Vyhláška, kterou se mění vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum zjištěna v nejméně v 10^6 a 10^4 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

Dodatek 4

Pufry pro testovací postupy

OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

• 1. Pufry pro extrakci

• 1.1 Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)

Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.

Na2 HPO4 (bezvodý)	4,26 g
KH2PO4	2,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Užitečné mohou být následující složky:

	Účel	Množství (na litr)
Lubrolové vločky	Protisrážlivý prostředek (*)	0,5 g
DC silikonový odpěňovač	Odpěňovací činidlo (*)	1,0 ml
Tetrasodiumpyrofosfát	Antioxidační činidlo	1,0 g
Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP – 40)	Vázání inhibitorů PCR	50 g
(*) pro použití při extrakci homogenizací

• 1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)

Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.

Na2HPO4.12H2O	2,7 g
NaH2PO4. 2H2O	0,4 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

• 1. Pufry pro IF test

Pufr pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)

Tento pufr se používá k ředění protilátek.

Na2HPO4.12H2O	2,7 g
NaH2PO4.2H2O	0,4 g
NaCl	8,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

IF-pufr-Tween

Tento pufr se používá k oplachování podložních sklíček.

Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.

Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6

Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.

Na2HPO4 .12H2O	3,2 g
NaH2PO4 . 2H2O	0.15 g
Glycerol	50 ml
Destilovaná voda	100 ml

Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield^® (Vector Laboratories) nebo Citifluor^® (Leica).

• 1. Pufry pro účely nepřímého testu ELISA

• 3.1. Dvojnásobný uhličitanový potahovací pufr, pH 9,6.

Na2CO3	6,36 g
NaH CO3	11,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a steriluje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, je možné jako antioxidant přidat siřičitan sodný (0,2 %).

• 3.2. Desetinásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (10 x PBS), pH 7,4

NaCl	80,0 g
KH2PO4	2,0 g
Na2HPO4.12H2O	29,0 g
KCl	2,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

• 3.3. PBS-Tween

10 x PBS	100 ml
10 % Tween 20	5 ml
Destilovaná voda	895 ml

• 3.4. Blokační pufr (musí být čerstvě připraven).

10 x PBS	10,0 ml
Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44)	2,0 g
10 % Tween 20	0,5 ml
Sušené mléko	0,5 g
Destilovaná voda	doplnit do 100 ml

• 3.5. Roztok pro substrát alkalické fosfatázy, pH 9,8

Diethanolamin	97 ml
Destilovaná voda	800 ml

Rozpustí se a koncentrovanou HCl se upraví pH na 9,8.

Doplní se do 1 l destilovanou vodou.

Přidá se 0,2 g MgCl2.

Rozpustí se dvě 5 mg tabletky fosfatázového substrátu (Sigma) v 15 ml roztoku.

• 1. Pufry pro účely testu DASI ELISA

• 4.1. Potahovací pufr, pH 9,6.

Na2CO3	1,59 g
NaH CO3	2,93 g
Destilovaná voda	1 000 ml

Rozpustí se složky a zkontroluje pH 9,6.

• 4.2. 10 x fosfátosolný pufr (PBS) pH 7,2‒ 7,4

NaCl	80,0 g
Na2HPO4.12H2O	27 g
NaH2PO4.2H2O	4g
Destilovaná voda	1 000 ml

• 4.3. PBS-Tween

10 x PBS	50 ml
10 % Tween 20	5 ml
Destilovaná voda	950 ml

• 4.4 Substrátový pufr, pH 9,8

Diethanolamin	100 ml
Destilovaná voda	900 ml

Smíchá se a nastaví se hodnota pH 9,8 koncentrovanou HCl.

Dodatek 5

Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk

• 1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).

• 1. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku mikroskopického sklíčka (C).

C = c x S/s,

kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více okénky a

s = plocha pole objektivu.

s=πi2/4G2K2,

kde i = koeficient pole (v rozmezí 8-24 podle typu okuláru),

K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),

G = zvětšení objektivu (100 x, 40 x atd.).

• 1. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).

N =C x 1 000/y x F,

kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a

F = zřeďovací faktor resuspendované pelety

Dodatek 6

Validované protokoly a činidla pro PCR

Poznámka:

Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 10^3 až 10^4 buněk R. solanacearum na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií (viz dodatek 3).

• 1. Protokol PCR Seal et al. (1993)

• 1.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer OLI-1:	5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
Reverzní primer Y-2:	5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp

• 1.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	17,65 μl
10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 μl	1x (1,5 mM MgCl2)
Směs dNTP (20mM)	0,25 μl	0,2 mM
Primer OLI-1 (20 μM)	1,25 μl	1μM
Primer Y-2 (20 μM)	1,25 μl	1μM
Taq polymerasa (5U/μl) (1)	0,1 μl	0,5 U
Množství vzorku	2,0 μl
Celkové množství	25 μl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

• 1.3. Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus:	i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza)
vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

• 1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci při teplotě 37 °C.

• 1. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)

• 2.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer Ps-1:	5'-agt cga acg gca gcg ggg g -3'
Reverzní primer Ps-2:	5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553 bp.

• 2.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	16,025 μl
10x pufr PCR (1)	2,5 μl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 μl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 μl	0,1 mM
Primer Ps-1 (10 μM)	0,5 μl	0,2 μM
Primer Ps-2 (10 μM)	0,5 μl	0,2 μM
Taq polymerasa (5U/μl) (1)	0,1 μl	0,5 U
Množství vzorku	5,0 μl
Celkové množství	25,0 μl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. Poznámka: Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou být rovněž použity ve stejných koncentracích.

• 2.3 Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze)
vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

• 2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu

Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.

• 1. Protokol pro multiplexní PCR s interní kontrolou (Pastrik et al., 2002)

• 3.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer RS-1-F:	5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Reverzní primer RS-1-R:	5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Přímý primer NS-5-F:	5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
Reverzní primerNS-6-R:	5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 718 bp (sada primerů RS).

Očekávaná velikost amplikonu interní kontroly PCR 18S rRNA = 310 bp (sada primerů NS).

• 3.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	12,625 μl
10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 μl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 μl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 μl	0,1 mM
Primer RS-1-F (10 μM)	2,0 μl	0,8 μM
Primer RS-1-R (10 μM)	2,0 μl	0,8 μM
Primer NS-S-F (10 μM)(2)	0,15 μl	0,06 μM
Primer NS-6-R (10 μM)(2)	0,15 μl	0,06 μM
Taq polymeráza (5U/μl)(1)	0,2 μl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 μl
Celkové množství	25,0 μl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. (2) Koncentrace primerů NS-5-F a NS-6-R byly optimalizovány pro výkrojky pletiva pupkových částí hlíz bramboru pomocí homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz 6.1.6.1.a)). Použití extrakční metody třepáním nebo jiných metod izolace DNA může vyžadovat nové provedení optimalizace koncentrací reagencií.

• 3.3. Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus:	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
vi) nechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

• 3.4. Restrikční enzymová analýzy amplikonu

Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C.

• 1. Protokol PCR specifický pro biovar R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)

• 4.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer Rs-1-F:	5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Reverzní primer Rs-1-R:	5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Reverzní primer Rs-3-R:	5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum:

s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

• 4.2. Reakční směs PCR

• a) Protokol PCR specifický pro biovar ½

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	12,925 μl
10x pufr PCR(1)	2,5 μl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 μl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 μl	0,1 mM
Primer Rs-1-F (10 μM)	2,0 μl	0,8 μM
Primer Rs-1-R (10 μM)	2,0 μl	0,8 μM
Taq polymeráza (5U/μl)(1)	0,2 μl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 μl
Celkové množství	25,0 μl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

• b) Protokol PCR specifický pro Biovar 3/4/5

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	14,925 μl
10x pufr PCR (1)	2,5 μl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 μl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 μl	0,1 mM
Primer Rs-1-F (10 μM)	1,0 μl	0,4 μM
Primer Rs-3-R (10 μM)	1,0 μl	0,4 μM
Taq polymeráza (5U/μl) (1)	0,2 μl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 μl
Celkové množství	25,0 μl
(1)Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

• 4.3. Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces pro obě reakce specifické pro biovary 1/2- a biovary 3/4/5:

1 cyklus:	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
	vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

• 4.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

Produkty PCR vzniklé amplifikací DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-1-R vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-3-R nemají žádná restrikční místa.

• 1. Příprava nanášecího pufru

• 5.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)

Bromfenolová modř	5g
Destilovaná (redestilovaná) voda	50 ml

• 5.2. Nanášecí pufr

Glycerol (86 %)	3,5 ml
Bromfenolová modř (5,1)	300 μl
Destilovaná (redestilovaná) voda (bidestilát)	6,2 ml

• 1. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0

TRIS	48,4 g
Ledová kyselina octová	11,42 ml
EDTA (sodná sůl)	3,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Před použitím se zředí na 1X.

Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).

Dodatek 7

Validovaná činidla pro FISH test

• 1. Oligosondy

Sonda specifická pro R. solanacearum OLI-1-CY3:	5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC:	5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'

• 1. Fixační roztok

[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ. POUŽÍT RUKAVICE A NEVDECHNOUT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]

ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Zkontroluje se pH indikačním proužkem a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH. [UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ PH!]

iii) Přefiltruje se roztok přes membránový filtr 0,22 μm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.

• 1. 3x Hybmix

NaCl	2,7 M
Tris-HCl	60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)	15 mM

Zředí se až 1x, podle potřeby.

• 1. Hybridizační roztok

1x Hybmix
Sodium dodecyl sulfát (SDS)	0,01 %
Formamid	30 %
Sonda EUB 338	5 ng/μl
Sonda OLI-1 nebo OLI2	5 ng/μl

Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce 1. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 μl hybridizačního roztoku.UPOZORNĚNÍ: FORMAMID JE VELMI JEDOVATÝ, NUTNO POUŽÍVAT RUKAVICE A UČINIT POTŘEBNÁ BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ!

Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

Počet sklíček	1	4	6	8	10
Sterilní ultra čistá voda	23,1	92,4	138,6	184,8	231,0
3 x Hybmix	30,0	120,0	180,0	240,0	300,0
1 % SDS	0,9	3,6	5,4	7,2	9,0
Formamid	27,0	108,0	162,0	216,0	270,0
Sonda EUB 338 (100 ng/μl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Sonda OLI-1 nebo OLI2 (100 ng/μl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Celkové množství	90,0	360,0	540,0	720,0	900,0

Poznámka:

Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití se chrání před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.

• 1. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0

Na2HPO4	8,52 g
KH2PO4	5,44 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Dodatek 8

Pěstování lilku a rajčete

Vysejí se semena rajčete (Lycopersicon esculentum) nebo lilku (Solanum melongena) do pasterizovaného výsevního substrátu. Sazeničky s plně rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přesadí do pasterizovaného pěstebního substrátu.

Rostliny lilku a rajčete by se měly pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

Délka dne:		14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;
Teplota:	den:	21 až 24 °C,
noc:	14 až 18 °C.
Vhodná odrůda lilku vejcoplodého:	„Black Beauty“
---	---
Vhodná odrůda rajčete:	„Moneymaker“

Dodavatelé: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

LITERATURA

• 1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

• 1. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

• 1. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105;373-380.

• 1. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

• 1. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

• 1. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

• 1. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

• 1. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

• 1. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

• 1. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

• 1. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

• 1. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

• 1. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

• 1. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

• 1. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

• 1. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

• 1. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

• 1. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

• 1. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

• 1. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

• 1. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

• 1. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

• 1. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

• 1. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

• 1. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

• 1. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

• 1. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

• 1. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

• 1. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

• 1. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.“.

• 1. V příloze č. 2 části A se v nadpise a v první větě slova „odst. 12“ nahrazují slovy „odst. 11“.

• 1. V příloze č. 2 části A písm. a) poznámka pod čarou č. 1 zní:

„^1) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.

• 1. V příloze č. 2 části A písm. a) se za první odrážku vkládá nová odrážka, která zní:

„– celková plocha pěstování sadbových a ostatních brambor v hektarech,“.

• 1. V příloze č. 2 části A písm. a) čtvrté odrážce se slova „a hmotnost (v tunách)“ zrušují.

• 1. V příloze č. 2 části A písm. c) třetí odrážce se slova „– pro hnědou hnilobu“ zrušují.

• 1. V příloze č. 2 část B zní:

„ B. Uchování testovaných vzorků a partií a dokladování testování

• celá partie rostlin, z níž byl odebrán vzorek, nebo část této partie v původním obalu s etiketou, je-li to možné,

• všechny hlízy a pokud možno i rostliny odebraného vzorku,

• jakýkoliv zbývající extrakt a dodatečně připravený materiál pro screeningový(é) test(y), např. sklíčka pro imunofluorescenční test, a

• všechny příslušné podklady.

Uchování hlíz umožní případné testování odrůdové pravosti anebo použít jinou metodu testování.

• materiál specifikovaný v bodě 1,

• vzorek infikovaných rostlin lilku vejcoplodého nebo rajčete naočkovaných extraktem z hlíz nebo rostlin (v případě hnědé hniloby, kde je to vhodné), a

• izolovaná kultura původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby.“.

• 1. V příloze č. 3 bodu 1 pátá odrážka zní:

„– na němž byla k závlaze nebo postřiku použita povrchová voda ze zdroje, u něhož bylo potvrzeno, že je zamořen původcem hnědé hniloby nebo který je ze zamoření původcem hnědé hniloby podezřelý,“.

• 1. V příloze č. 3 bodu 2 první odrážce se slovo „označené“ nahrazuje slovem „označeném“.

• 1. V příloze č. 3 bodu 2 páté a šesté odrážce se slovo „objekty“ nahrazuje slovem „předměty“.

• 1. V příloze č. 3 bodu 2 šesté odrážce se slova „bodě 3 přílohy č. 4“ nahrazují slovy „příloze č. 6,“.

• 1. V příloze č. 3 bodu 2 sedmá odrážka zní:

„– hostitelské rostliny, které mají na základě testování podle § 6 stejný klonový původ jako hostitelské rostliny označené za zamořené podle § 5 odst. 1 písm. a), a u kterých rostlinolékařská správa na základě odborného šetření podle § 76 odst. 2 zákona označí vzhledem ke klonové souvislosti zamoření za pravděpodobné, a to včetně rostlin testovaných s negativním výsledkem; v případě pochybností o identitě zamořených a klonově příbuzných hostitelských rostlin rostlinolékařská správa určí testování odrůdové pravosti,“.

• 1. V příloze č. 3 bodu 2 desáté odrážce se za slovo „rostliny“ vkládají slova „původce hnědé hniloby“.

• 1. V příloze č. 3 bodu 3 čtvrté odrážce se slovo „zaplaveno“ nahrazuje slovem „zaplaveny“.

• 1. V příloze č. 3 bodu 3 páté odrážce se slova „každá jednotlivá“ nahrazují slovy „každou jednotlivou“ a na konci odrážky se tečka nahrazuje čárkou.

• 1. V příloze č. 3 bodu 3 se za pátou odrážku doplňuje nová odrážka, která zní:

„– vodní objekty, které jsou spojeny s povrchovou vodou označenou podle § 5 odst. 2 písm. b) za zamořenou původcem hnědé hniloby, s přihlédnutím ke směru toku a množství průtoku této vody a k planě rostoucím hostitelským rostlinám původce hnědé hniloby z čeledi lilkovitých.“.

• 1. V příloze č. 3 bod 4 zní:

„4. Náležitosti oznámení potvrzeného výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podle § 5 odst. 3.

4.1. Bezprostředně po potvrzení přítomnosti původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby laboratorními testy za použití metod stanovených v příloze č. 1 se oznámí Komisi a členským státům alespoň:

• u bramboru název odrůdy příslušné partie, druh dodávky (konzumní, sadba atd.), u sadby kategorie rozmnožovacího materiálu,

• u rajčete název odrůdy příslušné partie a případně kategorie rozmnožovacího materiálu.

Aniž jsou dotčeny požadavky na oznámení podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby podle § 4 odst. 4, pokud je potvrzen výskyt v partii bramboru nebo rajčete původem z jiného členského státu(jiných členských států) nebo hrozí riziko zamoření bramboru nebo rajčete v jiném členském státu(jiných členských státech), musí být neprodleně oznámeny dotčenému státu(dotčeným státům) informace nezbytné ke splnění opatření dle § 5 odst. 4, zejména:

• název odrůdy příslušné partie bramboru nebo rajčete,

• název a adresa odesílatele a příjemce partie,

• datum doručení a množství doručené partie,

• identifikace příslušného rostlinolékařského osvědčení podle § 21 odst. 1 písm. d) zákona, popřípadě kopie nebo číslo rostlinolékařského pasu, nebo registrační číslo pěstitele nebo obchodníka a kopie dodacího listu.

4.2. Po ukončení všech šetření se oznámí:

• datum potvrzení zamoření,

• stručný popis šetření provedeného k zjištění zdroje a možného rozšíření zamoření, včetně rozsahu provedeného odběru vzorků,

• informace o zjištěném nebo předpokládaném zdroji(zdrojích) zamoření,

• podrobnosti o rozsahu zamoření, včetně počtu míst produkce a počtu partií s uvedením odrůdy a u sadbových brambor kategorie rozmnožovacího materiálu,

• podrobnosti o vymezeném karanténním území a bezpečnostní zóně, včetně počtu míst produkce, která nebyla označena jako zamořená, ale nacházejí se v karanténním území nebo v bezpečnostní zóně,

• v případě původce hnědé hniloby podrobnosti o určení vodního zdroje, včetně názvu a umístění vodního objektu a rozsahu označení oblasti se zákazem zavlažování;

• pro každou zásilku nebo partii rostlin rajčete označenou za zamořenou, příslušné rostlinolékařské osvědčení podle § 21 odst. 1 písm. d) zákona a číslo rostlinolékařského pasu;

• další informace související s potvrzeným(i) zdrojem(zdroji) zamoření, které si Komise případně vyžádá.“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 1 písm. a) se slova „pro hlízy napadené původcem hnědé hniloby“ zrušují a za slovo „nebo“ se vkládají slova „v případě hlíz napadených původcem hnědé hniloby“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 1 písm. c) se za slova „funguje systém“ vkládají slova „očisty a“ a za slovo „zneškodňování“ slova „nebo likvidaci“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 1 písm. e) se slova „a při kterém“ nahrazují slovy „, pokud bylo prokázáno, že“ a na konci se tečka nahrazuje čárkou.

• 1. V příloze č. 4 bodu 1 se na konci tečka nahrazuje čárkou a doplňuje se písmeno f), které včetně poznámky pod čarou č. 1 zní:

• „f) spálení s přihlédnutím ke zvláštnímu zákonu^1).

^1) Zákon č. 86/2002 Sb., o ochraně ovzduší a o změně některých dalších zákonů (zákon o ochraně ovzduší), ve znění pozdějších předpisů.“.

Dosavadní poznámka pod čarou č. 1 se označuje jako poznámka pod čarou č. 3.

• 1. V příloze č. 4 bodu 1 text za písmenem f) zní:

„Při likvidaci jakéhokoliv odpadu souvisejícího s výše uvedenými možnostmi nebo vzniklého z výše uvedených možností musí být splněny požadavky na zneškodňování odpadů stanovené v příloze č. 5.

Opatření pod písmenem a) je možné použít k naložení s partií označenou jako zamořená jen v případě, kdy nebylo možné zcela využít postup v písmenech b) až e). Opatření nařízená v souladu s písmeny d) a e) sděluje rostlinolékařská správa neprodleně Komisi a ostatním členským státům. Pokud má být opatření pod písmeny a) až e) provedeno na území jiného členského státu, povinnná osoba o tom informuje rostlinolékařskou správu, která tuto informaci sdělí úřední organizaci rostlinolékařské péče příslušného členského státu.“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 2 písm. a) se za slovy „konzumní brambory“ vkládají slova „, v místě s vhodným zařízením na likvidaci odpadu dle požadavků stanovených v příloze č. 5“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 2 písmeno e) včetně poznámky pod čarou č. 2 zní:

• e) v případě původce kroužkovitosti a rozmnožovacího materiálu bramboru výsadba hlíz v karanténním území vymezeném podle § 5 odst. 1 písm. c) za podmínek, že:

• hlízy byly v tomto karanténním území vypěstovány a bylo prokázáno, že nedošlo k jejich bezprostřednímu kontaktu s hlízami partie označené za zamořenou,

• se karanténní území nenachází v uzavřené pěstební oblasti pro výrobu rozmnožovacího materiálu bramboru podle zvláštního zákona^2),

• porost bude rostlinolékařskou správou kontrolován a testován dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti,

• hlízy sklizené z příslušného porostu budou použity pouze způsobem podle písmene b) popř. d), pokud nepůjde o hlízy z partie označené za zamořenou,

^2) § 7 odst. 4 zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.

Dosavadní písmeno e) se označuje jako písmeno f).

Dosavadní poznámka pod čarou č. 2 se označuje jako poznámka pod čarou č. 5.

• 1. V příloze č. 4 bodu 2 text za písmenem f) zní: „Při likvidaci jakéhokoliv odpadu souvisejícího s výše uvedenými možnostmi nebo vzniklého z výše uvedených možností musí být splněny požadavky na zneškodňování odpadů stanovené v příloze č. 5.

Opatření nařízená v souladu s písmeny d), e) a f) sděluje rostlinolékařská správa neprodleně Komisi a ostatním členským státům. Pokud má být opatření pod písmeny a) až d) provedeno na území jiného členského státu, povinná osoba o tom v předstihu informuje rostlinolékařskou správu, která tuto informaci sdělí úřední organizaci rostlinolékařské péče příslušného členského státu tak, aby bylo možno zajistit úřední kontrolu nad plněním nařízeného opatření.“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 4.1.1. písmena a) až c) včetně poznámek pod čarou č. 3 a 4 znějí:

„a) nesmí po dobu tří vegetačních období následujících po roce potvrzení výskytu původce kroužkovitosti pěstovat brambor včetně osiva, a musí systematicky vyhledávat a likvidovat planě rostoucí rostliny bramboru a ostatní planě rostoucí hostitelské rostliny původce kroužkovitosti (§ 76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona)

nebo

musí tento pozemek po čtyři vegetační období udržovat jako černý úhor nebo jej po prvním roce černého úhoru na dobu tří vegetačních období zatravnit nebo osít jetelem, jetelotrávou, vojtěškou či vojtěškotrávou a porost na něm udržovat sekáním jako co nejnižší strniště, či intenzivně spásat, a musí na něm vyhledávat a odstraňovat planě rostoucí rostliny bramboru a ostatní planě rostoucí hostitelské rostliny původce kroužkovitosti (§ 76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona);

• během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru a ostatních planě rostoucích hostitelských rostlin původce kroužkovitosti,

• k výsadbě bude použit rozmnožovací materiál^3) nebo farmářská sadba^4) vypěstovaná pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovaná dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním, a

• sklizeň bude určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému zpracování (§ 76 odst.1 písm. a) bod 1. zákona);

^3) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.

^4) § 19a zákona č. 408/2000 Sb., o ochraně práv k odrůdám rostlin a o změně zákona č. 92/1996 Sb., o odrůdách, osivu a sadbě pěstovaných rostlin, ve znění pozdějších předpisů, (zákon o ochraně práv k odrůdám), ve znění pozdějších předpisů.“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 4.1.4. se na konci před středník vkládají slova „a sklizené brambory musí být testovány postupem podle přílohy č. 1 [§ 76 odst. 1 písm. d) zákona]“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 4.1.5. se slovo „manipulace“ nahrazuje slovem „manipulaci“, slovo „materiálu^1)“ slovem „materiálu^3)“ a za slova „materiálu^3) bramboru“ se vkládají slova „a farmářské sadby^4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle prílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 4.1.6. druhá odrážka zní: „– provádět očistu strojů, dopravních prostředků, skladovacích prostor, třídicích linek, obalů, palet a jiných předmětů po každém použití při výrobě hlíz bramboru po dobu stanovenou rostlinolékařskou správou [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona]; očista strojů se provádí po ukončení jejich práce na jednom pozemku s alespoň jedním porostem bramboru, očista skladovacích prostorů, obalů, palet, třídiček, dopravních prostředků a jiných předmětů vždy po vyskladnění jedné partie nebo ukončení práce s jednou partií;“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 4.1.7. se slovo „materiál^1)“ nahrazuje slovem „materiál^3)“ a za slovo „materiál^3)“ se vkládají slova „nebo farmářská sadba^4) vypěstovaná pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovaná dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním,“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 4.2. písm. a) se za slovo „brambor,“ vkládají slova „včetně osiva,“ a slovo „dezinfekce“ se nahrazuje slovem „dezinfekci“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 4.5. písmeno b) zní:

• „b) musí zabezpečit oddělenou manipulaci a oddělené skladování rozmnožovacího materiálu bramboru^3) a farmářské sadby^4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním od ostatních rostlin bramboru [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 4.5. písm. c) se slovo „materiál^1)“ nahrazuje slovem „materiál^3)“ a za slovo „materiál^3)“ se vkládají slova „nebo farmářskou sadbu^4) vypěstovanou pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovanou dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.2.1. písm. a) se za slova „hnědé hniloby“ vkládají slova „včetně osiva bramboru a rajčete,“ a slova „její přenos“ se nahrazují slovy „jeho přenos“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.2.1. písmena c) a d) znějí: „c) smí v případě režimu podle písmene a) pěstovat brambor nebo rajče v prvním vegetačním období, které následuje po splnění ustanovení uvedených pod písmenem a), ale jen s podmínkou, že

• během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru, rajčete a jiných hostitelských rostlin, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, a

• v případě pěstování brambor bude k výsadbě použit rozmnožovací materiál^3), a

• sklizeň bude určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému zpracování,

• v případě bramboru a rajčete budou sklizené bramborové hlízy či rostliny rajčete testovány postupem podle přílohy č. 1;

následně smí pěstovat brambor nebo rajče až po uplynutí vhodné rotace plodin stanovené rostlinolékařskou správou a v případě pěstování brambor musí k výsadbě použit rozmnožovací materiál^3), a sklizeň musí být určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému zpracování, pro případné pěstování sadbových brambor musí být předem proveden vymezovací průzkum výskytu původce hnědé hniloby podle § 3 odst. 3 [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];

• d) smí v případě režimu podle písmene b) pěstovat brambor nebo rajče v prvním vegetačním období, které následuje po splnění ustanovení uvedených pod písmenem b), ale jen s podmínkou, že

• během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru, rajčete a jiných hostitelských rostlin původce hnědé hniloby, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, a

• v případě pěstování brambor bude k výsadbě použit rozmnožovací materiál^3), a

• brambory mohou být pěstovány pro sadbové nebo konzumní účely nebo k průmyslovému zpracování, a v případě bramboru a rajčete budou sklizené bramborové hlízy, případně rostliny rajčete, testovány postupem podle přílohy č. 1 [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.2.1. písm. e) se slova „a po uplynutí odpovídajícího rotačního cyklu“ zrušují, slovo „materiál^2)“ se nahrazuje slovem „materiál^3)“ a slovo „zákona^2)“ slovem „zákona^5)“; poznámka pod čarou č. 5 zní:

„^5) § 6 zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.2.2. písm. a) se za slova „hostitelské rostliny původce hnědé hniloby“ vkládají slova „, včetně osiva bramboru a rajčete,“, na konci písm. a) se vkládá čárka a slovo „nebo“ a vkládají se dvě nové odrážky, které včetně poznámky pod čarou č. 6 znějí:

„– smí pěstovat brambor za podmínky, že k výsadbě bude použit pouze rozmnožovací materiál^3), který byl úředně uznán podle zvláštního zákona^5), a produkce bude určena výlučně pro konzumní účely nebo k průmyslovému zpracování [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona],

– smí pěstovat rajče pouze z osiva, které odpovídá požadavkům podle zvláštního právního předpisu^6), a to pouze pro produkci plodů [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];

^6) Příloha č. 4 vyhlášky č. 215/2008 Sb., o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů.“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.2.2. písmeno b) zní:

• „b) smí po dobu dvou let následujících po roce provedení opatření podle písmene a)

– k pěstování bramboru používat jen rozmnožovací materiál^3) nebo farmářskou sadbu^4) vypěstovanou pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovanou dle přílohy č. 1 na výskyt původce hnědé hniloby s výsledkem negativním,

– k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá požadavkům podle zvláštního právního předpisu^6), nebo rostliny rajčete vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.2.2. písmeno c) zní:

• „c) musí ihned po označení místa produkce za zamořené a následně až do doby prvého přípustného pěstování bramboru nebo rajčete každoročně provádět očistu a dezinfekci všech strojů a skladovacích zařízení používaných při pěstování bramboru nebo rajčete způsobem uvedeným v příloze č. 6 [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.2.2. se doplňuje písmeno e), které zní:

• „e) musí po dobu tří úplných vegetačních období od potvrzení výskytu původce hnědé hniloby vyhledávat a likvidovat planě rostoucí rostliny bramboru a ostatní planě rostoucí hostitelské rostliny původce hnědé hniloby [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona].“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.7. písm. a) se slova „jiných hostitelských rostlin“ nahrazují slovy „jiné hostitelské rostliny“ a za slova „hnědé hniloby včetně“ se vkládají slova „, osiva bramboru a“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.7. písm. b) se slovo „materiálu“ nahrazuje slovy „materiálu^3) úředně uznaného podle zvláštního zákona^5) nebo“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.7. se za písmeno b) vkládá nové písmeno c), které zní:

• „c) musí k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá požadavkům podle zvláštního právního předpisu^6), nebo rostliny rajčete vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];“.

Dosavadní písmeno c) se označuje jako písmeno d).

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.10. písmena b) až d) znějí:

• „b) zabezpečit oddělenou manipulaci a oddělené skladování rozmnožovacího materiálu^3) bramboru a farmářské sadby^4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle přílohy č. 1 na výskyt původce hnědé hniloby s výsledkem negativním od ostatních rostlin bramboru [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];

• c) k pěstování bramboru používat jen rozmnožovací materiál^3) nebo farmářskou sadbu^4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle přílohy č. 1 na výskyt původce hnědé hniloby s výsledkem negativním [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];

• d) k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá požadavkům podle zvláštního právního předpisu^6), nebo rostliny rajčete vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona].“.

• 1. V příloze č. 4 bodu 5.11. písmena a) a b) znějí:

• „a) provádí každoročně průzkum výskytu původce hnědé hniloby, a to vzorkováním povrchové vody a případných hostitelských rostlin z čeledi lilkovitých u dotyčných zdrojů vody způsobem stanoveným rostlinolékařskou správou a následným testováním podle příslušných metod stanovených v příloze č. 1;

• b) provádí kontrolu zavlažovacích a postřikových systémů a popřípadě stanoví takové podmínky umělého zavlažování hostitelských rostlin původce hnědé hniloby, aby se zabránilo jeho šíření, včetně zákazu používání vody označené za zamořenou k zavlažování a postřiku hostitelských rostlin původce hnědé hniloby. Tento zákaz může být odvolán v případě, kdy je na základě výsledků prováděného průzkumu prokázáno, že povrchová voda již není zamořena, nebo že jsou používány k zavlažování a postřiku technologie schválené rostlinolékařskou správou, které vylučují výskyt původce hnědé hniloby a jeho šíření;“.

• 1. V příloze č. 5 bod 1. včetně poznámky pod čarou č. 2 zní:

• „1. Pevný odpad ze zpracování hlíz brambor a rostlin rajčete

Vyhozené hlízy bramboru, bramborové slupky nebo plody rajčete a jiný pevný odpad vzniklý při zpracování hlíz bramboru (např. zemina, kamení apod.) a rostlin rajčete musí být:

• a) odvezeny do řízené skládky odpadů a okamžitě převrstveny vhodným materiálem (zemina, suť apod.). Odpad musí být přivezen přímo na skládku a musí být zabalen tak, aby bylo během transportu vyloučeno nebezpečí vypadnutí odpadu z dopravního prostředku.

Mohou být přitom využity jen takové skládky, u nichž je vyloučeno nebezpečí úniku původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby do prostředí, např. prosáknutím do zemědělsky využívané orné půdy nebo, v případě hlíz napadených původcem hnědé hniloby, do povrchových vod využívaných k zavlažování zemědělské půdy, nebo

• b) spáleny s přihlédnutím ke zvláštnímu zákonu^2), nebo

• c) zneškodněny jiným opatřením, které bylo předem písemně schváleno rostlinolékařskou správou a pokud bylo prokázáno, že nehrozí rozpoznatelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti ani hnědé hniloby. Tato opatření sděluje rostlinolékařská správa Komisi a ostatním členským státům.

^2) Zákon č. 86/2002 Sb., o ochraně ovzduší a o změně některých dalších zákonů (zákon o ochraně ovzduší), ve znění pozdějších předpisů.“.

• 1. V příloze č. 5 bodu 2. první odrážka zní:

— před vypuštěním zahřát po dobu minimálně 30 minut při teplotě minimálně 60 °C uvnitř objemu,“.

Čl. II

Účinnost

Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem jejího vyhlášení.

Ministr:

Mgr. Gandalovič v. r.