Orden de 7 de julio de 1972 por la que se aprueban las normas de toma de muestras y análisis de los diferentes tipos de leche que figuran en el Reglamento de Centrales Lecheras y otras Industrias Lácteas

9.2.1. Balanza analítica de sensibilidad 10 miligramos como mínimo.

9.2.2. Vasos de precipitados de 100 mililitros en vidrio.

9.2.3. Matraces graduados, de 200 y 50 mililitros.

9.2.4. Pipetas de 40 mililitros.

9.2.5. Probetas graduadas de 25 mililitros.

9.2.6. Pipetas graduadas de 10 mililitros.

9.2.7. Embudos filtrantes de diámetro entre 8 y 10 centímetros y filtros (plegados) de 15 centímetros de diámetro.

9.2.8. Tubo de polarímetro de 2 decímetros de longitud, exactamente calibrado.

9.2.9. Polarímetro o sacarímetro.

9.2.9.1. Polarímetro con luz de sodio o con luz verde de mercurio (lámpara de vapor de mercurio con prisma o pantalla Wratten número 77 A), permitiendo lecturas con una precisión por lo menos igual a 0,05 grados de ángulo.

9.2.9.2. Sacarímetro con escala internacional de azúcar utilizando luz blanca que pasa a través de un filtro de 15 milímetros de una solución al 8 por 100 de dicromato potásico, o bien luz de sodio, y permitiendo la lectura con una precisión por lo menos igual a 0,1 grados de la escala sacarimétrica internacional.

9.2.10. Baño de agua a 60º ± 1ºC.

9.3. Reactivos.

9.3.1. Solución de acetato de cinc, 2,0 N: Disolver 21,9 gramos de acetato de cinc cristalizado (C₂H₃O₂), Zn. 2H₂O y 3 mililitros de ácido acético glacial en agua destilada y completar hasta 100 mililitros.

9.3.2. Solución de ferrocianuro potásico, 1,0 N: Disolver 10,6 gramos de ferrocianuro potásico cristalizado [Fe(CN)₆]K₄ . 3H₂O en agua destilada y completar hasta 100 mililitros.

9.3.3. Solución de ácido clorhídrico, 6,35 ± 0,20 N (20-22 por 100).

9.3.4. Solución diluida de amoniaco, 2,0 ± 0,2 N (3,5 por 100).

9.3.5. Solución diluida de ácido acético, 2,0 ± 0,2 N (12 por 100).

9.4. Procedimiento.

9.4.1. Preparación de la muestra.

Para muestras de productos recientemente preparados en los que no se pueda prever separación alguna apreciable de los componentes. Abrir el recipiente, introducir en él el producto adherido a la tapa y mediante movimientos de arriba abajo, con ayuda de una cuchara, conseguir que se mezclen íntimamente las capas superiores así como el contenido del fondo del recipiente. Trasvasar el contenido de un bote a un frasco provisto de tapón bien adaptado.

Para muestras de productos más antiguos y muestras en las que se pueda prever una separación de componentes, calentar en baño de agua, aproximadamente a 40ºC, hasta que la muestra casi haya alcanzado esta temperatura, abrir el recipiente y operar de la misma manera que arriba. En el caso de un bote, trasvasar el contenido a un frasco, raspar el producto que se haya adherido a las paredes y continuar la mezcla hasta que toda la masa sea homogénea. Cerrar el frasco con una tapadera que se adapte perfectamente. Dejar enfriar.

9.4.2. Comprobación del método.

Proceder como en 9.4.3, utilizando una mezcla de 100 gramos de leche o 110 gramos de leche desnatada y de 18,00 gramos de sacarosa pura, que corresponde a 40,00 gramos de una leche concentrada conteniendo el 45 por 100 de sacarosa. Calcular la cantidad de sacarosa como en 9.5.1, utilizando en la fórmula I), para W, F y P, la cantidad de leche pesada y la riqueza en materia grasa y proteínas de esta leche, y en la fórmula II), pala W, la cifra de 40,00. La media de los valores encontrados no debe diferir de dicho valor (45 por 100) en más del 0,1 por 100.

9.4.3. Determinación.

En un vaso de 100 mililitros pesar aproximadamente 40 gramos de la muestra bien mezclada con una aproximación de 10 miligramos, añadir 50 mililitros de agua destilada caliente (80º - 90ºC) y mezclar cuidadosamente. Trasvasar cuantitativamente la mezcla a un matraz aforado de 200 mililitros, enjuagar el vaso con cantidades sucesivas de agua destilada a 60ºC hasta que el volumen total sea de 120 a 150 mililitros. Mezclar y enfriar a temperatura ambiente. Añadir 5 mililitros de la solución de amoníaco diluida. Mezclar de nuevo y dejar reposar durante quince minutos. Neutralizar el amoníaco añadiendo una cantidad equivalente de la solución diluida de ácido acético. Determinar previamente la cantidad exacta de mililitros por valoración de la solución de amoníaco diluida empleando el azul de bromotimol como indicador. Mezclar. Añadir, mezclando suavemente por rotación del matraz Inclinado, 12,5 mililitros de solución de acetato de cinc. De la misma forma que para la solución de acetato, añadir 12,5 mililitros de solución de ferrocianuro potásico. Poner el contenido del matraz a 20ºC y añadir agua destilada (a 20ºC) hasta alcanzar el enrase de 200 mililitros.

Hasta este momento todas las adiciones de agua o reactivos deberán haberse efectuado de tal manera que se haya evitado la formación de burbujas de aire y por esta misma razón todas las mezclas se habrán realizado por rotación del matraz y no por agitación violenta. Si se observa la presencia de burbujas de aire antes de alcanzar los 200 mililitros se pueden eliminar aplicando al matraz una bomba de vacío e imprimiéndolo un movimiento de rotación. Tapar el matraz con un tapón seco y mezclar íntimamente sacudiendo con energía. Dejar reposar durante algunos minutos, filtrar a continuación por un papel filtro seco. Despreciar los primeros 25 mililitros del filtrado.

9.4.3.1. Polarización directa.

Determinar la rotación óptica del filtrado a 20º ± 2ºC.

9.4.3.2. Inversión.

Introducir con la pipeta en un matraz graduado de 50 mililitros, 40 mililitros del filtrado obtenido de la manera indicada antes: Añadir 6,0 mililitros de ácido clorhídrico 6,35 N. Poner el matraz en baño de agua a 60ºC durante quince minutos, sumergiéndolo hasta el nacimiento del cuello. Mezclar por rotación durante los cinco primeros minutos, al final de los cuales el contenido deberá haber alcanzado la temperatura del baño. Enfriar a 20ºC y completar hasta 50 mililitros con agua destilada a 20ºC, mezclar y dejar reposar una hora a esta temperatura.

9.4.3.3. Polarización después de inversión.

Determinar el poder rotatorio de la solución invertida a 20º ± 2ºC (Cuando la temperatura del liquido en el tubo de polarización difiera en más de 0,2ºC de 20ºC durante la medida, se debe aplicar la corrección de la temperatura indicada en el apartado 9.5.2).

9.5. Cálculo.

9.5.1. Riqueza en sacarosa.

S = Cantidad de sacarosa.

W = Peso de la muestra expresado en gramos.

P = Porcentaje de proteínas (N x 6,38) de la muestra.

F = Porcentaje de materia grasa de la muestra.

V = Volumen en mililitros de la muestra diluida antes de filtrar.

D = Lectura polarimétrica directa (polarización antes de la inversión).

I = Lectura polarimétrica después de la inversión.

L = Longitud en decímetros del tubo del polarímetro.

Q = Factor de inversión cuyos valores se indican más adelante.

Pesando exactamente 40,00 gramos de leche condensada y utilizando un polarímetro con luz de sodio provisto de escala en grados de ángulo y un tubo de 2 decímetros de longitud, el contenido en sacarosa de las leches condensadas normales (C = 9) a 20,0º ± 0,1ºC se puede calcular con ayuda de la siguiente fórmula:

S = (D-5/4 I) (2,833-0,00612 F-0,00878 P).

Si la medida de la polarización después de la inversión se efectúa a una temperatura diferente de 20ºC, las cifras obtenidas se deben multiplicar por

[I + 0,0037 (T-20)]

9.5.2. Valores del factor de inversión Q.

Las fórmulas siguientes dan valores precisos de Q para diversas clases de luz con correcciones, si es necesario, para la concentración y la temperatura.

