Legalize
Legalize / Česká republika / Vyhláška

Vyhláška, kterou se mění vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

Typ Vyhláška
Publikace 2008-09-02
Stav Platný
Zdroj e-Sbírka
článků Not indexed
Historie novel JSON API

4) Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu je popsán v oddíle 6.1.2.

5) Sérologické aglutinační testy bakteriálního slizu nebo extraktů z pletiva vykazujícího příznaky jsou popsány v oddíle 6.1.3.

6) Test IF bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.5.

7) Test FISH bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.7.

8) Test ELISA bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.8.

9) Test PCR bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.6.

10) Patogen je obvykle snadno izolovatelný z rostlinného materiálu vykazujícího příznaky metodou zřeďovacích roztěrů (postupným ředěním) (viz. v oddíle 2.3.).

11) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

12) Kultivace může selhat při pokročilých fázích infekce z důvodů konkurence nebo bujného růstu saprofytických bakterií. Jestliže jsou příznaky infekce typické, ale izolační test je negativní, musí se izolace opakovat, nejlépe kultivací na selektivních živných půdách.

13) Spolehlivá identifikace čistých kultur R. solanacearum se provede pomocí testů popsaných v bodu 6.2. Dílčí specifická charakteristika je nepovinná, ale doporučuje se pro každý nový případ.

14) Test patogenity je popsán v bodu 6.3.

Testování je určeno ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek alespoň ze dvou screeningových testů (viz poznámka v diagramu 3), z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogenu a dále, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je R. solanacearum. Pozitivní výsledek pouze z jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý. Screeningové testy a izolační testy musí umožnit detekční práh 10^3 až 10^4 buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.

[image omitted]

1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použit i na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.

2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.1.1.

3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, je pro validaci prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Je-li druhý nebo další test negativní, je vzorek považován za negativní. Další testy nejsou nutné.

4) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.

5) Test selektivní izolace je popsán v oddíle 6.1.4.

6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.

7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.

8) Testy ELISA jsou posány v oddíle 6.1.8.

9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, je třeba opakovat izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku, případně provést test s dalšími vzorky.

12) Spolehlivé identifikace čistých kultur podezřelých na R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích rostlin bramboru nevykazujících příznaky, rostlin rajčete nevykazujících příznaky nebo rostlin jiných hostitelských rostlin nevykazujících příznaky

[image omitted]

1) Viz. oddíl 3.2.1., kde jsou uvedeny doporučené velikosti vzorků.

2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.2.1.

3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se alespoň jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, vyžaduje se pro validaci prvního pozitivního výsledku provedení druhého nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Jsou-li druhý nebo další testy negativní, považuje se vzorek za negativní. Další testy nejsou nutné.

4) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

5) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.

6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.

7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.

8) Testy ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.8.

9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, opakují se izolační testy.

12) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že se jedná o R. solanacearum, se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

Rostlina bramboru. Raná fáze infekce v polních podmínkách se rozpozná vadnutím listů směrem k vrcholu rostliny při vysokých teplotách během dne, přičemž v noci dochází k zotavení. V raných fázích vadnutí zůstávají listy zelené, ale později žloutnou a objevují se hnědé nekrózy. Dochází také k ohýbání listů dolů. Vadnutí jednoho výhonku nebo celé rostliny se rychle stává nevratným a končí kolapsem a uhynutím rostliny. Z cévních svazků napříč uříznutých stonků zvadlých rostlin obvykle vytéká hnědý a mléčný bakteriální sliz nebo je možné sliz vymáčknout. Při ponoření uříznutého stonku svisle do vody se z cévních svazků táhnou vlákna slizu.

Hlíza bramboru. Hlízy bramboru je třeba překrojit napříč u pupkového konce a podélně přes pupkový konec. V rané fázi se infekce pozná podle láhvově žlutého až světle hnědého zabarvení cévního prstence, ze kterého po několika minutách začne prýštit bledý krémový bakteriální sliz. Později se cévní zbarvení stává výrazněji hnědým a odumření se může rozšířit do parenchymatického pletiva. V pokročilejších fázích se infekce rozšíří vně od pupkového konce hlízy a z oček může vytékat bakteriální sliz, na který se přilepují částice půdy. Na slupce se mohou objevit červenohnědá, lehce propadlá místa jako důsledek vnitřního kolapsu cévního pletiva. V pokročilejších fázích infekce je obvyklý sekundární rozvoj měkkých hnilob bakteriálního a houbového původu.

Rostlina rajčete. Prvním viditelným příznakem je povadlý vzhled nejmladších listů. Za příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy kolem 25°C, při nasycené vzdušné vlhkosti) se během několika málo dní rozvine kroucení listů směrem dolů a vadnutí na jedné straně rostliny nebo celé rostliny, které končí jejím úplným odumřením. Za méně příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy méně než 21°C) rostlina tolik nevadne, ale na stonku se může tvořit větší počet postranních výhonů. Je možné pozorovat vodou nasáklé pruhy od spodu stonku, které jsou dokladem odumírání cévního systému. Při příčném řezu stonkem vylučují hnědě zbarvená vodivá pletiva bílý nebo nažloutlý bakteriální sliz.

Rostliny Solanum dulcamara a S. nigrum. Za normálních podmínek jsou u těchto plevelných hostitelských rostlin zřídkakdy pozorovány příznaky vadnutí, pokud teploty půdy nepřevyšují 25°C nebo není extrémně vysoká koncentrace inokula (např. u rostliny S. nigrum rostoucí u nemocné rostliny bramboru nebo rajčete). Při vadnutí jsou příznaky stejné jako u rostliny rajčete. Nevadnoucí rostliny S. dulcamara, která má stonky a kořeny ve vodě, mohou vykazovat vnitřní světle hnědé zbarvení vodivých pletiv na příčném řezu spodní části stonku nebo částí stonku pod vodou. Z řezu cévních svazků mohou vytékat bakterie nebo mohou tvořit vlákna slizu, jestliže je řez stonku ponořen svisle do vody, a to i při absenci příznaků vadnutí.

