnostní opatření obvyklá pro stopovou analýzu rtuti.

• 5.1 Rozklad

• 5.1.1 Naváží se 150 mg vzorku přesně (m). Přidá se 10 ml kyseliny dusičné (3.1) a ponechá se působit tři hodiny ve vzduchotěsné nádobce ve vodní lázni při 55 °C, v pravidelných intervalech se protřepává. Současně se provede slepý pokus s reakčními činidly.

• 5.1.2 Po vychladnutí se přidá 10 ml kyseliny sírové (3.2) a ještě jednou se zahřívá 30 minut ve vodní lázni vyhřáté na 55 °C.

• 5.1.3 Nádoba se vloží do ledové lázně a opatrně se přidá 20 ml vody (3.3).

• 5.1.4 Po dávkách se přidají 2 ml 7% roztoku manganistanu draselného (3.4), dokud roztok nezůstane zbarvený. Vrátí se na dalších 15 minut do vodní lázně vyhřáté na 55 °C.

• 5.1.5 Přidají se 4 ml roztoku peroxodisíranu draselného (3.6). V zahřívání na vodní lázni při 55 °C se pokračuje po dobu 30 minut.

• 5.1.6 Nechá se vychladnout a obsah se převede do odměrné baňky na 100 ml. Nádobka se vypláchne 5 ml roztoku hydroxylamonium-chloridu (3.5) a poté čtyřikrát 10 ml vody (3.3). Roztok by se měl úplně odbarvit. Doplní se po rysku vodou (3.3).

• 5.2 Kvantitativní stanovení

• 5.2.1 10 ml zkušebního roztoku (5.1.6) se převede do skleněné nádobky pro stanovení rtuti technikou generování studených par (4.2). Zředí se 100 ml vody (3.3) a následně se přidá 5 ml kyseliny sírové (3.2) a 5 ml roztoku chloridu cínatého (3.7). Po každém přídavku se promíchá. Vyčká se 30 sekund, aby se veškeré ionty rtuti zredukovaly na kovovou rtuť, a odečte se výsledná hodnota (n).

• 5.2.2 Skelná vata impregnovaná chloridem paladnatým (3.9) se vloží mezi redukční nádobku a průtočnou kyvetu přístroje (4.2). Postup podle bodu 5.2.1 se opakuje a odečte se výsledná hodnota. Pokud hodnota není nulová, mineralizace byla neúplná a analýza se musí opakovat.

• 1. VÝPOČET

Označí-li se

m = hmotnost zkušebního vzorku (v mg)

n = množství rtuti odečtené na přístroji (v μg)

Množství rtuti vyjádřené v hmotnostních procentech rtuti se vypočte ze vzorce:

% rtuti = nm