Orden de 22 de marzo de 1994 relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata, en aplicación de la Directiva 93/85/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas

Norma derogada, con efectos a partir del 1 de enero de 2022, por la disposición derogatoria única.2.b) del Real Decreto 739/2021, de 24 de agosto. Ref. BOE-A-2021-15095#dd

La Directiva 93/85/CEE del Consejo, de 4 de octubre de 1993, relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata, establece las medidas generales a adoptar en el seno de la Comunidad para la lucha contra este agente nocivo, así como la posibilidad de que los Estados miembros puedan adoptar medidas adicionales más estrictas en caso necesario, siempre que no se obstaculice la circulación de las patatas dentro de la Comunidad, salvo en los casos previstos en el Real Decreto 2071/1993, de 26 de noviembre, relativo a las medidas de protección contra la introducción y difusión en el territorio nacional y de la Comunidad Económica Europea de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales; así como para la exportación y tránsito hacia países terceros.

Teniendo en cuenta que el conocimiento de esta enfermedad y sus métodos de detección han evolucionado significativamente en los últimos años y que la aplicación del régimen fitosanitario comunitario a la Comunidad como un espacio sin fronteras son circunstancias por las que ha sido necesario derogar la Directiva 80/665/CEE del Consejo, de 24 de junio de 1980, relativa a las medidas mínimas que los Estados miembros debían adoptar contra la necrosis bacteriana, se hace preciso adoptar las medidas necesarias contempladas en la Directiva 93/85/CEE del Consejo, de 4 de octubre de 1993.

En consecuencia, mediante esta Orden se traspone al ordenamiento interno dicha Directiva, de acuerdo con la competencia atribuida al Estado por los artículos 149.1.10.ª y 149.1.13.ª de la Constitución Española en materia de comercio exterior y bases y coordinación de la planificación general de la actividad económica, así como en ejercicio de la facultad que la disposición final primera del Real Decreto 2071/1993 atribuye al Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentación para su desarrollo.

En su virtud, dispongo:

Artículo 1. Objeto.

La presente disposición establece las medidas que deben adoptarse contra «Clavibacter michiganensis» (Smith) Davis et al. ssp. «sepedonicus» (Spieckermann et kottohoff) Davis et al., causante de la necrosis bacteriana de la patata (en lo sucesivo denominado «el organismo»), para:

Artículo 2. Establecimiento de encuestas oficiales sistemáticas.

1. Se llevarán a cabo sistemáticamente encuestas oficiales relativas al organismo en tubérculos y, cuando corresponda, en plantas de patata («Solanum tuberosum» L.), para confirmar su ausencia.

Para estas encuestas, en el caso de los tubérculos, se tomarán muestras de patatas de siembra y de otro tipo, preferiblemente procedentes de lotes almacenados, que se someterán a pruebas de laboratorio oficiales o realizadas bajo control oficial, según el método dispuesto en el anexo I, para la determinación y el diagnóstico del organismo. Además cuando proceda, podrá realizarse una inspección visual oficial o bajo control oficial de otras muestras que implique el corte de los tubérculos.

En el caso de las plantas deberán realizarse según los métodos apropiados que se determinen y las muestras deberán someterse a pruebas oficiales o bajo control oficial.

2. Los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma, a los que se hace referencia en el artículo 11.2, b), del Real Decreto 2071/1993, deberán elaborar anualmente un programa en el que se determine el número, origen, estrato y calendario de toma de muestras, basándose en principios científicos y estadísticos sólidos, y en la biología del organismo, teniendo en cuenta los sistemas particulares de producción de patatas de las diferentes Comunidades Autónomas.

Los detalles se comunicarán anualmente a través del cauce establecido a los demás Estados miembros y a la Comisión de la Comunidad Europea, con objeto de garantizar niveles de protección comparables entre los Estados miembros para la confirmación de la ausencia del organismo.

3. Los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas notificarán los resultados de las encuestas oficiales a que se refiere el apartado 1, a la Dirección General de Sanidad de la Producción Agraria, y ésta a su vez a los demás Estados miembros de la Comunidad y a la Comisión de la Comunidad Europea.

Los detalles de esta notificación serán confidenciales y podrán comunicarse al Comité Fitosanitario Permanente con arreglo al procedimiento comunitario establecido.

Artículo 3. Obligación de notificación.

Los productores, los almacenes colectivos y los centros de expedición de patatas deberán notificar inmediatamente a los órganos competentes de las Comunidades Autónomas, en que estén situadas sus parcelas o establecimientos, la aparición sospechosa o la presencia confirmada del organismo en tubérculos o plantas que produzcan, almacenen o comercialicen.

Artículo 4. Aparición sospechosa del organismo.

1. Cuando los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas, tengan conocimiento, a través de las encuestas a que se refiere el apartado 1 del artículo 2 o mediante la notificación a que se refiere el artículo 3, o por cualquier otro medio, de la aparición sospechosa del organismo, éstos adoptarán las medidas oportunas para que se realicen pruebas de laboratorio oficiales o realizadas bajo control oficial con el método a que se refiere el anexo I y en las condiciones establecidas en el punto 1 del anexo II, con el fin de confirmar o desmentir la aparición sospechosa; en el primer caso se aplicará lo dispuesto en el punto 2 del anexo II.

2. Hasta tanto no se haya confirmado ni desmentido la aparición sospechosa con arreglo al apartado 1, en aquellos casos de aparición sospechosa en que:

ii) Se hayan obtenido resultados positivos con la prueba de inmunofluorescencia con arreglo al anexo I o con otra prueba idónea que se establezca al efecto.

Los órganos competentes de las Comunidades Autónomas adoptarán las siguientes medidas:

Artículo 5. Confirmación de la presencia del organismo.

1. En el caso de que las pruebas de laboratorio oficiales o realizadas bajo control oficial con el método establecido en el anexo I confirmen la presencia del organismo en una muestra de tubérculos, plantas o partes de plantas, los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas, basándose en principios científicos sólidos, las características biológicas del organismo y los sistemas particulares de producción, comercialización y transformación de cada región:

2. Los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas notificarán inmediatamente a la Dirección General de Sanidad de la Producción Agraria, y ésta a los demás Estados miembros de la Comunidad y a la Comisión de la Comunidad Europea, de acuerdo con lo dispuesto en el punto 3 del anexo III, cualquier contaminación declarada de conformidad con la letra a) del apartado 1 y los detalles de la zona delimitada de conformidad con la letra c) del apartado 1. Los detalles de esta notificación serán confidenciales.

3. Cuando el Estado español sea mencionado en la notificación de contaminación confirmada de otros Estados miembros, la autoridad competente deberá declarar la contaminación, determinar la extensión de la probable contaminación y delimitar una zona de conformidad con las letras a), b) y c) del apartado 1.

Artículo 6. Encuestas de patatas relacionadas clonalmente con las contaminadas.

Cuando los tubérculos o plantas hayan sido declarados contaminados, en virtud de la letra a) del apartado 1 del artículo 5, se dispondrá la realización de pruebas conforme a lo dispuesto en el apartado 1 del artículo 4 en las existencias de patatas que tengan relación clonal con las implicadas en la contaminación. Las pruebas se realizarán en tantos tubérculos o plantas como sea necesario para determinar la causa primaria de infección probable y la extensión de la probable contaminación, preferiblemente por orden de riesgo.

A la vista de los resultados de las pruebas, se procederá a una nueva declaración de contaminación, a la determinación de la extensión de la probable contaminación y a la delimitación de una zona, cuando proceda, de conformidad, respectivamente, con las letras a), b) y c) del apartado 1 del artículo 5.

Artículo 7. Medidas fitosanitarias a adoptar sobre el material contaminado.

Los órganos competentes de las Comunidades Autónomas adoptarán las siguientes medidas:

Destruidos o

Eliminados de otro modo, por medio de medidas bajo control oficial, de conformidad con el punto 1 del anexo IV, siempre que se compruebe que no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo.

Artículo 8. Medidas aplicables para evitar la contaminación mediante la patata de siembra.

Los organismos oficiales responsables dispondrán que las patatas de siembra se ajusten a los requisitos establecidos en el Real Decreto 2071/1993 y que procedan directamente de material obtenido de acuerdo con un programa oficialmente aprobado y que haya sido declarado exento del organismo merced a pruebas oficiales o realizadas bajo control oficial según el método establecido en el anexo I.

Las mencionadas pruebas se llevarán a cabo:

Artículo 9. Prohibición expresa.

Queda prohibida la tenencia y manipulación del organismo.

Artículo 10. Excepciones a las medidas fitosanitarias.

Sin perjuicio de lo dispuesto en el Real Decreto 2071/1993, los órganos competentes de las Comunidades Autónomas podrán autorizar excepciones a las medidas contempladas en los artículos 6, 7 y 9 de la presente disposición para fines experimentales o científicos y para trabajos de selección varietal, siempre que tales excepciones no obstaculicen la lucha contra el organismo ni supongan un riesgo de propagación de éste.

Artículo 11. Medidas adicionales.

Los órganos competentes de las Comunidades Autónomas podrán adoptar medidas adicionales o más estrictas necesarias para combatir al organismo o impedir su propagación, siempre y cuando se ajusten a lo dispuesto en el Real Decreto 2071/1993.

Las medidas adicionales que se mencionan en el párrafo primero del presente artículo podrán disponer que sólo puedan plantarse patatas de siembra que, de acuerdo con una certificación o una inspección oficial, se ajusten a las normas fitosanitarias. La inspección oficial podrá aplicarse en caso de que los agricultores estén autorizados a utilizar en sus explotaciones patatas de siembra de recolección propia o en otros casos en que se planten patatas de siembra de producción propia.

Los detalles de tales medidas serán notificados a la Dirección General de Sanidad de la Producción Agraria y ésta, a su vez, a los demás Estados miembros y a la Comisión de la Comunidad Europea a través del cauce correspondiente.

Disposición derogatoria.

Queda derogada la Orden de 28 de febrero de 1986 relativa a la prevención y lucha contra el marchitamiento bacteriano de la patata, en aplicación de la Directiva 80/665/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas.

Disposición final única.

La presente disposición entrará en vigor el día siguiente al de su publicación en el «Boletín Oficial del Estado».

Madrid, 22 de marzo de 1994.

ALBERO SILLA

Ilmos. Sres. Secretario general de Producciones y Mercados Agrarios y Director general de Sanidad de la Producción Agraria.

ANEXO I. Método de diagnóstico, detección e identificación de la necrosis bacteriana, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis etal. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff)

ÁMBITO DE APLICACIÓN DEL MÉTODO

El método expuesto describe diversos procedimientos relacionados con:

ii) la detección de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en muestras de tubérculos y plantas de patata,

iii) la identificación de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus).

PRINCIPIOS GENERALES

Los apéndices recogen protocolos optimizados para los distintos métodos, reactivos validados y datos relativos a la preparación de los materiales utilizados en las pruebas y de los materiales de control. El apéndice 1 incluye una lista de los laboratorios que participaron en la optimización y la validación de los protocolos.

Dado que los protocolos entrañan la detección de un organismo sujeto a cuarentena e incluirán la utilización de cultivos viables de C. m. subsp. sepedonicus como materiales de control, será necesario ejecutar los procedimientos en las condiciones de cuarentena apropiadas con las instalaciones necesarias para el desecho de los residuos y contando con los permisos pertinentes emitidos por las autoridades oficiales responsables de la cuarentena fitosanitaria.

Los parámetros de prueba deben garantizar la detección coherente y reproducible de los niveles de C. m. subsp. sepedonicus en los límites fijados por los métodos seleccionados.

Es esencial una preparación precisa de los controles positivos.

El hecho de ejecutar las pruebas de acuerdo con los límites exigidos implica también la utilización de los ajustes correctos, el mantenimiento y la calibración del equipo, una cuidadosa manipulación y conservación de los reactivos, y la aplicación de todas las medidas destinadas a evitar la contaminación entre las muestras, como, por ejemplo, la separación de los controles positivos de las muestras de prueba. Se deben aplicar normas relativas al control de la calidad con el fin de evitar errores administrativos y de otro tipo, especialmente por lo que se refiere al etiquetado y la documentación.

Toda aparición sospechosa, como la referida en el artículo 4, apartado 2, de esta orden, entraña un resultado positivo en las pruebas de diagnóstico o de selección realizadas con una muestra tal como se especifica en los diagramas de flujo.

Si en la primera prueba de selección (IF o PCR/FISH) se obtiene un resultado positivo, puede sospecharse la contaminación con C. m. subsp. sepedonicus y se debe efectuar una segunda prueba de selección. Si el resultado de la segunda prueba de selección es positivo, la sospecha se confirma (aparición sospechosa) y las pruebas deben proseguir de acuerdo con el método. En el caso de que el resultado de la segunda prueba de selección sea negativo, la muestra no se considerará contaminada con C. m. subsp. sepedonicus.

Por tanto, los resultados positivos de una prueba IF a los que hace referencia el artículo 4, apartado 2, se definen mediante una lectura positiva en una prueba IF confirmada por una segunda prueba de selección (PCR/FISH).

La presencia confirmada a la que se hace referencia en el artículo 5, apartado 1 de esta orden, requiere el aislamiento y la identificación de un cultivo puro de C. m. subsp. sepedonicus con confirmación de su patogenicidad.

1. PRESENTACIÓN EN DIAGRAMAS DE FLUJO.

1.1 Método de detección para el diagnóstico de la necrosis bacteriana en tubérculos y plantas de patata que presentan síntomas de necrosis bacteriana.

Este protocolo de análisis está destinado a los tubérculos y plantas de patata que muestran síntomas típicos o sospechosos de necrosis bacteriana. Incluye una prueba de selección rápida, el aislamiento del patógeno del tejido vascular infectado en un medio de diagnóstico y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivo como C. m. subsp. Sepedonicus.

(1) El punto 2 recoge una descripción de los síntomas.

(2) Se consideran adecuadas las pruebas siguientes:

– la prueba IF (punto 4),

– la prueba PCR (punto 5),

– la prueba FISH (punto 6).

(3) Aunque el aislamiento de patógeno a partir de material vegetal con síntomas típicos mediante dilución de placas es sencillo, el aislamiento puede fallar en estados avanzados de infección, las bacterias saprofitas que crecen en el tejido enfermo pueden enmascarar o inhibir el patógeno en el medio de aislamiento. Se recomienda, por tanto, utilizar medios selectivos y no selectivos, preferiblemente MTNA (punto 8) o la prueba de bioensayo (punto 7).

(4) El punto 8 recoge una descripción de la morfología típica de las colonias.

(5) Si los resultados de la prueba de aislamiento son negativos, pero los síntomas de la enfermedad son los típicos, deberá repetirse el aislamiento.

(6) La identificación fiable de un cultivo puro de C.m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se enumeran en el punto 9.

(7) En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad.

1.2 Método de detección e identificación de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus en muestras de tubérculos de patata asintomáticos.

Principio.

Este protocolo de análisis se destina a la detección de infecciones latentes en tubérculos de patata asintomáticos mediante al menos dos pruebas de selección basadas en distintos principios biológicos que, de ser positivas, deberán complementarse con el aislamiento del patógeno; en caso de aislamiento de colonias típicas, se procede a continuación a la identificación de un cultivo puro como C. m. subsp. sepedonicus. El hecho de obtener resultados positivos sólo en una de las pruebas no es suficiente para considerar la muestra sospechosa.

Las pruebas de selección y aislamiento deben permitir límites de detección de 10³ a 10⁴ células por ml de precipitado resuspendido, incluidos como controles positivos en cada serie de pruebas.

(1) El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos, aunque el procedimiento puede adaptarse para muestras con menos tubérculos en el caso de que no se disponga de 200.

(2) Los métodos de extracción y concentración del patógeno se describen en el punto 3.1.

(3) En el caso de que al menos dos de las pruebas basadas en principios biológicos diferentes proporcionen resultados positivos, habrá de procederse al aislamiento y la confirmación. Debe realizarse como mínimo una prueba de selección. Cuando el resultado de esta prueba sea negativo, la muestra se considerará negativa. En el caso de que el resultado de esta prueba sea positivo, será necesario realizar dos o más pruebas de selección basadas en principios biológicos diferentes con el fin de verificar el primer resultado positivo. Sí la segunda prueba o el resto de las pruebas proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa y no será necesario llevar a cabo más pruebas.

(4) Prueba de inmunofluorescencia (IF}. Para la prueba de selección IF debe utilizarse siempre un anticuerpo policional, los anticuerpos monoclonales adicionales pueden proporcionar una mayor especificidad (véase el punto 4).

(5) Prueba PCR. Deben utilizarse reactivos y protocolos PCR convenientemente validados (véase el punto 6).

(6) Prueba FISH. Deben utilizarse reactivos y protocolos convenientemente validados (véase el punto 5).

(7) Aislamiento selectivo. Con el medio MTNA o el medio NCP-88 y una dilución al 1/100 del precipitado resuspendido, es en muchos casos un método adecuado para el aislamiento directo de C. m. subsp. sepedonicus. Entre 3 y 10dias después de la siembra selectiva pueden obtenerse colonias típicas. Posteriormente se puede purificar e identificar el patógeno. Para poder aprovechar plenamente el potencial de la prueba, es necesario preparar con cuidado las cuñas de la parte basal a fin de evitar que otras bacterias secundarias asociadas al tubérculo de la patata, que compitan con C. m. subsp. sepedonicus en el medio, puedan afectar al desarrollo del patógeno. Si la prueba de la siembra selectiva no resulta efectiva, se deberá proceder al aislamiento a partir de las plantas utilizadas para el bioensayo (véase el punto 8).

(8) La prueba de bioensayo se utiliza para el aislamiento de C. m. subsp. sepedonicus a partir de precipitado de extracto de patatas mediante el enriquecimiento selectivo de la bacteria en berenjenas (Solanum melongena). Exige que las condiciones de incubación sean óptimas, según se especifican en este método. Es muy probable que las bacterias inhibidoras de C. m. subsp. sepedonicus en los medios MTNA o NCP-88 no interfieran en esta prueba (véase el punto 7).

(9) En el punto 8 se describe la morfología típica de las colonias.

(10) Los cultivos o bioensayos pueden fallar debido a la competencia de las bacterias saprofitas o a la inhibición provocada por las mismas. En el caso de que se obtengan resultados positivos en las pruebas de selección pero negativos en las de aislamiento, se deberán repetir las pruebas de aislamiento a partir del mismo precipitado o utilizando además tejido vascular de la parte basal de tubérculos cortados de la misma muestra y, si fuese necesario, con otras muestras.

(11) La identificación fiable de cultivos puros supuestamente de C. m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se describen en el punto 9.

(12) En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad.

1.3 Método de detección e identificación de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus en muestras de plantas de patata asintomáticas.

(1) Véase el punto 3.2 para obtener información sobre los tamaños recomendados de la muestra.

(2) Los métodos de extracción y concentración del patógeno se describen en el punto 3.2.

(3) En el caso de que al menos dos de las pruebas basadas en principios biológicos diferentes proporcionen resultados positivos, habrá de procederse al aislamiento y la confirmación. Debe realizarse como mínimo una prueba de selección. Cuando el resultado de la prueba sea negativo, la muestra se considerará negativa. En el caso de que el resultado de esta prueba sea positivo, será necesario realizar dos o más pruebas de selección basadas en principios biológicos diferentes con el fin de verificar el primer resultado positivo. Si la segunda prueba o el resto de las pruebas proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa y no será necesario llevar a cabo más pruebas.

(4) En el punto 8 se describe la prueba de aislamiento selectivo y la morfología típica de las colonias.

(5) En el punto 4 se describe la prueba IF.

(6) En el punto 6 se describe la prueba PCR.

(7) En el punto 5 se describe la prueba FISH.

(8) En el punto 7 se describe la prueba de bioensayo.

(9) Los cultivos o bioensayos pueden fallar debido a la competencia de las bacterias saprofitas o a la inhibición provocada por las mismas. En el caso de que se obtengan resultados positivos en las pruebas de selección pero negativos en las de aislamiento, se deberán repetir las pruebas de aislamiento y, si fuese necesario, efectuar pruebas con otras muestras.

(10) La identificación fiable de cultivos puros supuestamente de C. m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se describen en el punto 9.

(11) En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad.

2. EXAMEN VISUAL PARA DETECTAR SÍNTOMAS DE NECROSIS BACTERIANA.

2.1 Plantas de patata.

En las condiciones climáticas europeas, los síntomas se presentan rara vez en el campo y con frecuencia sólo al final de la temporada. Por otra parte, en numerosos casos, otras enfermedades, la senescencia o los daños mecánicos enmascaran los síntomas o se confunden con ellos. Por tanto, puede ser fácil pasar por alto los síntomas en las inspecciones de campo. Los síntomas de marchitamiento son muy distintos de los de la podredumbre parda; el marchitamiento es normalmente un proceso lento y se limita en principio a los bordes de las hojas. El crecimiento de las hojas jóvenes infectadas no suele detenerse, aunque sea más lento en las zonas infectadas. Esto hace que las hojas tengan formas extrañas. Las hojas afectadas por el bloqueo de los tejidos vasculares de la parte baja del tallo desarrollan con frecuencia zonas intenerviales cloróticas amarillas o anaranjadas. Los foliolos, hojas e incluso tallos infectados pueden llegar a morir. Con frecuencia las hojas y tubérculos muestran simplemente un tamaño reducido. En algunos casos las plantas se atrofian. Se pueden consultar fotografías en color de algunos de estos síntomas en el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2.2 Tubérculos de patata.

Los primeros síntomas consisten en un ligero aspecto vítreo o traslúcido del tejido, sin ablandamiento, en torno al sistema vascular, en especial cerca de la parte basal. La corona vascular de la parte basal puede tener un color ligeramente más oscuro de lo normal. El primer síntoma claramente detectable consiste en que la corona vascular adquiere una coloración amarillenta y al comprimir suavemente el tubérculo emergen de los vasos unos exudados de aspecto lechoso. Dicho exudado contiene millones de bacterias. Se puede producir el oscurecimiento del tejido vascular y los síntomas que presentan los tubérculos en esta fase son similares a los de la podredumbre parda provocada por Ralstonia solanacearum. Al principio, estos síntomas pueden limitarse a una parte de la corona, no necesariamente cerca de la parte basal, y pueden extenderse posteriormente a la totalidad de la corona.

A medida que la infección progresa, se produce destrucción de tejido vascular; la zona cortical externa puede separarse de la zona cortical interna. En las fases avanzadas de la infección, se producen grietas en la superficie del tubérculo, que suelen tener un color pardo rojizo en los bordes. Recientemente se han producido varios casos en Europa en los que la zona cortical central se ha podrido al mismo tiempo que la corona vascular provocando una invasión secundaria con oquedades y necrosis interna. Los síntomas pueden verse enmascarados por una invasión secundaria fúngica o bacteriana que puede hacer difícil, o incluso imposible, diferenciar los síntomas de necrosis bacteriana avanzada de otras necrosis de los tubérculos. Pueden presentarse síntomas atípicos. Se pueden consultar fotografías en color de algunos de estos síntomas en el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.

3.1 Tubérculos de patata.

Nota:

‒ El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos por ensayo. Para realizar un muestreo más intensivo es preciso llevar a cabo más pruebas con muestras de este tamaño. El hecho de disponer de un número mayor de tubérculos en la muestra puede provocar la inhibición o dificultar la interpretación de los resultados. No obstante, el procedimiento puede adaptarse convenientemente a muestras formadas por un número menor de tubérculos en el caso de que no se disponga de 200.

‒ La validación de todos los métodos de detección descritos más adelante se basa en los ensayos realizados con muestras de 200 tubérculos.

‒ El extracto de patata descrito a continuación puede emplearse también para la detección de la bacteria de la podredumbre parda de la patata, Ralstonia solanacearum.

Pretratamiento opcional previo a la preparación de la muestra:

Lavar los tubérculos. Utilizar desinfectantes (cuando se vaya a efectuar la prueba PCR, la desinfección con compuestos de cloro puede interferir en la extracción de ADN del patógeno) y detergentes adecuados para cada muestra. Secar los tubérculos al aire. Este procedimiento de lavado resulta particularmente útil (aunque no necesario) en el caso de muestras con exceso de tierra y cuando se vaya a efectuar una prueba PCR o un procedimiento de aislamiento directo.

3.1.1 Quitar la epidermis de la parte basal de cada tubérculo con un bisturí o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que el tejido vascular quede a la vista. Extraer cuidadosamente una pequeña cuña de tejido vascular de la parte basal y el mínimo volumen posible de tejido no vascular (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

Nota: Retirar los tubérculos que presenten síntomas sospechosos de necrosis bacteriana y analizarlos separadamente.

En el caso de que se observen síntomas sospechosos de necrosis bacteriana durante la extracción de la cuña de la parte basal, deberá realizarse una inspección visual del tubérculo una vez cortado a la altura de la parte basal.

Todo tubérculo cortado que presente síntomas sospechosos deberá suberizarse a temperatura ambiente durante dos días y almacenarse en cuarentena (a una temperatura de entre 4 y 10 °C) hasta que concluyan todos los ensayos. Todas las muestras de tubérculos, incluidas las que presenten síntomas sospechosos, deberán conservarse de acuerdo con lo dispuesto en el anexo II.

3.1.2 Introducir las cuñas de la parte basal en recipientes desechables que no hayan sido utilizados previamente y que puedan cerrarse y/o sellarse (en el caso de que estos recipientes vayan a volver a utilizarse deberán limpiarse y desinfectarse concienzudamente con compuestos de cloro). Preferiblemente, las cuñas deben procesarse inmediatamente. Si esto no fuese posible, deberán almacenarse en el recipiente, sin tampón, y conservarse por un período máximo de 72 horas refrigeradas o de 24 horas a temperatura ambiente. El secado y la suberización de las cuñas, así como el crecimiento de saprofitos durante el almacenamiento, pueden dificultar la detección de la bacteria causante de la necrosis bacteriana.

3.1.3 Procesar las cuñas básales por uno de los métodos siguientes:

Nota: El riesgo de contaminación cruzada de las muestras es alto cuando éstas se homogeneizan mediante una trituradora. Se debe actuar con precaución para evitar la generación de aerosoles o el vertido durante el proceso de extracción. Es preciso asegurarse de que se esterilizan las cuchillas de la trituradora y los recipientes que vayan a utilizarse para cada muestra. Si se va a realizar la prueba PCR, es preciso evitar que existan restos de ADN en los recipientes o el aparato triturador. Cuando se vaya a efectuar la prueba PCR se recomienda la trituración en bolsas desechables y la utilización de tubos desechables.

3.1.4 Decantar el sobrenadante. Si presenta un aspecto excesivamente turbio, clarificarlo centrifugándolo a baja velocidad (a 180 g como máximo, durante 10 minutos, a una temperatura entre 4 y 10 °C) o mediante filtración al vacío (40-100 μm), lavando el filtro con solución adicional (10 ml) de tampón de extracción (apéndice 3).

3.1.5 Concentrar la fracción bacteriana mediante centrifugación a 7.000 g durante 15 minutos (o a 10.000 g durante 10 minutos) a una temperatura entre 4 y 10 °C y descartar el sobrenadante sin perturbar el precipitado.

3.1.6 Resuspender el precipitado en un 1,5 ml de tampón de precipitado (apéndice 3). Utilizar 500 μl para la prueba de C. m. subsp. sepedonicus, 500 μl para Ralstonia solanacearum y 500 μl a efectos de referencia. Añadir glicerol estéril en una concentración final de 10-25 % (v/v) a los 500 μl de la alícuota de referencia y a la alícuota restante de cada prueba, homogeneizar por agitación y guardar a una temperatura entre ‒16 y ‒24 °C (semanas) o entre ‒68 y ‒86 °C (meses). Mantener las alícuotas de la prueba a una temperatura comprendida entre 4 y 10 °C durante los ensayos.

No es recomendable congelar y descongelar el extracto en repetidas ocasiones.

Si fuese preciso transportar el extracto, es conveniente asegurarse de que la entrega se efectúa en una caja refrigerada en el plazo de 24 a 48 horas.

3.1.7 Es imprescindible que todos los controles y muestras positivas de C. m. subsp. sepedonicus se procesen por separado, a fin de evitar la contaminación. Esto se aplica a las preparaciones para IF y a todas las pruebas.

3.2 Plantas de patata.

Nota: Para la detección de poblaciones latentes de C. m. subsp. sepedonicus se recomienda efectuar las pruebas con muestras mixtas. El procedimiento se puede adaptar convenientemente para muestras mixtas de hasta 200 partes de tallos (los estudios deberán basarse en una muestra representativa desde el punto de vista estadístico de la población vegetal que se someta a investigación).

3.2.1 Extraer una sección de 1 a 2 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo, utilizando un cuchillo o tijeras de podar limpios y desinfectados.

Desinfectar ligeramente las secciones de tallo con etanol al 70 % y secar inmediatamente con un pañuelo de papel.

Introducir las secciones de tallo en un recipiente estéril cerrado de acuerdo con los siguientes procedimientos de muestreo:

3.2.2 Procesar las secciones de tallo mediante uno de los métodos siguientes:

3.2.3 Decantar el sobrenadante tras haberlo dejado reposar durante 15 minutos.

3.2.4 Normalmente no es necesario clarificar más el extracto ni la concentración de la fracción bacteriana, pero esto se puede lograr mediante la filtración y/o la centrifugación, tal como se describe en los puntos 3.1.4 a 3.1.6.

3.2.5 Dividir el extracto puro o concentrado de la muestra en dos partes iguales. Mantener una de las partes a 4-10 °C durante los ensayos y almacenar la parte restante, tras haber añadido glicerol estéril al 10-25 % (v/v), a una temperatura comprendida entre ‒16 y ‒24 °C (semanas) o entre ‒68 y ‒86 °C (meses) en el caso de que sea necesario realizar nuevas pruebas.

4. PRUEBA IF.

Principio:

La utilización de la prueba IF como principal prueba de selección está recomendada por su solidez demostrada para alcanzar los límites exigidos.

Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, deberán realizarse las pruebas PCR o FISH como segunda prueba de selección. Cuando se utilice la prueba IF como segunda prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, será preciso realizar las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el análisis.

Nota: Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de selección, deberá utilizarse siempre un anticuerpo policlonal. En el caso de resultados IF positivos con un anticuerpo policlonal, la selección posterior de la muestra con un anticuerpo monoclonal puede proporcionar una mayor especificidad pero ser menos sensible.

Conviene utilizar anticuerpos frente a la cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus. Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución superior en la que se produce la reacción óptima cuando se realiza la prueba con una suspensión que contiene entre 10⁵ y 10⁶ células por ml de la cepa homologa de C. m. subsp. sepedonicus y se utiliza una dilución apropiada del conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), según las recomendaciones del fabricante.

Los anticuerpos policlonales o monoclonales crudos deberían tener un título IF de al menos 1:2000. Durante las pruebas, los anticuerpos deberían utilizarse en diluciones de trabajo (DT) próximas o iguales al título. Utilizar anticuerpos validados.

(véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

La prueba debería realizarse con extractos de muestras que se acaben de preparar. Si fuese necesario, puede efectuarse también con extractos almacenados a una temperatura comprendida entre ‒68 y ‒86 °C en glicerol. El glicerol puede separarse de la muestra mediante la adición de 1 ml de tampón de precipitado (apéndice 4), la recentrifugación durante 15 minutos a 7.000 g y la resuspensión en el mismo volumen de tampón de precipitado. Normalmente esto no es necesario, especialmente si las muestras se fijan al portaobjetos flameándolas (véase el punto 2.2).

Preparar otros portaobjetos con controles positivos de la cepa homologa o de cualquier otra cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 2 y, opcionalmente, en tampón.

De ser posible, deberán utilizarse tejidos infectados de forma natural (conservados mediante liofilización o congelación a temperaturas comprendidas entre ‒16 y ‒24 °C) como control similar, en el mismo portaobjetos.

Como controles negativos, utilizar alícuotas de extractos de muestra que previamente hayan proporcionado resultados negativos en la prueba.

Utilizar portaobjetos de pocillos múltiples, de preferencia con 10 pocillos de 6 mm de diámetro como mínimo.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

4.1 Preparar los portaobjetos según uno de los procedimientos siguientes:

Verter con una pipeta un volumen determinado (15 μl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) de una dilución al 1/100 del precipitado de patata resuspendido en el primer pocillo. Posteriormente, verter un volumen similar de precipitado sin diluir (1/1) en los demás pocillos de la fila. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1.

ii) Para otros precipitados:

Preparar diluciones decimales (1/10 y 1/100) del precipitado resuspendido en el tampón de precipitado. Verter con una pipeta un volumen determinado (15 μl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada dilución en una de las filas de pocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 2.

4.2 Dejar secar las gotitas a temperatura ambiente o calentándolas a una temperatura comprendida entre 40 y 45 °C.

Fijar las células bacterianas al portaobjetos calentándolo (15 minutos a 60 °C), flameándolo, mediante etanol al 95 %, o de acuerdo con las instrucciones específicas de los proveedores de los anticuerpos.

De ser necesario, los portaobjetos fijados pueden almacenarse congelados en una caja seca durante el mínimo tiempo posible (hasta un máximo de tres meses) antes de realizar nuevas pruebas.

4.3 Procedimiento IF:

Preparar un conjunto de diluciones a 1/2 del anticuerpo en el tampón IF. El primer pocillo deberá tener 1/2 del título (T/2) y el resto 1/4 del título (T/4), 1/2 del título (T/2), el título (T) y dos veces el título (2T),

ii) si el portaobjetos se ha preparado según el inciso ii) del punto 4.1:

Preparar la dilución de trabajo (DT) del anticuerpo en tampón IF. La dilución de trabajo afecta a la especificidad.

Figura 1. Preparación del portaobjetos de acuerdo con el punto 4.1, inciso i), y el punto 4.3, inciso i)

Figura 2. Preparación del portaobjetos de acuerdo con el punto 4.1, inciso ii), y el punto 4.3, inciso ii)

4.3.1 Colocar los portaobjetos en papel humedecido. Cubrir completamente cada pocillo con la dilución o diluciones del anticuerpo. El volumen del anticuerpo aplicado en cada pocillo debe ser equivalente al menos al del extracto aplicado.

A falta de instrucciones específicas de los proveedores de anticuerpos, deberá seguirse el procedimiento siguiente:

4.3.2 Tapar los portaobjetos y dejar incubar sobre papel humedecido durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C).

4.3.3 Sacudir las gotitas de cada portaobjetos y enjuagar cuidadosamente con tampón IF. Lavar por inmersión durante 5 minutos en tampón IF-Tween (apéndice 3) y repetir la operación durante 5 minutos en tampón IF. Deben evitarse los aerosoles o la transferencia de gotitas que puedan provocar la contaminación cruzada. Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad secándolos ligeramente.

4.3.4 Colocar los portaobjetos en papel humedecido. Cubrir los pocillos con la dilución del conjugado FITC utilizado para determinar el título. El volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser idéntico al volumen de anticuerpo aplicado.

4.3.5 Tapar los portaobjetos y dejar incubar sobre papel humedecido durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C).

4.3.6 Sacudir las gotitas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (punto 4.3.3). Retirar con cuidado el exceso de humedad.

4.3.7 Verter con una pipeta de 5 a 10 μl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M (véase el apéndice 3) o una solución comercial similar que proteja la fluorescencia (anti-fading) en cada pocillo y tapar.

4.4 Lectura de la prueba IF:

4.4.1 Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitación del FITC, con aceite o agua de inmersión y a 500-1.000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que no presenten células o sólo un pequeño número de ellas es preciso observar como mínimo 40 campos microscópicos.

En primer lugar, comprobar el control positivo. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas al título de anticuerpos determinado o la dilución de trabajo. La prueba IF (punto 4) debe repetirse si la tinción no es correcta.

4.4.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con la morfología característica de C. m. subsp. sepedonicus en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo a la misma dilución del anticuerpo o mejor que ésta. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.

En el caso que se sospeche cualquier posible contaminación, deberá repetirse la prueba. Esto puede ocurrir cuando todos los portaobjetos de un lote presenten células positivas debido a la contaminación del tampón o cuando se encuentren células positivas (fuera de los pocillos) en la superficie del portaobjetos.

4.4.3 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba de inmunofluorescencia. En los precipitados de cuñas básales y secciones de tallo de patata pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de C. m. subsp sepedonicus.

4.4.4 Sólo deben considerarse las células fluorescentes con tamaño y morfología típicos, al título o la dilución de trabajo de los anticuerpos, al igual que en el punto 4.3.

4.4.5 Interpretación de los resultados de la prueba IF:

La prueba IF es positiva para las muestras que presenten al menos 5 × 10³ células típicas por ml de precipitado resuspendido. La muestra se considera potencialmente contaminada y es necesario realizar nuevas pruebas,

ii) la prueba IF es negativa para las muestras que presenten menos de 5 × 10³ células por ml de precipitado resuspendido y la muestra se considera negativa. No es necesario realizar nuevas pruebas.

5. PRUEBA FISH.

Principio:

Cuando se utilice la prueba FISH como primera prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, deberá realizarse la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la prueba FISH como segunda prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, será preciso realizar las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico.

Nota: Utilizar oligosondas específicas para C. m. subsp. sepedonicus validadas (apéndice 7). Las pruebas preliminares realizadas con este método deberán permitir la detección reproducible de al menos 10³-10⁴ células de C. m. subsp. sepedonicus por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos.

El procedimiento siguiente debería llevarse a cabo, a ser posible, con extracto de muestra que se acabe de preparar, pero también puede realizarse con extracto de muestra que se haya almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre ‒16 y ‒24 °C o entre ‒68 y ‒86 °C.

Como controles negativos, deben utilizarse alícuotas de extracto de muestra que previamente haya arrojado resultados negativos para C. m. subsp. sepedonicus.

Como controles positivos, deben prepararse suspensiones que contengan de 10⁵ a 10⁶ células por ml de C. m. subsp. sepedonicus (por ejemplo, la cepa NCPPB 4053, o PD 406) en tampón fosfato de concentración 0,01 M de un cultivo de 3 a 5 días (para la preparación véase el apéndice 2). Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homologa o de cualquier otra cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 2.

El uso de una oligosonda eubacteriana marcada con FITC ofrece un control para el proceso de hibridación, ya que teñirá todas las eubacterias que estén presentes en la muestra.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

5.1 Fijación del extracto de patata.

El protocolo siguiente se basa en Wullings et al., (1998):

5.1.1 Preparar la solución de fijación (véase el apéndice 7).

5.1.2 Verter 100 μl de cada extracto de muestra en un tubo eppendorf y centrifugar durante 8 minutos a 7 000 g.

5.1.3 Quitar el sobrenadante y disolver el precipitado en 500 μl de solución fijadora preparada con menos de 24 horas de antelación. Agitar e incubar de un día para otro a 4 °C.

El etanol al 96 % constituye una solución fijadora alternativa. Para utilizarlo, disolver el precipitado a partir del paso 5.1.2 en 50 μl de tampón fosfato de concentración 0,01 M y 50 μl de etanol al 96 %. Agitar la mezcla e incubar a 4 °C durante 30 a 60 minutos.

5.1.4 Centrifugar durante 8 minutos a 7 000 g, quitar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 μl de tampón fosfato de concentración 0,01 M (véase el apéndice 3).

5.1.5 Colocar 16 μl de las suspensiones fijadas en un portaobjetos múltiple limpio, tal como muestra la figura 3. Aplicar 2 muestras diferentes por portaobjetos sin diluir y utilizar 10 μl para realizar una dilución al 1:100 (en tampón fosfato de concentración 0,01 M). La solución de la muestra restante (49 μl) puede almacenarse a ‒20 °C tras la adición de 1 volumen de etanol al 96 %. En el caso de que sea necesario repetir la prueba FISH, separar el etanol mediante centrifugación y añadir un volumen equivalente de tampón fosfato de concentración 0,01 M (mezclar mediante agitación).

Figura 3

5.1.6 Secar los portaobjetos al aire (o con secador de portaobjetos a 37 °C) y fijarlos flameándolos.

El procedimiento puede interrumpirse en esta fase, pudiéndose proseguir con la hibridación al día siguiente. Los portaobjetos deben almacenarse secos y sin polvo a temperatura ambiente.

5.2 Prehibridación e hibridación.

5.2.1 Preparar una solución de lisozima que contenga 10 mg de lisozima (Sigma L-6876) en 10 ml de tampón (100 mM Tris-HCI, 50 mM EDTA, pH 8,0). Esta solución puede almacenarse pero sólo debe congelarse y descongelarse una vez. Cubrir todas las muestras bien con aproximadamente 50 μl de solución de lisozima e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Sumergir los portaobjetos en agua desmineralizada una única vez y secar con papel de filtro.

Alternativamente, en lugar de lisozima, añadir 50 μl de 40-400 μg ml^-1 de proteinasa K en tampón (20 mM Tris-HCI, 2 mM CaCl₂, pH 7,4) en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 30 minutos.

5.2.2 Deshidratar las células en series de etanol escalonadas al 50 %, 80 % y 96 % durante 1 minuto cada una. Secar las preparaciones en un portaobjetos.

5.2.3 Preparar una cámara de incubación húmeda recubriendo el fondo de una caja hermética con un pañuelo de papel o papel de filtro empapado en 1x hybmix (apéndice 7). Preincubar la caja en el horno de hibridación a 55 °C durante 10 minutos como mínimo.

5.2.4 Preparar la solución de hibridación (apéndice 7) con 45 μl por portaobjeto, y preincubar durante 5 minutos a 55 °C.

5.2.5 Colocar los portaobjetos en una placa caliente a 45 °C y aplicar 10 μl de solución de hibridación en cada uno de los 4 pocillos del (o de los) portaobjetos.

5.2.6 Aplicar 2 cubreobjetos (24 × 24 mm) a cada portaobjeto evitando la entrada de aire. Colocar los portaobjetos en la cámara húmeda precalentada y dejar que se produzca la hibridación de un día para otro a 55 °C en la oscuridad.

5.2.7 Preparar 3 vasos de precipitado que contengan 1 I de agua ultrapura, 1 I de 1x hybmix (334 ml 3x hybmix y 666 ml de agua ultrapura) y 1 I de 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix y 833 ml de agua ultrapura). Preincubarlos al baño maría a 55 °C.

5.2.8 Quitar los cubreobjetos de los portaobjetos y colocar los portaobjetos en un soporte.

5.2.9 Lavar el exceso de sonda mediante incubación durante 15 minutos en el vaso de precipitado con 1x hybmix a 55 °C.

5.2.10 Transferir el portaobjetos a una solución de lavado de hybmix al 1/2 e incubar durante otros 15 minutos.

5.2.11 Sumergir las preparaciones brevemente en agua ultrapura y colocarlas en papel de filtro. Eliminar el exceso de humedad cubriendo la superficie con cuidado con papel de filtro. Verter de 5 a 10 μl de solución de montaje protectora de la fluorescencia (p. ej. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA o equivalente) en cada pocillo y aplicar un cubreobjetos grande (24 × 60 mm) sobre la totalidad de los portaobjetos.

5.3 Lectura de la prueba FISH:

5.3.1 Los portaobjetos deben examinarse inmediatamente utilizando un microscopio epifluorescente a 630 o 1.000 aumentos con aceite de inmersión. Con un filtro adecuado para isotiocianato de fluoresceína (FITC) las células eubacterianas (incluidas la mayoría de las células gramnegativas) de la muestra aparecen teñidas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina-5-isotiocianato, las células de C. m. subsp. sepedonicus marcadas con Cy3 aparecen teñidas de rojo fluorescente. Comparar la morfología de las células con la de los controles positivos. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas.

Debe repetirse la prueba FISH (punto 9.4) si la tinción es aberrante. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que no presenten células o sólo un pequeño número de ellas es preciso observar como mínimo 40 campos microscópicos.

5.3.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con la morfología característica de C. m. subsp. sepedonicus en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

La intensidad de la fluorescencia debe ser mejor que la de la cepa de control positivo o equivalente a la misma. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.

5.3.3 En el caso que se sospeche cualquier posible contaminación, deberá repetirse la prueba. Esto puede ocurrir cuando todos los portaobjetos de un lote presenten células positivas debido a la contaminación del tampón o cuando se encuentren células positivas (fuera de los pocillos) en la superficie del portaobjetos.

5.3.4 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba FISH. En los precipitados de cuñas básales y secciones de tallo de patata pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de C. m. subsp. sepedonicus, aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF.

5.3.5 Deben tenerse en cuenta únicamente las células fluorescentes de tamaño y morfología típicos (véase el punto 5.3.2).

5.3.6 Interpretación de los resultados de la prueba FISH:

ii) los resultados de la prueba FISH serán negativos cuando, utilizando el filtro de rodamina, no se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante con un tamaño y morfología típicos de C. m. subsp. sepedonicus, siempre que se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante típicas en las preparaciones de control positivo cuando se utilice el filtro de rodamina.

6. PRUEBA PCR.

Principio:

Cuando se utilice la prueba PCR como principal prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, deberá realizarse la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la prueba PCR como segunda prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, será preciso realizar las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico.

La plena explotación de este método como principal método de selección sólo se recomienda en el caso de que se hayan adquirido conocimientos especializados del mismo.

Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberán permitir la detección reproducible de 10³ a 10⁴ células de C. m. subsp. sepedonicus por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos. Puede ser necesario llevar a cabo experimentos de optimización para lograr niveles máximos de sensibilidad y especificidad en todos los laboratorios.

Deben utilizarse reactivos y protocolos PCR validados. Seleccionar preferiblemente un método con control interno.

Tomar las precauciones necesarias para evitar la contaminación de la muestra con el ADN buscado. La prueba PCR deben llevarla a cabo técnicos experimentados en laboratorios especializados en biología molecular, con el fin de reducir al máximo la posibilidad de contaminación con el ADN buscado.

Como prueba final del procedimiento siempre deben efectuarse controles negativos (extracción de ADN y PCR) que dejen constancia de que no se ha producido arrastre de ADN.

En la prueba PCR deben incluirse los siguientes controles negativos:

‒ extracto de la muestra que previamente haya proporcionado resultados negativos para C. m. subsp. sepedonicus,

‒ controles de tampón utilizados para extraer la bacteria y el ADN de la muestra,

‒ mezcla para la reacción PCR.

Deben incluirse los siguientes controles positivos:

‒ alícuotas de los precipitados resuspendidos a los que se haya añadido C. m. subsp. sepedonicus (para la preparación, véase el apéndice 2),

‒ una suspensión de 10⁶ células por ml de C. m. subsp. sepedonicus en agua de un aislado virulento (por ejemplo, NCPPB 2140 o NCPPB 4053),

‒ siempre que sea posible, utilizar también ADN extraído de las muestras de control positivas en la prueba PCR.

Para evitar toda posible contaminación, preparar los controles positivos en un entorno distinto al de las muestras que se vayan a someter a prueba.

Los extractos de muestras deben estar, en la medida de lo posible, libres de tierra. En determinados casos puede ser recomendable preparar las extracciones a partir de patatas lavadas cuando vayan a utilizarse protocolos PCR.

6.1 Métodos de purificación del ADN.

Utilizar muestras de control positivas y negativas, como se indica más arriba.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

Para la purificación del ADN buscado a partir de sustratos de muestras complejas, existen diversos métodos que eliminan los inhibidores de PCR y otras reacciones enzimáticas y concentran el ADN buscado en el extracto de la muestra.

El siguiente método ha sido optimizado para su utilización con el método PCR validado que figura en el apéndice 6.

6.1.a) Método de Pastrik (2000):

1. Verter con una pipeta 220 μl de tampón de lisis (100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) en un tubo eppendorf de 1,5 ml.

2. Añadir 100 μl de extracto de muestra y colocar en un calentador o al baño maría a 95 °C durante 10 minutos.

3. Colocar el tubo en hielo durante 5 minutos.

4. Añadir 80 μl de solución madre de lisozima (50 mg de lisozima por ml en 10 mM Tris HCI, pH 8,0) e incubar a 37 °C durante 30 minutos.

5. Añadir 220 μl de solución A Easy DNA® (Invitrogen), mezclar adecuadamente por agitación e incubar a 65 °C durante 30 minutos.

6. Añadir 100 μl de solución B Easy DNA® (Invitrogen) y agitar vigorosamente hasta que el precipitado se mueva libremente en el tubo y la muestra sea uniformemente viscosa.

7. Añadir 500 μl de cloroformo y agitar hasta que disminuya la viscosidad y la mezcla sea homogénea.

8. Centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4 °C para separar las fases y formar la interfase.

9. Transferir la fase superior a un tubo eppendorf sin utilizar.

10. Añadir 1 ml de etanol al 100 % (‒20 °C), agitar brevemente e incubar en hielo durante 10 minutos.

11. Centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4 °C y retirar el etanol del precipitado.

12. Añadir 500 μl de etanol al 80 % (‒20 °C) y mezclar invirtiendo el tubo.

13. Centrifugar a 15.000 g durante 10 minutos a 4 °C, guardar el precipitado y retirar el etanol.

14. Dejar que el precipitado se seque al aire o en un Speed Vac de ADN.

15. Resuspender el precipitado en 100 μl de agua ultrapura estéril y dejar a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos.

16. Almacenar a ‒20 °C hasta que se necesite para PCR.

17. Decantar todo precipitado blanco mediante centrifugación, y utilizar 5 μl del sobrenadante que contenga ADN para la prueba PCR.

6.1.b) Otros métodos:

Se pueden aplicar otros métodos de extracción de ADN (como p. ej. Qiagen DNeasy Plant Kit) siempre que hayan demostrado ser igual de eficaces para purificar el ADN de muestras de control que contengan de 10³ a 10⁴ células patógenas por ml.

6.2 PCR.

6.2.1 Preparar los ensayos controles de PCR de acuerdo con el protocolo validado (apéndice 6). Preparar una dilución decimal de extracto de ADN de la muestra (1:10 en agua ultrapura).

6.2.2 Preparar la mezcla de reacción PCR adecuada en un entorno libre de contaminación de acuerdo con el protocolo publicado (apéndice 6). El protocolo PCR validado es una reacción “multiplex” que también incorpora un protocolo PCR interno.

6.2.3 Añadir 5 μl de extracto de ADN por 25 μl de reacción PCR en tubos PCR estériles.

6.2.4 Incorporar una muestra de control negativa que contenga sólo mezcla de reacción PCR y añadir la misma fuente de agua ultrapura utilizada en la mezcla PCR en lugar de la muestra.

6.2.5 Colocar los tubos en el mismo termociclador utilizado en las pruebas preliminares y aplicar el programa PCR optimizado adecuado (apéndice 6).

6.3 Análisis del producto de la PCR.

6.3.1 Confirmar los amplicones PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Correr al menos 12 μl de mezcla de reacción de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 μl de tampón de carga (apéndice 6) en un gel de agarosa al 2,0 % (p/v) en tampón tris-acetato-EDTA (TAE) (apéndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar un marcador de ADN adecuado, por ejemplo, 100 bp ladder.

6.3.2 Revelar las bandas de ADN mediante la tinción con bromuro de etidio (0,5 mg por I) durante 30 a 45 minutos, tomando las precauciones adecuadas para el manejo de este mutágeno.

6.3.3 En el caso de los productos PCR amplificados del tamaño esperado (apéndice 6), visualizar el gel teñido mediante transiluminación UV de onda corta (por ejemplo, = 302 nm) y anotar los resultados.

6.3.4 Para todos los resultados o casos nuevos, verificar la autenticidad del amplicón de PCR realizando un análisis con enzima de restricción en una muestra del ADN amplificado restante mediante la incubación a la temperatura óptima y durante el tiempo necesario con una enzima y tampón adecuados (véase el apéndice 6). Confirmar los fragmentos digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa, siguiendo el método indicado anteriormente, y observar el patrón característico del fragmento de restricción con transiluminación UV una vez teñido con bromuro de etidio y comparar con el control positivo no digerido y digerido.

Interpretación de los resultados de la prueba PCR.

La prueba PCR es negativa si el amplicón PCR específico de la C. m. subsp. sepedonicus del tamaño esperado no se detecta en la muestra en cuestión pero sí en todas las muestras de los controles positivos (en el caso de PCR “multiplex” con cebadores de control interno específicos de la planta, se debe amplificar con la muestra en cuestión un segundo producto PCR del tamaño esperado).

La prueba PCR es positiva si se detecta el amplicón PCR específico de la C. m. subsp. sepedonicus del tamaño y patrón de restricción (cuando sea necesario) esperados, siempre que no se amplifique a partir de ninguna de las muestras de los controles negativos. La confirmación fiable de un resultado positivo puede obtenerse también repitiendo la prueba con un segundo conjunto de cebadores PCR (punto 9.3).

Nota: Se puede sospechar la inhibición de la PCR si el amplicón esperado se obtiene de la muestra de control positiva que contiene C. m. subsp. sepedonicus en agua pero se obtienen resultados negativos de los controles positivos con C. m. subsp. sepedonicus en extracto de patata. En protocolos PCR “multiplex” con controles PCR internos, la inhibición de la reacción aparece indicada cuando no se obtiene ninguno de los dos amplicones.

Se puede sospechar la existencia de contaminación si el amplicón esperado se obtiene a partir de uno o varios de los controles negativos.

7. PRUEBA DE BIOENSAYO.

Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberán permitir la detección reproducible de 10³ a 10⁴ unidades de formación de colonias de C. m. subsp. sepedonicus por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos (para la preparación véase el apéndice 2).

La máxima sensibilidad de detección se alcanzará cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cultivo sean las óptimas. No obstante, este método puede aplicarse también con éxito a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre ‒68 y ‒86 °C.

Algunas variedades de berenjena constituyen un medio de enriquecimiento selectivo excelente para la proliferación de C. m. subsp. sepedonicus, incluso en ausencia de síntomas, y facilitan también una prueba confirmatoria de huésped excelente.

Las condiciones de cultivo deben ser óptimas para reducir el riesgo de obtener falsos resultados negativos en las pruebas.

Para más detalles sobre el cultivo, véase el apéndice 8.

7.1 Distribuir la totalidad de la alícuota de prueba sobrante del precipitado resuspendido de los puntos 3.1.6 o 3.2.5 entre las berenjenas, siguiendo uno de los métodos que se exponen a continuación (7.3 o 7.4). Utilizar exclusivamente plantas que se encuentren en la fase foliar 2 - 3 y hasta la plena expansión de la tercera hoja verdadera. A fin de garantizar la utilización completa del precipitado resuspendido, así como la inoculación efectiva, se requerirán entre 15 y 25 berenjenas por muestra para los procedimientos que se esbozan a continuación.

7.2 Las berenjenas no deben regarse de uno a dos días antes de la inoculación para reducir la presión de turgencia.

7.3 Inoculación en estrías.

7.3.1 Sosteniendo la planta entre dos dedos aplíquese con una pipeta una gota (de unos 5-10 μl) del precipitado en suspensión en el tallo situado entre los cotiledones y la primera hoja.

7.3.2 Con un bisturí estéril practicar una incisión diagonal de aproximadamente 1,0 cm de largo y una profundidad de aproximadamente 2/3 del grosor del tallo, comenzando el corte a partir de la gota del precipitado.

7.3.3 Sellar el corte con vaselina estéril con una jeringa.

7.4 Inoculación con jeringa.

Inocúlense los tallos de la berenjena justo por encima de los cotiledones utilizando una jeringa provista de aguja hipodérmica (no menos de 23G). Distribuir la muestra entre las berenjenas.