Rychlé screeningové testy mohou napomoci předběžné diagnóze, ale nejsou dostačující. Použije se jeden nebo více následujících testů:

(Viz. 6.1.1.)

Charakteristické granule PHB v buňkách R. solanacearum jsou zviditelněny obarvením tepelně fixovaných skvrn bakteriálního slizu z infikovaného pletiva na mikroskopickém sklíčku nilskou modří A nebo súdánskou černí (viz. oddíl 6.1.2.).

(Viz. oddíl 6.1.3.)

Dalšími vhodnými rychlými screeningovými testy jsou test IF (viz.oddíl 6.1.5.), test FISH (viz.oddíl 6.1.7.), testy ELISA (viz.oddíl 6.1.8.) a testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.).

Testy potvrzující výskyt R. solanacearum v podezřelých izolátech jsou popsány v bodu 6.2.

Poznámka:

Nepovinné ošetření před přípravou vzorku

Poznámka:

Všechny (hnijící) hlízy s podezřelými příznaky hnědé hniloby se dají stranou a testují se odděleně.

Pokud jsou při vyříznutí výkrojku zjištěny příznaky podezření na hnědou hnilobu, provede se vizuální vyšetření takové hlízy na řezu hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se uchovávají po dobu nejméně 2 dnů při pokojové teplotě, aby mohlo dojít ke zkorkovatění (suberizaci) a potom se uchovávají v chladu (4-10°C) za řádných karanténních podmínek. Všechny hlízy včetně hlíz s podezřelými příznaky by měly být uchovány podle přílohy III.

Výkrojky z pupkových konců se zpracují jedním z následujících postupů:

nebo

Poznámka:

Při homogenizaci vzorků pomocí mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutné zamezit vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakčního procesu. Pro každý vzorek se použijí čerstvě sterilované nože (ostří) a nádoby. Při testu PCR je nutno zabránit přenosu DNA na nádobách nebo v mlecím přístroji. U testu PCR se doporučuje použít drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavek na jedno použití.

Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.

Je-li nutná přeprava extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu s doručením do 24 až 48 hodin.

Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:

Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)

IF test (viz.oddíl 6.1.5.)

Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)

Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)

Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)

Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)

Poznámka:

Pro účely detekce latentních populací R. solanacearum se doporučuje testovat smíšené vzorky. Postup lze vhodně použít na smíšené vzorky o počtu až 200 stonkových částí. Provádí-li se průzkum, měl by být založen na statisticky reprezentativním vzorku zkoumané rostlinné populace.

Rajčatové sazenice z předpěstírny: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere kousek dlouhý 1 cm z paty každého stonku hned nad úrovní země.

Rostliny z pole nebo skleníku: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere nejspodnější postranní výhonek z každé rostliny uříznutý hned nad spojením s hlavním stonkem. Odebere se nejspodnější, 1 cm dlouhý díl z každého výhonku.

Jiné hostitelské rostliny: Čistým dezinfikovaným nožem nebo zahradnickými nůžkami se odebere 1 cm dlouhý díl z paty každého stonku hned nad úrovní země. U lilku potměchuti (S. dulcamara) nebo jiných hostitelských rostlin rostoucích ve vodě se odeberou 1-2 cm díly ze stonku pod vodou nebo oddenků s vodními kořeny.

Při vzorkování určité oblasti se doporučuje testovat statisticky representativní vzorek o počtu nejméně 10 rostlin na 1 vzorkovací místo pro každou potenciální plevelnou hostitelskou rostlinu. Detekce patogenu bude nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu, ačkoli přirozenou infekci je možné zjistit po celý rok u víceleté Solanum dulcamara rostoucí ve vodních tocích. Mezi známé hostitelské rostliny patří plevelné rostliny bramboru, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium a další zástupci čeledi Solanaceae. Dalšími hostitelskými rostlinami jsou rostliny rodu Pelargonium spp. a Portulaca oleracea. Některé evropské plevelné druhy, které mohou hostit populace R. solanacearum biovar 2/Race 3 v kořenech a/nebo oddencích za specifických podmínek, zahrnují Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra a Urtica dioica.

Poznámka:

V této fázi je možné provést vizuální šetření vnitřních příznaků (zbarvení cév nebo bakteriální sliz). Jakýkoli díl stonku s příznaky se dá stranou a testuje se odděleně (viz. oddíl 2.).

nebo

Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:

Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)

Test IF (viz. oddíl 6.1.5.)

Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)

Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)

Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)

Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)

[image omitted]

(1) Viz. oddíl 4.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování.

(2) Metody koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 4.2.1. Koncentrace zvětšuje populaci jak patogenu, tak konkurenčních saprofytických bakterií a doporučuje se jen tehdy, jestliže nebrání izolačnímu testu.

(3) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

(5) Metody obohacovacího testu PCR jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.

(6) Metody obohacovacího testu ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.8.

(7) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

(8) Kultivace může selhat z důvodu konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření, že velká saprofytická populace ovlivní spolehlivost izolace, opakují se izolační testy po zředění vzorku sterilní vodou.

