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DECRETO DEL PRESIDENTE DELLA REPUBBLICA 1 marzo 1992, n. 230

Current text a fecha 1992-03-19

IL PRESIDENTE DELLA REPUBBLICA

Visto l'art. 87 della Costituzione;

Visto l'art. 17, comma 2, della legge 23 agosto 1988, n. 400;

Vista la legge 9 marzo 1989, n. 86;

Vista la legge 29 dicembre 1990, n. 428, ed in particolare l'allegato C;

Vista la legge 16 aprile 1987, n. 183;

Vista la legge 30 aprile 1976, n. 397;

Ritenuto di dover emanare le disposizioni occorrenti per assicurare l'attuazione delle direttive 79/109/CEE, 79/111/CEE, 80/219/CEE, 80/1098/CEE, 80/1099/CEE, 80/1274/CEE, 82/893/CEE, 83/646/CEE, 84/336/CEE, 85/586/CEE, 87/489/CEE, 88/406/CEE in materia di scambi intracomunitari di animali della specie bovina e suina, tenuto conto anche delle direttive 84/643/CEE, 90/422/CEE e 90/423/CEE;

Vista la deliberazione del Consiglio dei Ministri, adottata nella riunione del 26 luglio 1991;

Acquisiti i pareri delle commissioni parlamentari del Senato della Repubblica e della Camera dei deputati;

Udito il parere del Consiglio di Stato, espresso nell'adunanza generale del 23 gennaio 1992;

Vista la deliberazione del Consiglio dei Ministri, adottata nella riunione del 27 febbraio 1992;

Sulla proposta del Ministro per il coordinamento delle politiche comunitarie;

E M A N A il seguente regolamento:

Art. 1

1.All'art. 2, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni e integrazioni, le lettere e) ed i) sono sostituite dalle seguenti: " e) allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi: l'allevamento bovino che risponde alle condizioni indicate nell'allegato A, capitolo II lettera A, punti 1 o 1- bis; i) zona indenne da epizoozia: la zona di un diametro di 20 km, entro la quale, secondo accertamenti ufficiali, non si e' avuto da almeno trenta giorni prima del carico: 1) per gli animali della specie bovina: alcun caso di afta epizootica; 2) per gli animali della specie suina: alcun caso di afta epizootica, di peste suina, di malattia vescicolare dei suini o di paralisi suina contagiosa (morbo di Teschen);".

2.All'art. 2, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, sono aggiunte, in fine, le seguenti lettere: " n) regione: parte del territorio di superficie minima di 2000 km(Elevato al Quadrato) e comprendente almeno una delle seguenti circoscrizioni amministrative: - per il Belgio: Province/Provincie, - per la Germania: Regierungbezirk, - per la Danimarca: Amt o isola, - per la Francia: Departement, - per l'Italia: Provincia, - per il Lussemburgo: - per i Paesi Bassi: Provincie, - per il Regno Unito: - per l'Inghilterra, il Galles e l'Irlanda del Nord: County, - per la Scozia: District o Island Area, - per l'Islanda: County; o) azienda ufficialmente indenne da peste suina, un'azienda: 1) in cui non si sono accertati casi di peste suina almeno negli ultimi dodici mesi; 2) in cui non sono presenti suini vaccinati contro la peste suina negli ultimi dodici mesi; 3) in cui la vaccinazione contro la peste suina non e' stata autorizzata da almeno dodici mesi; 4) che si trovi al centro di una zona con un raggio di 2 km in cui la peste suina, non sia stata accertata almeno negli ultimi dodici mesi; p) Stato membro o regione ufficialmente indenne da peste suina, uno Stato membro o una regione: 1) in cui non si sono accertati casi di peste suina almeno negli ultimi dodici mesi; 2) in cui la vaccinazione contro la peste suina non e' stata autorizzata da almeno dodici mesi; 3) in cui le aziende non presentano suini vaccinati contro la peste suina negli ultimi dodici mesi; q) Stato membro, regione o azienda indenne da peste suina, uno Stato membro, una regione o un'azienda in cui non si sono accertati casi di peste suina almeno negli ultimi dodici mesi; r) allevamento indenne da leucosi bovina enzootica: un allevamento che soddisfa le condizioni previste all'allegato G, capitolo I, lettera A; s) Stato membro o regione indenne da leucosi bovina enzootica: una regione o uno Stato membro che soddisfa i requisiti fissati nell'allegato G, capitolo I, lettera B.".

Art. 2

1.All'art. 3, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni e integrazioni, alla lettera c), numero 2), dopo le parole: "per gli animali della specie suina, da afta epizootica," sono inserite le seguenti: "da malattia vescicolare dei suini".

Art. 3

1.All'art. 6, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni ed integrazioni, sono aggiunte, in fine, le seguenti lettere: " e) provenire da un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica; f) oltre al requisito di cui alla lettere e), se sono di eta' superiore a dodici mesi e qualora provengono da una regione o da uno Stato membro che non abbia ricevuto la qualifica di indenne da leucosi bovina enzootica, aver reagito negativamente ad un esame individuale effettuato, in conformita' dell'allegato G, capitolo II nei trenta giorni precedenti la data del carico; g) non essere soggetti ai requisiti delle lettere e) ed f), quando si tratta di bovini di eta' inferiore a trenta mesi destinati alla produzione di carne, i quali: 1) provengono da un allevamento nel quale nessun caso di leucosi bovina enzootica e' stato notificato e confermato negli ultimi 2 anni; 2) siano contrassegnati con uno speciale marchio al momento del carico e restino sotto sorveglianza sino alla macellazione a cura del paese destinatario per evitare l'infezione degli allevamenti locali.".

Art. 4

1.All'art. 7, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni ed integrazioni, dopo le parole: "indenne da brucellosi" sono aggiunte le seguenti: "e da una azienda ufficialmente indenne da peste suina o da una azienda indenne da peste suina purche', in quest'ultimo caso, siano accompagnati da un certificato che attesti che gli animali non sono stati vaccinati.".

Art. 5

1.Dopo l'art. 9 della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni ed integrazioni, e' inserito il seguente: "Art. 9-bis. - 1. La Commissione delle Comunita' europee puo' decidere che, in uno Stato membro o in una parte di uno Stato membro composto da piu' regioni contigue in cui il 99,8% degli allevamenti bovini e' stato dichiarato ufficialmente indenne da brucellosi per almeno dieci anni e in cui non si e' constatato alcun caso di aborto da brucellosi negli ultimi tre anni, le prove di controllo per il mantenimento di tale qualifica possono essere effettuate in deroga all'allegato A, capitolo II, sub ii, precisandone le modalita' e individuando eventualmente i territori. 2. La Commissione delle Comunita' Europee puo' decidere che il regime previsto nell'allegato A, capitolo II, lettera A, punto 1 c), sub iii, si applichi ad una parte di uno Stato membro composta da piu' regioni contigue. 3. La Commissione delle Comunita' europee puo' decidere, che in uno Stato membro, o in una parte di uno Stato membro composta da piu' regioni contigue, in cui almeno il 99,9% degli allevamenti bovini e' stato dichiarato ufficialmente indenne da tubercolosi da almeno dieci anni e in cui per almeno sei anni non sono stati constatati casi di tubercolosi in numero superiore, per anno, ad uno su 10.000 allevamenti situati in detto Stato membro, o in detta parte di uno Stato membro, purche' tutti gli animali della specie bovina che hanno reagito positivamente ad una tubercolinizzazione e tutti gli animali della specie bovina macellati nel territorio del detto Stato membro abbiano subito l'ispezione post mortem da parte di un veterinario ufficiale e, se necessario, l'esame batteriologico, i controlli per conservare tale qualifica possono essere effettuati in deroga all'allegato A, capitolo I, lettera b) precisandone i metodi ed eventualmente i territori. 4. In deroga ai requisiti di cui all'allegato G, capitolo I, lettera B, punto 2), uno Stato membro o una regione di uno Stato membro dichiarata indenne da leucosi bovina enzootica puo' essere autorizzato dalla Commissione delle Comunita' europee a ridurre il livello di controllo degli animali di piu' di due anni, a condizione che gli esami abbiano permesso di constatare il rispetto dei seguenti requisiti: a) almeno per tre anni non siano stati constatati casi di leucosi bovina enzootica nella proporzione di uno su 10.000 allevamenti; b) tutti gli animali che hanno reagito positivamente ad un esame di immunodiffusione siano stati abbattuti e l'allevamento sia restato in regime di restrizione sino a ripristino della sua qualifica in conformita' dell'allegato G, capitolo I, lettera C, punti 1) o 2); c) tutti gli animali macellati in detto Stato membro o in detta regione abbiano subito l'ispezione post mortem da parte di un veterinario ufficiale, che deve notificare tutti i tumori in vista di un esame di laboratorio.".

Art. 6

1.All'art. 10- bis, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni ed integrazioni, la data: "31 dicembre 1982" e' sostituita dalla seguente: "31 dicembre 1991".

Art. 7

Art. 8

1.All'art. 19, terzo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni e integrazioni, dopo la data: "19 luglio 1971" sono aggiunte le seguenti parole: "; tali garanzie non possono pero' essere richieste per l'introduzione di animali provenienti da uno Stato membro o da una regione indenni dalla leucosi bovina enzootica".

Art. 9

1.Dopo l'art. 33 della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni ed integrazioni, e' inserito il seguente: "Art. 33- bis .- 1. Il Ministro della sanita', con i propri decreti, adotta regolamenti ai sensi dell'art. 17 della legge 23 agosto 1988, n. 400, per estendere al territorio nazionale le norme sanitarie previste negli allegati".

Art. 10

1.Gli allegati alla legge 30 aprile 1976, n. 397, sono soppressi e vengono sostituiti dagli allegati al presente regolamento.

COSSIGA

ANDREOTTI, Presidente del Consiglio dei Ministri

ROMITA, Ministro per il Coordinamento delle politiche comunitarie

Visto, il Guardasigilli: MARTELLI Registrato nalla Corte dei conti il 13 marzo 1992

Atti di Governo, registro n. 85, foglio n. 11

Allegato A

ALLEGATO A (1) (3) I. ALLEVAMENTI BOVINI INDENNI DA TUBERCOLOSI E' considerato ufficialmente indenne da tubercolosi un allevamento bovino nel quale: a) tutti i bovini sono esenti da manifestazioni chimiche di tubercolosi; b) tutti i bovini di eta' superiore a cinque settimane hanno avuto una reazione negativa ad almeno due intradermotubercolinizzazioni ufficiali praticate secondo le disposizioni dell'allegato B, che hanno luogo la prima sei mesi dopo la fine delle operazioni di risanamento dell'allevamento, la seconda sei mesi dopo la prima e le successive ad un anno di intervallo. Quando in uno Stato membro o in una regione di uno Stato membro, nel quale tutti i bovini sono soggetti alle misure ufficiali di lotta contro la tubercolosi, la percentuale degli allevamenti bovini infettati da tubercolosi non e' superiore ad 1 in occasione di due controlli succedentisi ad intervallo di un anno, tale intevallo puo' essere portato a due anni. Quando la percentuale degli allevamenti bovini infettati non e' superiore a 0,2 in occasione di due controlli succedentisi ad intervallo di due anni, l'intervallo tra le tubercolinizzazioni puo' essere portato a tre anni. Qualora la percentuale degli allevamenti bovini infetti non sia superiore allo 0,1 in occasione di due controlli successivi ad intervallo di tre anni, l'intervallo tra le tubercolinizzazioni suc- cessive puo' essere portato a quattro anni e/o l'eta' alla quale gli animali dovranno essere sottoposti a tali controlli puo' essere portata a ventiquattro mesi; c) non e' stato introdotto alcun bovino senza attestato di un veterinario ufficiale in cui si certifichi che detto animale proviene da un allevamento bovino ufficialmente indenne da tubercolosi e, se e' di eta' superiore a sei settimane, ha avuto una reazione negativa all'intradermotubercolinizzazione valutata secondo i criteri dell'allegato B , 31 a): i) tuttavia, l'intradermotubercolinizzazione non e' richiesta in uno Stato membro in cui la percentuale degli allevamenti bovini infettati da tubercolosi e' inferiore allo 0,2 e che risulta da un attestato del veterinario ufficiale che l'animale: 1) e' debitamente identificato; 2) proviene da un allevamento ufficialmente indenne da tubercolosi di questo Stato membro; 3) in occasione del trasporto non e' entrato in contatto con bovini non provenienti da allevamenti bovini ufficialmente indenni da tubercolosi; ii) l'attestato previsto al punto 1) puo' non essere richiesto in uno Stato membro in cui, da almeno quattro anni: - almeno il 99,80% degli allevamenti bovini e' ufficialmente riconosciuto indenne da tubercolosi e in cui - gli allevamenti non ufficialmente indenni si trovano sotto controllo ufficiale, ed e' vietato il trasferimento di bovini da tali allevamenti salvo che gli stessi siano portati direttamente al macello sotto controllo ufficiale. Qualora in un allevamento bovino ufficialmente indenne da tubercolosi, la reazione di un animale ad una tubercolinizzazione di routine sia considerata positiva o qualora, nello stesso allevamento, sia diagnosticato un caso clinico di tubercolosi nel corso dell'ispezione post mortem di routine su un animale proveniente da un allevamento ufficialmente indenne da tubercolosi, la qualifica 'ufficialmente indenne' deve essere sospesa fintanto che tutti i rimanenti animali, di eta' superiore alle sei settimane, non avranno reagito negativamente ad almeno due intradermotubercolinizzazioni ufficiali conformemente all'allegato B, la prima delle quali effettuata almeno due mesi dopo l'eliminazione dell'animale dall'allevamento in questione, e la seconda ad almeno quarantadue giorni di distanza. II. ANIMALI DELLA SPECIE SUINA E ALLEVAMENTI BOVINI E SUINI INDENNI DA BRUCELLOSI A. Allevamenti bovini. 1. E' da considerare ufficialmente indenne da brucellosi un allevamento bovino in cui: a) non vi sono animali della specie bovina vaccinati contro la brucellosi, salvo che non si tratti di femmine che siano state vaccinate da almeno tre anni; b) tutti i bovini sono immuni da manifestazioni chimiche di brucellosi da almeno sei mesi; c) tutti i bovini di eta' superiore a dodici mesi: i) hanno presentato, in occasione di due sieroagglutinazioni praticate ufficialmente ad intervalli di tre mesi almeno e di dodici mesi al massimo e secondo le disposizioni dell'allegato C, paragrafo A, un tasso brucellare inferiore a 30 u.i. agglutinati per millilitro, rimanendo inteso che; - la prima sieroagglutinazione puo' essere sostituita da tre prove dell'anello (ring test) effettuate ad intervalli di tre mesi purche' tuttavia la seconda sieroagglutinazione sia effettuata almeno sei settimane dopo la terza prova dell'anello; - le prove di sieroagglutinazione di cui al primo paragrafo possono essere sostituite da due prove ufficiali all'antigene di brucella tamponato o da due prove di microagglutinazione effettuate conformemente alle disposizioni dell'allegato C, punti D e G. Anche queste prove devono essere effettuate ad intervalli non inferiori a tre mesi e non superiori a dodici mesi; ii) sono controllati annualmente per stabilire l'assenza di brucellosi mediante tre prove dell'anello, oppure tre saggi ELISA su latte, effettuati ad intervalli di almeno tre mesi o mediante due prove dell'anello, o due saggi ELISA su latte, effettuati a intervalli di almeno tre mesi e una prova sierologica (prova di sieroagglutinazione, prova all'antigene di Brucella tamponato, prova di plasmoagglutinazione, prova dell'anello di latte su plasma sanguigno, prova di microagglutinazione o saggio singolo ELISA su sangue) effettuata non meno di sei settimane dopo la seconda prova dell'anello o il secondo saggio ELISA su latte. Se non vengono effettuate le prove dell'anello o il saggio ELISA sul latte, si devono effettuare ogni anno due prove sierologiche (prova di sieroagglutinazione, prova all'antigene di Brucella tamponato, prova di plasmoagglutinazione, prova dall'anello di latte su plasma sanguigno, prova di microagglutinazioneo saggio singolo ELISA su sangue) ad un intervallo non inferiore a tre mesi e non superiore a sei mesi. Se in uno Stato membro o in una regione di uno Stato membro in cui tutti gli allevamenti bovini sono sottoposti ad operazioni ufficiali di lotta contro la brucellosi la percentuale degli allevamenti di bovini infetti non supera l'1%, e' sufficiente effettuare ogni anno due prove dell'anello o due saggi ELISA su latte a intervalli di almeno tre mesi, oppure una prova sierologica (prova di sieroagglutinazione, prova all'antigene di Brucella tamponato, prova di plasmoagglutinazione, prova dell'anello di latte su plasma sanguigno, prova di microagglutinazione o saggio ELISA su sangue). In caso di controllo mediante prove dell'anello sulle cisterne gli esami di cui ai commi precedenti devono essere raddoppiati e gli intervalli tra le prove devono essere ridotti della meta'; iii) si puo' rinunciare alle prescrizioni relative al controllo animale dell'assenza di brucellosi previsto dal comma ii) in ogni Stato membro in cui il 99,8% almeno del patrimonio bovino e' riconosciuto ufficialmente indenne da brucellosi da almeno quattro anni: in tal caso l'intervallo tra i controlli puo' essere portato a due anni e i controlli devono essere effettuati mediante una delle prove sierologiche menzionate nel comma ii); d) non e' stato introdotto alcun bovino senza un attestato di un veterinario ufficiale che certifichi che detto animale proviene da un allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi e, se e' di eta' superiore a dodici mesi, che ha presentato un tasso brucellare inferiore a 30 u.i. agglutinanti per millilitro alla siero- agglutinazione praticata secondo le disposizioni dell'allegato C nei trenta giorni che precedono l'introduzione nell'allevamento; i) tuttavia la siero-agglutinazione puo' non essere richiesta nello Stato membro o in parte di uno Stato membro composta da piu' regioni contigue in cui la percentuale di allevamenti bovini infettati da brucellosi non e', da almeno due anni, superiore a 0,2 e se risulta dall'attestato del veterinario ufficiale che l'animale: 1) e' debitamente identificato; 2) proviene da un allevamento bovino di questo Stato membro ufficialmente indenne da brucellosi; 3) in occasione del suo trasporto non e' entrato in contatto con bovini non provenienti da allevamenti bovini ufficialmente indenni; ii) l'attestato previsto al punto i) puo' non essere richiesto nello Stato membro in cui da quattro anni almeno: - il 99,8% almeno degli allevamenti bovini e' riconosciuto ufficialmente indenne da brucellosi e in cui: - gli allevamenti che non sono ufficialmente indenni si trovano sotto controllo ufficiale, ed e' vietato il trasferimento dei bovini da tali allevamenti, salvo che gli stessi siano portati direttamente al macello sotto controllo ufficiale. 1- bis. E' parimenti considerato ufficialmente indenne da brucellosi un allevamento bovino: - che si trova in uno Stato membro in cui alla data del 1 gennaio 1979 non e' stato ufficialmente constatato alcun caso di brucellosi bovina da almeno dieci anni; - che ha soddisfatto in questo periodo le disposizioni del paragrafo 1, tranne, se tutti gli allevamenti bovini dello Stato membro in questione sono stati sottoposti periodicamente a esami di controllo ufficali durante lo stesso periodo, quelle di cui alla lettera c). 2. Un allevamento bovino e' considerato indenne da brucellosi quando: a) non comprende maschi vaccinati contro la brucellosi; b) tutte le femmine della specie bovina, o una parte di esse, sono state vaccinate: - entro i primi sei mesi di eta', con vaccino vivo Buck19 o con altri vaccini autorizzati secondo la procedura dell'art. 12; - entro i primi quindici mesi di eta', con vaccino ucciso con adiuvante 45/20, controllato e riconosciuto ufficialmente; c) tutti i bovini soddisfano le condizioni indicate nel punto 1), lettere b) e c), rimenendo inteso che i bovini di eta' inferiore a trenta mesi, vaccinati con vaccino vivo Buck19, possono presentare un tasso brucellare pari o superiore a 30 unita' internazionali agglutinanti per millilitro, ma inferiore a 80 unita' internazionali agglutinanti per millilitro, sempreche' presentino, alla reazione di fissazione del complemento: - un tasso inferiore a 30 unita' CEE, se si tratta di femmine vaccinate da almeno dodici mesi; - un tasso inferiore a 20 unita' CEE in tutti gli altri casi. Le prove di sieroagglutinazione di cui al punto 1) c) i), primo trattino, possono essere sostituite da prove all'antigene di brucella tamponato effettuate conformemente alle disposizioni dell'allegato C), lettera D, o da prove di microagglutinazione effettuate conformemente alle disposizioni dell'allegato C, lettera G; d) non e' stato introdotto nessun bovino senza un attestato del veterinario ufficiale con cui si certifichi che l'animale risponde alle condizioni previste al numero 1, lettera d), oppure che esso proviene da un allevamento riconosciuto indenne da brucellosi e, in questo caso, se e' di eta' superiore a dodici mesi, ha presentato nei trenta giorni precedenti l'introduzione nell'allevamento, secondo le disposizioni dell'allegato C), un tasso brucellare inferiore a 30 u.i. agglutinanti per millilitro e una reazione negativa di fissazione del complemento. Tuttavia, un bovino vaccinato con vaccino vivo 19 e, di eta' inferiore a trenta mesi puo' presentare un tasso brucellare uguale o superiore a trenta u.i. agglutinanti per millilitro ma inferiore a 80 u.i. agglutinanti per millilitro, purche' alla reazione di fissazione del complemento presenti: - un tasso inferiore a 30 unita' CEE, se si tratta di una femmina vaccinata da meno di dodici mesi; - un tasso inferiore a 20 unita' CEE dopo il dodicesimo mese successivo alla vaccinazione. 3. Un allevamento bovino indenne da brucellosi puo' essere qualificato allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi dopo un termine minimo di tre anni se: a) non vi si trova alcun animale vaccinato contro la brucellosi da meno di tre anni; b) durante questi tre anni sono state rispettate senza interruzione le condizioni di cui al numero 2, lettera c); c) al termine del terzo anno gli animali di piu' di dodici mesi hanno presentato un tasso brucellare inferiore a 30 u.i. agglutinanti per millilitro alla siero-agglutinazione ed una reazione negativa alla fissazione del complemento. Tali prove sono praticate secondo le disposizioni dell'allegato C). 4. In un allevamento bovino ufficialmente riconosciuto indenne da brucellosi possono essere introdotti anche bovini provenienti da un allevamento indenne da brucellosi quando: - al momento della loro introduzione hanno un'eta' di almeno diciotto mesi; - nel caso in cui siano stati vaccinati contro la brucellosi, la vaccinazione e' stata effettuata da oltre un anno; - entro i trenta giorni che precedono la loro introduzione, conformemente alle disposizioni dell'allegato C), hanno presentato un tasso brucellare inferiore a 30 u.i. agglutinanti per millilitro e una reazione negativa alla fissazione del complemento. Se un bovino e' introdotto, conformemente al primo comma, in un allevamento ufficialmente riconosciuto indenne da brucellosi, quest'ultimo, ai fini degli scambi intracomunitari, e' considerato indenne da brucellosi per un periodo di due anni a decorrere dalla data di introduzione dell'animale. 5. Se in un allevamento ufficialmente indenne da brucellosi si constata un sospetto di brucellosi presso uno o piu' bovini, la qualifica di questo allevamento puo' essere provvisoriamente sospesa piuttosto che ritirata, purche' l'animale o gli animali siano immediatamente eliminati o isolati. La sospensione provvisoria puo' essere tolta qualora due siero- agglutinazioni, praticate secondo le disposizioni dell'allegato C) con intervalli da sei ad otto settimane su tutti gli animali d'eta' superiore a dodici mesi, diano un tasso inferiore a 30 u.i. agglutinanti per millilitro. Gli animali possono essere reintrodotti nell'allevamento se, nell'intervallo dalle sei alle otto settimane, due siero- agglutinazioni hanno dato un tasso inferiore a 30 u.i. agglutinanti per millilitro e due fissazioni del complemento hanno dato risultato negativo. Tali prove sono praticate secondo le disposizioni dell'allegato C. Le disposizioni di cui sopra sono applicabili altresi' agli allevamenti indenni da brucellosi quando un sospetto di tale malattia e' constatato presso uno o piu' bovini d'eta' superiore a trenta mesi. 6. Le disposizioni di cui sopra, relative agli animali appartenenti ad un allevamento indenne da brucellosi, si applicano anche agli animali che sono stati vaccinati ad un'eta' compresa fra i cinque e gli otto mesi prima della data di applicazione delle disposizioni della presente direttiva in ciascuno degli Stati membri. 7. Le prove di cui ai paragrafi da 1 a 6 non sono richieste per gli animali maschi castrati in eta' inferiore a quattro mesi.

Allegato B

ALLEGATO B NORME PER LA FABBRICAZIONE E L'UTILIZZAZIONE DELLE TUBERCOLINE BOVINE ED AVIARIE 1. Le tubercolinizzazioni controllate ufficalmente devono essere effettuate mediante tubercoline PPD o tubercoline preparate sinteticamente e concentrate a caldo ('tubercoline sintetiche'). Lo Stato membro che, alla data di adozione della presente direttiva, impiega, per il controllo delle tubercoline cosiddette 'sintetiche', una tubercolina standard conforme al campione internazionale della vecchia tubercolina, puo', in deroga alle disposizioni dell'allegato B, punto 1 della direttiva 64/432/CEE, continuare ad utilizzare questo metodo fino all'applicazione di norme internazionali piu' perfezionate. 2. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle tubercoline PPD bovine e delle tubercoline cosiddette 'sintetiche' devono essere titolati in unita' tubercoliniche comunitarie (UTC) mediante prove biologiche secondo le norme CEE per la tubercolina standard CEE. 3. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle tubercoline aviarie devono essere espressi in unita' internazionali e titolati per via biologica, secondo lo strandard CEE della tubercolina PPD aviaria. 4. Lo standard CEE per la tubercolina PPD bovina e' fornito dal 'Centraal Diergeneeskundig Instituut', Afdeling Rotterdam, Paesi Bassi. 5. Lo standard CEE per la tubercolina 'sintetica' bovina e' fornita dall''Institut Pasteur' di Parigi, Francia. 6. Lo standard CEE per la tubercolina aviaria e' fornito dal 'Cen- tral Veterinary Laboratory', Weybridge, Surrey, Regno Unito. 7. Le tubercoline bovine devono essere preparate con uno dei ceppi di Mycobacterium bovis indicati qui di seguito: a) An5; b) Vallee. 8. Le tubercoline aviarie devono essere preparate con uno dei ceppi di Mycobacterium avium indicati qui di seguito: a) D4ER; b) TB56. 9. Il pH delle tubercoline deve essere compreso fra 6,5 e 7,5. 10. Per quanto concerne l'aggiunta alle tubercoline di conservanti antimicrobici o di altre sostanze, deve risultare dimostrato, a giudizio dell'istituto statale responsabile del controllo ufficiale della tubercolina, che tale aggiunta non altera l'innocuita' ne' l'efficacia del prodotto. Le concentrazioni massime consentite per il fenolo e la glicerina sono le seguenti: a) fenolo - 0,5% M/v; b) glicerina - 10% v/v. 11. Superata con esito favorevole l'ultima prova di attivita', le tubercoline, conservate a temperature comprese fra 2 C e 8 C ed al riparo dalla luce, rimangono valide per tutta la durata dei periodi sotto indicati: a) tubercoline PPD liquide: due anni; tubercoline PPD liofilizzate: otto anni; b) tubercoline 'sintetiche' diluite: due anni. 12. Nei rispettivi Paesi, gli istituti statali seguenti sono incaricati del controllo ufficiale delle tubercoline: a) Germania: Paul-Ehrlich-Institut, Frankfurt/Main; b) Belgio: Institut d'hygiene et d'epidemiologie, rue J. Wytsman 14, B 1050 Bruxelles; c) Francia: Laboratoire national des medicaments veterinaires, Fougeres; d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore; e) Italia: Istituto superiore di sanita', Roma; f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam; g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn V; h) Irlanda: Istituto del paese fornitore; i) Regno Unito: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey; j) Grecia: Kthniat Inshtouton Loimvdvn Kai Parasiokvn Noshmatan 1era odos75 Auhnai 301; k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de Granada; l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria - Lisboa. 13. Ciascuna partita di tubercoline infialate e pronte per l'uso deve essere oggetto di un controllo ufficiale. 14. Le tubercoline devono essere controllate con metodi biologici e chimici. 15. Le tubercoline devono essere sterili. Le prove di sterilita' devono essere effettuate secondo le norme della farmacopea europea. 16. Le tubercoline devono risultare esenti da proprieta' tossiche od irritanti in base a una prova effettuata secondo le norme della farmacopea europea. 17. Le tubercoline devono essere sottoposte a un'analisi chimica per determinare l'esatta concentrazione della glicerina e/o del fenolo, nonche' la concentrazione di altri eventuali conservanti. 18. Una prova di non sensibilizzazione alla tubercolina deve essere effettuata secondo le norme della farmacopea europea. 19. L'attivita' delle tubercoline deve essere valutata con i metodi biologici, applicabili alle tubercoline PPD e a quelle 'sintetiche' e basati sul confronto delle tubercoline in esame con tubercoline standard. 20. Il contenuto proteico delle tubercoline PPD (tubercoloproteina) si ottiene secondo il metodo di Kjeldahl. Il fattore di conversione dell'azoto in tubercoloproteine e' 6,25. 21. Lo standard CEE per la tubercolina 'sintetica' bovina ha un'attivita' di 65.000 unita' tubercoliniche comunitarie (UTC) provvisorie per ml, e viene distribuito in fiale da 5 ml. 22. Lo standard CEE, per la tubercolina PPD bovina ha un'attivita' di 50.000 UTC per mg di PPD, e viene distribuito alla stato liofilizzato in fiale contenenti 1,8 mg di PPD (0,00002 mg di PPD corrispondono cioe' ad 1 unita' tubercolinica comunitaria di attivita'). 23. La tubercolina PPD aviaria della norma CEE ha un'attivita' di 50.000 unita' internazionali (UI) per mg di derivato proteico purificato essiccato e viene distribuita allo stato liofilizzato in fiale contenenti 10 mg di PPD piu' 26,3 mg di sali (0,0000726 mg dello standard corrispondono cioe' ad 1 unita' internazionale di attivita'). 24. Le tubercoline che i fabbricanti presentano per il controllo agli istituti statali di cui al paragrafo 12 devono essere state oggetto di una prova biologica di attivita' in paragone con gli opportuni standard elencati ai paragrafi 2 e 3. 25. a) Prove di attivita' su cavie. La prova deve essere effettuata su cavie albine di peso fra g 400 e 600. Tali cavie devono essere in buona salute al momento dell'inoculazione della tubercolina. Per ciascuna prova vanno impiegate non meno di otto cavie. La prova deve essere effettuata a non meno di un mese di distanza dalla sensibilizzazione. aa) Per il controllo delle tubercoline bovine, le cavie devono essere sensibilizzate con uno dei metodi seguenti: 1) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5, ucciso col calore, in coadiuvante oleoso; 2) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5 vivo in emulsione salina fisiologica: 3) iniezione di vaccino BCG. bb) Per il controllo delle tubercoline aviarie, le cavie devono essere sensibilizzate mediante inoculazione di 2 mg, di micobatteri tubercolari del tipo aviario, uccisi col calore, sospesi in 0,5 ml di paraffina liquida sterile, ovvero mediante inoculazione di micobatteri tubercolari vivi del tipo aviario in emulsione salina fisiologica, Il ceppo da impiegare e' quello del tipo aviario D4. cc) Qualunque tubercolina esaminata deve essere titolata mediante inoculazione intradermica in paragone con l'opportuna tubercolina standard, impiegando gruppi di cavie opportunamente sensibilizzate. Le cavie devono essere tosate su due fianchi. La prova deve essere effettuata confrontando le reazioni indotte da una serie di inoculazioni intracutanee di dosi da 0,2 ml al massimo di diluizioni della tubercolina standard in soluzione salina isotonica tamponata contenente lo 0,0005% di Tween 80, con una corrispondente serie di inoculazioni della tubercolina in esame. Le diluizioni devono essere preparate in serie geometrica ed essere iniettate nelle cavie secondo una distribuzione irregolare in quadrato latino (otto iniezioni, da praticarsi in quattro punti su ciascun lato). Il diametro delle aree di reazione su ciascun lato deve essere misurato e registrato dopo 24-28 ore. Per ciascun campione di tubercolina sotto prova deve essere effettuata una valutazione dell'attivita' relativa e dei suoi limiti di affidabilita', basata su metodi statistici, impiegando come metametri i diametri delle aree di reazione e dei logaritmi delle dosi. L'attivita' della tubercolina bovina in esame e' accettabile se, in base alla valutazione, ogni dose destinata ai bovini risulta contenere 2.000 UTC (+/- 25%). L'attivita' di qualunque tubercolina in esame deve essere espressa, secondo i casi, in unita' tubercoliniche comunitarie o in UI/ml. b) Controllo dell'attivita' sui bovini. Un controllo dell'attivita' delle tubercoline bovine puo' essere effettuato periodicamente su bovini infetti da tubercolosi per via naturale o artificiale. Dette prove di attivita', da praticarsi su gruppi di bovini tubercolotici, devono essere effettuate per inoculazione intradermica della tubercolina in esame in quattro o sei punti, in paragone con l'opportuno standard; l'attivita' della tubercolina deve essere valutata con metodi statistici come nella prova su cavie. 26. Per l'etichettatura dei contenitori e degli imballaggi delle tubercoline devono essere rispettate le seguenti norme. L'etichetta del contenitore e quella dell'imballaggio devono indicare: - il nome del preparato: - per i preparati liquidi, il volume totale del contenitore; - il numero di unita' comunitarie o di unita' internazionali per ml o per mg; - il nome del fabbricante; - il numero della partita; - per i preparati liofilizzati, la natura e la quantita' del liquido di ricostituzione. L'etichetta del contenitore o dell'imballaggio deve indicare: - data di scadenza; - condizioni di conservazione; - denominazione e, se possibile, proporzione di ogni sostanza aggiunta; - tipo di bacillo dal quale e' stata ricavata la tubercolina. 27. Dei laboratori comunitari designati conformemente all'art. 3 verranno incaricati di controlli complementari delle tubercoline normalmente utilizzati nei vari Stati membri per assicurare che l'attivita' di ciascuna di queste tubercoline sia conforme a quella della corrispondente tubercolina standard comunitaria. Tali analisi devono essere effettuate su bovini tubercolotici, su cavie opportunamente sensibilizzate e mediante appropriate reazioni chimiche. 28. Sono riconosciute ufficialmente le seguenti tecniche di intradermotubercolinizzazione: a) intradermotubercolinizzazione unica: inoculazione singola di tubercolina bovina; b) intradermotubercolinizzazione comparativa: inoculazione simultanea delle due tubercoline (aviaria e bovina). 29. La dose di tubercolina inoculata non deve essere inferiore: 1) a 2.000 UTC di tubercolina bovina; 2) a 2.000 u.i. di tubercolina aviaria. Il volume di ciascuna dose non deve superare 0,2 ml. 30. La tubercolinizzazione deve essere effettuata inoculando la tubercolina, o le tubercoline, nella pelle del collo. I punti di inoculazione devono trovarsi al limite tra il terzo anteriore ed il terzo mediano del collo. Quando nello stesso animale vengono inocu- late ambedue le tubercoline il punto di iniezione della tubercolina aviaria deve trovarsi a 10 cm circa dalla cresta del collo ed il punto di inoculazione della tubercolina bovina a 12,5 cm al di sotto di una linea approssimativamente parallela a quella delle spalle, o su diversi punti del collo; negli animali giovani, sul cui collo non vi e' abbastanza spazio per effettuare le due inoculazioni a distanza sufficiente sullo stesso lato, ciascuna inoculazione va praticata su uno dei due lati del collo, in punti identici, al centro del terzo mediano del collo. 31. Tecnica ed interpretazione delle reazioni di tubercolinizzazione. a) Tecnica. Tosare e pulire i punti di inoculazione. Prendere fra il pollice e l'indice una piega di pelle in ciascuna delle zone depilate, misurarne lo spessore con calibro e annotarne il risultato. Introdurre obliquamente negli strati piu' profondi della pelle, tenendo il taglio trasversale della punta rivolto verso l'esterno, un ago corto sterile, collegato ad una siringa graduata caricata con la tubercolina in esame. Iniettare la dose di tubercolina. L'inoculazione e' avvenuta in modo corretto se la palpazione rivela un piccolo gonfiore, delle dimensioni di un pisello, in ciascun punto di inoculazione. A distanza di 22 ore dall'inoculazione, misurare nuovamente lo spessore della piega cutanea in ciascun punto di inoculazione e annotarne il risultato. b) Interpretazione delle reazioni. - L'interpretazione delle reazioni deve essere fondata su osservazioni cliniche e sulla registrazione dell'aumento, o degli aumenti, dello spessore della piega cutanea nei punti di inoculazione, 72 ore dopo l'inoculazione della tubercolina o delle tubercoline; ba) reazione negativa: si osserva solo un gonfiore circoscritto con aumento di spessore della piega cutanea non superiore a 2 mm senza segni clinici, quali edema diffuso od esteso, esudazione, necrosi, dolore o infiammazione dei dotti linfatici della regione o dei linfonodi. bb) reazione dubbia: non si osservano segni clinici del tipo di quelli menzionati al punto ba), e l'aumento dello spessore della piega cutanea e' superiore a 2 mm ed inferiore a 4 mm. bc) reazione positiva: si osservano segni clinici del tipo di quelli menzionati al punto ba), si riscontra un aumento di 4 mm o piu' dello spessore della piega cutanea nel punto di iniezione. 32. Interpretazione delle intradermotubercolinizzazioni ufficiali: a) Intradermotubercolinizzazione singola: positiva: reazione secondo la definizione del par. 31 bc); dubbia: reazione secondo la definizione del par. 31 bb); negativa: reazione secondo la definizione del par. 31 ba). Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione singola non da' esito conclusivo devono essere sottoposti ad un'altra prova a distanza di almeno quarantadue giorni. Gli animali che non risultano negativi a questa seconda prova devono essere ritenuti positivi. Gli animali che risultano positivi all'intradermotubercolinizzazione singola possono essere sottoposti ad un'intradermotubercolinizzazione comparativa. b) Intradermotubercolinizzazione comparativa per il riconoscimento degli allevamenti ufficialmente indenni da tubercolosi e per il mantenimento di tale qualifica: positiva: reazione bovina positiva, superiore di oltre 4 mm alla reazione alla tubercolina aviaria, ovvero presenza di segni clinici; dubbia: reazione bovina positiva o dubbia, superiore da 1 a 4 mm alla reazione alla tubercolina aviaria, ed assenza di segni clinici; negativa: reazione bovina negativa, ovvero reazione bovina positiva o dubbia, ma di intensita' pari o inferiore ad una reazione positiva o dubbia alla tubercolina aviaria ed assenza di segni clinici in ambedue i casi. Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione comparativa non da' esito conclusivo devono essere sottoposti ad un'altra prova a distanza di almeno quarantadue giorni. Gli animali che non risultano negativi a questa seconda prova devono essere ritenuti positivi. c) Per gli allevamenti dove siano presenti animali per i quali si ritenga che: 1) abbiano avuto una reazione dubbia ad una intradermotubercolinizzazionesingola, 2) siano risultati positivi all'intradermotubercolinizzazione singola, ma che sono in attesa di un nuovo controllo per intradermotubercolinizzazione comparativa, 3) abbiano avuto una reazione dubbia ad una intradermotubercolinizzazionecomparativa, la qualifica di allevamento ufficialmente indenne da 'tubercolosi' puo' essere sospesa fino al momento in cui sia chiarito lo stato degli animali di cui sopra. 33. Gli animali destinati al commercio intracomunitario devono essere sottoposti a intradermotubercolinizzazione singola nei trenta giorni precedenti lo spostamento; gli animali che mostrano un aumento dello spessore della piega cutanea superiore a 2 mm o la presenza di segni clinici non possono essere ammessi allo scambio intracomunitario. Gli animali provenienti dagli allevamenti di cui al par. 32, lettera c), sono esclusi dagli scambi intracomunitari fino a quando non sara' stato chiarito lo stato sanitario degli animali ivi contemplati.

Allegato C

ALLEGATO C BRUCELLOSI A. Siero-agglutinazione. 1. Il siero agglutinante tipo deve essere conforme al siero campione preparato dal Veterinary Laboratory Weybridge - Surrey, Inghilterra. L'ampolla deve contenere 1.000 unita' internazionali (UI) agglutinanti provenienti dalla liofilizzazione di 1 ml di siero bovino. 2. La fornitura del siero tipo deve essere assicurata dal Bundesgesundheitsamt, Berlino. 3. Il tasso delle agglutine brucellari di un siero deve essere espresso in unita' internazionali per ml (ad es.: siero X - 80 u.i. per ml). 4. La lettura della siero-agglutinazione lenta in tubi deve avvenire al 50% o al 75% di agglutinazione; l'antigene utilizzato dovra' essere stato titolato nelle identiche condizioni in presenza di siero tipo. 5. L'agglutinabilita' dei vari antigeni nei confronti del siero tipo deve essere compresa entro i seguenti limiti: - se la lettura e' fatta al 50%: tra 1/600 e 1/1000; - se la lettura e' fatta al 75%: tra 1/500 e 1/750. 6. Per la preparazione dell'antigene destinato alla siero- agglutinazione in tubi (metodo lento) devono essere utilizzati i ceppi Weybridge n. 99 e USDA 1119 o qualsiasi altro ceppo di sensibilita' equivalente. 7. I terreni di coltura utilizzati sia per la conservazione del ceppo nel laboratorio che per la produzione dell'antigene devono essere scelti in modo da non favorire la dissociazione batterica (S-R); si dovra' impiegare di preferenza l'agarpatata. 8. L'emulsione batterica deve essere effettuata con soluzione fisiologica (NaCI 8,5%) fenicato allo 0,5%. Non deve essere usato il formolo. 9. Si devono incaricare del controllo ufficiale degli antigeni i seguenti istituti ufficiali: a) Germania: Bundesgesundheitsamt, Berlino; b) Belgio: Institut national de recherches ve'te'rinaires, Bruxelles; c) Francia: Laboratoire central de recherches ve'te'rinaires, Alfort; d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore; e) Italia: Istituto superiore di sanita', Roma; f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam; g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn V; h) Irlanda: The Veterinary Research Laboratory Departement of Agricolture and Fisheries, Thorndale Beaumont Road, Dublin 9; i) Regno Unito: - Gran Bretagna: The Central Veterinary Labora- tory, Weybridge, Surrey England; - Island del Nord: The Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast; j) Grecia: Kthniatrikon Institoytoy Lovvdvn Kai Parasitikvn Noshmatvn 1era odow75 Auhnai 301; k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de Granada; l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria - Lisboa. 10. Gli antigeni possono essere forniti concentrati purche' il coefficiente di diluizione richiesto sia indicato sull'etichetta del flacone. 11. Per effettuare una siero-agglutinazione occorre preparare almeno tre diluizioni per ogni siero. Le diluizioni del siero sospetto devono essere affermate in modo che la lettura della reazione al limite di infezione avvenga nel tubo mediano. In caso di reazione positiva in questo tubo il siero sospetto conterra' quindi almeno la quantita' di 30 UI agglutinanti per millilitro. B. Reazione di fissazione del complemento. 1. Come siero standard vale lo stesso substandard del siero della brucellosi di cui al punto A 1 del presente allegato. Oltre alle unita' di agglutinazione internazionali (UAI), devono essere presenti in un millilitro di questo siero della brucellosi liofilizzato 1.000 unita' sensibilizzanti che fissano il complemento. Queste unita' sensibilizzanti sono denominate unita' sensibilizzanti CEE (USC). 2. La fornitura del siero standardizzato e' assicurata dal BundesgesundheitSamt di Berlino. 3. Il tenore di anticorpi che fissano il complemento, in un siero, va espresso in unita' sensibilizzanti CEE (USC) (es.: siero x = USC ml). 4. Un siero contenente in 1/ml 20 unita' sensibilizzanti CEE (il che corrisponde ad un'attivita' del 20% dell'attivita' del siero di riferimento) o piu', deve essere considerato positivo. 5. I sieri devono essere inattivati come segue: a) bovini: 56 - 60C per 30-50 minuti; b) suini: 60C per 30-50 minuti. 6. Per la produzione dell'antigene si devono usare i ceppi Weybridge n. 99 o USDA 1119. L'antigene e' costituito da un'emulsione batterica in soluzione fisiologica allo 0,85% o in soluzione tampone veronal. 7. Per la reazione si deve usare una dose di complemento che sia maggiore della dose minima necessaria per una emolisi totale. 8. Nell'esecuzione della reazione, si devono effettuare ogni volta i seguenti controlli: a) controllo dell'effetto anticomplementare del siero; b) controllo dell'antigene; c) controllo delle emazie sensibilizzate; d) controllo del complemento; e) controllo di sensibilita' della reazione con l'aiuto di un siero positivo; f) controllo della specificita' della reazione con l'aiuto di un siero negativo. 9. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri standard e degli antigeni sono affidati agli organismi di cui al punto A 9 del presente allegato. 10. Gli antigeni possono essere forniti in forma concentrata, purche' sull'etichetta sia indicato il coefficiente di diluizione necessario. C. Prova dell'anello (Ring Test). 1. La prova dell'anello deve essere effettuata sul contenuto di ogni bidone di latte o sul contenuto di ogni grande contenitore dell'azienda. 2. L'antigene tipo da impiegare deve provenire da uno degli istituti elencati al punto A 9, lettere da a) a j). Si raccomanda di impiegare antigeni standardizzati secondo le raccomandazioni dell'OMS/FAO. 3. L'antigene puo' essere colorato solo con ematossilina o tetrazolo; occorre dare la preferenza all'ematossilina. 4. Se non sono utilizzati metodi di conservazione, la reazione deve essere effettuata tra la 18a e la 24a ora successiva alla mungitura. Qualora la prova sul latte debba essere effettuata oltre 24 ore dopo il prelievo del campione, si devono adottare sistemi di conservazione. Come conservanti si possono utilizzare il formolo o il cloruro mercurico; in tal caso, la prova deve essere effettuata entro 14 giorni successivi al giorno in cui e' stato prelevato il campione. In caso di utilizzazione del formolo, la concentrazione finale nel campione di latte deve essere dello 0,2%; la proporzione tra la quantita' del latte e la soluzione di formolo da aggiungere deve essere almeno di 10 a 1. Al posto del formolo si puo' utilizzare il cloruro mercurico; anche in tal caso la concentrazione finale nel latte deve essere dello 0,2% e la proporzione tra la quantita' di latte e la soluzione del cloruro mercurico da aggiungere, di 10 a 1. 5. La reazione deve essere effettuata secondo uno dei seguenti metodi: - su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,03 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,05 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su un volume di latte di 8 ml cui sono stati aggiunti 0,08 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 2 ml cui sono aggiunti 0,05 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati. 6. La miscela di latte e di antigeni deve essere tenuta in termostato a 37 C per almeno 45 e al massimo per 60 minuti. La prova deve essere valutata entro 15 minuti dalla rimozione della soluzione dal termostato. 7. La reazione deve essere valutata secondo il seguente criterio: a) reazione negativa: latte colorato, crema decolorata; b) reazione positiva: latte e crema colorati in modo identico o latte decolorato e crema colorata. D. Prova dell'antigene di Brucella tamponato. La prova all'antigene di Brucella tamponato puo' essere effettuata secondo uno dei seguenti metodi: A. METODO MANUALE. 1. Come siero standard e' impiegato il secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus, fornito dal Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey, Inghilterra. 2. L'antigene e' preparato senza riferimento alla concentrazione delle cellule, ma la sua sensibilita' deve essere standardizzata rispetto al secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus, in modo tale che l'antigene dia reazione positiva con un siero diluito 1:47,5 e reazione negativa con un siero diluito 1:55. 3. L'antigene deve essere sospeso in diluente per l'antigene di Brucella tamponato a pH 3,65 (Piu' o Meno) 0,5, e puo' essere stato colorato mediante rosa Bengala. 4. Per la preparazione dell'antigene devono essere utilizzati il ceppo Weybridge n. 99 oppure l'USDA 1119 o qualunque altro ceppo di sensibilita' equivalente. 5. I terreni di coltura impiegati per la conservazione del ceppo in laboratorio e per la produzione dell'antigene devono essere tali da non provocare la dissociazione batterica (S-R); sono raccomandabili il terreno agarpatata oppure i metodi di coltura continua. 6. L'antigene deve essere controllato nei confronti di 8 sieri liofilizzati riconosciuti rispettivamente positivi e negativi. 7. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri e degli antigeni standard sono effettuati dagli organismi ufficiali elencati nell'allegato C, punto A 9. 8. L'antigene deve essere fornito pronto per l'uso. 9. La prova dell'antigene di Brucella tamponato deve essere effettuata nel modo seguente: a) porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia (0,03 ml) del siero su una piastra bianca; b) mescolare con un agitatore, prima di linea retta, poi tracciando dei cerchi del diametro di 10-12 mm circa; c) agitare la piastra alternativamente per 4 minuti (circa 30 movimenti al minuto); d) effettuare la lettura della prova in buone condizioni d'illuminazione: in mancanza di agglutinazione la prova sara' considerata negativa; qualsiasi grado di agglutinazione va considerato positivo, salvo quando appare chiara un'eccessiva essiccazione intorno ai margini. B. METODO AUTOMATIZZATO. Il metodo automatizzato deve essere sensibile ed esatto almeno quanto il metodo manuale. E. Prova dell'anello di latte, effettuata su plasma sanguigno. A. PRELIEVO DEL PLASMA SANGUIGNO. Le provette con il sangue teso non coagulabile mediante aggiunta di EDTA sono centrifugate per 3 minuti a 3000 giri al minuto e poi conservate per 12-24 ore a 37 C. B. IMPOSTAZIONE DIAGNOSTICA. Si versano 0,2 di plasma stabilizzato in una provetta contenente 1 ml di latte crudo. Dopo aver agitato, si aggiunge una goccia (0,05 ml) di antigene ABR e si agita nuovamente. L'antigene e' standardizzato rispetto ad un antigene standard messo a disposizione dall'istituto menzionato al punto A 9 a). Dopo aver lasciato riposare per 45 minuti ad una temperatura di 37 C, si esamina il risultato entro 15 minuti. La prova e' considerata positiva se l'anello di latte ha la stessa colorazione o una colorazione piu' pronunciata di quella della colonna di latte. F. Agglutinazione del plasma sanguigno. Il plasma sanguigno ottenuto conformemente al metodo di cui alla sezione E, punto A, puo' essere utilizzato immediatamente dopo centrifugazione senza che sia necessario procedere alla stabilizzazione termica. Si mescolano 0,05 ml di plasma con 1 ml di antigene per la sieroagglutinazione al 50%, il che corrisponde ad un titolo di diluizione 1:20 nel caso della sieroagglutinazione. Si esamina il risultato dopo aver lasciato riposare per 18-24 ore alla temperatura di 37 C. La prova e' considerata positiva se l'aggiudicazione e' uguale o superiore al 50%. G. Prova di microagglutinazione. 1. Il diluente e' preparato da una soluzione salina fisiologica 0,85% fenicata allo 0,5%. 2. L'antigene preparato nel modo descritto nei punti 6,7 e 8 dell'allegato C, punto A, e titolato nel modo descritto al punto A5 dell'allegato C. Al momento dell'uso dell'antigene si aggiunge safranina 0 alla 0,02% (diluizione finale). 3. Il siero standard e' lo stesso siero di cui al punto A1 dell'allegato C. 4. La fornitura del siero standard e' assicurata dal Bundesgesundheitsamt di Berlino. 5. La prova di microagglutinazione utilizza piastre fornite di pozzetti a fondo conico e della capacita' di 0,250 ml. La prova viene eseguita nella maniera seguente: a) prediluizioni dei sieri: a ciascun pozzetto di una piastra contenente 0,075 ml di diluente si aggiungono 0,050 ml di ogni siero in esame. Le mescolanze vengono agitate per 30 secondi. b) Diluizioni scalari dei sieri: per ogni siero preparare almeno tre diluizioni. A tale scopo a partire dalle prediluizioni (1:2,5) si prelevano 0,025 ml di ciascun siero e si trasferiscono su una piastra contenente 0,025 ml di diluizione. In tal modo la prima diluizione viene portata dal valore di 1:5 e le successive vengono eseguite per raddoppio. c) Aggiunta dell'antigene: nei singoli pozzetti contenenti le diverse diluizioni dei sieri in esame si aggiunge antigene in volume di 0,025 ml. Previa agitazione per 30 secondi le piastre vengono chiuse con i rispettivi coperchi e poste a 37 C per 20-24 ore in atmosfera umidificata. d) Lettura dei risultati: si valuta il quadro della sedimentazione dell'antigene mediante esame del fondo del pozzetto riflesso da uno specchio concavo posto al di sotto di esso. Nel caso di prova negativa l'antigene sedimenta sotto forma di un bottone compatto, a margini netti e di colore rosso intenso. In caso di positivita' si forma invece un velo diffuso, di colorito rosa ed uniformemente distribuito. Le diverse percentuali di agglutinazione vengono determinate per raffronto con controlli dell'antigene indicanti 0,25, 50, 75 e 100% di agglutinazione. Il titolo di ciascun siero viene espresso in UIA/ml. Nella prova e' opportuno inserire controlli costituiti da siero negativo e siero positivo diluito in modo da contenere 30 UIA/ml. H. Il saggio ELISA per la brucellosi bovina come descritto all'allegato G.

Allegato D

ALLEGATO D ANALISI DEL LATTE 1. Tutte le analisi del latte devono essere effettuate in laboratori ufficialmente autorizzati. 2. I campioni di latte devono essere prelevati osservando le seguenti condizioni: a) i capezzoli devono essere disinfettati precedentemente con alcool al 70%; b) durante la riempitura i tubi devono essere mantenuti in posizione iclinata; c) i campioni di latte devono essere prelevati all'inizio della mungitura, dopo l'eliminazione dei primi getti di ogni capezzolo; d) un campione dev'essere prelevato su ogni quarto mammario; il latte di tali campioni non puo' essere mescolato; e) ogni campione deve comportare almeno 10 ml di latte; f) qualora sia necessario un conservativo, si dovra' impiegare l'acido borico allo 0,5%; g) ogni tubo dev'essere munito di etichetta comprendente le seguenti indicazioni: il numero del contrassegno auricolare o qualsiasi altro mezzo d'identificazione dell'animale; la designazione del quarto mammario; la data e l'ora del prelevamento; h) i campioni devono essere accompagnati da un documento contenente le seguenti indicazioni: il nome e l'indirizzo del veterinario ufficiale; il nome e l'indirizzo del proprietario; gli elementi di identificazione dell'animale; lo stadio di lattazione. 3. L'analisi del latte dev'essere praticata non oltre 30 giorni prima del carico e deve sempre comportare un esame batteriologico nonche' un White Side Test (WST) o un California-Mastiris-Test (CMT). I risultati di ambedue gli esami devono essere negativi, fatte salve le seguenti disposizioni: a) se il risultato dell'esame batteriologico e' positivo - anche in mancanza di uno stato infiammatorio caratteristico - mentre il risultato del WST o del CMT e' negativo, deve essere effettuato un secondo esame batteriologico almeno quaranta giorni dopo - entro il termine di trenta giorni summenzionato. Questo secondo esame deve stabilire: aa) la scomparsa dei germi patogeni; bb) l'assenza di antibiotici. Inoltre, l'assenza di uno stato infiammatorio deve essere accertata da un nuovo WST (o un nuovo CMT) che deve dare risultato negativo; b) qualora il risultato dell'esame batteriologico sia negativo, mentre il WST (o CMT) e' positivo, si deve procedere ad un esame citologico completo che deve dare risultato negativo. 4. L'esame batteriologico deve comportare: a) l'inseminazione del latte, su agar con sangue di bue o di montone in piastre di Petri; b) l'inseminazione del latte in terreno TKT o in terreno di Edwars. L'esame batteriologico ha lo scopo di identificare qualsiasi germe patogene e non puo' essere limitato a mettere in evidenza streptococchi e stafilococchi specificamente patogeni. A tale scopo, l'identificazione delle colonie sospette, ottenute mediante inseminazione sui terreni suddetti, deve essere effettuata mediante le classiche tecniche batteriologiche di differenziazione, quali l'uso del terreno di Chapman per l'identificazione dei stafilococchi e di vari terreni selettivi per l'isolamento degli enterobatteri. 5. L'esame citologico completo e' destinato a mettere in evidenza, eventualmente, uno stato infiammatorio caratteristico, indipendentemente da qualsiasi sintomo clinico. Questo stato infiammatorio viene rilevato quando la numerazione leucocitaria secondo la tecnica di Breed raggiunge 1 milione di leucociti per ml e il rapporto tra mononucleati e polinucleati e' inferiore a 0,5.

Allegato E

ALLEGATO E Sono sogette a denuncia obbligatoria le malattie seguenti: a) Malattie della specie bovina: rabbia; tubercolosi; brucellosi; afta epizootica; carbonchio ematico; peste bovina; pleuropolmonite; leucosi bovina enzootica. b) Malattie della specie suina: rabbia; brucellosi; carbonchio ematico; afta epizootica; paralisi contagiosa dei suini (morbo di Teschen); peste suina; malattia vescicolosa dei suini; peste suina africana.

Allegato F

ALLEGATO F (3) (5) (6) MODELLO I Certificato sanitario (1) per gli scambi tra gli Stati membri della CEE - Bovini da allevamento o da produzione - N. ............. Paese speditore: .................................................. Ministero competente: .............................................. Servizio territoriale competente: .................................. I. Numero di animali: .............................................. II. Identificazione degli animali.

Numero degli animali Vacca, toro, bue, giovenca, vitello Razza Eta' Contrassegni ufficiali, altri contrassegni o dati segnaletici (indicare numero e posto)

III. Provenienza degli animali. Gli animali hanno soggiornato almeno 3 mesi prima del giorno del carico o sin dalla nascita nel territorio dello Stato membro speditore. IV. Destinazione degli animali. Gli animali saranno spediti: da ............................................................ (Luogo di spedizione) a ............................................................ (Paese e luogo di destinazione) a mezzo di (2): ferrovia (3), autocarro (3), aereo (3), nave (3). Nome e indirizzo dello speditore: .............................. .................................................................... Nome e indirizzo del destinatario: .............................. .................................................................... V. Informazioni sanitarie. Il sottoscritto certifica che gli animali sopraindicati rispondono alle seguenti certificazioni: a) sono stati esaminati in data odierna e non presentano alcun sintomo clinico di malattia; b) ( 4 )- sono stati vaccinati entro i termini prescritti di almeno quindici giorni e non piu' di 4 mesi ( 5 ) contro i tipi A, O e C del virus aftoso con un vaccino inattivato, ufficialmente autorizzato e controllato (2 ); - sono stati rivaccinati contro i tipi A, O e C del virus aftoso negli ultimi dodici mesi (5) con un vaccino inattivato, ufficialmente autorizzato e controllato (2); - non sono stati vaccinati contro l'afta epizootica (2); c) provengono da un allevamento bovino ufficialmente indenne da tubercolosi. Il risultato dell'intradermotubercolinizzazione praticata nel termine prescritto di trenta giorni (5) e' stato negativo (2) (7); d) - provengono da un allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi (2 ); - provengono da un allevamento bovino indenne da brucellosi (2); - non provengono ne' da un allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi ne' da un allevamento bovino indenne da brucellosi (2) (10). La sieroagglutinazione praticata nel termine prescritto di trenta giorni (5), ha rivelato un tasso brucellare inferiore a trenta unita' internazionali agglutinanti per millilitro (2) (8). e) - sono stati mantenuti negli ultimi dodici mesi (5) o sedi eta' inferiore a dodici mesi, dalla nascita, in un allevamento in cui, nel corso degli ultimi tre anni (5), ha conoscenza del sottoscritto e secondo le assicurazioni date dal proprietario, non e' stato accertato alcun caso di leucosi bovina enzootica (2) (12); - provengono da un allevamento in cui nulla ha consentito di desumere l'esistenza di casi di leucosi bovina enzootica (2); - alla data dell'esame, tutti i bovini dell'allevamento di eta' superiore a ventiquattro mesi sono stati sottoposti (2) (12) nel corso degli ultimi 12 mesi (5) con risultato negativo, ad un esame sierologico (10); - hanno reagito negativamente (2) (9) (11) entro il termine prescritto di trenta giorni (5) ad esame sierologico (10) per la ricerca della leucosi bovina enzootica; - sono stati destinati all'ingrasso (2); f) non presentano alcun sintomo clinico di mastite; l'analisi - la seconda analisi (2) - del latte praticata nel termine prescritto di trenta giorni (5) non ha rivelato ne' uno stato infiammatorio caratteristico, ne' germi patogeni specifici, ne' inoltre - nel caso di una seconda analisi - la presenza di antibiotici (2) (8); g) non si tratta di animali che debbono essere eliminati nel quadro di un programma nazionale di eradicazione delle malattie contagiose; h) negli ultimi trenta giorni (5) hanno soggiornato in un'azienda situata nel territorio dello Stato membro speditore, nella quale non e' stata constatata ufficialmente, durante detto periodo, alcuna delle malattie contagiose dei bovini soggette a denuncia obbligatoria ai sensi delle disposizioni applicabili agli scambi intracomunitari. L'azienda e' inoltre situata al centro di una zona indenne da epizoozia e, secondo costatazioni ufficiali, e' risultata essere indenne, negli ultimi tre mesi (5), da afta epizootica e da brucellosi bovina; i) essi sono stati acquistati: - presso un'azienda (2), - su un mercato di animali da allevamento o da produzione autorizzato ufficialmente per la spedizione verso un altro Stato membro.............................. (2); (Designazione del mercato) j) sono stati trasportati direttamente passando - senza passare (2 ) - per un luogo di raccolta: - dall'azienda (2); - dall'azienda al mercato e da questo (2) sul luogo esatto di carico senza entrare in contatto con animali biungulati che non fossero animali da allevamento o da produzione delle specie bovina e suina rispondenti alle condizioni previste per gli scambi intracomunitari, impiegando mezzi di trasporto e di contenzione previamente puliti e disinfettati con un disinfettante ufficialmente autorizzato. Il luogo esatto in cui avviene il carico e' situato al centro di una zona indenne da epizoozia. VI. Il consenso necessario per quanto riguarda: - il punto V, lettera b), secondo termine dell'alternativa (2), - il punto V, lettera b), terzo termine dell'alternativa (2), - il punto V, lettera d), secondo termine dell'alternativa (2), - il punto V, lettera d), terzo termine dell'alternativa (2), e' stato dato dal: - Paese destinatario (2), - Paese destinatario e da quelli di transito (2). VII. La validita' del presente certificato e' di dieci giorni a decorrere dalla data di carico Fatto a .............................., addi' .................... (Giorno del carico) Timbro (Firma) ........................................................ Nome in lettere maiuscole e qualifica del firmatario (1) (1) Ciascun certificato sanitario deve riferirsi al numero di animali trasportati in uno stesso carro ferroviario, autocarro, aereo o nave, provenienti dalla stessa azienda e aventi lo stesso destinatario. (2) Cancellare l'indicazione se essa e' inutile o in caso di deroga. (3) Per i carri ferroviari e gli autocarri indicare il numero di immatricolazione, per gli aerei il numero di volo e per le navi il nome. (4) In Belgio "Inspecteur veterinaire" oppure "Inspecteur Dierenarts"; in Francia "Directeur des services veterinaires du departement"; in Germania "Beamteter Ticrarzt"; in Italia "Veterinario provinciale"; nel Lussemburgo "Inspecteur veterinaire"; nei Paesi Bassi: "Inspecteur districtshoofd"; in Danimarca: "Autoriseret Dyrlaged"; in Irlanda "Veterinary Inspector"; nel Regno Unito "Veterinary Inspector"; in Spagna: "Inspector veterinario; in Portogallo: " Inspector Veterinario"; in Grecia: (Dicitura in lingua greca) (5) Il termine e' riferito al giorno del carico. (6) L'indicazione e' necessaria solo per i bovini di eta' superiore a quattro mesi. (7) L'indicazione e' necessaria solo per i bovini di eta' superiore a sei settimane. (8) L'indicazione e' necessaria solo per i bovini di eta' superiore a dodici mesi, salvo che non si tratti di bovini di cui alla nota (10). (9) L'indicazione e' necessaria solo per le vacche lattifere. (10) Questa deroga e' possibile solo per i bovini di eta' inferiore a trenta mesi, alla condizione che sul corpo di tali animali sia marcato un contrassegno speciale e che essi siano sorvegliati in modo speciale nel Paese destinatario. (11) Questa eccezione e' consentita solo per gli animali maschi di eta' inferiore a trenta mesi destinati all'ingrasso, sempreche' tali animali rechino un contrassegno distintivo e siano sottoposti ad un controllo particolare nel Paese di destinazione. (12) L'esame sierologico e' stato effettuato conformemente all'allegato G della direttiva 64/422/CEE. MODELLO II Certificato sanitario (1 ) per gli scambi tra gli Stati membri della CEE - Bovini da macello (2) - N. .................. Paese speditore: .................................................. Ministero competente: .............................................. Servizio territoriale competente: .................................. I. Numero di animali: .............................................. II. Identificazione degli animali.

Numero degli animali Vacca, toro, bue, giovenca, vitello Contrassegni ufficiali, altri contrassegni o dati segnaletici (indicare numero e posto)

III. Provenienza degli animali. Gli animali hanno soggiornato almeno 3 mesi prima del giorno del carico o sin dalla nascita nel territorio dello Stato membro speditore. IV. Destinazione degli animali. Gli animali saranno spediti: da ............................................................ (Luogo di spedizione) a ............................................................ (Paese e luogo di destinazione) a mezzo di (3): ferrovia (4), autocarro (4), aereo (4), nave (4). Nome e indirizzo dello speditore: .............................. .................................................................... Nome e indirizzo del destinatario: .............................. .................................................................... V. Informazioni sanitarie. Il sottoscritto certifica che gli animali sopraindicati rispondono alle seguenti condizioni: a) sono stati esaminati in data odierna e non presentano alcun sintomo clinico di malattia; b) (6) - sono stati vaccinati entro i termini prescritti di almeno quindici giorni e non piu' (7) di dodici mesi; quattro mesi, contro i tipi A, O e C del virus aftoso con un vaccino inattivato, ufficialmente autorizzato e controllato (3); - non sono stati vaccinati contro l'afta epizootica (3); c) (6) - provengono da un allevamento bovino ufficialmente indenne da tubercolosi (3 ); - non provengono da un allevamento bovino ufficialmente indenne da tubercolosi; la intradermorubercolinizzazione praticata nel termine prescritto di trenta giorni (7) e' risultata negativa (3); d) (6) - provengono da un allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi o da un allevamento bovino indenne da brucellosi (3); - non provengono ne' da un allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi, ne' da un allevamento bovino indenne da brucellosi; la sieroagglunitazione, praticata nel termine prescritto di trenta giorni (7), ha rivelato un tasso brucellare: - inferiore a 30 Ul/ml (3), - di 30 Ul/ml o piu' (3); e) non si tratta di animali che debbono essere eliminati nel quadro di un programma nazionale di eradicazione delle malattie contagiose; f) non provengono ne' da un'azienda ne' da una zona situata nel territorio dello Stato membro speditore che, per la specie bovina, sono oggetto di misure di divieto per motivi di polizia sanitaria ai sensi della direttiva del Consiglio relativa a problemi di polizia sanitaria in materia di scambi intracomunitari di animali delle spe- cie bovina e suina; g) sono stati acquistati: - in un'azienda (3); - su un mercato di animali da macello autorizzato ufficialmente per la spedizione verso un altro Stato membro............ (3); h) sono stati trasportati direttamente passando - senza passare (3 ) - per un luogo di raccolta: - dall'azienda (3); - dall'azienda al mercato e da questo (3), sul luogo esatto di carico, senza entrare in contatto con animali biungulati che non fossero animali da macello delle specie bovina e suina rispondenti alle condizioni previste per gli scambi intracomunitari, impiegando mezzi di trasporto e di contenzione previamente puliti e disinfettati con un disinfettante ufficialmente autorizzato. Il luogo esatto in cui avviene il carico e' situato al centro di una zona indenne da epizoozia. VI. (6) Se del caso, l'accordo necessario concernente: - il punto V, lettera b), secondo trattino (3); - il punto V, lettera d) (tasso brucellare di 30 Ul/ml o piu') (3), e' stato dato dal - Paese destinatario (3), - Paese destinatario e Paesi di transito (3). VII. La validita' del presente certificato e' di dieci giorni a decorrere dalla data di carico Fatto a................................., addi'................... (Giorno del carico) Timbro ....................................................... (Firma) Nome in lettere maiuscole e qualifica del firmatario (1) (1) Ciascun certificato sanitario deve riferirsi al numero di animali trasportati in uno stesso carro ferroviario, autocarro, aereo o nave, provenienti dalla stessa azienda e aventi lo stesso destinatario. (2) Bovini da macello: bovini destinati, subito dopo il loro arrivo nel paese destinatario, ad essere condotti direttamente al macello o a un mercato. (3) Cancellare l'indicazione se essa e' inutile o in caso di deroga. (4) Per i carri ferroviari e gli autocarri indicare il numero di immatricolazione, per gli aerei il numero del volo e per le navi il nome. (5) In Belgio "Inspecteur ve'te'rinaire" oppure "Inspecteur Dierenarts"; in Francia "Directeur des services ve'te'rinaires du de'partement"; in Germania "Deamteter Tierarzt"; in Italia "Veterinario provinciale"; nel Lussemburgo "Inspecteur ve'te'rinaire"; nei Paesi Bassi: "Inspecteur districtshoold"; in Danimarca: "Autoriseret Dyrlaged"; in Irlanda "Veterinary Inspector"; nel Regno Unito "Veterinary Inspector"; in Grecia: O Pro/'sta'menow th(Paragrafo)w Kthniatrikhw(Paragrafo) (Esponenziale)Yphres/'aw toy(Paragrafo) shme/'oy ejo'doy"; in Spagna: "Inspector Veterinario"; in Portogallo: "Inspector veterina'rio". (6) Per i vitelli di eta' inferiore a quattro mesi non devono essere fornite le indicazioni del punto V, lettere b), c) e d), del precedente certificato. (7) Il termine si riferisce al giorno del carico. MODELLO III Certificato sanitario (1) per gli scambi tra gli Stati membri della CEE - Suini da allevamento o da produzione - N. ............. Paese speditore: .................................................. Ministero competente: .............................................. Servizio territoriale competente: .................................. I. Numero di animali: .............................................. II. Identificazione degli animali.

Numero degli animali Vacca, toro, bue, giovenca, vitello Razza Eta' Contrassegni ufficiali, altri contrassegni o dati segnaletici (indicare numero e posto)

Numero degli animali Suini o , suinetti Contrassegni ufficiali, altri contrassegni o dati segnaletici (indicare numero e posto)

Allegato G

ALLEGATO G Capitolo I ALLEVAMENTI, STATI MEMBRI O REGIONI INDENNI DA LEUCOSI BOVINA ENZOOTICA A. Allevamento indenne da leucosi bovina enzootica. 1) Un allevamento nel quale: i) nessun caso di leucosi bovina enzootica sia stato constatato, clinicamente oppure come risultato degli esami effettuati conformemente al capitolo II, ne' confermato nel corso degli ultimi due anni; e ii) tutti gli animali di eta' superiore ai ventiquattro mesi abbiano, nel corso dei precedenti dodici mesi, reagito negativamente a due esami praticati conformemente al presente allegato ad un intervallo di almeno quattro mesi; e iii) al termine degli esami di cui al sottopunto ii), si trovino unicamente gli animali nati in detto allevamento o che provengano da un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica; e nel quale, dopo la sua qualifica, gli animali di piu' di ventiquattro mesi abbiano continuato a reagire negativamente ad uno degli esami praticati conformemente al capitolo II ad un intervallo di tre anni e le condizioni previste ai punti i) e iii) continuino ad essere soddisfatte. 2) Un allevamento situato in uno Stato membro o in una regione indenne da leucosi bovina enzootica. B. Stato membro o regione indenne da leucosi bovina enzootica. Uno Stato membro o una regione ai sensi dell'art. 2, lettera o), di tale Stato membro: 1) nel quale o nella quale: a) almeno il 99,8% degli allevamenti bovini siano indenni da leucosi bovina enzootica ai sensi della lettera s), oppure b) da un lato, durante gli ultimi cinque anni precedenti la data di notifica della presente direttiva o durante gli ultimi tre anni successivi a tale data, non sia stato notificato ne' confermato in alcun modo un caso di leucosi bovina enzootica e, dall'altro, nel corso degli ultimi due anni, i) i controlli estemporanei praticati in tutto il territorio conformemente al capitolo II, effettuati per un periodo di due anni su tutti gli animali di eta' superiore ai ventiquattro mesi in almeno il 10% degli allevamenti abbiano dato risultati negativi; e ii) tutti gli animali di eta' superiore ai ventiquattro mesi abbiano reagito negativamente almeno una volta ad uno degli esami di cui al capitolo II; 2) nel quale o nella quale, dopo aver soddisfatto le condizioni di cui al punto 1): i) ogni anno, un campione a caso con un tasso di certezza del 99% abbia dimostrato che meno dello 0,2% degli allevamenti era stato infettato, oppure almeno il 20% di bovini di eta' superiore ai due anni abbia reagito negativamente ad uno degli esami praticati in conformita' del capitolo II, e ii) siano sempre soddisfatti i requisiti di cui al punto A 1). C. Sospensione della qualifica di indennita' dopo l'insorgere della leucosi. 1. Se in un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica un animale ha reagito positivamente ad uno degli esami di cui al punto ii) viene sospesa la qualifica di tale allevamento fino a quando non vengano adottate le seguenti misure: i) l'animale che ha reagito positivamente e, se si tratta di una vacca, l'eventuale vitello debbono abbandonare l'allevamento ed essere macellati sotto il controllo delle autorita' veterinarie; ii) gli altri animali debbono essere sottoposti ad un esame sierologico individuale, che deve dare un risultato negativo, effettuato conformemente al capitolo II almeno tre mesi dopo l'eliminazione dell'animale positivo e della sua eventuale discendenza; iii) un'indagine epidemiologica deve essere svolta e gli allevamenti epidemiologicamente collegati all'allevamento infetto debbono essere sottoposti alle misure di cui al punto ii). Tuttavia, l'autorita' competente puo' concedere una deroga all'obbligo della macellazione del vitello di una vacca infetta, qualora il vitello sia stato separato dalla madre dopo il parto. In questo caso il vitello e' sottoposto ai requisiti di cui al punto 2) ii). 2) Se piu' di un animale di un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica ha reagito positivamente, viene sospesa la qualifica di tale allevamento fino a quando non vengano adottate le seguenti misure: i) gli animali infetti e, se si tratta di vacche infette - salvo deroga concessa dall'autorita' competente a norma del punto 1) iii), secondo comma -, i loro eventuali vitelli devono abbandonare l'allevamento ed essere macellati sotto il controllo delle autorita' veterinarie; ii) gli altri animali - compresi eventualmente i vitelli degli animali infetti - di eta' inferiore a sei mesi debbono, previa identificazione, restare nell'azienda fino a quando non siano soddisfatte le condizioni relative agli esami di cui al punto A 1) ii); iii) l'allevamento deve restare sotto controllo ufficiale fino a quando non siano nuovamente soddisfatte le condizioni di cui ai punti A 1) ii) e iii); iv) d'evessere effettuata un'indagine epidemiologica e gli allevamenti epidemiologicamente collegati all'allevamento infetto debbono essere sottoposti alle misure di cui al punto A 1) ii). 3) Se la leucosi bovina enzootica e' stata constatata e confermata su piu' dello 0,2% degli allevamenti della regione o dello Stato membro, viene sospesa la loro qualifica e, oltre alle misure di cui al punto 1) o 2), il 20% degli altri allevamenti della regione o dello Stato membro deve essere soggetto ad uno degli esami di cui al capitolo II, entro i termini fissati al punto A 1) ii). La qualifica viene ripristinata in caso di risultato negativo di tali esami. Capitolo II ESAMI PER LA RICERCA DELLA LEUCOSI BOVINA ENZOOTICA La ricerca della leucosi bovina enzootica e' effettuata mediante un'esame di immunodiffusione come descritto nelle lettere A e B o meidante un saggio di immunoassorbimento anzimatico (ELISA) come descritto nella lettera C. L'esame di immunodiffusione e' effettuato solo in esami individuali. In caso di contestazione debitamente motivata del risultato degli esami, si effettua un controllo complementare mediante un esame di immunodiffusione. A. Reazione di immunodiffusione su gel di agar. 1. L'antigene da impiegare nella prova deve contenere glicoproteine del virus della leucosi bovina. Esso va standardizzato rispetto a un siero di riferimento (siero E 1) fornito dal laboratorio sierologico veterinario statale danese di Copenaghen. 2. La responsabilita' della standardizzazione degli antigeni di laboratorio rispetto al siero ufficiale CEE di riferimento (siero E 1) fornito dal laboratorio sierologico veterinario di Stato di Copenaghen e' affidata ai seguenti istituti: a) Germania: Bundesforschungsanstaltfur Viruskrankheiten der Tiere - Tubingen; b) Belgio: Institut national de recherches veterinaires, Bruxelles; c) Francia: Laboratoire national des medicamentes veterinaires, Fouge'res; d) Granducato di Lussemburgo; e) Italia: Istituto zooprofilattico sperimentale, Perugia; f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam; g) Danimarca: Statens Veterinare Serumlaboratorium, Kobenhavn; h) Irlanda: Veterinary Research Laboratory, Abborstown, Dublin; i) Regno Unito; 1) Gran Bretagna: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge, England; 2) Irlanda del Nord: The Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast; j) Spagna: Subdireccion general de sanidad animal. Laboratorio de sanidad i produce animal Algete (Madrid). k) Portogallo: Laboratorio Nacional de Investigacao Veterinaria, Lisboa. 3. Gli antigeni standard di laboratorio devono essere presentati almeno una volta all'anno ai laboratori di riferimento CEE elencati al paragrafo 2 per essere esaminati in rapporto al siero CEE. Indipendentemente da detta standardizzazione, l'antigene in uso puo' essere standardizzato secondo la tecnica descritta alla lettera B. 4. I reattivi da impiegare sono i seguenti: a) antigene: esso dovra' contenere le glicoproteine specifiche del virus della leucosi bovina enzootica standardizzato rispetto al siero ufficiale CEE; b) siero in esame; c) siero di controllo riconosciuto positivo; d) gel di agar 0,8% di agar 8,5 di NaCl tampone Tris 0,05 M a pH 7,2; versare 15 ml di questo terreno in una scatola Petri del diametro di 85 mm, in modo da ottenere uno strato dello spessore di 2,6 mm. 5. Nell'agar sul fondo della scatola ricavare sette pozzetti, esenti da umidita' e distribuiti come segue: un pozzetto centrale e 6 pozzetti disposti in cerchio attorno ad esso; diametro del pozzetto centrale: 4 mm, diametro dei pozzetti periferici: 6 mm, distanza fra il pozzetto centrale e i pozzetti periferici: 3 mm. 6. Riempire il pozzetto centrale con l'antigene standard, i pozzetti periferici 1 e 4 (vedi lo schema) con un siero riconosciuto come positivo e i pozzetti 2, 3, 5 e 6 con i sieri in esame. Il riempimento va effettuato fino a scomparsa del menisco. Parte di provvedimento in formato grafico 7. Le quantita' di reattivi da impiegare sono dunque le seguenti: antigene: 32 microlitri, siero di controllo: 73 microlitri, sieri in esame: 73 microlitri. 8. Incubare per 72 ore a temperatura ambiente (20-27 C), in atmosfera confinata ed umida. 9. La lettura puo' essere effettuata dopo 24 e 48 ore, ma non e' possibile ottenere il risultato finale prima di 72 ore. a) Il siero in esame e' positivo se forma una linea specifica di precipitine con l'antigine del virus della LBE e una linea completa di identita' con il siero di riferimento; b) il siero in esame e' negativo se non forma una linea specifica di precipitazione con l'antigene della LBE e se non provoca l'incurvamento della linea del siero di riferimento; c) la reazione e' considerata non conclusiva: i) se la linea del siero di riferimento si incurva verso l'antigene della LBE senza formare con l'antigene una linea di precipitine visibile, ovvero ii) se non puo' essere, interpretata come negativa o positiva. Quando la reazione non e' conclusiva, la prova puo' essere ripetuta e puo' essere impiegato siero concentrato. B. Metodo per la standardizzazione dell'antigene. Soluzioni e materiali necessari: 1. 40 ml di agarosio all'1,6% in tampone Tris/HC1 0,05m a pH 7,2, contenente l'8,5% di NaCl; 2. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:10 in tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl; 3. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:5 in tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl; 4. 4 scatole Petri in plastica, del diametro di 85 mm; 5. un punzone del diametro di 4-6 mm; 6. antigene di riferimento; 7. antigene da standardizzare; 8. bagnomaria (56 C). Modo da operare: Sciogliere l'agarosio (1,6%) nel tampone Tris/HCI, riscaldando cautamente a 100 C. Mettere in bagnomaria a 56 C per circa 1 ora. Porre in bagnomaria a 56 C anche le deluizioni di siero della leucosi bovina. Mescolare 15 ml della soluzione di agarosio a 56 C con 15 ml di siero della leucosi bovina (1:10), agitare rapidamente e versare due porzioni da 15 ml della miscela in due scatole Petri. Ripetere il procedimento con il siero della leucosi bovina diluito 1:5. Quando l'agarosio si e' solidificato, praticare i pozzetti secondo il seguente schema: Parte di provvedimento in formato grafico Aggiunta di antigene I. Scatole Petri 1 e 3: pozzetto A - antigene di riferimento non diluito, pozzetto B - antigene di riferimento, diluito 1:2, pozzetto C + E - antigene di riferimento, pozzetto D - antigene da controllare, non diluito. II. Scatole Petri 2 e 4: pozzetto A - antigene in esame, non diluito, pozzetto B - antigene in esame, diluito 1:2, pozzetto C - antigene in esame, diluito 1:4, pozzetto D - antigene in esame, diluito 1:8. Istruzioni complementari 1. Per realizzare una precipitazione ottimale, l'esperimento va effettuato con due diluizioni di siero (1:5 e 1:10). 2. Se il diametro di precipitazione e' troppo piccolo ad ambedue le diluizioni, il siero va ulteriormente diluito. 3. Se la precipitazione per ambedue le diluizioni e' indistinta e il diametro e' troppo grande, per il siero va scelta una diluizione inferiore. 4. La concentrazione finale dell'agarosio deve essere dello 0,8%; quella dei sieri deve essere rispettivamente del 5% e del 10%. 5. Riportare i diametri misurati sull'accluso sistema di assi coordinati. La diluzione di lavoro deve corrispondere alla diluzione dell'antigene sotto prova che ha lo stesso diametro dell'antigene di riferimento. Parte di provvedimento in formato grafico Diluizioni dell'antigene C. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la ricerca della leucosi bovina enzootica. 1. Per procedere al saggio ELISA occorrono le attrezzature e i reattivi qui indicati: a) micropiastre, cuvette o qualsiasi altro recipiente per la fase solida; b) l'antigene e' fissato sulla fase solida con o senza l'ausilio di anticorpi leganti policlonali o monoclonali. Se la fase solida e' rivestita direttamente dall'antigene, tutti i campioni in esame che presentano reazione positiva devono essere riesaminati facendo riferimento all'antigene di controllo. Nel caso dell'E.B.L. l'antigene di controllo dovrebbe essere identico all'antigene in questione, fatta eccezione per gli antigeni del virus della leucosi bovina. Se gli anticorpi leganti sono distribuiti sulla fase solida, gli anticorpi non devono reagire ad antigeni diversi da quelli del virus della leucosi bovina; c) il fluido biologico da esaminare; d) controlli positivi e controlli negativi corrispondenti; e) il coniugato; f) un substrato adatto all'enzima impiegato; g) una soluzione di arresto, se necessario; h) soluzioni per la diluizione dei campioni per la preparazione dei reattivi e per il lavaggio; i) un sistema di lettura corrispondente al substrato impiegato. 2. Standardizzazione e sensibilita' della prova: a) Per la leucosi bovina enzootica la sensibilita' del saggio ELISA deve essere di livello tale che il siero E4 risulti positivo quando e' diluito 10 volte (campioni di siero) o 250 volte (campioni di latte) piu' della diluizione ottenuta da singoli campioni presi congiuntamente. Nelle prove in cui i campioni (siero e latte) sono esaminati individualmente, il siero E4 diluito nella proporzione di 1:10: (nel siero negativo) o di 1:250 (nel latte negativo) deve presentare una reazione positiva quando e' esaminato in una diluizione di prova uguale a quella impiegata per le prove individuali. Gli istituti ufficiali indicati nel punto A.2 sono responsabili del controllo di qualita' del metodo ELISA, in particolare per determinare, per ogni lotto di produzione, il numero di campioni da mettere in comune in funzione del titolo ottenuto per il siero E4. Il siero E4 e' fornito dal laboratorio veterinario nazionale di Copenaghen. b) Per la brucellosi: 1) i campioni di latte sfuso vengono classificati negativi se danno una reazione inferiore al 50% di quella data da una diluizione 1:10.000 del secondo siero standard internazionale della brucellosi diluito in latte negativo; 2) i campioni singoli di siero vengono classificati negativi se danno una reazione inferiore al 10% di quella data da una diluizione di 1:200 del secondo siero standard internazionale della brucellosi diluito in soluzione salina o qualsiasi altra soluzione riconosciuta secondo la procedura prevista all'articolo 12 previo parere del Comitato scientifico veterinario. Gli standard ELISA della brucellosi devono essere quelli specificati nell'allegato C, punti A.1 e A.2 (da usare alle diluizioni indicate sull'etichetta). 3. Condizioni di impiego del saggio ELISA per la ricerca della leucosi bovina enzootica e della brucellosi bovina: Il metodo ELISA puo' esser utilizzato su un campione di latte o di siero prelevato dal latte proveniente da un'azienda in cui almeno il 30% delle vacche da latte sono in lattazione. In caso di ricorso alla facolta' precitata devono essere prese misure per assicurare una corrispondenza tra i campioi prelevati e gli animali da cui provengono il latte o i sieri esaminati. In caso di risultato positivo su uno dei campioni, sono applicabili le disposizioni previste nell'allegato A, capitolo II, punto A1 c) i) per quanto concerne la brucellosi bovina e nel presente all'allegato, capitolo I, punto A1 per quanto concerne la EBL.