Luz de sodio y polarímetro con escala en grados de ángulo.

Q = 0,8825 + 0,0006 (C-9) – 0,0033 (T-20).

Luz verde de mercurio y polarímetro con escala en grados de ángulo:

Q = 1,0392 + 0,0007 (C-9) – 0,0039 (T-20).

Luz blanca con filtro de dicromato y sacarímetro con escala sacarimétrica:

Q = 2,549 + 0,0017 (C-9) – 0,0095 (T-20).

En las fórmulas precedentes:

C = Porcentaje de azúcares totales en la solución invertida, según la lectura polarimétrica.

T = Temperatura de la solución invertida en la lectura del polarímetro.

El porcentaje de azúcares totales C en la solución invertida se puede calcular a partir de la lectura directa y de la variación después de la inversión según el método habitual, utilizando los valores usuales de, rotación específica de sacarosa de lactosa y de sacarosa invertida. La corrección 0,0006 (C-9), etcétera, no es exacta más que cuando C es aproximadamente 9; para leche concentrada normal esta corrección se puede despreciar, por ser C próximo a 9.

Variaciones en la temperatura de 20ºC influyen escasamente en la lectura de la polarización directa. Por el contrario, diferencias de más de 0,2ºC, en la lectura de polarización después de la inversión necesitan una corrección. La corrección – 0,003 (T-20), etc., no es exacta más que para temperaturas comprendidas entre 18ºC y 22ºC.

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o una inmediatamente después de otra por el mismo analista no debe ser mayor de 0,3 gramos de sacarosa para 100 gramos de leche condensada.

9.6. Referencias.

1. Norma Internacional FIL-IDF 35: 1966.

10. Humedad

Leche en polvo

10.1. Principio.

Se entiende por humedad de la leche en polvo el contenido en agua libre, es decir, la pérdida de peso, expresado en porcentaje en peso, determinado por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde al descrito en la norma FIL-26: 1964 de la Federación Internacional de Lechería.

Este método es aplicable a las leches en polvo, entera y desnatada.

El agua, contenida en la leche en polvo, se elimina por calentamiento de la muestra en una estufa de desecación, a una temperatura de 102º ± 2ºC, hasta peso constante.

10.2. Material y aparatos.

10.2.1. Balanza analítica, de sensibilidad 0,1 miligramos como mínimo.

10.2.2. Cápsulas apropiadas, preferentemente en aluminio, níquel, acero inoxidable o vidrio. Las cápsulas deberán estar provistas de tapas que se adapten convenientemente, pero que se puedan quitar con facilidad. Las dimensiones más convenientes son: diámetro aproximado 50 milímetros: profundidad aproximada 25 milímetros.

10.2.3. Un desecador provisto de gel de sílice con indicador de humedad.

10.2.4. Una estufa de desecación bien ventilada, provista de termostato, y regulada a 102º ± 2ºC. Es importante que la temperatura sea uniforme en toda la estufa.

10.2.5. Frascos provistos de tapones herméticos para el mezclado de la leche en polvo.

10.3. Procedimiento.

10.3.1. Preparación de la muestra.

Trasvasar toda la muestra de la leche en polvo a un frasco seco y tapado, de un volumen igual al doble aproximadamente del de la muestra, mezclar íntimamente por rotación y agitación. (En el caso de que no se pueda obtener una homogeneización completa por este procedimiento, extraer, con objeto de realizar determinaciones paralelas, dos muestras en dos puntos, lo más distantes posibles el uno del otro.)

10.3.2. Determinación.

Colocar la cápsula destapada y la correspondiente tapa en la estufa de desecación durante una hora, a la temperatura de 102º ± 2ºC. Colocar la tapa sobre la cápsula y pasarla de la estufa al desecador. A continuación enfriar a la temperatura ambiente y pesar. Introducir aproximadamente un gramo de leche en polvo en la cápsula, tapar la cápsula y pesar rápidamente con la mayor exactitud posible. Destapar la cápsula y colocarla con su tapa, en la estufa a una temperatura de 102º ± 2ºC durante dos horas. Volver a colocar la tapa, poner la cápsula en el desecador, dejar enfriar a temperatura ambiente y pesar rápidamente con la mayor exactitud posible.

Calentar la cápsula abierta y su tapa a 102º ± 2ºC en la estufa durante una hora suplementaria, volver a tapar y dejar enfriar en el desecador a temperatura ambiente; pesar de nuevo. Repetir la operación hasta que las pesadas sucesivas no difieran en más de 0,0005 gramos. La desecación se. acaba aproximadamente en dos horas.

10.4. Cálculo.

Calcular la humedad mediante la fórmula siguiente:

M₁ = la masa inicial, en gramos, de la cápsula y su tapa más la leche en polvo utilizada para el análisis.

M₂ = la masa final, en gramos, de la cápsula y su tapa más la leche en polvo.

M₃ = la masa, en gramos, de la leche en polvo utilizada para el análisis.

La diferencia entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar el 0,06 por 100 de agua.

10.5. Referencias.

1. Norma Internacional FIL-IDF 26: 1964.

11. Índice de solubilidad

Leche en polvo

11.1. Principio.

Se entiende por índice de solubilidad de la leche en polvo la cantidad de sedimento, expresada en volumen, determinada por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde al descrito en la norma UNE-34.101 del Instituto Nacional de Racionalización del Trabajo.

Este método es aplicable a la leche en polvo, entera o desnatada.

11.2. Material y aparados.

11.2.1. Centrífuga con soportes para la colocación de los tubos centrífugos cónicos. La velocidad requerida varía, como a continuación se indica, con el diámetro.

Diámetro	Revoluciones por minuto	Diámetro	Revoluciones por minuto
250 milímetros	1.083	450 milímetros	807
300 milímetros	988	500 milímetros	766
350 milímetros	916	550 milímetros	730
400 milímetros	856	600 milímetros	700

El «Diámetro» es la distancia entre los fondos internos de dos soportes opuestos, medida a través del centro de rotación de la cabeza de la centrífuga estando los soportes extendidos horizontalmente.

11.2.2. Tubos de centrífuga cónicos, graduados como se indica a continuación:

De 0 a 1,0 ml en divisiones de 0,1 ml.

De 1,0 a 2,0 ml en divisiones de 0,2 ml.

De 2,0 a 10,0 ml en divisiones de 0,5 ml.

De 10,0 a 20,0 ml en divisiones de 1,0 ml.

y a 50 ml una marca que quede, por lo menos, a 13 milímetros del borde del tubo.

11.2.3. Mezclador eléctrico.

11.2.4. Tubo sifón de vidrio.

11.3. Procedimiento.

Se añaden 10 ó 13 gramos de la muestra, según se trate de leche desnatada o completa, respectivamente, a 100 mililitros de agua destilada, a la temperatura de 24ºC, en el vaso especial del mezclador que seguidamente se pone en éste para agitar durante noventa segundos exactos. Si hay necesidad inmediata de volver a emplear el vaso del mezclador, puede verterse la solución total en un vaso de precipitación apropiado. Se deja reposar la solución hasta que la espuma se separe lo suficiente, para poder quitarla completamente con una cuchara. El periodo de reposo después de la mezcla no ha de exceder de quince minutos.

Después de separada la espuma se mezcla completamente con una cuchara durante cinco segundos y, seguidamente, se llena un tubo cónico hasta la marca de 50 mililitros. Se centrifuga durante cinco minutos a las revoluciones por minuto requeridas, según la tabla del apartado 11.2.1. A continuación se sifona el líquido que sobrenada, hasta dos mililitros del nivel del sedimento, teniendo cuidado de no remover éste. Se vierten en el tubo 25 mililitros de agua destilada a 24ºC y se agita para dispersar el sedimento, desalojándole si fuera necesario con un alambre. Se llena con agua destilada, 24ºC, hasta la marca de 50 mililitros se invierte y se agita para la perfecta mezcla del contenido, y se centrifuga de nuevo durante cinco minutos a la velocidad requerida. Se mantiene el tubo en posición vertical, de modo que el nivel superior del sedimento quede a nivel del ojo; se refieren los mililitros de sedimento a la división de la escala más próxima. La lectura se efectúa fácilmente, cuando se observa el tubo, colocado delante de una luz fuerte.

Cuando se opere con leches en polvo parcialmente desnatadas, las cantidades que se han de añadir a los 100 mililitros de agua destilada son, según sus porcentajes grasos, las siguientes:

Hasta el 4 %: 10,0 gramos.

Desde el 4,1 al 9 %: 10,5 gramos.

Desde el 9,1 al 13 %; 11,0 gramos.

Desde el 13,1 al 17 %: 11,5 gramos.

Desde el 17,1 al 21 %: 12,0 gramos.

Desde el 21,1 al 24 %: 12,5 gramos.

Más del 24 %: 13,0 gramos.

11.4. Referencias.

1. Instituto Nacional de Racionalización del Trabajo. Una Norma Española 34.101.

12. Calcio

12.1. Principio.

Se entiende por contenido en calcio de la leche, la cantidad total de calcio expresada en porcentaje en peso, determinada por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde a la norma FIL-36: 1966 de la Federación Internacional de Lechería.

Este método se aplica a todas las leches líquidas normales, así como a las leches reconstituidas por dilución o disolución de leches concentradas o de leches desecadas.

El calcio total se lleva a disolución por precipitación de las materias proteicas con ácido tricloroacético. El calcio contenido en el filtrado es precipitado bajo forma de exalato cálcico, que se separa por centrifugación y se valora con permanganato potásico.

12.2. Material y aparatos.

12.2.1. Balanza analítica.

12.2.2. Matraz aforado de 50 mililitros.

12.2.3. Pipeta para leche de 20 mililitros.

12.2.4. Papel filtro sin cenizas para filtración lenta.

12.2.5. Centrífuga que pueda desarrollar una aceleración centrífuga de 1.400 g (g = aceleración de la gravedad).

12.2.6. Tubos de centrífuga cilíndricos con fondo redondo de 30 mililitros aproximadamente, marcados a 20 mililitros.

12.2.7. Pipetas de dos y cinco mililitros.

12.2.8. Dispositivo de sifón por succión, provisto de un tubo capilar.

12.2.9. Baño de agua, a temperatura de ebullición.

12.2.10. Bureta graduada en 1/50 milímetros.

12.3. Reactivos.

12.3.1. Ácido tricloroacético: solución acuosa al 20 por 100 (en peso por volumen).

12.3.2. Ácido tricloroacético: solución acuosa al 12 por 100 (en peso por volumen).

12.3.3. Oxalato amónico: solución acuosa saturada en frío.

12.3.4. Rojo de metilo: solución al 0,05 por 100 (en peso por volumen) en alcohol etílico del 96 por 100 (en volumen por volumen).

12.3.5. Ácido acético: solución acuosa al 20 por 100 (en volumen por volumen).

12.3.6. Amoníaco: solución acuosa obtenida mezclando volúmenes iguales de amoníaco al 25 por 100 (en peso por peso) y de agua destilada.

12.3.7. Amoníaco: solución acuosa obtenida diluyendo dos mililitros de amoníaco al 25 por 100 (en peso por peso) hasta 100 mililitros, con agua destilada.

12.3.8. Ácido sulfúrico: solución acuosa obtenida añadiendo 20 mililitros de ácido sulfúrico del 98 por 10 (en peso por peso) a 80 mililitros de agua destilada.

12.3.9. Permanganato potásico: solución acuosa titulada, 0,02N.

Todos los reactivos deben ser puros para análisis.

12.4. Procedimiento.

12.4.1. Preparación de la muestra.

Antes del análisis, poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclar con cuidado. Si no se obtiene una dispersión homogénea de la materia grasa, calentar lentamente la muestra a 40ºC, mezclar suavemente y enfriar a 20º ± 2ºC.

12.4.2. Defecación de la muestra.

En un matraz aforado de 50 mililitros pesar exactamente alrededor de 20 gramos de leche, con una aproximación de 10 miligramos. Añadir poco a poco mientras se agita una solución acuosa de ácido tricloroacético al 20 por 100 y completar hasta 50 mililitros con este reactivo. Agitar fuertemente durante algunos segundos. Dejar reposar treinta minutos. Filtrar sobre papel filtro sin cenizas. El filtrado obtenido debe ser límpido.

12.4.3. Precipitación del calcio en forma de oxalato y separación del oxalato.

En un tubo de centrífuga, cilíndrico de fondo redondo, introducir cinco mililitros del filtrado límpido; después cinco mililitros de ácido tricloroacético al 12 por 100, dos mililitros de una solución acuosa saturada de oxalato de amonio, dos gotas de solución alcohólica de rojo de metilo y dos mililitros de ácido acético al 20 por 100. Mezclar mediante agitación circular y añadir poco a poco solución de amoníaco (12.3.6) hasta coloración amarillo pálido; después, algunas gotas de ácido acético al 20 por 100 hasta coloración rosa. Dejar reposar cuatro horas a la temperatura ambiente.

Diluir hasta 20 mililitros con agua y centrifugar diez minutos a 1.400 g (g = aceleración de la gravedad). Mediante un dispositivo de succión; decantar el líquido límpido que sobrenada. Lavar las paredes del tubo de centrifugación (sin remover el depósito de oxalato cálcico) con cinco mililitros de solución de amoníaco diluido (12.3.7). Centrifugar cinco minutos a 1.400 g. Decantar el liquido que sobrenada con el dispositivo de succión. Proceder a tres lavados sucesivos.

12.4.4. Valoración del oxalato.

Después de haber extraído con sifón el agua del último lavado, añadir dos mililitros de solución acuosa de ácido sulfúrico y cinco mililitros de agua destilada sobre el precipitado de oxalato de calcio. Poner el tubo en baño de agua hirviendo y, cuando el oxalato esté completamente disuelto, valorar con solución de permanganato potásico 0,02 N, hasta coloración rosa persistente. La temperatura debe permanecer superior a los 60 ºC durante la valoración.

12.4.5. Ensayo en blanco.

Efectuar un ensayo en blanco con todos los reactivos, utilizando 20 mililitros de agua destilada en vez de leche.

12.5. Cálculo.

V = volumen en mililitros de MnO₄K (0,02 N) gastados en la valoración de la muestra.

v = volumen en mililitros de MnO₄K (0,02 N) gastados en el ensayo en blanco.

P = peso en gramos de la muestra inicial (alrededor de 20 gramos).

K = coeficiente de corrección del volumen del precipitado resultante de la precipitación tricloroacética.

Para leche entera (3,5 a 4,5 por 100 de materia grasa): K = 0,972.

Para leche con 3 por 100 de materia grasa: K = 0,976.

Para leche con 2 por 100 de materia grasa: K = 0,980.

Para leche con 1 por 100 de materia grasa: K = 0,985.

Para leche desnatada: K = 0,989.

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o una inmediatamente después de otra por el mismo analista, no debe ser mayor de 0,002 gramos de calcio por 100 gramos de leche.

12.6. Referencias.

1. Norma internacional FIL-IDF 36: 1966.

13. Fósforo

13.1. Principio.

Se entiende por contenido en fósforo de la leche la cantidad total de fósforo expresada en porcentaje en peso, determinada por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde a la norma FIL-42: 1967 de la Federación Internacional de Lechería.

Este método se aplica a todas las leches liquidas normales, así como a las leches reconstituidas por dilución o disolución de las leches concentradas o de las leches desecadas.

Las materias orgánicas de la leche se destruyen por mineralización en seco (incineración). El fósforo se determina colorimétricamente, reduciendo el fosfomolibdato de amonio con diaminofenol (amidol) y midiendo la densidad óptica de la solución obtenida.

13.2. Material y aparatos.

13.2.1. Balanza analítica.

13.2.2. Cápsulas de platino o de cuarzo (de 55 mililitros de diámetro aproximadamente) provistas de vidrio de reloj.

13.2.3. Baño de agua.

13.2.4. Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mililitros.

13.2.5. Matraces aforados, de 25 mililitros con tapones esmerilados, de 100 y de 1.000 mililitros.

13.2.6. Horno mufla.

13.2.7. Estufa a 105 ± 2ºC.

13.2.8. Espectrofotocolorímetro.

13.3. Reactivos.

13.3.1. Ácido clorhídrico (ClH) 1,0 N.

13.3.2. Ácido perclórico (ClO₄H) al 65 por 100 (densidad, 1,61 gramos por mililitro a 20ºC).

13.3.3. Solución de amidol: Disolver en agua destilada un gramo o de amidol (diclorhidrato de 2,4 diaminofenol: (NH₂)₂ C₆H₃OH. 2ClH) y 20 gramos de metabisulfito de sodio o pirosulfito de sodio (S₂O₅Na₂). Completar hasta 100 mililitros en un matraz aforado con tapón esmerilado. Preparar cada día una solución nueva.

13.3.4. Solución de molibdato: Disolver en agua destilada 8,3 gramos de molibdato de amonio: Mo₇O₂₄ (NH₄)₆ . 4H₂O. Completar hasta 100 mililitros.

13.3.5. Solución acuosa de fosfato monopotásico (a partir de PO₄H₂K, desecado durante dos horas a 105 ºC), que permite trazar una curva de referencia para la determinación del fósforo: Pesar 4,393 gramos de PO₄H₂K, disolver en agua destilada y completar hasta 1.000 mililitros (solución A). Diluir 10 mililitros de solución A hasta 1.000 mililitros (solución B). Un mililitro de solución B = 10 microgramos de P.

Todos los reactivos deben ser puros para análisis.

13.4. Procedimiento.

13.4.1. Preparación de la muestra.

Antes del análisis poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclar cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersión homogénea de la materia grasa, calentar lentamente la muestra a 40ºC, agitar suavemente y enfriar a 20º ± 2ºC.

13.4.2. Ensayo en blanco.

Efectuar un ensayo en blanco con todos los reactivos, operando como se prescribe en 13.4.3.3, pero reemplazando los cinco mililitros de la dilución por cinco mililitros de agua destilada.

13.4.3. Determinación.

13.4.3.1. Mineralización por vía seca.

En una cápsula de platino o de cuarzo pesar exactamente alrededor de 10 gramos de leche con una aproximación de 10 miligramos. Evaporar, hasta sequedad, al baño de agua hirviendo. Después de la desecación completa, calcinar en la mufla a una temperatura comprendida entre 500ºC y 550ºC hasta la obtención de cenizas blancas.

13.4.3.2. Preparación de la solución de cenizas.

Después de enfriar la cápsula, cubrirla con vidrio de reloj, disolver las cenizas en dos o tres mililitros de ácido clorhídrico normal y diluir con agua destilada. Trasvasar la solución de las cenizas a un matraz aforado de 100 mililitros, lavar el vidrio de reloj y la cápsula, recogiendo las aguas de lavado en el matraz. Completar hasta 100 mililitros con agua destilada, agitar y filtrar. Tomar 10 mililitros del filtrado, introducirlos en un matraz de 100 mililitros. Completar hasta 100 mililitros con agua destilada y agitar.

13.4.3.3. Determinación colorimétrica del fósforo.

Tomar cinco mililitros de la dilución preparada en 13.4.3.2 e introducirlos en un matraz aforado de 25 mililitros.

Añadir sucesivamente dos mililitros de ácido perclórico, dos mililitros de la solución de amidol, un mililitro de la solución de molibdato de amonio. Completar hasta 25 mililitros con agua destilada y mezclar. Esperar cinco minutos y medir la densidad óptica utilizando cubeta de un centímetro en un espectrofotocolorímetro a 750 milimicras. Buscar en la curva patrón la cantidad de fósforo contenida en el matraz de 25 mililitros, expresada en microgramos y correspondiente a la densidad óptica leída.

13.4.3.4. Determinación de la curva patrón.

En cuatro matraces aforados de 25 mililitros introducir 3, 5, 7 y 10 mililitros de la solución B. Las cantidades así introducidas son iguales a 30, 50, 70 y 100 microgramos de fósforo. Proceder a continuación como en 13.4.3.3 situar sobre una gráfica las densidades ópticas obtenidas en función de las cantidades de fósforo presentes en los matreros. Trazar la curva patrón (que es una recta).

13.5. Cálculo.

El contenido en fósforo de la leche expresada en gramos de fósforo por 100 gramos de leche viene dado por la fórmula siguiente:

m = masa de fósforo, expresada en microgramos, obtenida según 13.4.3.4 y contenida en el matraz de 25 mililitros con la muestra de aproximadamente 50 miligramos de leche.

m’ = masa de fósforo, expresada en microgramos, obtenida según 13.4.3.4 y contenida en el ensayo en blanco.

M = masa de la leche, expresada en gramos, empleada para la mineralización.

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o una inmediatamente después de otra por el mismo analista no debe ser mayor de 0,003 gramos de fósforo por 100 gramos de leche.

13.6. Referencias.

1. Norma internacional FIL-IDF 42: 1967.