(9) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

(10) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

Princip

Validované schéma detekce popsané v tomto oddíle je použitelné k detekci patogenu ve vzorcích povrchové vody a rovněž může být použito k testování vzorků odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody. Očekávaná citlivost detekce se však liší v závislosti na substrátu. Citlivost testu selektivní izolace je ovlivňována populacemi konkurenčních saprofytických bakterií, kterých je obecně mnohem více v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě než v povrchové vodě. Zatímco níže uvedené schéma předpokládá detekci asi 10^3 buněk/litr povrchové vody, citlivost detekce v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě bude pravděpodobně podstatně nižší. Z tohoto důvodu se doporučuje testovat odpadní vodu po provedení nějakého čistícího postupu (např. sedimentace nebo filtrace), při nichž dojde ke snížení saprofytických bakteriálních populací. Omezení citlivosti testovacího schématu by mělo být bráno v úvahu při hodnocení spolehlivosti v případě získání negativních výsledků.Vzhledem k tomu, že se toto schéma používá úspěšně k mapování výskytu nebo nepřítomnosti patogenu v povrchové vodě, je třeba si uvědomit jeho omezení při použití k podobnému mapování v odpadní vodě ze zpracování brambor a v odpadní vodě.

Poznámka:

Koncentrace se obvykle nedoporučuje u vzorků vody ze zpracování brambor nebo u vzorků odpadní vody, protože zvýšená populace konkurenčních saprofytických bakterií inhibuje detekci Ralstonia solanacearum.

Viz. postupový diagram a popis testů v příslušných dodatcích.

[image omitted]

(1) Viz. oddíl 5.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování

(2) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

(3) Obohacovací PCR testy jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.

(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

(5) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

(6) Kultivace může selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření na vliv saprofytické populace na spolehlivost izolace, opakují se testy selektivní izolace po dalším zředění vzorku.

(7) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

(8) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

Principy

Platné detekční schéma popsané v tomto oddíle je použitelné pro detekci patogenu ve vzorcích půdy, ale může být rovněž použito k testování vzorků pevného odpadu při zpracování brambor nebo kalu z odpadní vody. Je však nutné poznamenat, že tyto metody nejsou dostatečně citlivé, aby zaručovaly detekci nízkých nebo nepravidelně rozptýlených populací Ralstonia solanacearum, které se mohou vyskytovat v přirozeně infikovaných vzorcích těchto substrátů.

Při hodnocení spolehlivosti všech získaných negativních výsledků a také při sestavování přehledů určujících přítomnost patogenu v půdě nebo kalu je třeba vzít v úvahu omezenou citlivost tohoto testovacího schématu. Nejspolehlivějším testem přítomnosti patogenu v polní půdě je vypěstování náchylné hostitelské rostliny a její sledování, zda není infikována, ale i při použití této metody unikne nízký stupeň zamoření pozornosti.

Postupový diagram a popis testů jsou v příslušném dodatku.

Přítomnost R. solanacearum ve stoncích vadnoucích rostlin bramboru, rajčete nebo jiných hostitelských rostlin může ukázat následující jednoduchý test pravděpodobného výskytu: uřízne se stonek právě nad úrovní země. Řez stonku se ponoří do zkumavky s čistou vodou. Sleduje,se, zda se po několika minutách objeví charakteristická samovolně proudící vlákna bakteriálního slizu z přeříznutých cévních svazků.

Test nilskou modří:

Test súdánskou černí:

Aglutinace buněk R. solanacearum v bakteriálním slizu nebo v extraktech z pletiv s příznaky je nejlépe pozorovatelná pomocí validovaných protilátek (viz. dodatek 3) označených příslušnými obarvenými značkovači, např. červenými buňkami Staphylococcus aureus nebo obarvenými latexovými částicemi. Při použití komerčně dostupného vybavení (viz. dodatek 3) se postupuje podle instrukcí výrobce. Jinak je postup následující:

Poznámka:

Než se použije tato metoda poprvé, provede se předběžný test k zajištění reprodukovatelné detekce 10^3 až 10^4 jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaných do extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Použije se řádně validovaná selektivní živná půda, např. SMSA (ve znění Elphinstone et al., 1996; viz. dodatek 2).

Rozlišení R. solanacearum od jiných bakterií schopných na živné půdě růst vyžaduje velkou pozornost. Dále, kolonie R. solanacearum mohou mít atypickou morfologii, jestliže Petriho misky jsou přeplněny nebo jsou rovněž přítomny antagonistické bakterie. Je-li podezření na konkurenci nebo inhibici, měl by být vzorek otestován znovu pomocí jiného testu.

Při použití čerstvě připravených extraktů ze vzorků lez očekávat, že citlivost detekce touto metodou bude velmi vysoká. Metoda je však použitelná i pro extrakty, které byly uchovány v glycerolu při teplotě od -68 do -86°C.

Pozitivní kontroly se připraví jako desetinné ředění ze suspenze 10^6 cfu/ml virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762= CFBP 3857). K vyloučení možné kontaminace se připraví pozitivní kontrolní vzorky zcela odděleně od vzorků k testování.

U každé nově připravené šarže selektivní živné půdy by měla být před jejím použitím k rutinnímu testování vzorků nejdříve otestována její vhodnost pro kultivaci patogenu. Kontrolní materiál se testuje týmž způsobem jako vzorek (vzorky).

Poznámka:

Někdy se na tomto médiu tvoří atypické kolonie R. solanacearum. Mohou být malé, kruhové, zcela červené a nefluidní nebo jen částečně fluidní, a proto obtížně rozeznatelné od saprofytických bakterií tvořících kolonie.

Interpretace výsledků testu očkováním na selektivní média.

Test očkování na selektivní média je negativní, jestliže po 6 dnech nejsou zpozorovány žádné bakterie nebo nejsou nalezeny žádné podezřelé kolonie typické pro R. solanacearum, za předpokladu, že nedošlo k inhibici jinými bakteriemi a v kontrolních vzorcích jsou nalezeny typické kolonie R. solanacearum.

Test očkování na selektivní média je pozitivní, jestliže jsou izolovány podezřelé kolonie R. solanacearum.

Použije se validované médium pro obohacení, např. modifikovaný bujón Wilbrink (viz dodatek 2).

Tento postup lze použít pro selektivní zvětšení populací R. solanacearum v extraktech ze vzorků a zvýšení citlivosti detekce. Tímto způsobem dojde i ke zředění potenciálních inhibitorů PCR testu (1:100). Obohacení R. solanacearum však může být neúspěšné z důvodů konkurence nebo antagonismu saprofytických organismů, které bývají často současně také obohaceny. Z tohoto důvodu může být izolace R. solanacearum z obohacené kultury obtížná. Kromě toho, protože může dojít k rozvoji populací sérologicky příbuzných saprofytů, se pro test ELISA doporučuje použít místo polyklonálních protilátek specifické monoklonální protilátky.

Poznámka:

Očekává-li se inhibice obohacení R. solanacearum z důvodu vysoké koncentrace konkurenčních saprofytických bakterií, lze docílit lepších výsledků obohacením extraktů ze vzorků před jakýmkoli odstřeďováním nebo jinými postupy zvyšování koncentrace.

Postup

Použití testu IF jako hlavního screeningového testu se doporučuje kvůli dokázané spolehlivosti v dosažení požadovaných prahů.

Použije-li se test IF jako hlavní a výsledek IF testu je pozitivní, musí být jako druhý screeningový test použit test izolace, PCR nebo FISH. Jestliže je test IF použit jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.

Poznámka:

Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se určit titr pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování suspenze obsahující 10^5 až 10^6 buněk/ml homologického kmene R. solanacearum a použitím vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Validovaná polyklonální antiséra mají všechna titr IF nejméně 1:2 000. Během testování by měly být použity protilátky v pracovních ředěních blízkých nebo stejných jako titr.

Test by měl být proveden na čerstvě připravených extraktech ze vzorků. Jestliže je to nutné, může být úspěšně proveden na vzorcích uchovaných při teplotě - 68 až - 86 °C v glycerolu. Glycerol může být ze vzorku odstraněn přidáním 1 ml pufru (dodatek 4), 15minutovým odstřeďováním při 7000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. Často to není potřeba, zvláště pokud jsou vzorky fixovány na sklíčka plamenem.

Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo jiným referenčním kmenem R. solanacearum suspendovaným v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B, a nepovinně v pufru.

Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě - 16 až 24 °C) by se mělo podle možností použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.

Jako negativní kontroly se použijí alikvotní díly extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.

Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, pokud možno s 10 okénky s průměrem nejméně 6 mm.

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.

i)

Pro pelety s relativně nízkým množstvím sedimentu škrobu:

Napipetuje se odměřené standardní množství (15 μl je vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru) resuspendované bramborové pelety v ředění 1/100 do prvního okénka. Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhá řada může být použita jako duplikát nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr. 1.

ii) Pro jiné pelety:

Připraví se desetinná ředění (1/10, 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetuje se odměřené standardní množství (15 μl je vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru) resuspendované pelety pro každé ředění do řady okének. Druhá řada může být použita jako rezervní nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr.2.

Pokud je potřeba, fixovaná sklíčka je možné skladovat ve zmrazeném stavu v suchém boxu po nezbytně krátkou dobu (maximálně 3 měsíce) před dalším testováním.

i)

Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.i):

Připraví se sada dvojnásobných zředění. První jamka by měla mít 1/2 titru (T/2), ostatní 1/4 titru (T/4), 1/2 titru (T/2), titr (T) a dvojnásobek titru (2T).

ii) Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.ii):

Připraví se pracovní ředění (PŘ) protilátek v pufru IF. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.

Ředění resuspendované pelety

[image omitted]

Obrázek 1. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.i) a 6.1.5.3.i)

Pracovní ředění antitiséra/protilátky

[image omitted]

Obrázek 2. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.ii) a 6.1.5.3.ii)

Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:

Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.

Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (odst. 6.1.5).

Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

i)

Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek 5).

Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně 5 x 10^3. Vzorek je považován za potenciálně infikovaný a je povinné další testování.

ii) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než 5 x 10^3 buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.

Principy

Použije-li se test PCR jako hlavní screeningový test a výsledek je pozitivní, musí být povinně proveden druhý screeningový test, a sice izolace nebo IF. Jestliže je PCR použita jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.

Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.

Poznámka:

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10^3 až 10^4 buněk R. solanacearum na 1 ml přidaný do vzorků extraktů, které byly předtím testovány jako negativní. Dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích může vyžadovat optimalizační pokusy.

Použijí se schválená činidla a protokoly PCR (viz dodatek 6). Pokud možno, zvolí se metoda s interní kontrolou.

Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření k zabránění kontaminace vzorku cílovou DNA. Test PCR by měl být prováděn zkušenými laboranty v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.

S negativními kontrolami (v průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.

PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:

Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:

Aby se zabránilo případné kontaminaci, připravují se pozitivní kontroly v prostředí odděleném od vzorků, které budou testovány.

Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.

Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.

Používají se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky (viz. dodatek 3).

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.

K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymových reakcí a koncentrující cílovou DNA ve vzorku. Následující metoda byla optimalizována pro použití se schválenými metodami PCR uvedenými v dodatku 6.

Jiné metody extrakce DNA, např. Qiagen DNeasy Plant Kit, by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10^3 až 10^4 patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.

Interpretace výsledků testu PCR

Test PCR je negativní, jestliže amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti není u zkoumaného vzorku zjištěn, ale je zjištěn u všech pozitivních kontrolních vzorků (v případě vícenásobné PCR s interními kontrolními primery specifickými pro rostlinu: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován se zkoumaným vzorkem).

Test PCR je pozitivní, jestliže je zjištěn amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti a (případně) vzoru, za předpokladu, že není amplifikován u žádného vzorku negativní kontroly. Spolehlivé potvrzení pozitivního výsledku lze také získat opakováním testu s druhou sadou primerů PCR dodatek 6).

Poznámka:

Lze mít podezření na inhibici PCR, jestliže je získán očekávaný amplikon ze vzorku pozitivní kontroly obsahujícího R. solanacearum ve vodě, zatímco ze vzorku pozitivní kontroly R. solanacearum v bramborovém extraktu byly získány negativní výsledky. V multiplexních protokolech PCR s interními kontrolami PCR nasvědčuje inhibici reakce, jestliže není získán žádný ze dvou amplikonů.

V případě, že očekávaný amplikon je získán z jednoho nebo více vzorků negativních kontrol, je podezření na kontaminaci.

Princip

Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test provedena izolace nebo IF test. Když se FISH test provede jako druhý vyšetřovací test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.

Poznámka:

Používají se schválené oligosondy specifické pro R. solanacearum (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 10^3-10^4 buněk R. solanacearum na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě - 16 až - 24 °C nebo - 68 až - 86 °C.

Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem.

Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml R. solanacearum biovar 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 3) v 0,01M fosfátovém pufru (PB) ze 3-5 denní kultury. Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmenu nebo jiného referenčního kmene R. solanacearum, suspendovaného v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B.

Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.

Standardizovaný pozitivní a negativní kontrolní materiál, který se používá v tomto testu, je uveden v dodatku 3 bodu A.

Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako u vzorku(ů).

Následující protokol vychází z Wullingse et al. (1998).

Obrázek 7.1 Rozmístění na sklíčku FISH

[image omitted]

V této fázi je možné postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.

i)

Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum a při použití rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadne se průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítá počet typických buněk v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň 5 x 10^3 typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za pravděpodobně infikované. Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než 5 x 10^3 typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za negativní.

ii) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.

Princip

Testy ELISA lze použít pouze jako volitelný test kromě testů IF, PCR nebo FISH pro jeho relativně nízkou citlivost. Při použití DAS ELISA je obohacení a použití monoklonálních protilátek povinné. Obohacení vzorků před použitím testu ELISA může zvýšit citlivost testu, ale může se rovněž setkat s nezdarem kvůli konkurenci jiných organismů ve vzorku.

Poznámka:

Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se určení titru pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování suspense obsahující 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml homologického kmene R. solanacearum a použití vhodných druhotných konjugátů protilátek podle doporučení výrobce. Při testování by měly být použity protilátky v pracovním ředění, které je blízké nebo stejné jako u titru komerční formulace.

Určí se titr protilátek pro suspenzi 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml homologického kmene R. solanacearum.

Vzorek, který byl předtím otestován jako R. solanacearum negativní a suspenze bakterií bez vzájemného působení v solném roztoku fosfátového pufru (PBS) se použijí jako vzorky negativní kontroly.

Jako pozitivní kontrolní vzorky se použijí alikvótní podíly vzorkových extraktů, které byly předtím otestovány jako negativní, s příměsí 10^3 až 10^4 buněk na 1 ml biovaru 2 R. solanacearum (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 2 A a B). Pro srovnání výsledků na každé destičce se použije standardní suspenze 10^5 až 10^6 buněk na 1 ml v PBS R. solanacearum. Pozitivní kontrolní vzorky musí být na mikrotitrové destičce dobře odděleny od vzorků k testování.

Standardizované pozitivní a negativní materiály, které se používají pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3 bodu A.

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorku(ů).

Validované jsou dva protokoly ELISA.

1) Použije se 100-200 μl vzorkového extraktu. (Zahřátí na 100 °C na 4 minuty ve vodní lázni nebo topném boxu může v některých případech redukovat vznik nespecifických výsledků).

2) Přidá se stejné množství dvojnásobně silného uhličitanového krycího pufru (dodatek 4) a směs se promíchá.

3) Nakape se 100 μl do každé jamky mikrotitrační destičky (např. Nunc-Polysorp nebo rovnocenné) a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C nebo 14 –18 h při teplotě 4 °C.

4) Extrakty se vylijí z jamek. Jamky se třikrát vymyji pomocí PBS-Tween (dodatek 4) a poslední vymývací roztok se nechá v jamce nejméně 5 minut.

5) Připraví se vhodné ředění protilátek proti R. solanacearum v blokačním pufru (dodatek 4). U validovaných komerčních protilátek se použijí doporučená ředění (obvykle dvojnásobné koncentrace, než je titr).

6) Přidá se 100 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.

7) Roztok protilátek se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4.).

8) Připraví se vhodné ředění konjugátu alkalické fosfatázy v blokačním pufru. Přidá se 100 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.

9) Konjugát se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4).

10) Přidá se 100 μl substrátového alkalického roztoku fosfatázy (dodatek 4) do každé jamky. Nechá se inkubovat v temnu při pokojové teplotě a odečítá se absorbance při 405 nm v pravidelných 90minutových intervalech.

1) Připraví se vhodné ředění polyklonálního imunoglobulinu v uhličitanovém pufru pH 9.6 (dodatek 4). Přidá se 200 μl do každé jamky. Nechá se inkubovat při teplotě 37 °C 4 až 5 hodin nebo 4 ° C po dobu 16 hodin.

2) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).Přidá se 190 μl extraktu ze vzorku do nejméně dvou jamek. Přidají se rovněž pozitivní a negativní kontrolní vzorky do dvou jamek na každé destičce. Nechá se inkubovat 16 hodin při teplotě 4 °C.

3) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).

4) Připraví se vhodné ředění specifických monoklonálních protilátek R. solanacearum v PBS (dodatek 4) s obsahem 0,5 % hovězího sérového albuminu (BSA), přidá se 190 μl do každé jamky a nechá stát 2 hodiny při teplotě 37 °C.

5) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).

6) Připraví se ředění protimyšího imunoglobulinu konjugovaného alkalickou fosfatázou v PBS. Přidá se 190 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 2 hodiny při teplotě 37 °C.

7) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).

8) Připraví se roztok 1 mg p-NPP/ml alkalické fosfatázy v substrátovém pufru (dodatek 4). Přidá se 200 μl do každé jamky a inkubuje se v temnu při pokojové teplotě. Absorbance při 405 nm se odečítá v pravidelných intervalech 90 minut.

Interpretace výsledků testu ELISA

Test ELISA je negativní, jestliže průměrná hodnota optické hustoty (OH) z jamek se stejnými vzorky je menší než dvojnásobek OH u negativního kontrolního vzorku, pokud všechny hodnoty OH pozitivních kontrolních vzorků jsou větší než 1,0 (po 90 minutách inkubace se substrátem) a jsou větší než dvojnásobek OH získané z negativních vzorkových extraktů.

Test ELISA je pozitivní, jestliže průměrné hodnoty OH z jamek se stejným vzorkem jsou větší než dvojnásobek OH v negativním extraktu testovaného vzorku, pokud hodnoty OH ve všech negativních kontrolních vzorcích jsou menší než dvojnásobek hodnot v pozitivních kontrolních vzorcích.

Negativní hodnoty ELISA v pozitivních kontrolních vzorcích ukazují, že test nebyl proveden správně nebo že byl inhibován. Pozitivní hodnoty ELISA v negativních kontrolních vzorcích ukazují, že došlo k vzájemné kontaminaci nebo nespecifickému vázání protilátek.

Poznámka.:

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelnou detekci 10^3 až 10^4 jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaný do extraktu ze vzorku, který byl předtím testován s negativním výsledkem (přípravu viz v dodatku 3).

Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a v optimálních růstových podmínkách. Metodu lze však také úspěšně použít na extrakty, které byly uchovány v glycerolu v teplotě - 68 až - 86 °C.

Následující protokol vychází z Janseho (1988):

Inokulují se stonky rostlin hned nad děložními listy pomocí stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23G). Vzorek se rozdělí mezi testovací rostliny.

Rostlina se přidrží mezi dvěma prsty a pipetou se kápne přibližně 5-10 μl suspendované pelety na stonek mezi děložními listy a prvním listem.

Sterilním skalpelem se udělá příčný řez asi 1 cm dlouhý a hluboký přibližně 2/3 tloušťky stonku, přičemž řez se začne v místě kapky resuspendované pelety.

Řez se utěsní sterilní vazelínou z injekční stříkačky.

Hledají se příznaky vadnutí, epinastie, chloróz anebo krnění rostlin.

Interpretace výsledků biotestu

Platné výsledky biotestu jsou získány, jestliže pozitivní kontrolní testovací rostliny vykazují typické příznaky, bakterie mohou být z těchto rostlin znovu izolovány a negativní kontrolní rostliny nevykazují žádné příznaky.

Biotest je negativní, jestliže rostliny nejsou infikovány bakteriemi R. solanacearum, pokud byl organismus zjištěn u pozitivních kontrolních testovacích rostlin.

Biotest je pozitivní, jestliže testovací rostliny jsou infikovány bakteriemi R. solanacearum.

Identifikují se čisté kultury izolovaného podezřelého organismu R. solanacearum použitím nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.

Zahrnou se případně známé referenční kmeny pro každý provedený test (viz dodatek 3).

Určují se následující fenotypové vlastnosti, které jsou vesměs přítomny nebo naopak chybí u R. solanacearum, metodami Lelliott a Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

Text Očekávaný výsledek
Produkce fluorescenčního pigmentu -
Inkluze PHB +
Oxidačně fermentační test O+/F-
Katalázová aktivita +
Oxidázový test podle Kovacse +
Redukce dusičnanů +
Využití citrátů +
Růst při 40°C -
Růst v 1% NaCl +
Růst v 2% NaCl -
Arginin-dihydrolázová aktivita -
Ztekucení želatiny -
Hydrolýza škrobu -
Hydrolýza eskulinu -
Produkce levanu -

Média a metody viz. Lelliot &Stead (1987).

Poznámka:

Při provádění pouze 2 identifikačních testů se nepoužívá kromě této metody jiný sérologický test.

Pro každý nový případ izolace R. solanacearum se doporučuje charakteristika kmenu použitím jedné z následujících metod.

U každého provedeného testu se zahrnou případně známé referenční kmeny (viz. dodatek 3).

R. solanacearum tvoří biovary lišící se schopností využití a/nebo oxidace tří disacharidů a tří hexosových alkoholů (Hayward, 1964 a Hayward et al., 1990). Živná půda pro test biovaru je popsána v dodatku 2. Test lze úspěšně provést očkováním do živné půdy s čistou kulturou R. solanacearum a inkubací při teplotě 28 °C. Je-li živná půda rozdělena na sterilní destičky s 96 jamkami (200 μl na 1 jamku), zbarvení se mění během 72 hodin od olivově zelené po žlutou a znamená pozitivní výsledek testu.

[image omitted]

Dodatečné testy pro rozlišení dílčích fenotypů biovaru 2

[image omitted]

Molekulární identifikace kmenů komplexu R. solanacearum lze dosáhnout několikerými technikami, mezi něž patří:

Specifické primery PCR (Pastrik et al, 2002; viz dodatek 6) lze použít k diferenciaci kmenů patřících do skupiny 1 (biovary 3, 4 a 5) a skupiny 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum, jak bylo původně definováno analýzou RFLP (Cook et al., 1989) a sekvenováním 16S rDNA (Taghavi et al., 1996).

Jako závěrečné potvrzení diagnózy R. solanacearum a k potvrzení virulence kultur identifikovaných jako R. solanacearum musí být proveden test patogenity.

1) Připraví se inokulum o hustotě přibližně 10^6 buněk na 1 ml ze 24 až 48 hodinových kultur k testování a příslušný kmen pozitivní kontroly R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3).

2) Inokuluje se 5 až 10 náchylných sazenic rajčete nebo lilku ve fázi 3 pravých listů (viz odst. 6.1.9).

3) Sazenice se nechají inkubovat až 2 týdny při teplotě 25-28 °C a vysoké relativní vzdušné vlhkosti s přiměřeným zaléváním, bez vystavení zamokření nebo vyprahlosti půdy. U čistých kultur by typické vadnutí mělo nastat během 14 dnů. Neobjeví-li se po této době příznaky, kultura nemůže být považována jako patogenní forma R. solanacearum.

4) Hledají se příznaky vadnutí a/nebo epinastie, chlorózy nebo krnění.

5) Provede se izolace z rostlin vykazujících příznaky odebráním segmentu ze stonku asi 2 cm nad místem inokulace. Segment se rozmělní a suspenduje v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fosfátového pufru (dodatek 4). Izolace ze suspense se provede zřeďovacím roztěrem pokud možno na selektivní živné půdě (dodatek 2). Po inkubaci 48 až 72 hodin při teplotě 28 °C se vyhodnotí výskyt typických kolonií pro R. solanacearum.

Dodatek 1

Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů

Laboratoř (1) Místo Země
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Vídeň a Linec Rakousko
Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgie
Plantedirektoratet Lyngby Dánsko
Central Science Laboratory York Anglie
Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Skotsko
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Francie
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Francie
Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Německo
Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Německo
State Laboratory Dublin Irsko
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali Boloň Itálie
Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi Fitosanitari Verona Itálie
Nederlandse Algemene Keuringsdienst Emmeloord Nizozemsko
Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Nizozemsko
Direcção-General de Protecção das Culturas Lisabon Portugalsko
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia Salamanca Španělsko
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias Valencie Španělsko
Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala Švédsko
(1) Kontakty: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Dodatek 2

Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum

Živný agar (NA)
Živný agar (Difco) 23,0 g
Destilovaná voda 1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Kvasnično-pepton-glukózový agar (YPGA)
Kvasnicový extrakt (Difco) 5,0 g
Bacto-Pepton (Difco) 5,0 g
D(+) Glukóza (monohydrát) 10,0 g
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Sacharózopeptonový agar (SPA)
Sacharóza 20,0 g
Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g
K2 HPO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,25 g
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
pH 7,2–7,4

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Kelmanovo tetrazoliové médium
kasein hydrolyzát (Difco) 1,0 g
Bacto-Pepton (Difco) 10,0 g
Dextróza 5,0 g
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Ochladí se na 50 °C a přidá se filtrem sterilizovaný roztok 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma), až do dosažení konečné koncentrace 50 mg na litr.

Živná půda SMSA (Englebrecht, 1994 ve znění Elphinstone et al., 1996)

Základní živná půda
Casamino kyseliny (Difco) 1,0 g
Bacto-Pepton (Difco) 10,0 g
Glycerol 5,0 ml
Bacto-Agar (Difco) (viz pozn. 2) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Ochladí se na 50 °C a přidá filtrem sterilizovaný vodný roztok následujících složek, aby se získala stanovená konečná koncentrace:

Krystalová violeť (Sigma) 5 mg/l
Polymixin-B-sulfát (Sigma P1004) 600 000 U (přibližně 100 mg)/l
Bacitracin (Sigma B-0125) 1 250 U (přibližně 25 mg)/l
Chloramfenikol (Sigma C-3175) 5 mg/l
Penicilín-G (Sigma P-3032) 825 U (přibližně 0,5 mg)/l
2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid (Sigma) 50 mg/l

Poznámky:

Roztoky antibiotik se uchovávají a skladují při teplotě 4 °C v temnu a musí se spotřebovat do 1 měsíce.

Misky s médiem by měly být před použitím zbaveny povrchové kondenzace.

Nutno zabránit přílišnému vysušení média.

Každá nově připravená šarže živné půdy by měla být podrobena kontrole kvality živné půdy roztěrem suspense referenční kultury R. solanacearum na médium (viz dodatek 3) a pozorováním, zda se po 2 až 5 dnech při teplotě 28 °C objeví typické kolonie.

Živná půda SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Provede se příprava jako pro selektivní agarovou živnou půdu SMSA, ale vynechá se Bacto-Agar a 2,3,5- trifenyltetrazolium chlorid.

Upravená živná půda Wilbrink (Caruso et al., 2002)

Sacharóza 10 g
Proteázový pepton 5g
K2 HPO4 0,5 g
MgSO4 0,25 g
NaNO3 0,25 g
Destilovaná voda 1,00 l

Steriluje se tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut a ochladí se na 50 °C.

Přidá se antibiotický zásobní roztok jako pro živnou půdu SMSA.

Dodatek 3

A. Komerční standardizovaný kontrolní materiál

Následující izolované bakteriální kultury se doporučují jako standardní referenční materiál buď k pozitivní kontrole (tabulka 1) nebo během optimalizace testů, aby se zabránilo vzájemnému působení (tabulka 2). Všechny kmeny jsou komerčně dostupné a lze je získat z těchto sbírek:

Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum

Kód NCPPB SMT # Jiné kódy Země původu Biovar
NCPPB 4153 6 CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 Egypt 2
NCPPB 4154 10 CFBP 4585, 550, EURS21 Turecko 2
NCPPB 3857 12 CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 Anglie 2
NCPPB 1584 23 CFBP 4598, EURS49 Kypr 2
NCPPB 2505 24 CFBP 4599, EURS50 Švédsko 2
NCPPB 4155 26 CFBP 4601, 502, EURS55 Belgie 2
NCPPB 4156 (*) 71(*) PD 2762, CFBP 3857 Nizozemsko 2
NCPPB 4157 66 LNPV 15.59 Francie 2
NCPPB 4158 39 CFBP 4608, Port 448, EURS80 Portugalsko 2
NCPPB 4160 69 IVIA-1632-2 Španělsko 2
NCPPB 4161 76 B3B Německo 2
NCPPB 325 41 CFBP 2047, KEL60-1, R842 USA 1
NCPPB 3967 42 CFBP 4610, R285, GONg7 Kostarika 1
NCPPB 4028 43 CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 Kolumbie 2
NCPPB 3985 44 CFBP 4612, R578, CIP312 Peru 2T
NCPPB 3989 45 CFBP 4613, R568, CIP226 Brazílie 2T
NCPPB 3996 46 CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 Peru 3
NCPPB 3997 47 CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131 Austrálie 3
NCPPB 4029 48 CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 Srí Lanka 4
NCPPB 4005 49 CFBP 4616, R470 Filipíny 4
NCPPB 4011 50 CFBP 4617, R288, HEmps2 Čína 5
(*) Jako standardní referenční kmen se použije R. solanacearum biovar 2 (rod 3).

Poznámka:

Spolehlivost výše uvedených kmenů může být zaručena pouze v případě, že pocházejí z původních sbírek kultur.

Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů

Kód NCPPB SMT # Jiné kódy Identifikace
NCPPB 4162 51 CFBP 1954 Bacillus polymyxa(1)
NCPPB 4163 52 CFBP 1538 Pseudomonas marginalis pv. marginalis(1)
NCPPB 4164 - CFBP 2227 Burkholderia cepacia (2)
NCPPB 4165 - CFBP 2459 Ralstonia pickettii(2)
NCPPB 4166 58 CFBP 3567, CSL Pr1150 Ralstonia pickettii(1)
NCPPB 4167 60 CFBP 4618, PD 2778 Ralstonia sp. (1)
NCPPB 1127 53 CFBP 3575 Burkholderia andropogonis (1)
NCPPB 353 54 CFBP 3572 Burkholderia caryophylli(1)
NCPPB 945 55 CFBP 3569 Burkholderia cepacia (1)
NCPPB 3708 56 CFBP 3574 Burkholderia glumae (1)
NCPPB 3590 57 CFBP 3573 Burkholderia plantarii (1)
NCPPB 3726 59 CFBP 3568 Banana Blood Disease Bacterium (1)(2)(3)
NCPPB 4168 61 CFBP 4619, IPO S339 Enterobacter sp. (1)
NCPPB 4169 62 IPO 1695 Enterobacter sp. (1)
NCPPB 4170 63 CFBP 4621, IPO S306 Ochrobactrum anthropi(1)(2)
NCPPB 4171 64 CFBP 4622, IPO 1693 Curtobacterium sp.(1)(2)
NCPPB 4172 65 IPO 1696a Pseudomonas sp.(1)
NCPPB 4173 - PD 2318 Aureobacterium sp. (2)
NCPPB 4174 81 IVIA 1844.06 Flavobacterium sp. (1)(2)
(1) Potencionální křížově reagující kmen v sérologických testech (IF a/nebo ELISA) s polyklonálním antisérem. (2) Kmen, ze kterého lze v některých laboratořích amplifikovat produkt PCR na podobnou velikost, jako je očekávaná velikost při použití specifických primerů OLI-1 a Y-2 (viz dodatek 6). (3) Pravděpodobnost křížové reakce ve většině testů, ale výskyt znám pouze u banánů v Indonésii.

Následující standardní kontrolní materiál je možné získat ze sbírky kultur NCPPB.

Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru k negativní kontrole všech testů.

Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru obsahující 10^3 až 10^4 a 10^4 až 10^6 buněk biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozitivní kontroly serologických a PCR testů. Protože životaschopnost buňky je ovlivněna lyofilizací, nejsou tyto vhodné jako standardy v testech izolace a testech patogenity.

Ve formaldehydu fixované suspense biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s 10^6 buňkami na 1 ml k pozitivní kontrole sérologických testů.

B. Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy vodivých pletiv PCR/IF a FISH

Kultivuje se 48hodinová kultura virulentního kmene R. solanacearum rasy 3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné půdě a suspenduje se v 10 mM fosfátovém pufru, aby se získala buněčná hustota přibližně 2 × 10^8 buněk tvořících kolonie na 1 ml. Obvykle se jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15 při 600 nm.

Odebere se dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou slupkou, o které se ví, že je prosta R. solanacearum.

Zpracují se pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspenduje se peleta v 10 ml.

Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 μl resuspendované pelety.

Přenese se 100 μl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky a protřepe se..

Provede se desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.

Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako kontrolní vzorky. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako kontrolní negativní vzorky. Mikrozkumavky musí být řádně označeny.

Připraví se alikvotní části z 100 μl ve sterilních zkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Uskladní se při teplotě - 16 až - 24 °C až do doby použití.

Přítomnost a množství R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly být nejprve potvrzeny testem IF.

Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum zjištěna v nejméně v 10^6 a 10^4 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

Dodatek 4

Pufry pro testovací postupy

OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.

Na2 HPO4 (bezvodý) 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
Destilovaná voda 1,00 l

Čtení tohoto dokumentu nenahrazuje čtení příslušného vydání Sbírky zákonů. Neneseme odpovědnost za případné nepřesnosti vyplývající z převodu originálu do tohoto formátu.

Tento text je zveřejněn za vlastních podmínek opětovného použití zdroje e-Sbírka, nikoli pod licencí Legalize ani pod licencí volného díla. e-Sbírka
volné dílo (úřední díla podle § 3 písm. a) zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona)