Vyhláška, kterou se stanoví analytické metody kontroly složení kosmetických prostředků

Podle potřeby lze podpořit odpaření rozpouštědla proudem vzduchu. TLC deska se odstraní z topné desky a nechá se vychladnout na laboratorní teplotu. Vyvíjecí komora (4.2) se naplní 100 ml mobilní fází (3.19).

TLC deska se ihned vloží do nenasycené komory a vyvíjí se při laboratorní teplotě, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí asi 15 cm od základní linie. Deska se z vyvíjecí komory vyjme a vysuší v proudu horkého vzduchu pomocí horkovzdušného fénu.

Deska se prohlédne v UV světle (4.3) a pozice skvrn se vyznačí. Deska se zahřívá 30 minut v sušárně (4.5) při 100 °C, aby se odstranila nadbytečná kyselina octová. Konzervační přísady v chromatogramu se zviditelní Millonovým činidlem (3.10) tak, že válečkem (4.7) namočeným do činidla se TLC deska přejede tak, aby byla rovnoměrně navlhčená.

Poznámka: Skvrny lze rovněž zviditelnit opatrným nanesením kapky Millonova činidla na každou skvrnu označenou pod UV světlem.

Estery kyseliny 4-hydroxybenzoové se projeví jako červené skvrny, 2-fenoxyethanol a 1-fenoxypropan-2-ol jako žluté skvrny. Je však třeba dávat pozor na to, že kyselina 4-hydroxybenzoová, která může být přítomná ve vzorcích jako konzervační látka nebo produkt rozkladu parabenů, se sama o sobě projeví jako červená skvrna. Viz 7.3 a 7.4.

• 1. Kvalitativní stanovení

Pro každou skvrnu se vypočte hodnota Rf. Skvrny získané z roztoku vzorku se porovnají se skvrnami získanými z referenčních roztoků, pokud jde o jejich hodnoty Rf, jejich chování v UV světle a barvu po zviditelnění. Učiní se předběžné závěry o identitě konzervantů.

Pokud se zdá, že jsou přítomny parabeny, provede se analýza vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) popsanou v oddílu B. Výsledky chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) se zkombinují, aby se potvrdila přítomnost 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu a parabenů.

• 1. Poznámky

• 7.1 Vzhledem k toxicitě Millonova činidla je nejvhodnější aplikovat toto činidlo jedním z popsaných způsobů. Postřik se nedoporučuje.

• 7.2 Jiné sloučeniny obsahující hydroxylové skupiny mohou rovněž při reakci s Milionovým činidlem dávat zbarvení. Tabulka barev a hodnot Rf získaných pro řadu konzervantů použitím chromatografie na tenké vrstvě je uvedena v práci N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi a A. Schouten (1987): Determination of preservatives in cosmetic products I: Thin-layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J. Chromatography 410, 395-411).

• 7.3 Hodnoty Rf uvedené v následující tabulce slouží jako ukazatele hodnot, které lze získat:

• 7.4 V případě kyseliny 4-hydroxybenzoové a methylparabenu a ani v případě benzylparabenu a ethylparabenu nedochází k oddělení. Kvalitativní stanovení těchto sloučenin by mělo být potvrzeno metodou HPLC popsanou v oddílu B a porovnáním retenčních časů vzorku s retenčními časy standardů.

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

• 1. Rozsah a oblast použití

V této metodě je specifikován postup pro stanovení 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.

• 1. Definice

Množství konzervačních přísad stanovená touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.

• 1. Princip

Vzorek se okyselí přidáním kyseliny sírové a poté se suspenduje ve směsi ethanolu a vody. Směs se opatrně zahřeje do rozpuštění tukové fáze, aby se zajistila kvantitativní extrakce, a poté se zfiltruje.

Konzervační látky ve filtrátu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s obrácenou fází za použití isopropyl-4-hydroxybenzoátu jako vnitřního standardu.

• 1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

• 4.1 Všeobecně

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.

• 4.2 Ethanol, absolutní

• 4.3 2-Fenoxyethanol

• 4.4 1-Fenoxypropan-2-ol

• 4.5 Methyl-4-hydroxybenzoát (methylparaben)

• 4.6 Ethyl-4-hydroxybenzoát (ethylparaben)

• 4.7 n-Propyl-4-hydroxybenzoát (propylparaben)

• 4.8 Isopropyl-4-hydroxybenzoát (isopropylparaben)

• 4.9 n-Butyl-4-hydroxybenzoát (butylparaben)

• 4.10 Benzyl-4-hydroxybenzoát (benzylparaben)

• 4.11 Tetrahydrofuran

• 4.12 Methanol

• 4.13 Acetonitril

• 4.14 Roztok kyseliny sírové, 2 mol/l

• 4.15 Směs ethanol/voda

Smíchá se devět dílů ethanolu (4.2) a jeden díl vody.

• 4.16 Roztok vnitřního standardu

Naváží se přibližně 0,25 g isopropylparabenu (4.8) přesně, převede se do odměrné baňky na 500 ml, rozpustí se a doplní se na objem směsí ethanol/voda (4.15).

• 4.17 Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril

Smíchá se 5 dílů tetrahydrofuranu, 60 dílů vody, 10 dílů methanolu a 25 dílů acetonitrilu.

• 4.18 Zásobní roztok standardů

Do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží přibližně 0,2 g 2-fenoxyethanolu, 0,2 g 1-fenoxypropan-2-olu, 0,05 g methylparabenu, 0,05 g ethylparabenu, 0,05 g propylparabenu, 0,05 g butylparabenu a 0,025 g benzylparabenu, rozpustí se a doplní se na objem směsí ethanol/voda.

Roztok se uchovává v ledničce a je stabilní 1 týden.

• 4.19 Standardní roztoky konzervačních přísad

Do odměrných baněk na 50 ml se ze zásobního roztoku (4.18) převede 20,00 ml, 10,00 ml, 5,00 ml, 2,00 ml a 1,00 ml. Do každé baňky se přidá 10,00 ml roztoku vnitřního standardu (4.16) a 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a doplní se na objem směsí ethanol/voda. Tyto roztoky se připravují vždy čerstvé.

• 1. Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní vybavení a

• 5.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C ± 1 °C

• 5.2 HPLC chromatograf s UV detektorem, vlnová délka 280 nm

• 5.3 Analytická kolona:

Nerezová ocel, délka 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm, (nebo délka 12,5 cm a vnitřní průměr 4,6 mm), naplněná Nucleosilem 5C18 nebo ekvivalentním (viz 10.1).

• 5.4 Erlenmeyerovy baňky na 100 ml, se zábrusovou zátkou

• 5.5 Varné kamínky, karborundum, velikost 2 až 4 mm, nebo ekvivalentní

• 1. Postup

• 6.1 Příprava vzorku

• 6.1.1 Příprava vzorku bez přidání vnitřního standardu

Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se odváží asi 1,0 g vzorku přesně. Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 50,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5), baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1°C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.

Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do ledničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.

Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky. Extrakty se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.

• 6.1.2 Příprava vzorků včetně přidání vnitřního standardu

Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se s přesností na tři desetinná místa odváží 1,0 g ± 0,1 g vzorku.

Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5) a přesně 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1°C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.

Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do chladničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.

Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky (zkušební roztok). Extrakt se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.

• 6.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)

• 6.2.1 Chromatografické podmínky

— Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril (4.17)

— Průtoková rychlost: 1,5 ml/min

— Detekční vlnová délka: 280 nm

• 6.2.2 Kalibrace

Nastříkne se 10 μl každého ze standardních roztoků konzervantů (4.19). Ze získaných chromatogramů se stanoví poměr výšek píků standardních roztoků konzervantů k píku vnitřního standardu. Pro každý konzervant se sestrojí křivka závislosti těchto poměrů na koncentraci standardních roztoků.

• 6.2.3 Stanovení

Do chromatogafu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku bez vnitřního standardu (6.1.1) a zaznamená se chromatogram.

Nastříkne se 10 μl jednoho ze standardních roztoků konzervantů (4.19) a zaznamená se chromatogram. Získané chromatogramy se porovnají.

Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (6.1.1) přítomen pík s přibližně stejným retenčním časem, jako je retenční čas píku isopropylparabenu (doporučený vnitřní standard), pokračuje se nastříknutím 10 μl roztoku vzorku s vnitřním standardem (6.1.2). Chromatogram se zaznamená a změří se výšky píků.

Je-li v chromatogramu roztoku vzorku rušivý pík s retenčním časem přibližně stejným jako retenční čas isopropylparabenu, měl by být vybrán jiný vnitřní standard.

Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu vzorku přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.

Vypočítají se poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.

Je třeba ověřit, že kalibrační křivka použitého standardu je lineární.

Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

— separace píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice separace píků je uveden na obrázku 16.)

[image omitted]

Obrázek 16: Separace píků

Není-li požadované separace dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona, nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn.

— faktor asymetrie (As) všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 17.) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.

[image omitted]

17: Faktor asymetrie píku

— Základna by měla být stabilní.

• 1. Výpočet

Pro výpočet koncentrace konzervantů v roztoku vzorku se použije kalibrační křivka (6.2.2) a hodnoty poměrů výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.

Obsah (wi) 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v hmotnostních procentech (% m/m) se vypočte pomocí vzorce:

% wim/m = bi200×a

kde

• 1. Opakovatelnost

Viz poznámka v bodě 10.5.

• 1. Reprodukovatelnost

Viz poznámka v bodě 10.5.

• 1. Poznámky

• 10.1 Stacionární fáze

Retenční chování rozpouštěných látek při stanoveních HPLC výrazně závisí na typu, značce a historii stacionární fáze. Zda lze kolonu použít pro oddělení vyšetřovaných konzervantů, lze usoudit z výsledků získaných pro standardní roztoky (viz poznámky v bodě 6.2.3). Kromě navrhovaného materiálu náplně kolony byly shledány vhodnými také materiály Hypersil ODS a Zorbax ODS.

Za účelem dosažení požadovaného oddělení lze popřípadě optimalizovat složení mobilní fáze.

• 10.2 Detekční vlnová délka

Testování robustnosti popisované metody ukázalo, že nepatrná změna detekční vlnové délky může mít významný vliv na výsledky stanovení.

Tento parametr musí být proto během analýzy pečlivě kontrolován.

• 10.3 Rušivé vlivy

Za podmínek popsaných v této metodě je eluováno mnoho dalších sloučenin, jako jsou konzervanty a kosmetické přísady. Retenční časy velkého množství konzervantů uvedených v příloze VI směrnice Rady týkající se kosmetických prostředků jsou uvedeny v práci N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schoulen, (1989). Determination of preservatives in cosmetic products II. High-performance liquid chromatographic identification (J, Chromatography 469, 317-398).

• 10.4 Pro ochranu analytické kolony lze použít vhodnou předkolonu.

• 10.5 Metoda byla zkoušena při okružním pokusu, na němž se podílelo devět laboratoří. Byly analyzovány tři vzorky. V následující tabulce jsou pro každý ze tři vzorků uvedeny střední hodnoty v % m/m (m), opakovatelnosti (r) a reprodukovatelnosti (R) zjištěné pro analyty, které byly ve vzorcích obsaženy:

^1) Je vydána na základě a v mezích zákona, jehož obsah umožňuje zapracovat příslušné předpisy Evropských společenství vyhláškou.

^2) První směrnice komise ze dne 22. prosince 1980 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (80/1335/EHS). Druhá směrnice komise ze dne 14. května 1982 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (82/434/EHS). Třetí směrnice komise ze dne 27. září 1983 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (83/514/EHS). Čtvrtá směrnice komise ze dne 11. října 1985 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (85/490/EHS). Směrnice komise ze dne 10. února 1987, kterou se mění první směrnice 80/1335/EHS o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (87/143/EHS). Směrnice komise ze dne 4. dubna 1990, kterou se mění druhá směrnice 82/434/EHS o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků (90/207/EHS). Pátá směrnice komise 93/73/EHS ze dne 9. září 1993 o metodách analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků. Šestá směrnice komise 95/32/ES ze dne 7. července 1995 o metodách analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků. Sedmá směrnice komise 96/45/ES ze dne 2. července 1996 o metodách analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků.