Orden de 22 de marzo de 1994 relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata, en aplicación de la Directiva 93/85/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas

7.5 Como controles positivos, inocular 5 plantas con una suspensión acuosa de 10⁵ a 10⁶ células por ml de un cultivo conocido de C. m. subsp. sepedonicus y, siempre que sea posible, con tejido de tubérculo infectado de forma natural (véase el punto 4) mediante el mismo método de inoculación (7.3 o 7.4).

7.6 Como control negativo, inocular 5 plantas con tampón de precipitado estéril mediante el mismo método de inoculación (7.3 o 7.4).

7.7 Incubar las plantas en instalaciones adecuadas para la cuarentena durante un máximo de 4 semanas a una temperatura de 18 a 24 °C. Incubar las plantas con suficiente luz y un elevado nivel de humedad (70 a 80 %) y agua, evitando que el agua se estanque y que las plantas se marchiten por falta de agua. Las células de C. m. subsp sepedonicus mueren a temperaturas superiores a 30 °C y la temperatura óptima es 21 °C. Para evitar la contaminación se deben incubar las plantas de control positivo y negativo en bancos claramente separados en un invernadero o cámara de cultivo; en el caso de que se disponga de un espacio reducido, garantizar la estricta separación entre tratamientos. En el caso de que plantas para distintas muestras deban incubarse juntas, deben separarse con las pantallas adecuadas. Durante la fertilización, el riego, la inspección y cualquier otra manipulación deben extremarse las precauciones para evitar la contaminación cruzada. Es esencial mantener los invernaderos y las cámaras libres de toda plaga de insectos, ya que estos pueden transmitir la bacteria de una muestra a otra.

7.8 Transcurrida una semana, examinar con regularidad a fin de detectar los síntomas. Contar el número de plantas que muestren síntomas. C. m. subsp. sepedonicus provoca el marchitamiento de las hojas en las berenjenas, que puede iniciarse con flacidez internervial o de los bordes. El tejido marchito puede aparecer al principio de color verde oscuro o moteado, pero se vuelve más pálido antes de necrosarse. Las zonas de marchitamiento internerviales suelen tener un aspecto graso o húmedo como empapados en agua. El tejido necrosado presenta a veces un borde amarillo brillante. Las plantas no están necesariamente muertas; cuanto más tardan en aparecer los síntomas, tanto mayor es la posibilidad de supervivencia. Las plantas pueden superar la infección. Las berenjenas jóvenes son mucho más sensibles a las poblaciones bajas de C. m. subsp. sepedonicus que las plantas de más edad, por lo que es necesario utilizar plantas en el estadio foliar 3, o inmediatamente antes del mismo.

El marchitamiento puede estar inducido también por poblaciones de otras bacterias u hongos presentes en el precipitado de tejido tuberoso. Entre estos se incluyen Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora y E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, así como grandes poblaciones de bacterias saprofitas. En particular, Erwinia chrysanthemi puede provocar síntomas y marchitamiento en las hojas muy parecidos a los de C. m. subsp sepedonicus. La única diferencia en el caso de las infecciones causadas por Erwinia chrysanthemi es el ennegrecimiento de los tallos. Dichos marchitamientos se pueden distinguir de los causados por C. m. subsp. sepedonicus, porque se marchitan rápidamente hojas o plantas enteras. También puede prepararse una tinción de Gram, esta prueba diferenciará a C. m. subsp. sepedonicus de Erwinia ssp.

7.9 Tan pronto como se observen síntomas en las berenjenas deberá procederse al reaislamiento, utilizando secciones de tejido foliar o del tallo de las plantas marchitas (véase el punto 3.1.3 para la maceración del tejido). Desinfectar la superficie de las hojas y tallos de berenjena frotándolos con etanol al 70 %. Realizar una prueba IF o PCR con la savia de la planta de berenjena y aislar en medios (selectivos) adecuados (véase el punto 8). También puede prepararse una tinción de Gram (apéndice 9). Identificar los cultivos purificados de presunta C. m. subsp. sepedonicus y confirmar la patogenicidad (véanse las secciones 9 y 10).

7.10 En determinadas circunstancias, en particular cuando las condiciones de cultivo no sean óptimas, puede ocurrir que C. m. subsp. sepedonicus esté presente de forma latente en las berenjenas, incluso después de períodos de incubación de hasta 4 semanas. En el caso de que, transcurridas 4 semanas, no se observen síntomas, realizar una prueba IF/PCR con una muestra mixta de secciones de tallo de 1 cm de cada planta tomadas por encima de la sección de inoculación. Si los resultados de la prueba son positivos, deberá procederse al reaislamiento en medios (selectivos) adecuados de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto 8. Identificar los cultivos purificados de posible C. m. subsp. sepedonicus y confirmar la patogenicidad (secciones 9 y 10).

Interpretación de los resultados de la prueba del bioensayo.

Se obtendrán resultados válidos en la prueba del bioensayo cuando las plantas de control positivo muestren síntomas típicos, se puedan reaislar las bacterias de dichas plantas y no se detecten síntomas en los controles negativos.

Los resultados de la prueba del bioensayo serán negativos si las plantas sometidas a la prueba no están infectadas por C. m. subsp. sepedonicus y siempre que se detecte la C. m. subsp. sepedonicus en los controles positivos.

Los resultados de la prueba del bioensayo serán positivos cuando las plantas sometidas a la prueba estén infectadas por C. m. subsp. sepedonicus.

8. AISLAMIENTO DE C. m. subsp. sepedonicus.

Nota: El diagnóstico sólo estará completo cuando se haya aislado e identificado (véase el punto 9) C. m. subsp. sepedonicus, y posteriormente confirmado mediante una prueba de patogenicidad (punto 10). Aunque C. m. subsp sepedonicus es un organismo delicado, puede aislarse a partir de tejido sintomático.

No obstante, puede verse inhibida por las bacterias saprofitas que proliferan rápidamente y, por tanto, los aislamientos directos a partir del precipitado de tejido tuberoso o del tallo (punto 3.1.6 o 3.2.5) son difíciles. El aislamiento directo de C. m. subsp. sepedonicus se puede realizar con un medio selectivo y la dilución adecuada del precipitado resuspendido de las cuñas básales o tallos de patatas.

Los aislamientos se realizarán con todos los tubérculos o secciones de tallo de patata sintomáticos y con las berenjenas en las no se observen síntomas pero con las que la prueba IF/PCR realizada a partir de la muestra mixta haya arrojado resultados positivos (véase el punto 7.10). Cuando sea necesario, la maceración de los tallos de berenjena deberá realizarse siguiendo el procedimiento descrito en el punto 3.1.3.

Como controles positivos preparar diluciones decimales a partir de una suspensión de 10⁶ cfu por ml de C. m. subsp. sepedonicus (p. ej. NCPPB 4053 o PD 406). Para evitar cualquier posibilidad de contaminación, preparar los controles positivos separadamente de las muestras que se vayan a someter a prueba.

Cada lote de medio selectivo que se prepare deberá someterse a prueba a fin de determinar su idoneidad para el cultivo del patógeno con anterioridad a su utilización en pruebas con muestras rutinarias.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

8.1 Siembra en medio selectivo.

8.1.1 A partir de una alícuota de 100 μl de una muestra de precipitado de patata resuspendido o de savia de berenjena, realizar diluciones decimales en tampón de precipitado (apéndice 3).

8.1.2 El aislamiento a partir de precipitado de patata sin diluir no suele funcionar debido a la lentitud de crecimiento de C. m. subsp sepedonicus y a la competencia de saprofitas. Dado que en los tejidos infectados suele haber poblaciones elevadas de la bacteria, las saprofitas se diluyen normalmente, mientras que el patógeno persiste. Se recomienda, por tanto, recurrir a la técnica de la extensión en placa y extender, con ayuda de un asa de extensión (“palos de hockey”), 100 μl de cada una de las muestras, en diluciones de 1/100 hasta 1/10 000, en medio MTNA o NCP-88 (apéndice 5) (si se utilizan placas de Petri de 90 mm de diámetro, se deberá ajustar el volumen para tamaños alternativos de placa).

Nota: Otra estrategia alternativa consiste en extender la alícuota inicial de 100 μl de precipitado de patata en una primera placa de agar con ayuda de un aplicador y posteriormente extender, en estrías, todos los residuos que queden en el aplicador en una segunda placa de agar. Repetir por último con una tercera placa, logrando así, mediante el aplicador, el efecto de dilución en las placas.

8.1.3 Incubar las placas en la oscuridad a una temperatura de 21 a 23 °C.

8.1.4 Las observaciones iniciales de las placas, incluidos los recuentos de colonias típicas de la C. m. subsp. sepedonicus en relación con las placas de control, se realizan 3 días después, con recuentos posteriores transcurridos 5, 7 y, finalmente, 10 días.

8.2 Purificación de las colonias sospechosas.

Nota: El subcultivo de colonias de aspecto similar a C. m. subsp. sepedonicus debe realizarse en medios YMG para la inoculación de berenjenas y/o la posterior identificación. Esto debe realizarse antes de que las placas crezcan demasiado, es decir, preferiblemente transcurridos de 3 a 5 días.

8.2.1 Practicar una siembra en estrías de colonias de aspecto similar a la C. m. subsp. sepedonicus en la superficie de uno de los siguientes medios (apéndice 5): agar de dextrosa nutritivo (NAD) (para su utilización exclusiva en el subcultivo), agar de levadura, peptona, glucosa (YPGA), agar de extracto de levadura, sales minerales (YGM).

Incubar a 21-24 °C durante 10 días como máximo.

C. m. subsp. sepedonicus crece lentamente y suele provocar unas colonias punteadas, de color crema, de forma abovedada, en el plazo de diez días. [Fotos de colonias típicas de C. m. subsp. sepedonicus (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)].

8.2.2 Volver a sembrar en estrías para obtener cultivos puros.

El ritmo de crecimiento mejora con subcultivos. Las colonias típicas son de color blanco crema o marfil, amarillas en ocasiones, redondeadas, lisas, abultadas, abovedadas en forma convexa, mucoso-fluidas, con bordes intactos y normalmente de un diámetro de 1 a 3 mm.

Una simple tinción de Gram (apéndice 9) puede resultar útil para seleccionar colonias para pruebas posteriores.

8.2.3 Identificar los supuestos cultivos (véase el punto 9) y realizar una prueba de patogenicidad (véase el punto 10).

9. IDENTIFICACIÓN.

Identificar cultivos puros de posibles aislados de C. m. subsp. Sepedonicus, utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios biológicos diferentes.

Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada, como controles positivos.

9.1 Pruebas de identificación nutricional y enzimática.

Determinar las propiedades fenotípicas siguientes que estén universalmente presentes o ausentes en la C. m. subsp. sepedonicus, de acuerdo con los métodos de Lelliott y Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001), Anónimo (1987).

Incubar todos los medios a 21 °C y examinar transcurridos 6 días. Si no se ha producido crecimiento, incubar 20 días.

En todas las pruebas deberá incluirse un control conocido de C. m. subsp. sepedonicus. Las pruebas fisiológicas y nutricionales deberán realizarse utilizando inoculaciones de subcultivos en agar nutritivo. Las comparaciones morfológicas deberán realizarse a partir de cultivos de agar de dextrosa nutritivos.

Pruebas	Resultado esperado
Prueba de la oxidación/fermentac. (O/F)	Inerte o ligeramente oxidante
Actividad oxidasa	‒
Crecimiento a 37 °C	‒
Actividad ureasa	‒
Hidrólisis de la esculina	+
Hidrólisis del almidón	‒ o débil
Tolerancia de NaCI al 7 %	‒
Producción de indol	‒
Actividad catalasa	+
Producción de H2S	‒
Utilización de citrato	‒
Licuefacción de la gelatina	‒
Producción de ácido de glicerol	‒
Producción de ácido de lactosa	‒ o débil
Producción de ácido de ramnosa	‒
Producción de ácido de salicina	‒
Tinción de Gram (apéndice 9)	+

9.2 Prueba IF.

9.3 Prueba PCR.

9.4 Prueba FISH.

9.5 Perfiles de ácidos grasos (Fatty acid profiling o FAP).

9.6 BOX-PCR.

10 PRUEBA DE CONFIRMACIÓN DE PATOGENCIDAD.

Como confirmación final del diagnóstico de C. m. subsp. sepedonicus y para la evaluación de la virulencia de cultivos identificados como C. m. subsp. sepedonicus debe realizarse la prueba de patogenicidad.

10.1 Preparar un inoculo de aproximadamente 10⁶ células por ml de cultivos de 3 días del aislado que se vaya a someter a prueba y de una cepa de control positivo adecuada de C. m. subsp. sepedonicus.

10.2 Inocular entre 5 y 10 tallos de plántulas de berenjena en la fase de la tercera hoja (punto 7.3 o 7.4).

10.3 Incubar a una temperatura de 18 a 24 °C, con luz suficiente, humedad relativa alta y riego adecuado, evitando tanto el estancamiento del agua como el estrés provocado por la sequía (punto 7.7) Con los cultivos puros deberá obtenerse el marchitamiento típico en el plazo de dos semanas.

Transcurrido este plazo, las plantas que no muestren síntoma alguno (véase el punto 7.8) deberán incubarse durante un máximo de 3 semanas a temperaturas que favorezcan su crecimiento pero que no superen los 25 °C (apéndice 8). Si después de 3 semanas no se presentan los síntomas, no podrá confirmarse que el cultivo es una forma patógena de C. m. subsp. sepedonicus.

10.4 Aislar de las plantas sintomáticas separando una sección de tallo que esté 2 cm por encima de la sección de inoculación. Dilacerar y suspender en un pequeño volumen de agua destilada estéril o en tampón fosfato 50 mM (apéndice 3). Aislar de la suspensión mediante dilución, extendiendo o aplicando en estrías en MTNA e YPGA (apéndice 5), incubar entre 3 y 5 días a una temperatura de 21 a 23 °C y examinar la formación de colonias típicas de C. m. subsp. sepedonicus.

APÉNDICE 1

Laboratorios dedicados a la optimización y la validación de los protocolos

Laboratorio (1)	Ciudad	País
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit	Viena y Linz	Austria
Departement Gewasbescherming	Merelbeke	Bélgica
Plantedirektoratet	Lyngby	Dinamarca
Central Science Laboratory	York	Inglaterra
Scottish Agricultural Science Agency	Edimburgo	Escocia
Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité Bactériologie	Angers	Francia
Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre	Le Rheu	Francia
Biologische Bundesanstalt	Kleinmachnow	Alemania
Pflanzenschutzamt Hannover	Hannover	Alemania
State Laboratory	Irlanda	Dublín
Plantenziektenkundige Dienst	Wageningen	Países Bajos
Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre	Aas	Noruega
Direcção-Geral de Protecção das Culturas	Lisboa	Portugal
Nacionalni institut za biologijo	Liubliana	Eslovenia
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia	Salamanca	España

(1) Científicos de contacto: véase el sitio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

APÉNDICE 2

Preparación de controles positivos y negativos para las pruebas de selección básicas PCR/IF y FISH

Preparar un cultivo de 72 horas de una cepa virulenta de C. m. subsp. sepedonicus [NCPPB 4053 o PD 406] en medio base MTNA y suspender en tampón fosfato 10 mM para obtener una concentración de aproximadamente 1 a 2 × 10⁸ cfu por ml. Esto se obtiene normalmente mediante una suspensión ligeramente turbia equivalente a una densidad óptica de 0,20 a 600 nm.

Separar las cuñas básales de 200 tubérculos de una variedad de piel blanca conocida por estar exenta de C. m. subsp. sepedonicus.

Procesar las cuñas básales como siempre y resuspender el precipitado en 10 ml.

Preparar 10 microviales estériles de 1,5 ml con 900 μl del precipitado resuspendido.

Transferir 100 μl de la suspensión de C. m. subsp. sepedonicus al primer microvial. Homogeneizar por agitación.

Establecer niveles decimales de contaminación realizando nuevas diluciones en los 5 microviales siguientes.

Los 6 microviales contaminados se utilizarán como controles positivos. Los 4 microviales no contaminados se utilizarán como controles negativos. Etiquetar los microviales como corresponda.

Preparar alícuotas de 100 μl en microviales estériles de 1,5 ml para obtener de este modo 9 réplicas de cada muestra de control. Almacenar a una temperatura de ‒16 a ‒24 °C hasta su uso.

La presencia y la cuantificación de C. m. subsp. sepedonicus en las muestras de control deberá confirmarse en primer lugar mediante una prueba IF.

Para la prueba PCR, extraer ADN de las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensayo.

Para las pruebas IF y FISH, realizar ensayos con las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensayo.

En las pruebas IF, FISH y PCR, debe detectarse C. m. subsp. sepedonicus en al menos 10⁶ y 10⁴ células/ml de los controles positivos y en ninguno de los controles negativos.

APÉNDICE 3

Tampones para los métodos de prueba

GENERAL: Los tampones esterilizados pueden almacenarse sin abrir hasta un año.

1. Tampones para el procedimiento de extracción

1.1 Tampón de extracción (tampón fosfato 50 mM, pH 7,0)

Este tampón se utiliza para la extracción de la bacteria del tejido de las plantas mediante homogeneización o agitación.

Na₂HPO₄ (anhidro): 4,26 g

KH₂PO₄: 2,72 g

Agua destilada: 1,00 I

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Los siguientes componentes adicionales pueden resultar útiles:

	Finalidad	Cantidad (por I)
Copos de Lubrol	Defloculante (*)	0,5 g
Compuesto DC silicona antiespumante	Antiespumante (*)	1,0 ml
Pirofosfato tetrasódico	Antioxidante	1,0 g
Polivinilpirrolidona -40 000 (PVP-40)	Unir los inhibidores PCR	50 g

(*) Para su utilización en el método de extracción por homogeneización.

1.2 Tampón de extracción (tampón fosfato 10 mM, pH 7,2)

Este tampón se utiliza para la resuspensión y la dilución de extractos de cuñas básales de tubérculos de patata tras la concentración en un precipitado mediante centrifugación.

Na₂HPO₄.12H₂O: 2,7 g

NaH₂PO₄.2H₂O: 0,4 g

Agua destilada: 1,00 l

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

2. Tampones para la prueba IF.

2.1 Tampón IF [tampón fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2].

Este tampón se utiliza para la difusión de anticuerpos

Na₂HPO₄.12H₂O: 2,7 g

NaH₂PO₄.2H₂O: 0,4 g

NaCl: 8,0 g

Agua destilada: 1,00 l

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

2.2 Tampón IF-Tween.

Este tampón se utiliza para lavar los portaobjetos.

Añadir Tween 20 al 0,1 % al tampón IF.

2.3 Solución de glicerol con tampón fosfato, pH 7,6.

Este tampón se utiliza como fluido de montaje en los pocillos de los portaobjetos de IF para aumentar la fluorescencia.

Na₂HPO₄.12H₂O: 3,2 g

NaH₂PO₄.2H₂O: 0,15 g

Glicerol: 50 ml

Agua destilada: 100 ml

En el mercado se pueden encontrar soluciones de montaje que protegen la fluorescencia, como p. ej., Vectashield® (Vector Laboratories) o Citifluor® (Leica).

APÉNDICE 4

Determinación del nivel de contaminación en las pruebas IF y FISH

1. Contar el número de células fluorescentes típicas por campo de visión (c).

2. Calcular el número de células fluorescentes típicas por pocillo del portaobjetos del microscopio (C).

C = c × S/s

donde:

S = superficie del pocillo del portaobjetos múltiple y

s = superficie del campo del objetivo

s = πi²/4G²K²

donde:

i = coeficiente de campo (varía de 8 a 24 dependiendo del tipo ocular)

K = coeficiente del tubo (1 o 1,25)

G = aumentos del objetivo (100x, 40x, etc.)

3. Calcular el número de células fluorescentes típicas por ml de precipitado resuspendido (N).

N = C × 1.000/y × F

donde:

y = volumen de precipitado resuspendido en cada pocillo y

F = factor de dilución del precipitado resuspendido.

APÉNDICE 5

Medios para el aislamiento y cultivo de C. m. subsp. sepedonicus

Agar nutritivo (NA)

Agar nutritivo (Difco): 23,0 g

Agua destilada: 1,00 I

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Agar de dextrosa nutritivo (NDA)

Agar nutritivo de Difco Bacto con un 1 % de D(+)-glucosa (monohidrato). Esterilizar en autoclave a 115 °C durante 20 minutos.

Agar de levadura, peptona, glucosa (YPGA)

Extracto de levadura (Difco): 5,0 g

Bacto-peptona (Difco): 5,0 g

D(+)-glucosa (monohidrato): 10,0 g

Bacto-agar (Difco): 15,0 g

Agua destilada: 1,00 I

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Medio de sales minerales, extracto de levadura (YGM)

Bacto-extracto de levadura (Difco): 2,0 g

D(+)-glucosa (monohidrato): 2,5 g

K₂HPO₄: 0,25 g

KH₂PO₄: 0,25 g

MgSO₄.7H₂O: 0,1 g

MnSO₄.H₂O: 0,015 g

NaCI: 0,05 g

FeSO₄.7H₂O: 0,005 g

Bacto-agar (Difco): 18 g

Agua destilada: 1,00 I

Disolver los ingredientes y esterilizar volúmenes de medio litro de este medio en autoclave a 115 °C durante 20 minutos.

Medio MTNA:

A menos que se especifique de otra manera, todos los componentes de los medios son de BDH.

Extracto de levadura (Difco): 2,0 g

Manitol: 2,5 g

K2HPO4: 0,25 g

KH2PO4: 0,25 g

NaCI: 0,05 g

MgSO₄.7H₂O: 0,1 g

MnSO₄.H₂O: 0,015 g

FeSO₄.7H₂O: 0,005 g

Agar (Oxoid no 1): 16,0 g

Agua destilada: 1,0 I

Disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7,2. Tras esterilizar en autoclave (a 121 °C durante 15 minutos) y enfriar a 50 °C, añadir los siguientes antibióticos: 0,06 g de trimetoprim, 0,002 g de ácido nalidíxico y 0,01 g de anfotericina B.

Soluciones antibióticas estándar: trimetoprim (Sigma) y ácido nalidíxico (Sigma) (en ambos casos a 5 mg/ml), en metanol al 96 %, anfotericina B (Sigma) (1 mg/ml) en dimetil sulfóxido. Las soluciones estándar se esterilizan por filtración.

Nota: La durabilidad del medio base es de 3 meses. Una vez añadidos los antibióticos, la durabilidad es de 1 mes siempre que se mantengan refrigerados.

Medio NCP-88

Agar nutritivo (Difco): 23 g

Extracto de levadura (Difco): 2 g

D-manitol: 5 g

K₂HPO₄: 2 g

KH₂PO₄: 0,5 g

MgSO₄.7H₂O: 0,25 g

Agua destilada: 1,0 I

Disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7,2. Tras esterilizar en autoclave y enfriar a 50 °C, añadir los siguientes antibióticos: 0,003 g de sulfato de polimixina B (Sigma), 0,008 g de ácido nalidíxico (Sigma) y 0,2 g de cicloheximida (Sigma).

Disolver los antibióticos en las siguientes soluciones estándar: el ácido nalidíxico en NaOH 0,01 M, la cicloheximida en etanol al 50 % y el sulfato de polimixina B en agua destilada. Las soluciones estándar se esterilizan por filtración.

Nota: La durabilidad del medio base es de 3 meses. Una vez añadidos los antibióticos, la durabilidad es de 1 mes siempre que se mantengan refrigerados.

APÉNDICE 6

Reactivos y protocolo PCR validados

Nota: Las pruebas preliminares deberán permitir la detección reproducible de al menos 10³ a 10⁴ células de C. m. subsp sepedonicus por ml de extracto de muestra.

Cebador directo PSA-1

Cebador reverso PSA -R

Cebador directo NS-7-F

Cebador reverso NS-8-R

Por otra parte, las pruebas preliminares no deben proporcionar resultados falsos positivos con respecto a un conjunto de cepas bacterianas seleccionadas.

1. Protocolo PCR “multiplex” con control PCR interno (Pastrik, 2000)

1.1 Cebadores oligonucleótidos

5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'

5'- tac tga gat gtt tea ctt ccc c -3'

5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'

5'- tcc gca ggt tea cct acg ga -3'

Tamaño esperado del amplicón de ADN de C. m. subsp. sepedonicus = 502 pb (conjunto de cebadores PSA).

Tamaño esperado del amplicón del control PCR interno de ARNr 18S = 377 pb (conjunto de cebadores NS).

1.2 Mezcla para la reacción PCR.

Reactivo	Cantidad para la reacción	Concentración final
Agua ultrapura estéril	15,725 μl
10x tampón PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 μl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (fracción V) (10 %)	0,25 μl	0,1 %
Mezcla d-nTP (20 mM)	0,125 μl	0,1 mM
Cebador PSA-1 (10pM)	0,5 μl	0,2 μM
Cebador PSA-R (10pM)	0,5 μl	0,2 μM
Cebador NS-7-F (10pM) (2)	0,1 μl	0,04 μM
Cebador NS-8-R (10pM) (2)	0,1 μl	0,04 μM
Polimerasa Taq (5U/pl) (1)	0,2 μl	1,0 U
Volumen de muestra	5,0 μl
Volumen total:	25,0 μl

(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq o Gold) y Gibco BRL.

(2) La concentración de los cebadores NS-7 F y NS-8-R se optimizó para la extracción de cuñas básales de patata utilizando el método de homogeneización y purificación del ADN de acuerdo con Pastrik (2000) (véanse los puntos 6.1.a) y 6.2). Será necesario proceder a la reoptimización de las concentraciones de reactivos si se utiliza el método de extracción por agitación u otros métodos de aislamiento del ADN.

1.3 Condiciones de reacción PCR.

Aplicar el siguiente programa:

1 ciclo de:

10 ciclos de:

ii) 1 minuto a 95 °C (desnaturalización de ADN)

iii) 1 minuto a 64 °C (anillamiento de los cebadores)

iv) 1 minuto a 72 °C (extensión de la copia)

25 ciclos de:

vi) 30 segundos a 62 °C (anillamiento de los cebadores)

vii) 1 minuto a 72 °C (extensión de la copia)

1 ciclo de:

viii) 5 minutos a 72 °C (extensión final)

ix) mantener a 4 °C

Nota: Este programa se ha optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii), iv), v), vi) y vii) para su utilización con otros modelos.

1.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón.

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de C. m. subsp. sepedonicus producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Bgl II tras la incubación a 37 °C durante 30 minutos. Los tamaños de los fragmentos de restricción obtenidos a partir del fragmento específico de C. m. subsp. sepedonicus son de 282 pb y 220 pb.

2. Preparación del tampón de carga:

2.1 Azul de bromofenol (solución estándar al 10 %):

Azul de bromofenol: 5 g

Agua bidestilada: 50 ml

2.2 Tampón de carga:

Glicerol (86 %): 3,5 ml

Azul de bromofenol (2.1): 300 μl

Agua bidestilada: 6,2 ml

3. 10X tampón de tris acetato EDTA (TAE), pH 8,0:

Tampón tris: 48,4 g

Ácido acético glacial: 11,42 ml

EDTA (sal disódica): 3,72 g

Agua destilada: 1,0 l

Diluir a 1X antes de utilizarlo.

Se encuentra también disponible en el mercado (por ejemplo, Invitrogen o equivalente).

APÉNDICE 7

Reactivos validados para la prueba FISH

1. Oligosondas.

Sonda específica para Cms CMS-CY3-01:

5'-ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'

Sonda eubacteriana no específica EUB-338-FITC:

5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'

2. Solución fijadora.

[ADVERTENCIA: LA SOLUCIÓN FIJADORA CONTIENE PARAFORMALDEHÍDO QUE ES TÓXICO. UTILIZAR GUANTES Y NO INHALAR. SE RECOMIENDA TRABAJAR EN UNA CAMPANA EXTRACTORA DE GASES.]

ii) Ajustar el pH a 7,0 mediante la adición de 1 ml de tampón fosfato de concentración 0,1 M (pH 7,0) y 5 gotas de HCI 1N. Verificar el pH con bandas indicadoras y ajustar si fuese necesario con HCI o NaOH.

[ADVERTENCIA: NO UTILIZAR UN MEDIDOR DE PH EN SOLUCIONES QUE CONTENGAN PARAFORMALDEHÍDO.]

iii) Filtrar la solución con un filtro de membrana de 0,22 pm y mantener libre de polvo a 4 °C hasta nueva utilización.

iv) Nota: Solución fijadora alternativa: etanol al 96 %.

3. 3X Hybmix.

NaCI: 2,7 M

Tris-HCI: 60 mM (pH 7,4)

EDTA (esterilizado por filtración y autoclave): 15 mM

Diluir a 1X cuando se precise.

4. Solución de hibridación.

1X Hybmix:

Dodecilsulfato sódico (SDS): 0,01 %

sonda EUB 338: 5 ng/μl

sonda CMSCY301: 5 ng/μl

Preparar las cantidades de solución de hibridación de acuerdo con los cálculos de la tabla 1. Para cada portaobjetos (que contenga 2 muestras distintas por duplicado) se precisan 90 μl de solución de hibridación.

Tabla 1. Cantidades sugeridas para la preparación de la mezcla de hibridación

	2 portaobjetos	8 portaobjetos
Agua ultrapura estéril	50,1	200,4
3x hybmix	30,0	120,0
1 % SDS	0,9	3,6
Sonda EUB 338 (100 ng/μl)	4,5	18,0
Sonda CMSCY301 (100 ng/μl)	4,5	18,0
Volumen total (μl)	90,0	360,0

NB.  Almacenar todas las soluciones que contengan oligosondas fotosensibles en la oscuridad a ‒20 °C. Proteger de la luz directa ya sea del sol o eléctrica durante su utilización.

5. Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0.

Na₂HPO₄: ‭‬8,52 g

KH₂PO₄: 5,44 g

Agua destilada: 1,00 l

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

APÉNDICE 8

Cultivo de berenjenas

Sembrar semillas de berenjena (Solanum melongena) en compost pasteurizado de semillas. Trasplantar las plántulas con los cotiledones completamente abiertos (1 a 14 días) en compost pasteurizado de tiesto.

Las berenjenas deben cultivarse en un invernadero que cumpla las siguientes condiciones ambientales:

Duración diurna: 14 horas o día natural si es de mayor duración.

Temperatura:

diurna: de 21 a 24 °C

nocturna: 15 °C

Variedades de berenjena sensibles:

'Black Beauty',

'Long Tom',

'Rima',

'Balsas'.

Proveedores: véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

APÉNDICE 9

Procedimiento de la tinción de Gram (modificación de Hucker) (Doetsch, 1981) (1)

(1) También pueden utilizarse otras soluciones y kits de tinción disponibles en el mercado.

Solución de cristal violeta:

Disolver 2 g de cristal violeta en 20 ml de etanol al 95 %.

Disolver 0,8 g de oxalato amónico en 80 ml de agua destilada.

Mezclar las dos soluciones.

Solución de Lugol:

Yodo: 1 g

Yoduro de potasio: 2 g

Agua destilada: 300 ml

Triturar conjuntamente los sólidos en un mortero. Añadir al agua y remover hasta su disolución en un recipiente cerrado.

Solución de contraste de safranina:

Solución estándar:

SafraninaO: 2,5 g

Etanol al 95 %: 100 ml

Mezclar y conservar.

Diluir al 1:10 para conseguir una solución de trabajo.

Procedimiento de tinción:

1. Preparar los frotis, secar al aire y fijar por calor.

2. Sumergir el portaobjetos en la solución de cristal violeta durante un minuto.

3. Lavar brevemente con agua corriente.

4. Sumergir en solución de Lugol durante un minuto.

5. Lavar con agua corriente y secar.

6. Decolorar con etanol al 95 %, añadido gota a gota hasta que ya no se produzca ningún cambio de color, o sumergir agitando suavemente durante 30 segundos.

7. Lavar con agua corriente y secar.

8. Sumergir en la solución de safranina durante 10 segundos.

9. Lavar con agua corriente y secar.

Las bacterias Gram. positivas se tiñen de violeta-azul y las Gram. negativas de rosa-rojo.

BIBLIOGRAFÍA

1. Anónimo, 1987, «Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers». Comisión de las Comunidades Europeas, Luxemburgo. Publ EUR 11 288 EN, 21 pp.

2. Bradbury, J. F., 1970, «Isolation and preliminary study of bacteria from plants», Rev. Pl. Path., 49, pp. 213-218.

3. Dinesen, I. G., 1984, «The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers», EPPO Bull. 14 (2), pp. 147-152.

4. Doetsch, R. N., 1981, «Determinative methods of light microscopy». Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology. Washington, pp. 21-23.

5. Hugh, R. F. Leifson, 1953, «The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria», J. Bact., 66, pp. 24-26.

6. Janse, J. D., 1991, «Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fattyacid análisis», Systematic and Applied Microbiology 14, pp. 335-345.

7. Janse, J. D. y J. Van Vaerenbergh, «The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato», EPPO Bull., 17, 1987, pp. 1-10.

8. Jansing, H. y K. Rudolph, 1998, «Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus and development of a semi-selective médium», Journal of Plant Diseases and Protection, 105, pp. 590-601.

9. Klement Z.; Rudolph, K y D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

10. .Kovacs, N., 1956, «Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction», Nature, Londres, 178, pp. 703

11. Lelliott, R. A., 1966, «The plant pathogenic coryneform bacteria», J. appl. Bact., 29, pp. 114-118.

12. Lelliott, R. A., E. Billing y A. C. Hayward, 1966, «A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads », J. appl. Bact., 29, pp. 470-489.

13. Lelliott, R. A. y P. W. Sellar, 1976, «The detection of latent ring rot [Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.)] in potato stocks», EPPO Bull., 6 (2), pp. 101-106.

14. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

15. Li, X. y S.H. de Boer, 1995, «Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer región for specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus», Phytopathology, 85, pp. 837-842.

16. Mills, D., Russell, B., W. y J., W. Hanus, 1997, «Specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization», Phytopathology, 87, 8, pp. 853-861.

17. Pastrik, K. -H. y R.A. Rainey. 1999, «Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques», J. Phytopathology 147; pp. 687-693.

18. Pastrik, K.-H., 2000, «Detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA», European Journal of Plant Pathology, 106, pp. 155-165.

19. Ramamurthi, C. S., 1959, «Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria», Mem. Cornell agrie. Exp. Sta., 366, 52 pp.

20. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. y Knorr, D. (1999), «Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system», Plant Disease 83; pp. 1095-1100.

21. Schaad, W. 2001, «Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria», Schaad [Hrsg.]. 3a. ed.; St. Paul, Minnesota, 373 pp.

22. Skerman, V. B. D., 1967, A guide to the identification of the genera of bacteria. Segunda edición, Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1967.

23. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001, «Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus», European Journal of Plant Pathology, 107 (7), pp. 739-748.

24. Sneath, P. H. A. y V. G. Collins, 1974, «A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party», Antonie van Leeuwenhoek, 40, pp. 481-527.

25. Stead, D.E., 1992, «Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty- acid profiles», International Journal of Systematic Bacteriology 42; pp. 281-295.

26. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. y A. D. L. Akkermans, 1998, «Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes», Appl. Environ. Microbiol, 64, pp. 4546-4554.

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ANEXO II. Conservación de las pruebas analíticas en caso de aparición de un brote sospechoso

1. En cada caso de foco sospechoso para el que se haya realizado una o varias pruebas de selección con resultados positivos de acuerdo con los métodos establecidos en el anexo I, y se espere recibir confirmación o refutación por aplicación de los citados métodos, se deberá proceder a la retención y adecuada conservación de:

‒ todos los tubérculos y, siempre que sea posible, las plantas de los que se hayan obtenido muestras,

‒ cualquier extracto sobrante y cualquier material adicional que se haya preparado para la prueba o pruebas de selección (por ejemplo, las placas de inmunofluorescencia),

y

‒ toda la documentación pertinente, hasta completar la aplicación de los métodos arriba mencionados.

La retención de los tubérculos permitirá que se puedan llevar a cabo pruebas de variedades cuando se estime oportuno.

2. En el caso de confirmación de la presencia del organismo, se procederá a la retención y adecuada conservación:

‒ del material especificado en el punto 1,

‒ de una muestra de las berenjenas infectadas inoculadas con extracto de tubérculo o de planta,

y

‒ del cultivo aislado del organismo,

hasta un mes después, como mínimo, en virtud del procedimiento establecido en el artículo 5, apartado 2.

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ANEXO III. Elementos que deben tenerse en cuenta para la determinación de la población contaminante

1. Los elementos que deben tenerse en cuenta para la determinación de la extensión de la probable contaminación con arreglo al artículo 5, apartado 1, letra b), incluirán:

‒ los tubérculos o plantas cultivados en un lugar de producción declarado contaminado en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a);

‒ el lugar o lugares de producción relacionados en alguna medida con la producción de los tubérculos o plantas declarados contaminados en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a), incluido el material y las instalaciones de producción compartidos directamente o a través de un contratista común;

‒ los tubérculos o plantas producidos en el lugar o los lugares de producción contemplados en el guión anterior, o presentes en tal(es) lugar(es) de producción durante el período en el que los tubérculos o plantas declarados contaminados según el artículo 5, apartado 1, letra a), se encontraban en el lugar de producción citado en el primer guión;

‒ los locales que manipulen patatas procedentes de los lugares de producción mencionados en los guiones anteriores;

‒ cualquier maquinaria, vehículo, buque, almacén o unidades de estos y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que puedan haber estado en contacto con los tubérculos o plantas declarados contaminados en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a);

‒ todos los tubérculos o plantas almacenados o que hayan estado en contacto con cualquiera de las estructuras u objetos enumerados en el guión anterior antes de la limpieza y desinfección de los mismos;

‒ como resultado de las pruebas contempladas en el artículo 6, aquellos tubérculos o plantas que tengan una relación clonal fraterna o paternal con los tubérculos o plantas declarados contaminados en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a), y con respecto a los cuales parezca probable la contaminación a través de un vínculo clonal, aunque las pruebas de detección del organismo hayan arrojado resultados negativos; pueden llevarse a cabo pruebas de variedades para verificar la identidad de los tubérculos o plantas contaminados y clonalmente relacionados,

y

‒ el lugar o lugares de producción de los tubérculos o plantas a los que se hace referencia en el guión anterior.

2. Los elementos que deben tenerse en cuenta para la determinación de la posible propagación con arreglo al artículo 5, apartado 1, letra c), incluirán:

‒ la proximidad de otros lugares de producción en los que se cultiven patatas u otras plantas huéspedes, y

‒ la producción en común y el uso común de existencias de patatas de siembra.

3. La notificación a que se hace referencia en el artículo 5, apartado 2, se ajustará a lo siguiente:

‒ se efectuará de manera inmediata una vez que la presencia haya sido confirmada por las pruebas de laboratorio con arreglo a los métodos expuestos en el anexo I, y deberá recoger, como mínimo:

• el nombre de la variedad del lote de patatas,

• el tipo (de consumo, de siembra, etc.) y, en su caso, la categoría de patata de siembra.

‒ cuando exista el riesgo de contaminación de patatas procedentes de otra u otras Comunidades Autónomas, la Comunidad Autónoma en que se haya confirmado el brote notificará inmediatamente a las Comunidades Autónomas interesadas la información necesaria para, en su caso, declarar la contaminación, determinar la extensión de la probable contaminación y delimitar una zona de conformidad con las letras a), b), y c) del apartado 1 del artículo 5, incluyendo:

• el nombre de la variedad del lote de patatas,

• el nombre y la dirección del proveedor y del destinatario,

• la fecha de entrega del lote de patatas,

• el tamaño del lote de patatas entregado,

• una copia del pasaporte fitosanitario o al menos el número de dicho pasaporte, en su caso, o el número de registro del cultivador o del comerciante, en su caso, y una copia del aviso de entrega.

Cuando se suministre dicha información, la Comunidad Autónoma informará de ello inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.

‒ cuando exista el riesgo de contaminación de patatas destinadas a otro u otros Estados Miembros, la Comunidad Autónoma en que se haya confirmado el brote notificará inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente a los Estados Miembros interesados, la información necesaria para, en su caso, declarar la contaminación y delimitar una zona de conformidad con las letras a), b), y c) del apartado 1 del artículo 5, incluyendo:

• el nombre de la variedad del lote de patatas,

• el nombre y la dirección del proveedor y del destinatario,

• la fecha de entrega del lote de patatas,

• el tamaño del lote de patatas entregado,

• una copia del pasaporte fitosanitario o al menos el número de dicho pasaporte, en su caso, o el número de registro del cultivador o del comerciante, en su caso, y una copia del aviso de entrega.

Cuando se suministre dicha información, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación informará de ello inmediatamente a la Comisión.

‒ cuando exista el riesgo de contaminación de patatas procedentes de otro u otros Estados Miembros a raíz de la correspondiente notificación o notificaciones de los mismos, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación comunicará la información recibida a las Comunidades Autónomas interesadas para, en su caso, declarar la contaminación, determinar la extensión de la probable contaminación y delimitar una zona de acuerdo con las letras a), b), y c) del apartado 1 del artículo 5.

‒ Una vez que todas las investigaciones hayan concluido, las Comunidades Autónomas facilitarán, para cada caso:

• la fecha en la que se confirmó la contaminación.

• una breve descripción de la investigación llevada a cabo para identificar la fuente y la posible propagación de la contaminación, incluido el alcance del muestreo efectuado,

• información sobre la fuente o fuentes de contaminación determinadas o presuntas,

• detalles relativos a la extensión de la contaminación declarada, incluido el número de lugares de producción y el número de lotes, con la indicación de la variedad y, en el caso de la patatas de siembra, la categoría,

• detalles relativos a la delimitación de la zona, incluido el número de lugares de producción no declarados contaminados pero incluidos en la zona,

• cualesquiera otros datos que requiera el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación o, en su caso, la Comisión relativos al brote o brotes confirmados.

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ANEXO IV. Medidas bajo control oficial

1. Las medidas bajo control oficial contempladas en el artículo 7, letra a), serán las siguientes:

‒ la utilización como piensos tras un tratamiento térmico adecuado que garantice que no hay riesgo alguno de supervivencia del organismo,

o bien

‒ la eliminación en un vertedero autorizado oficialmente a tal fin donde no se haya podido determinar riesgo alguno de escape del patógeno al medio ambiente, por ejemplo, mediante la filtración a tierras de cultivo,

o bien

‒ la incineración,

o bien

‒ la transformación industrial mediante entrega directa e inmediata a una planta de transformación dotada de instalaciones de eliminación de residuos autorizadas oficialmente, con respecto a las cuales se haya excluido cualquier riesgo identificable de propagación del organismo, y de un sistema de limpieza y desinfección de los vehículos de transporte, al menos,

o bien

‒ otras medidas, siempre que se haya descartado el posible riesgo de propagación del organismo, las cuales deberán notificarse al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a la Comisión y a los demás Estados miembros acompañadas de su justificación.

Todo residuo restante asociado y derivado de lo anterior deberá eliminarse mediante métodos autorizados oficialmente conforme a lo dispuesto en el anexo V de la presente orden.

2. La utilización o la eliminación apropiadas de los tubérculos o plantas declaradas probablemente contaminadas de conformidad con el artículo 5, apartado 1, letra b), a las que se hace referencia en el artículo 7, letra b), deberán efectuarse bajo el control de los organismos oficiales responsables interesados, así como con la oportuna comunicación entre estos organismos para garantizar en todo momento dicho control, y con la aprobación del organismo oficial responsable de la Comunidad Autónoma donde vayan a envasarse o transformarse las patatas, en lo que se refiere a los vertederos citados en los guiones primero y segundo, y consistirán en lo siguiente:

‒ la utilización como patatas de consumo destinadas al consumo, envasadas para su distribución y venta sin cambio de envase, en un lugar dotado de instalaciones de eliminación de residuos adecuadas; las patatas destinadas a la siembra sólo pueden manipularse en el mismo lugar si esto se realiza separadamente o tras la limpieza y desinfección,

o

‒ su uso como patatas de consumo para la transformación industrial y destinadas a la entrega directa e inmediata a una planta de transformación dotada de instalaciones adecuadas de eliminación de residuos y de un sistema de limpieza y desinfección de, al menos, los vehículos de transporte,

o

‒ algún otro tipo de uso o eliminación, siempre que se excluya todo riesgo identificable de propagación del organismo, y previa aprobación de los citados organismos oficiales responsables.

3. Los métodos apropiados de limpieza y desinfección de todos los objetos contemplados en el artículo 7, letra c), serán aquellos para los que se haya excluido cualquier riesgo identificable de propagación del organismo, y se aplicarán bajo el control de los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas.

4. La serie de medidas que deben adoptar las Comunidades Autónomas en la zona delimitada de conformidad con el artículo 5, apartado 1, letra c), a la que se hace referencia en el artículo 7, letra d), incluirá las medidas siguientes:

4.1 En los lugares de producción que se declaren contaminados en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a):

• se adoptarán medidas para eliminar las plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo,

y

• no se plantarán tubérculos, plantas ni semillas de patata propiamente dichas, ni ninguna otra planta que pueda contener naturalmente el organismo, ni ningún cultivo que presente un riesgo cierto de propagación del organismo,

‒ en la primera temporada de cultivo de patatas siguiente al período indicado en el guión anterior y, siempre que en las inspecciones oficiales se haya comprobado que, durante al menos los dos años de vegetación inmediatamente anteriores a la plantación, el campo estuvo libre de plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, sólo se permitirá la producción de patatas de consumo y los tubérculos recolectados se someterán a prueba conforme al procedimiento detallado en el anexo I,

‒ en la temporada de cultivo de patatas siguiente a la mencionada en el guión anterior y tras un ciclo de rotación adecuado, cuya duración mínima será de dos años cuando vayan a cultivarse patatas de siembra, se podrán plantar patatas de siembra o de consumo y se realizará una encuesta oficial tal como se dispone el artículo 2, apartado 1, o bien,

ii) ‒ durante los cuatro años de cultivo siguientes al de declaración de la contaminación:

• se adoptarán medidas para eliminar las plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo,

y

• se dejará y mantendrá el campo, o bien en barbecho completo, o bien en pasto permanente con siega o pastoreo intenso o frecuente,

‒ en la primera temporada de cultivo de patatas siguiente al período indicado en el guión anterior y, siempre que en las inspecciones oficiales se haya comprobado que, durante al menos los dos años de vegetación inmediatamente anteriores a la plantación, el campo estuvo libre de plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, se permitirá la producción de patatas de siembra o consumo y los tubérculos recolectados se someterán a prueba conforme al procedimiento detallado en el anexo I;

‒ durante el año de cultivo siguiente al de declaración de contaminación o bien no se plantarán tubérculos, plantas ni semillas propiamente dichas de patata, ni cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo, o se podrán plantar patatas de siembra certificadas, pero sólo para la producción de patatas de consumo, y

‒ durante el segundo año de cultivo siguiente al de declaración de contaminación sólo se podrán plantar patatas de siembra certificadas o patatas de siembra que hayan sido sometidas a pruebas oficiales para determinar la ausencia de necrosis bacteriana y cultivadas bajo control oficial en lugares de producción distintos a los mencionados en el punto 4.1, ya sea para la producción de siembra o de consumo,

‒ durante el tercer año de cultivo siguiente al de declaración de contaminación, al menos, sólo se podrán plantar patatas de siembra certificadas o patatas de siembra cultivadas bajo control oficial a partir de patatas de siembra certificadas, ya sea para la producción de siembra o de consumo,

‒ en cada uno de los años de cultivo mencionados en los guiones anteriores, se tomarán medidas para eliminar las plantas de patata espontáneas y cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo en caso de advertirse su presencia, y se realizarán pruebas oficiales de las patatas recolectadas conforme al procedimiento detallado en el anexo I en todos los campos de patatas;

‒ no se plantarán tubérculos, plantas ni semillas propiamente dichas hasta que la unidad de producción no haya sido sometida a medidas bajo control oficial destinadas a eliminar el organismo y a retirar todo el material vegetal que pueda ser huésped del mismo, incluida, como mínimo, la sustitución total del medio de cultivo y la limpieza y desinfección de la unidad de producción y de todos los equipos, y los organismos oficiales responsables no hayan concedido la subsiguiente autorización para la producción de patata,

y

‒ la producción de patata procederá de patatas de siembra certificadas o de minitubérculos o micro-plantas derivadas de fuentes probadas.

4.2 Dentro de la zona delimitada, sin perjuicio de lo dispuesto en el punto 4.1, las Comunidades Autónomas aplicarán las siguientes medidas:

‒ controlarán a través de sus organismos oficiales responsables las explotaciones que cultiven, almacenen o manipulen tubérculos de patata, además de las explotaciones que contraten máquinas para este cultivo,

‒ requerirán que, para todos los cultivos de patata dentro de la zona delimitada, se planten exclusivamente semillas certificadas o semillas cultivadas bajo control oficial, y se efectúe un análisis después de recolectar los cultivos de patatas de siembra en lugares de producción declarados probablemente contaminados según el artículo 5, apartado 1, letra b),

‒ exigirán que se manipulen por separado las existencias de patatas de siembra y de patatas de consumo recolectadas en todas las explotaciones de la zona, o que se establezca un sistema de limpieza y desinfección entre el manejo de las existencias de patatas de siembra y el de las de consumo.

‒ llevarán a cabo una encuesta oficial según lo dispuesto en el artículo 2, apartado 1;

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ANEXO V. Métodos oficialmente autorizados para la eliminación de residuos

Los métodos oficialmente autorizados para la eliminación de residuos mencionados en el punto 1 del anexo IV se ajustarán a las disposiciones siguientes, de tal forma que se excluya todo riesgo identificable de propagación del organismo:

‒ en un vertedero autorizado oficialmente a tal fin donde no se haya podido determinar riesgo alguno de escape del organismo al medio ambiente, por ejemplo, mediante la filtración a tierras de cultivo; los residuos se trasladarán directamente al vertedero en unas condiciones de confinamiento que impidan todo riesgo de pérdida de los mismos,

‒ se incinerarán,

o

‒ se someterán a otras medidas, siempre que se descarte el posible riesgo de propagación del organismo; dichas medidas deben notificarse inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a la Comisión y a los demás Estados miembros.

ii) Los residuos líquidos que contengan elementos sólidos en suspensión se filtrarán o se someterán a procesos de sedimentación para la separación de dichos elementos; estos se eliminarán de la forma dispuesta en el inciso i).

A continuación, los residuos líquidos se someterán a alguna de las medidas siguientes:

‒ se calentarán a un mínimo de 60 °C en todo su volumen durante 30 minutos por lo menos antes de la eliminación,

o

‒ se eliminarán por otro sistema que, aprobado oficialmente y aplicado bajo control oficial, descarte todo riesgo identificable de contacto de los residuos con tierras de cultivo. Las características de tal sistema serán notificadas al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a los demás Estados miembros y a la Comisión.

Las opciones descritas en el presente anexo se aplican asimismo a los residuos asociados a la manipulación, la eliminación y el tratamiento de lotes contaminados.

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