Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Jedna nebo více šarží purifikovaného Vi polysacharidu se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, které může obsahovat protimikrobní konzervační látku tak, aby objem odpovídající jedné dávce obsahoval 25 μg polysacharidu a roztok byl izotonický s krví (od 250 mosm/kg do 350 mosm/kg).

Pouze konečná várka vakciny, která vyhovuje následujícím zkouškám, se může použít pro výrobu šarže.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakciny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu, na každou půdu se použije 10 ml.

Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou fyzikálně-chemickou metodou. Zjistí se 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Šarže

Konečná várka vakciny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů, které se potom uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům předepsaným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu může být uvolněna k použití. Pokud byly zkoušky na volný formaldehyd a protimikrobní konzervační látky provedeny v konečné várce vakciny, mohou se u šarže vypustit.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá tekutina, prostá viditelných částic.

Zkouška totožnosti

Provede se zkouška totožnosti použitím vhodné imunochemické metody (2.7.1).

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 6,5 až 7,5.

O-Acetyl skupiny. 0,085 (± 25 %) μmol v dávce (25 μg polysacharidu).

Zkoušený roztok. Do každé ze tří zkumavek se dá po 3 ml vakciny (dva reakční roztoky a jeden korekční roztok).

Porovnávací roztoky. 0,150 g acetylcholiniumchloridu R se rozpustí v 10 ml vody R (základní roztok obsahující 15 g/l acetylcholiniumchloridu). Bezprostředně před použitím se 0,5 ml základního roztoku zředí vodou R na 50 ml (pracovní ředění obsahující 150 μg /ml acetylcholinium chloridu). Do deseti zkumavek se ve dvojicích (reakční a korekční roztok) rozplní 0,1 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml pracovního ředění. Slepá zkouška se připraví ze 3 ml vody R.

Objem v každé zkumavce se doplní vodou R na 3 ml. Přidá se 0,5 ml směsi objemových dílů vody R, kyseliny chlorovodíkové zředěné R (1 +2) do každé korekční zkumavky a ke slepé zkoušce. Do každé zkumavky se se přidá 1,0 ml hydroxylamoniumchloridu alkalického RS. Reakce se nechá probíhat přesně 2 min a do každé z reakčních zkumavek se přidá 0,5 ml směsi objemových dílů vody R a kyseliny chlorovodíkové zředěné R (1 + 2). Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku chloridu železitého R (200 g/l) v kyselině chlorovodíkové 2 mol/l RS, zkumavky se zazátkují a silně se protřepají k odstranění bublin.

Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 540 nm s použitím slepé zkoušky jako kompenzačního roztoku. Pro každý reakční roztok se odečte absorbance příslušného korekčního roztoku. Sestrojí se kalibrační křivka z absorbancí pěti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahů acetylcholiniumchloridu. Z křivky se odečte obsah acetylcholiniumchloridu ve zkoušených roztocích pro každý zkoušený objem. Vypočítá se průměr ze dvou hodnot.

1 mol acetylcholiniumchloridu (181,7 g) odpovídá 1 mol O-acetylu (43,05 g).

Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobních konzervačních látek vhodnou fyzikálně-chemickou metodou. Obsah je nejméně minimální účinné množství a nejvýše 115 % deklarovaného množství. Pokud byl při přípravě použit fenol, jeho množství 2,5 g/l (2.5.15).

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 3750 m.j. endotoxinu v jednotlivé lidské dávce.

Stanovení obsahu

Vi polysacharid se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) s použitím referenčního purifikovaného polysacharidu. Stanovené množství polysacharidu v dávce je 80 % až 120 % deklarovaného množství. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanoveného obsahu je v rozmezí 80 % až 120 %.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obale se uvede:

• počet mikrogramů polysacharidu v lidské dávce (25 μg),

• celkové množství polysacharidu v obalu.

Vaccinum febris typhoidis vivum perorale (stirpe Ty 21a) [image omitted]

Živá perorální vakcína proti tyfu (kmen Ty 21a)

Je to lyofilizovaný přípravek živého mikroba Salmonella typhi kmene Ty 21a, vypěstovaného ve vhodné živné půdě. Pokud je vakcína podávána v tobolkách, vyhovuje požadavkům článku Capsulae.

Výroba

Výběr vakcinačního kmene

Hlavní charakteristikou kmene je nedostatek enzymu uridin difosfat-galaktosa-4-epimerasy. Aktivita galaktopermeasy, galaktokinasy a galaktosa-1-fosfat uridyl-transferasy jsou sníženy o 50 % až 90 %. Kmen neobsahuje Vi antigen, i když jsou růstové podmínky jakékoli. Sérum anti-O:9 aglutinuje kmen pouze tehdy, pěstuje-li se na půdě s obsahem galaktosy. Obsahuje bičíkový H:d antigen a netvoří sirovodík na Kliglerově agaru s obsahem železa. Kmen není virulentní pro myši. Buňky kmene Ty 21a lyzují, pokud se pěstují v přítomnosti 1 % galaktosy.

Bakteriální inokula

K přípravě vakcíny se používá systém jednotné inokulace. Pracovní inokula jsou nanejvýš první subkulturou matečného inokula. Konečná vakcína představuje nanejvýš čtvrtou subkulturu původní vakcíny, se kterou byly provedeny laboratorní a klinické zkoušky prokazující vhodnost kmene.

Pro přípravu pracovního inokula se použije pouze takové matečné inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům.

Galaktosový metabolismus. Stanoví se spektrofotometricky; v cytoplazmě kmene Ty 21a není zjištěna žádná aktivita enzymu uridin difosfat-galaktosa-4-epimerasy.

Biosyntéza lipopolysacharidů. Lipopolysacharidy se extrahují metodou fenol-voda za tepla a zkoušejí chromatografií na molekulárním sítu. Kmen Ty 21a pěstovaný na půdě bez galaktosy vykazuje pouze přítomnost R typu lipopolysacharidu.

Sérologické charakteristiky. Kmen Ty 21a pěstovaný na syntetické půdě bez galaktosy se neaglutinuje specifickým anti-O:9 sérem. Vi antisérem se kmen Ty 21a neaglutinuje nikdy, bez ohledu na růstové podmínky. Kmen Ty 21a se aglutinuje H:d bičíkovým antisérem.

Biochemické markery. Kmen Ty 21a netvoří na Kliglerově agaru s obsahem železa sirovodík. Tato vlastnost slouží k jeho odlišení od ostatních galaktosa-epimerasa-negativních kmenů S. typhi.

Buněčný růst. Kmen Ty 21a lyzuje, když roste v přítomnosti 1 % galaktosy.

Množení a získávání bakterií

Bakterie z pracovního inokula se pomnoží v prekultuře, připraví se jedna subkultura a pak se při 30 °C pěstují 13 h až 15 h ve vhodné půdě obsahující 0,001 % galaktosy. Bakterie se sklidí tak, aby nedošlo ke kontaminaci jinými mikroorganismy.

K přípravě lyofilizované sklizně lze použít pouze takové jednotlivé sklizně, které vyhovují následujícím požadavkům.

Hodnota pH. 6,8 až 7,5; měří se kultura.

Optická hustota. 6,5 až 11,0; měřeno při 546 nm. Před měřením se kultura naředí tak, aby se naměřená hodnota pohybovala mezi 0,1 a 0,5 a podle ředění se pak skutečná hustota vypočítá.

Zkouška totožnosti. Bakterie se pěstují na agarové půdě obsahující 1 % galaktosy a modř bromthymolovou. Vytvoří se světle modré, konkávní, vzhledem k lýze buněk průhledné kolonie. Neobjeví se žádné žluté (galaktosu fermentující) kolonie.

Lyofllizovaná sklizeň

Sklizeň se smíchá s vhodným stabilizátorem a lyofilizuje postupem zaručujícím přežití nejméně 10 % bakterií a na takový obsah vody, který je prokazatelně vhodný pro stabilitu vakcíny. K vakcíně se nepřidává žádná protimikrobní konzervační látka.

K přípravě konečné várky vakcíny se použije pouze taková lyofllizovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Zkouška totožnosti. Bakterie se pěstují na agarové půdě obsahující 1 % galaktosy a modř bromthymolovou. Vytvoří se světle modré, konkávní, vzhledem k lýze buněk průhledné kolonie. Neobjeví se žádné žluté (galaktosu fermentující) kolonie.

Počet živých bakterií. Nejméně 1 . 10^11 živých mikrobů S. typhi kmene Ty 21a v gramu.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 1,5 % až 4,0 %.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví aseptickým smícháním jedné nebo více lyofilizovaných sklizní s vhodným sterilním vehikulem.

K přípravě šarže se použije pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícímu požadavku.

Počet živých bakterií. Nejméně 40 . 10^9 živých mikrobů S.typhi kmene Ty 21a v gramu.

Šarže

Konečná várka vakcíny se rozplní za aseptických podmínek do kapslí se stěnou odolnou proti žaludeční šťávě nebo do jiných vhodných obalů.

K použití se uvolní pouze šarže, která vyhovuje požadavkům dále uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Počet živých bakterií. Výjimkou je požadovaná hodnota počtu živých bakterií, která je nejméně 4 . 10^9 živých bakterií v dávce.

Zkouška totožnosti

Bakterie ze zkoušeného přípravku se pěstují na agarové půdě obsahující 1 % galaktosy a modř bromthymolovou. Vytvoří se světle modré, konkávní, vzhledem k lýze buněk průhledné kolonie. Neobjeví se žádné žluté (galaktosu fermentující) kolonie.

Zkoušky na čistotu

Cizí mikroorganismy (2.6.12, 2.6.13). Zkouška se provede na vhodných selektivních půdách. Plotnovou metodou se stanoví celkový počet živých mikroorganismů. Počet cizích mikroorganismů v jedné dávce není větší než 10 bakterií a 20 hub. Není nalezen žádný patogenní mikroorganismus, zvláště Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ani salmonela jiného kmene než Ty 21a.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 1,5 % až 4,0 %; stanoví se z obsahu jedné tobolky nebo obalu.

Stanovení počtu živých bakterií

Ke zkoušce se použije nejméně pět dávek. Obsah jednotlivých dávek se v chladném prostředí zhomogenizuje při 4 °C v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) za použití mixéru a tolika skleněných kuliček, aby vyčnívaly z tekutiny. Ihned po homogenizaci se připraví vhodné ředění suspenze ve vychlazeném rozpouštědle a očkuje se na agar s přísadou mozkosrdcové infuze. Inkubuje se 20 h až 36 h při (36 ± 1) °C. Zkoušený přípravek obsahuje v jedné dávce nejméně 2 .10^9živých mikrobů S. typhi Ty 21a.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

• minimální množství živých bakterií v jedné dávce,

• že vakcína je pouze pro perorální použití.

Vaccinum hepatitidis A inactivatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti hepatitidě A

Je to tekutý přípravek z vhodného kmene viru hepatitidy A pomnoženého v buněčných kulturách a inaktivovaného validovanou metodou. Vakcína je opalescentní suspenze.

Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace a na systému buněčné banky. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu.

Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce neškodnosti pro imunní séra a humánní vakcíny (2.6.9).

Pokud není doloženo a schváleno jinak, virus v konečném přípravku neprojde více pasážemi z matečného inokula než virus použitý k přípravě vakcíny, která vyhověla v klinických studiích z hlediska neškodnosti a účinnosti.

Referenční přípravek. Část šarže, která byla prokazatelně nejméně tak imunogenní jako šarže, jež v klinické studii na mladých zdravých dospělých vykazovala nejméně 95% sérokonverzi, odpovídající hladině neutralizačních protilátek považované za ochrannou po úplné primární imunizaci, se používá jako referenční přípravek. Jako ochranná hladina protilátek se uznává 0,02 m.j./ml, stanoveno metodou ELISA.

Substrát pro pomnožování viru

Virus se pomnožuje v linii lidských diploidních buněk (5.2.3) nebo v kontinuální linii buněk schválené oprávněnou autoritou.

Inokula

Kmen viru hepatitidy A, který se používá k přípravě matečného inokula, se identifikuje vývojovými záznamy, které obsahují informace o původu kmene a o následné manipulaci s ním.

Pouze virus, který odpovídá následujícím požadavkům, se může použít pro pomnožování.

Zkouška totožnosti. Každé matečné a pracovní inokulum viru se identifikuje jako virus hepatitidy A pomocí specifických protilátek.

Koncentrace viru. K zajištění stejnorodosti výroby se stanoví koncentrace viru v matečném a pracovním inokulu.

Cizí agens. Matečná a pracovní inokula vyhovují požadavkům na inokula pro virové vakcíny (2.6.16). Jestliže byla pro izolaci virového kmene použita kultura primárních opičích buněk, provedou se navíc opatření, aby se zajistilo, že kmen není kontaminován opičími viry, jako jsou virus opičí imunodeficience, Ebola virus a Marburg virus.

Pomnožování viru a sklizeň

Veškeré činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostorách, kde nejsou zpracovávány jiné buňky. Při přípravě média pro kultivaci buněk se používá schválené sérum zvířecího (nikoli lidského) původu. Sérum a trypsin používané při přípravě buněčné suspenze a médií jsou prokazatelně prosty cizích agens: trypsin vyhovuje článku Trypsinum. Médium pro kultivaci buněk může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá jako neinfikované buněčné kultury (kontrolní buňky). Několikanásobné sklizně z téže buněčné produkční kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň.

Pouze jednotlivá sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít k přípravě vakcíny. Jestliže stanovení poměru virové koncentrace k obsahu antigenu provedené na vhodném počtu sklizní prokazuje pravidelnost výroby, může se tato zkouška následně vypustit při rutinní kontrole.

Zkouška totožnosti. Zkouška na obsah antigenu slouží také jako zkouška totožnosti jednotlivé sklizně.

Bakterie a houby (2.6.1). Jednotlivá sklizeň vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na mykoplazmata; na každou půdu se použije 1 ml.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z kultur produkčních buněk vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Obsah antigenu. Stanoví se obsah antigenu hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) ke sledování pravidelnosti výroby; obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Poměr koncentrace viru k obsahu antigenu. Stálost poměru koncentrace infekčního viru, stanoveného vhodnou metodou na buněčné kultuře, k obsahu antigenu je stanoven validací na vhodném počtu jednotlivých sklizní.

Purifikace a purifikovaná sklizeň

Sklizeň, která může být spojením několika jednotlivých sklizní, se purifikuje validovanými metodami. Jsou-li pro pomnožení viru použity kontinuální buněčné linie, purifikační proces prokazatelně zahrnuje také důsledné snížení hladiny DNK hostitelských buněk.

Pouze purifikovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, může být použita k přípravě inaktivované sklizně.

Koncentrace viru. Koncentrace infekčního viru v purifikované sklizni se stanoví na vhodné tkáňové kultuře ke sledování pravidelnosti výroby a jako počáteční bod pro sledování inaktivační křivky.

Poměr antigenu k celkové bílkovině. Stanoví se obsah antigenu viru hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Stanoví se obsah celkové bílkoviny validovanou metodou. Poměr obsahu antigenu viru hepatitidy A k obsahu celkové bílkoviny je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v ekvivalentu jedné lidské dávky, stanoveno vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Jestliže to dovolí výrobní proces, lze použít jiné vhodné bílkovinné markery k průkazu účinné purifikace.

Zbytková DNK hostitelských buněk. Je-li pro pomnožení viru použita kontinuální buněčná linie, obsah zbytkové DNK hostitelských buněk, stanovený vhodnou imunochemickou metodou, jak je popsáno v článku Producta ab ADN recombinante, je nejvýše 100 pg v ekvivalentu jedné lidské dávky.

Zbytky chemikálií. Pokud se při purifikačních postupech používají chemické látky, provedou se na purifikované sklizni (nebo na inaktivované sklizni) zkoušky na tyto látky, pokud validace postupu neprokáže úplné odstranění. Koncentrace nepřesahuje rozmezí schválené pro jednotlivý přípravek.

Inaktivace a inaktivovaná sklizeň

Několik purifikovaných sklizní se může spojit před inaktivací. K zamezení interference v inaktivačním procesu se předchází tvorbě virových agregátů nebo se virové agregáty odstraňují bezprostředně před nebo během inaktivačního postupu. Virová suspenze se inaktivuje validovanou metodou; metoda je prokazatelně schopna stejnoměrně inaktivovat virus hepatitidy A bez poškození antigenní a imunogenní aktivity; jako část validační studie je nakreslena inaktivační křivka reprezentující koncentraci zbytkového živého viru měřenou nejméně třikrát (např. ve dni 0, 1 a 2 inaktivačního postupu). Při použití formaldehydu k inaktivaci se přítomnost zbytků volného formaldehydu stanovuje na konci inaktivačního procesu.

Pouze inaktivovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na přítomnost zbytků infekčního viru hepatitidy A inokulací určitého množství inaktivované sklizně, odpovídající 5 % šarže, ale nejvýše 1500 dávek vakcíny do buněčných kultur téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny. Po dvou pasážích se provede zkouška vhodné citlivosti na přítomnost zbytkového infekčního viru. Ve vzorcích odebraných na konci inaktivace se nenaleznou známky pomnožení viru hepatitidy A. Jako pozitivní kontrola se souběžně použije infekční virus k prokázání vnímavosti buněk a nepřítomnosti interference.

Sterilita. (2.6.1). Inaktivovaná virová sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Jestliže se v konečném výrobku nemůže provést validní test na bakteriální endotoxiny, např. pro přítomnost adjuvans, provede se zkouška v inaktivované sklizni. Obsahuje nejvýše 2 m.j. endotoxinu v ekvivalentu jedné lidské dávky.

Obsah antigenu. Vhodnou imunochemickou metodou se stanoví obsah antigenu viru hepatitidy A (2.7.1).

Zbytky chemikálií. Pokud se při purifikačních postupech používají chemické látky, provedou se na inaktivované sklizni (nebo na purifikované sklizni) zkoušky na tyto látky, pokud validace postupu neprokáže úplné odstranění. Koncentrace nepřesahuje rozmezí schválené pro jednotlivý přípravek.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakciny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných sklizní. Mohou se přidat schválená adjuvans, stabilizátory a protimikrobní konzervační látky.

Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Sterilita. (2.6.1). Konečná várka vakciny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví množství protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Množství je 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Šarže

Konečná várka vakciny se asepticky rozplní do sterilních obalů. Obaly se potom uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkoušky totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti se může uvolnit k použití. Za předpokladu, že zkouška na volný formaldehyd (přichází-li v úvahu) a stanovení obsahu protimikrobních konzervačních látek (přichází-li v úvahu) a stanovení účinnosti byly provedeny v konečné várce vakcín s vyhovujícími výsledky, lze je u šarže vypustit.

Zkoušky totožnosti

Obsah antigenu viru hepatitidy A ve vakcíně se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití specifických protilátek nebo zkouškou imunogenity na myších, popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Jestliže byl použit jako adsorbent hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Při použití formaldehydu pro inaktivaci vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví jejich množství vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Množství není nižší než nejnižší prokazatelně účinné množství a vyšší než 115 % množství uvedeného v označení.

Sterilita (2.6.1). Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 2 m.j. endotoxinu v jedné lidské dávce. Nelze-li provést validovanou zkoušku s konečnou šarží, např. pro přítomnost adjuvans, provede se zkouška s inaktivovanou sklizní.

Stanovení účinnosti

Buďto se účinnost vakciny stanoví porovnáním množství nezbytného k vytvoření specifických protilátek u myší s množstvím referenčního přípravku potřebným k vyvolání téhož účinku, nebo se provede validované stanovení obsahu antigenu in vitro.

Zkouška na myších uvedená dále je příkladem metody, která byla shledána vhodnou pro danou vakcínu; mohou se použít i jiné validované metody.

Požadavek na účinnost. Horní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené relativní účinnosti je nejméně 1,0.

Výběr a rozdělení zkoušených zvířat. Použijí se zdravé myši z jednoho chovu, staré 5 týdnů a prokazatelně vhodného kmene. Používají se zvířata téhož pohlaví. Zvířata se rozdělí do nejméně sedmi stejných skupin o počtech vhodných pro požadavky zkoušky.

Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. K ředění se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l) obsahující hliníkové adjuvans použité pro vakcínu. Připraví se nejméně tři ředění zkoušené vakcíny a referenčního přípravku. Každému zvířeti ve skupině se subkutánně vstříkne nejvýše 1,0 ml ředění určeného pro skupinu. Kontrolní skupině neočkovaných zvířat se subkutánně vstříkne stejné množství výše uvedeného roztoku k ředění. Po 28 až 32 dnech se zvířatům podá anestezie, vykrvácejí se a jednotlivá séra se zpracují odděleně. V jednotlivých sérech se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) stanoví obsah specifických protilátek proti hepatitidě A.

Výpočet. Výpočet se provede obvyklými statistickými metodami pro zkoušky s kvantitativní odpovědí (např. 5.3 Statistické hodnocení výsledků biologických zkoušek, sekce 4).

Podle rozložení reakčních hladin naměřených ve všech sérech nevakcinované skupiny se stanoví maximální reakční hladina, kterou lze nalézt u nevakcinovaných zvířat pro tuto zvláštní zkoušku. Odpověď ve vakcinovaných skupinách, která přesahuje tuto hladinu, je definována jako sérokonverze.

Provede se vhodná transformace na procentové vyjádření zvířat vykazujících sérokonverzi v každé skupině (např. probitová transformace) a provede se analýza dat podle rovnoběžného modelu log dávky - odpověď. Stanoví se účinnost zkoušeného přípravku ve vztahu k referenčnímu přípravku.

Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

• pro zkoušenou i referenční vakcínu leží ED50 mezi nejnižší a nejvyšší dávkou podanou zvířatům,

• statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti,

• předpokládané limity odhadované relativní účinnosti leží mezi 33 % a 300 % stanovené účinnosti.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede biologický původ buněk a adjuvans použité pro přípravu vakcíny.

Vaccinum hepatitidis B (ADNr) [image omitted]

Vakcína proti hepatitidě B (rDNK) rekombinantní

Je to přípravek z povrchového antigenu viru hepatitidy B, základního proteinu viru hepatitidy B. Tento antigen se získává rekombinantní DNK technologií.

Přípravek vyhovovuje požadavkům článků Producta ab ADN recombinante a Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Viz článek Producta ab ADN recombinante, zvláště v částech Klonování a exprese, Systém buněčných bank, Validace buněčných bank, Validace výrobního postupu a Pravidelnost výroby.

Přípravek prokazatelně podněcuje tvorbu specifických ochranných protilátek u člověka. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stále vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu a neškodnost.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9)

Přípravek se vyrábí expresí virového genu kódujícího povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg) v kvasinkách (Saccharomyces cerevisiae) nebo v savčích buňkách (buňky ovaria čínského křečka nebo jiných vhodných buněčných linií) purifikací výsledného HBsAg a převedením tohoto antigenu do imunogenního přípravku. Vhodnost a neškodnost buněk schvaluje oprávněná autorita.

Přípravek může obsahovat produkt S genu (hlavní bílkovina), kombinaci S genového a pre-S2 genového produktu (střední bílkovina), nebo kombinaci S genového, pre-S2 genového a pre-S1 genového produktu (velká bílkovina).

Referenční přípravek. Jako referenční přípravek se používá část šarže reprezentující šarži vakcíny, která v klinické studii na mladých zdravých dospělých jedincích prokazatelně vykazuje nejméně 95% sérokonverzi (HBsAg protilátkový titr je větší než 10 m.j. v litru po úplné primární imunizaci).

Charakteristika látky

K charakteristice antigenu se provede vývojová studie, ve které se určí jeho úplná bílkovinná, lipidová a sacharidová struktura. Morfologické charakteristiky antigenních částic se stanoví elektronovou mikroskopií. Vhodná denzita antigenních částic se stanoví fyzikálně-chemickými metodami, např. gradientovou centrifugací Charakterizují se antigenní epitopy. Bílkovinná frakce antigenu se charakterizuje primární strukturou (např. stanovením aminokyselinového složení, částečnou analýzou aminokyselinové sekvence a mapováním peptidů).

Kultura a sklizeň

Totožnost, mikrobiologická čistota, plazmidová retence a konzistence sklizně jsou určeny vhodným výrobním uspořádáním. Jestliže jsou použity savčí buňky, provedou se zkoušky na cizí antigeny a mykoplazmata podle stati Důkaz cizích antigenů v lidských virových vakcínách (2.6.16).

Přečištěný antigen

Pro přípravu konečné várky se použije pouze přečištěný antigen, který odpovídá následujícím požadavkům.

Celková bílkovina. Stanoví se validovanou metodou. Obsah je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek.

Totožnost a obsah antigenu. Množství a specificita HBsAg se stanoví porovnáním s mezinárodním standardem HBsAg subtypu ad nebo s národním referenčním přípravkem za pomoci vhodné imunochemické metody (2.7.1), jako je radioimunoanalýza, enzymové imunosorbentové stanovení (ELISA), imunoblot (přednostně se užívají monoklonální protilátky přímo proti protektivnímu epitopu), nebo jednoduchou radiální difuzí. Poměr antigenu k bílkovině je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek. Molekulová hmotnost v hlavním pásu zjištěná elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným (SDS-PAGE) za redukovaných podmínek odpovídá očekávané hodnotě z genové sekvence a možné glykosylace.

Čistota antigenu. Stanoví se srovnáním s referenčním přípravkem za použití kapalinové chromatografie nebo jiné vhodné metody, jako je SDS-PAGE s barvením modří kyselou 92 a stříbrem.

Vhodná metoda musí být dost citlivá k detekci možného znečištění v koncentraci 1 % celkové bílkoviny. Nejméně 95 % celkové bílkoviny tvoří povrchový antigen hepatitidy B.

Složení. Stanoví se obsah bílkovin, lipidů, nukleových kyselin a sacharidů.

DNK hostitelských buněk a vektorem derivovaná DNK. Nejvýše 10 pg DNK v množství přečištěného antigenu odpovídajícím jedné lidské dávce vakcíny. Stanoví se u přípravků vyrobených pomocí savčích buněk.

Cesium. Jestliže se při výrobě použijí cesiové soli, provede se v přečištěném antigenu stanovení zbytků cesia. Obsah je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek.

Sterilita (2.6.1). Přečištěný antigen vyhovuje zkoušce na sterilitu. Na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Další zkoušky se mohou u přečištěného antigenu požadovat v závislosti na použité výrobní metodě: např. stanovení zbytků zvířecího séra, jestliže byly pro výrobu použity savčí buňky, nebo zkoušky na zbytky chemikálií používaných při extrakci a čištění.

Konečná várka vakcíny

Vakcína může obsahovat protimikrobní konzervační látku a adjuvans.

Pouze várka, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu šarže.

Protimikrobní konzervační látky. Kde jsou použity, stanoví se jejich obsah vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Obsah je v rozmezí 85 % až 115 % deklarovaného množství.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu. Na každou živnou půdu se použije 10 ml konečné várky.

Šarže

K použití se propustí jenom ta konečná šarže, která vyhovuje každému požadavku uvedenému dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Jestliže zkoušky na volný formaldehyd, obsah protimikrobních konzervačních látek a účinnost na zvířatech byly provedeny v konečné várce vakcíny s vyhovujícími výsledky, mohou být tyto zkoušky u šarže vypuštěny.

Zkouška totožnosti

Totožnost přípravku se prokáže stanovením účinnosti nebo ve vhodných případech elektroforetickým profilem.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Jestliže je použit hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý jako sorbent, vyhovuje přípravek zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Při použití formaldehydu vyhovuje přípravek zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Jestliže byly použity, stanoví se jejich obsah vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Jejich obsah není nižší než prokazatelně nejmenší účinné množství a není vyšší než 115 % deklarovaného množství.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se každému králíkovi nitrožilně vstříkne ekvivalent lidské dávky.

Místo zkoušky na pyrogenní látky se může použít validovaná zkouška na bakteriální endotoxiny (2.6.14).

Stanovení účinnosti

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví buď na zvířatech porovnáním jeho schopnosti v daných podmínkách indukovat tvorbu specifických protilátek anti-HBsAg u myší nebo morčat se stejnou schopností referenčního přípravku, nebo stanovením obsahu antigenu validovanou metodou in vitro.

Požadavek na účinnost. Horní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené relativní účinnosti je nejméně 1,0.

Zkouška na zvířatech

Výběr a rozdělení zvířat. Použijí se zdravé myši z jednoho chovu, staré asi 5 týdnů. Použitý kmen myší pro tuto zkoušku dává signifikantní směrnici v křivce závislosti odpovědi na dávce antigenu: vhodné jsou myši s haplotypem H-2q nebo H-2d. Také jsou vhodná zdravá morčata hmotnosti 300 g až 350 g (stará asi 7 týdnů) z jednoho chovu. Zvířata jsou stejného pohlaví. Rozdělí se do nejméně sedmi stejných skupin o počtu vhodném pro hodnocení výsledků.

Stanovení účinnosti zkoušeného přípravku. K ředění přípravku se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l) obsahující hlinité adjuvans nebo jiné vhodné rozpouštědlo. Připraví se nejméně tři vhodná ředění zkoušeného přípravku a souhlasná ředění referenčního přípravku. Ředění se intraperitoneálně vstříknou v množství nejvýše 1,0 ml každému zvířeti ve skupině, pro kterou je ředění určeno. Jedna skupina zvířat zůstane neočkována, vstříkne se jí pouze intraperitoneálně stejný objem ředicího roztoku. Ve vhodném časovém intervalu (např. mezi čtyřmi až šesti týdny) se zvířatům v anestezii odebere krev a odděleně se získají jednotlivá séra. Pro každé sérum se provede vhodná imunoanalýza pro stanovení specifických HBsAg protilátek (2.7.1).

Výpočty. Výpočty se provedou běžnými statistickými metodami pro zkoušky s kvantitativní odpovědí (5.3 Statistická analýza výsledků biologických zkoušek, sekce 4).

Z rozložení reakčních hodnot naměřených ve všech sérech neočkované skupiny se stanoví nejvyšší reakční hladina pro nevakcinované zvíře. Všechny odpovědi u vakcinovaných zvířat, které převyšují tuto hodnotu, se označí za sérokonverzi.

Procento zvířat vykazujících sérokonverzi v každé skupině se vhodně transformuje (např. probitovou transformací) a použije se model rovnoběžnosti křivek závislosti log dávky a odpovědi. Relativní účinnost zkoušeného přípravku se stanoví vzhledem k referenčnímu přípravku.

Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

• pro zkoušený a referenční přípravek leží ED50 mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou zvířatům,

• statistická analýza neukazuje žádnou odchylku od podmínek linearity ani modelu rovnoběžnosti,

• meze spolehlivosti relativní účinnosti jsou mezi 33 % a 300 % stanovené účinnosti.

ED50 (50% účinná dávka) je statisticky vypočtená dávka vakcíny, která v podmínkách zkoušky u 50 % zvířat indukuje specifické protilátky na relevantní vakcinační antigeny.

Metody in vitro

Místo zkoušky na zvířatech lze použít některé validované metody in vitro. Vhodné jsou enzymově imunosorbentová stanovení (ELISA) a radioimunoanalýza s použitím monoklonálních protilátek specifických pro ochranu indukující epitopy HBsAg.

Vhodný počet ředění zkoušeného přípravku se porovnává s referenčním přípravkem za použití modelu rovnoběžnosti k analýze dat, která jsou vhodným způsobem transformována. Soupravy k měření HBsAg in vitro jsou běžně dostupné a mohou se přizpůsobit ke stanovení účinnosti vakcíny in vitro.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

• obsah HBsAg v obalu,

• typ buněk použitých k výrobě vakcíny,

• název a množství adjuvans,

• že se vakcína před použitím roztřepe,

• že vakcína nesmí zmrznout.

Vaccinum hepatitidis contagiosae caninae vivum cryodesiccatum [image omitted]

Živá vakcína proti infekční hepatitidě psů lyofílizovaná

Je to přípravek obsahující jeden nebo více oslabených kmenů psích adenovirů.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Oslabený virus se pomnožuje ve vnímavé buněčné kultuře (5.2.4).

Výběr vakcinačního kmene

K přípravě vakcíny se může použít pouze kmen viru prokazatelně uspokojivý z hlediska oslabení a imunogenity. K průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se použijí následující zkoušky.

Oslabení. Když se vnímavému štěněti starému osm až šestnáct týdnů intravenózně vstříkne objem virové suspenze odpovídající jedné dávce vakcíny, nevyvolá příznaky onemocnění, ale u zvířete se do 21 dní vyvinou specifické neutralizující protilátky.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k prokázání imunogenity kmene.

Zkoušení šarže

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno s vyhovujícím výsledkem na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěna, jestliže k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína rozpustí předepsaným způsobem a smíchá s jedním nebo více specifickými antiséry, nevyvolává již ve vnímavé buněčné kultuře specifický cytopatický efekt.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma vnímavým, 8 až 16 týdnů starým štěňatům, která jsou prosta specifických neutralizačních protilátek, se každému podá způsobem uvedeným v označení dvojnásobek dávky rozpuštěného přípravku. Zvířata se pozorují 21 dní. Zvířata zůstanou zcela zdravá a nemají příznaky keratitidy.

Cizí viry.

A. Rozpuštěná vakcína se smíchá s jedním nebo více specifickými antiséry. Ve vnímavé buněčné kultuře již nevyvolá cytopatický efekt, ani se v ní nedokážou hemaglutinační ani hemadsorpční látky.

B. Zkouška se provede na myších hmotnosti 11 g až 15 g. Každé myši se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml rozpuštěné vakcíny. Použije se tolik myší, aby se podaly 3/10 dávky vakcíny, nejméně však deset myší. Zvířata se pozorují 21 dní. Jestliže během prvních 48 h uhynou více než dvě myši, zkouška se opakuje. Od třetího do jedenadvacátého dne po podání nevykážou myši žádné abnormality, jež by bylo možno přisoudit vakcíně.

Bakterie a houby. Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Rozpuštěná vakcína vyhovuje ve zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Titr viru v rozpuštěném přípravku se stanoví na vnímavé buněčné kultuře. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství virových částic, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použije se sedm vnímavých štěňat ve stáří osmi až šestnácti týdnů, která nemají protilátky proti psím adenovirům. Způsobem uvedeným v označení se každému z pěti zvířat vstříkne objem rozpuštěné vakcíny obsahující množství viru, které odpovídá nejnižšímu titru uvedenému v označení. Dvě štěňata se ponechají jako kontrola. Všechna zvířata se pozorují 21 dní. Potom se každému zvířeti nitrožilně vstříkne takové množství virulentního kmene infekční hepatitidy psů, které u vnímavých psů stačí k vyvolání úhynu nebo typických příznaků nemoci. Zvířata se pozorují dalších 21 dní. Vakcinovaná zvířata zůstanou zdravá a kontrolní zvířata buďto uhynou, nebo jeví typické příznaky vážné infekce. Pokud jedno z kontrolních zvířat nemá žádné příznaky nemoci, stanovení se opakuje.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum influenzae equi inactivatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti chřipce koní

Je to suspenze jednoho nebo více kmenů virů chřipky koní inaktivovaná takovým způsobem, aby se nenarušila imunogenita kmenů.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Každý kmen viru se inokuluje odděleně do alantoidní dutiny kuřecích embryí starých 9 až 11 dní pocházejících ze zdravého chovu. Vejce se inkubují při vhodné teplotě 2 až 3 dny. Potom se odebere alantoidní tekutina. Virové suspenze každého kmene se odeberou odděleně a inaktivují se. Je-li to třeba, mohou se purifíkovat. Mohou se přidat i vhodná adjuvancia a protimikrobní konzervační látky. Vakcína se může lyofilizovat.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně dostatečná z hlediska imunogenity. K prokázání účinnosti se může použít zkouška dále popsaná (5.2.7).

Imunogenita. Zkouška na koních popsaná v odstavci Stanovení účinnosti se může použít při prokazování imunogenity.

Zkoušení šarže

Pokud bylo stanovení účinnosti na koních provedeno s vyhovujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěna, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkoušky totožnosti

Přípravek u vnímavých druhů vyvolá tvorbu specifických protilátek detekovatelných hemaglutinačně inhibičním testem.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Nejméně dvěma koňům se vstříkne na dvě různá místa zkoušený přípravek v dávce uvedené v označení. Za 4 týdny se vakcinace opakuje. Zvířata se pozorují dalších 10 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani celková reakce.

Inaktivace. Do alantoidní dutiny deseti kuřecích embryí 9 až 11 dní starých se naočkuje po 0,2 ml zkoušeného přípravku. Embrya se inkubují 3 dni ve vhodné teplotě. Smrt embrya do 24 h od inokulace se považuje za nespecifický úhyn a vejce se vyřadí. Z každého embrya se odebere alantoidní tekutina a vytvoří se směsný vzorek. Stejným způsobem se na embryích provede druhá pasáž. Po čtyřech dnech inkubace nevykazuje alantoidní tekutina těchto kuřecích embryí žádnou hemaglutinační účinnost.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

• a) Na koních. Každému z pěti vnímavých séronegativních koní se doporučeným způsobem vstříkne jedna dávka zkoušeného přípravku. Za dobu uvedenou v označení jako interval mezi první a druhou vakcinací se vstříkne objem odpovídající druhé dávce vakcíny. Každému zvířeti se odeberou dva vzorky krve, první za týden po první vakcinací, druhý za dva týdny po druhé vakcinací. Z každého vzorku krve se oddělí sérum. Séra se inaktivují zahřátím 30 min na 56 °C. K jednomu objemovému dílu séra se přidají tři objemové díly tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,4 a čtyři objemové díly suspenze kaolinu lehkého R ve stejném tlumivém roztoku (250 g/l). Všechny směsi se 10 min protřepávají při pokojové teplotě. Poté se odstředí, oddělí se supernatant, který se smíchá s koncentrovanou suspenzí kuřecích erytrocytů. Inkubuje se 60 min při 37 °C a odstředí se. Ředění získaného séra je 1 : 8. Ke zkoušení sér se použije antigen nebo antigeny připravené z kmene nebo kmenů použitých k výrobě vakcíny. Z každého zředěného séra se připraví řada dvojnásobných ředění. K 0,025 ml naředěného séra se přidá 0,025 ml suspenze každého antigenu (který byl napřed ošetřen etherem R) obsahující čtyři hemaglutinační jednotky. Směsi se nechají 30 min stát při pokojové teplotě a poté se přidá 0,05 ml 0,5% suspenze kuřecích erytrocytů. Nechá se dále stát 1 h při pokojové teplotě a zaznamená se poslední ředění séra, ve kterém ještě došlo k úplné inhibici hemaglutinace.

Titr protilátek u sér odebraných po druhé vakcinací není nižší než 1 : 64 (do hodnoty ředění se nezapočítávají objemy suspenzí antigenu a erytrocytů). Pokud u některých zvířat ukazuje nalezený titr protilátek po první vakcinací, že to je anamnestická odpověď, nebere se tento výsledek v úvahu, ale provede se za stejných podmínek doplňující stanovení s tolika zvířaty, kolik jich mělo anamnestickou odpověď.

• b) Na morčatech. Každému z deseti morčat prostých specifikovaných protilátek se podkožně vstříkne dávka uvedená v označení. Za 21 dní se odeberou vzorky krve a oddělí se sérum. Séra se inaktivují zahřátím 30 min na 56 °C. K jednomu objemovému dílu séra se přidají tři objemové díly tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,4 a čtyři objemové díly suspenze kaolinu lehkého R ve stejném tlumivém roztoku (250 g/l). Všechny směsi se 10 min protřepávají při pokojové teplotě. Poté se odstředí, oddělí se supernatant, který se smíchá s koncentrovanou suspenzí kuřecích erytrocytů. Inkubuje se 60 min při 37 °C a odstředí se. Ředění získaného séra je 1 : 8. Ke zkoušení sér se použije antigen nebo antigeny připravené z kmene nebo kmenů použitých k výrobě vakcíny. Z každého zředěného séra se připraví řada dvojnásobných ředění. K 0,025 ml každého naředěného séra se přidá 0,025 ml suspenze každého antigenu (který byl napřed ošetřen etherem R) obsahující čtyři hemaglutinační jednotky. Směsi se nechají 30 min stát při pokojové teplotě a poté se přidá 0,05 ml 0,5% suspenze kuřecích erytrocytů. Nechá se dále stát 1 h při pokojové teplotě a zaznamená se poslední ředění séra, ve kterém ještě došlo k úplné inhibici hemaglutinace.

Titr protilátek u žádného séra v žádné zkoušce není nižší než 1 : 16 (do hodnoty ředění se nezapočítávají objemy suspenzí antigenu a erytrocytů).

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

• stáří, ve kterém by se měla zvířata vakcinovat,

• interval mezi první a druhou vakcinací,

• požadovaná revakcinace.

Vaccinum influenzae inactivatum ad suem [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti chřipce prasat

Je to vodná suspenze, olejová emulze nebo lyofilizovaný přípravek jednoho nebo více inaktivovaných kmenů prasečího nebo lidského chřipkového viru. Vhodné kmeny obsahují jak hemaglutinin, tak neuraminidasu.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnožuje v alantoidní dutině kuřecích embryí ze zdravého chovu (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4).

Každý virový kmen se pomnožuje odděleně. Jednotlivé suspenze se shromažďují odděleně a inaktivují metodou, která vylučuje poškození imunogenity. Je-li to třeba, purifikují se.

S každou šarží antigenu se ihned po inaktivaci provede pomnožovací zkouška na zbylý infekční virus chřipky pasážováním ve stejném typu substrátu, jaký byl použit při výrobě (kuřecí embrya nebo buněčné kultury), nebo v substrátu, u něhož byla prokázána nejméně stejná citlivost. Ke zkoušce použité množství inaktivovaného viru odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Neprokáže se žádný živý virus.

Pokud se zkouška inaktivace u vakcíny z buněčných kultur nemůže provést u hotové šarže pro přítomnost olejového adjuvans, provede se zkouška na zbylý infekční chřipkový virus ve várce každé vakcíny bezprostředně před přidáním adjuvans. Provedou se dvě pasáže ve stejném typu substrátu, jaký byl použit při výrobě vakcíny. Množství inaktivovaného viru použité v této zkoušce je nejméně deset dávek vakcíny. Neprokáže se žádný živý virus.

Vakcína může obsahovat jedno nebo více vhodných adjuvans; může být lyofilizovaná.

Výběr složení vakcíny

Výběr kmenů je založen na antigenních typech a subtypech zjištěných v Evropě. Prokáže se, že vakcína je dostatečná z hlediska bezpečnosti a imunogenity pro prasata. Bezpečnost (5.2.6) a účinnost (5.2.7) se mohou prokázat dále uvedenými zkouškami.

Bezpečnost.

A. Zkouška se provede s každou kategorií zvířat, pro kterou je přípravek určen (prasnice, výkrmová prasata). Použitá zvířata nemají protilátky proti viru chřipky prasat. Nejméně deseti zvířatům se vstříkne doporučeným způsobem po dvou dávkách vakcíny. Po čtrnácti dnech se každému zvířeti vstříkne jedna dávka vakcíny a zvířata se pozorují ještě 14 dní. Během 28 dní trvání zkoušky se neprojeví žádná významná místní ani celková reakce.

B. K vyhodnocení bezpečnosti se použijí též zvířata ze zkoušky imunogenity. Každému vakcinovanému zvířeti se změří rektální teplota při vakcinaci, za 24 h a za 48 h. Nezjistí se významný účinek na rektální teplotu, ani jiná systémová reakce (např. anorexie). Při porážce se vyšetří místo podání a nezjistí se žádná významná místní reakce.

C. K vyhodnocení bezpečnosti se použijí též zvířata z terénní zkoušky. Zkouška se provede s každou kategorií zvířat, pro kterou je přípravek určen (prasnice, výkrmová prasata). Použijí se nejméně tři skupiny po nejméně dvaceti zvířatech a jedna kontrolní skupina o nejméně deseti zvířatech. Každému zvířeti se změří rektální teplota při vakcinaci, za 24 h a za 48 h. Nezjistí se významný účinek na rektální teplotu. Při porážce se vyšetří místo podání a nezjistí se žádná významná místní reakce.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti se může použít k důkazu imunogenity přípravku.

Zkouška účinnosti šarže

Dále popsaná zkouška se neprovádí při běžném zkoušení šarží. Provede se jednou nebo několikrát s určitou vakcínou podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Tam, kde se tato zkouška neprovede, použije se vhodná validovaná zkouška, kritéria pro přijetí jsou určena podle šarže, která má vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Následující zkouška se může použít po uspokojivé korelaci se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti po provedení statistického vyhodnocení.

Pěti séronegativním morčatům pět až sedm týdnů starým se podkožně vstříkne po jedné čtvrtině dávky uvedené v označení. Před vakcinací a za 21 dní po ní se zvířatům odebere krev. V každém vzorku se stanoví hladina specifických protilátek proti všem virovým kmenům ve vakcíně buďto hemaglutinačně inhibičním, nebo jiným vhodným testem. Přípravek vyhovuje, jestliže hladina protilátek není nižší než hladina zjištěná u té šarže, která dává uspokojivé výsledky při zkoušce účinnosti na prasatech (viz Stanovení účinnosti).

Zkoušky totožnosti

Jestliže přípravek neobsahuje adjuvans, provede se zkouška A, v opačném případě se provede zkouška B.

A. Antigenní specifita se potvrdí imunodifuzí s imunním sérem specifickým pro hemaglutininy a neuraminidasy obsažené ve zkoušeném přípravku.

B. Když se přípravek vstříkne dvěma zdravým a vnímavým zvířatům, vyvolá tvorbu specifických protilátek proti hemaglutininům a neuraminidasám v něm obsaženým. Protilátky se mohou zjistit vhodnou metodou, jako je imunodifuze.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma prasatům minimálního věku pro vakcinaci se vstříkne po dvojité dávce zkoušeného přípravku způsobem uvedeným v označení. Zvířata se pozorují 14 dní a poté se každému vstříkne jedna dávka zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují dalších 14 dní. Během 28 dní trvání zkoušky se neprojeví žádná významná místní ani celková reakce.

Inaktivace. Jestliže byl zkoušený přípravek vyroben na kuřecích embryích, naočkuje se po 0,2 ml do alantoidních dutin deseti kuřecích embryí, starých 9 až 10 dní, a nechá se 3 dni inkubovat při vhodné teplotě. Smrt embrya do 24 h od inokulace se považuje za nespecifický úhyn a vejce se vyřadí. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže přežije nejméně 80 % embryí. Z každého embrya se odebere alantoidní tekutina, stejné objemové díly všech tekutin se smíchají a stejným způsobem se na kuřecích embryích provede druhá pasáž. Inkubuje se 4 dny. Alantoidní tekutina z těchto kuřecích embryí nevykazuje žádnou hemaglutinační účinnost.

Jestliže byl zkoušený přípravek vyroben na buněčných kulturách, provede se vhodná zkouška na zbylý infekční virus chřipky s použitím dvou pasáží ve stejném typu buněčné kultury, jaký byl použit při výrobě. Nezjistí se žádný živý virus. Jestliže zkoušený přípravek obsahuje olejové adjuvans, které ruší při zkoušce, oddělí se vodná fáze takovým způsobem, který nezmenší schopnost zkoušky prokázat zbylý infekční virus chřipky.

Cizí viry. U prasat použitých ve zkoušce bezpečnosti se provedou zkoušky na protilátky. Zkoušený přípravek nevyvolá tvorbu jiných protilátek než proti viru chřipky. Zejména se nezjistí protilátky proti virům patogenním pro prasata nebo proti virům, které by mohly překážet při diagnóze infekčních onemocnění prasat (včetně virů ze skupiny pestivirů).

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Zkouška účinnosti se provede s každým kmenem použitým při výrobě. Použijí se vnímavá séronegativní prasata v minimálním věku doporučeném pro vakcinaci. Deset prasat se naočkuje, jak je doporučeno v označení, a deset prasat slouží jako kontrola. Za tři týdny po vakcinaci se všechna prasata v anestezii intratracheálně čelenžují vhodným množstvím terénního virulentního viru chřipky. Z každé skupiny se za 24 h po čelenži porazí pět prasat, přednostně při hypertermii. Změří se množství viru chřipky přítomné v určitém stejném množství rozdrceného pravého diafragmatického laloku plic poražených prasat. Množství viru v plicích vakcinovaných prasat je významně menší než v plicích kontrolních zvířat. U zbývající pětice prasat z obou skupin se 7 dní pozorují klinické příznaky, zejména se každý den u každého prasete zaznamenává rektální teplota. V den čelenže a o 4 dni později se každé prase zváží. Hmotnost vakcinovaných prasat za 4 dni po čelenži je významně vyšší. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže se u kontrolních prasat projeví závažné klinické příznaky (hypertermie, anorexie). U vakcinovaných prasat může být pozorován mírný vzestup rektální teploty.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článěk Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvedou virové kmeny obsažené ve vakcíně.

Vaccinum influenzae inactivatum ex corticis antigeniis praeparatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti chřipce (povrchový antigen)

Je to sterilní vodná suspenze kmene nebo kmenů chřipkového viru typu A nebo B nebo směs kmenů obou typů. Virové kmeny se pěstují odděleně v kuřecích embryích, inaktivují se a ošetří tak, aby byl zachován hemaglutinační a neuraminidasový antigen bez snížení antigenních vlastností těchto antigenů.

Uvedené množství hemaglutinačního antigenů každého kmene obsažené ve vakcíně je 15 μg v dávce, pokud klinická situace nepodporuje použití jiného množství.

Vakcína je čirý roztok.

Výroba

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že bude-li výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro humánní imunní séra a vakcíny (2.6.9).

Výběr vakcinačního kmene

Světová zdravotnická organizace vydává každý rok přehled světové epidemiologické situace, a je-li třeba, doporučuje nové kmeny odpovídající aktuální epidemiologické situaci. Tyto kmeny se použijí v souladu s platnými pravidly signatářských států Konvence o přípravě Evropského lékopisu. Nyní je obecnou praxí užívat vybrané kmeny mající vysoké výtěžky vhodných povrchových antigenů. Původ a průběh pasážování virových kmenů schvaluje oprávněná autorita.

Substrát pro pomnožení viru

Inokulum pro výrobu vakcíny se pomnoží v kuřecích embryích z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4), například kuřecích embryonálních fibroblastech nebo kuřecích ledvinných buňkách získaných z chovů kuřat prostých specifikovaných patogenů. Pro výrobu se virus každého kmene pěstuje v alantoidní dutině oplozených slepičích vajec ze zdravého chovu.

Virové inokulum

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Pracovní inokula jsou nejvýše patnáctou pasáží od schváleného vybraného kmene nebo od schváleného virového izolátu. Finální vakcínu představuje jedna pasáž z pracovního inokula. Pro potvrzení správnosti kmene chřipky se vhodnou metodou ověřuje hemaglutininový a neuramidasový antigen každého inokula. K přípravě monovalentní spojené sklizně se použije pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Provede se zkouška na mykoplazmata; použije se 10 ml.

Pomnožování a sklizeň viru

Do inokula se může přidat protimikrobní látka. Po inkubaci v kontrolované teplotě se odebere alantoidní tekutina a smíchá se do monovalentní spojené sklizně. Protimikrobní látka se může přidat i v době odběru. V žádném stupni výroby se nepoužije penicilín ani streptomycin.

Monovalentní spojená sklizeň

K omezení možnosti kontaminace se inaktivace zahájí co nejdříve možno po přípravě. Virus se inaktivuje metodou, u které byla výrobcem na třech po sobě jdoucích šaržích prokázána stejná účinnost. Inaktivační postup je prokazatelně schopný inaktivovat virus chřipky bez zničení jeho antigenity; postup může změnit hemaglutinační a neuraminidasový antigen co nejméně. Inaktivační postup je prokazatelně schopný inaktivovat virus ptačí leukózy a mykoplazmata. Jestliže se monovalentní spojená sklizeň uchovává po inaktivaci, použije se teplota (5 ± 3) °C. Při použití formaldehydového roztoku nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli inaktivace 0,2 g/l; při použití betapropiolaktonu jeho koncentrace nepřesahuje v žádné chvíli inaktivace 0,1 % (V/V).

Před nebo po inaktivačním postupu se monovalentní spojená sklizeň koncentruje a purifikuje vysokoobrátkovým odstřeďováním nebo jinou vhodnou metodou. Virové částice se rozštěpí na subjednotkové složky schválenými postupy a následně se purifikují, takže monovalentní várka sestává převážně z hemaglutinačních a neuraminidasových antigenů.

Jen taková monovalentní spojená sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Hemaglutinační antigen. Obsah hemaglutinačního antigenu se stanoví imunodifuzí (2.7.1), porovnáním s referenčním antigenem6) nebo s antigenem kalibrovaným podle referenčního antigenu. Zkouška se provede při 20 °C až 25 °C.

Neuraminidasový antigen. Přítomnost a typ neuraminidasového antigenu se ověří vhodnou enzymatickou nebo imunologickou metodou na prvních třech monovalentních spojených sklizních z každého pracovního inokula.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Virová inaktivace. Provedou se zkoušky popsané v odstavci Zkoušky na čistotu.

Čistota. Čistota monovalentní spojené sklizně se zjišťuje polyakrylamidovou gelovou elektroforézou nebo jinou schválenou metodou. Prokážou se zejména hemaglutinační a neuraminidasové antigeny.

Chemikálie použité ke štěpení a purifikaci. Zkoušky na chemikálie použité ke štěpení a purifikaci se provedou s monovalentní spojenou sklizní, limity schvaluje oprávněná autorita.

Konečná várka vakcíny

Odpovídající množství monovalentních spojených sklizní se smíchá do konečné várky vakciny. K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakciny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látka. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah je nejméně 85 % a nejvýše 115 % zamýšleného množství.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci. K použití se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje všem požadavkům uvedeným v odstavcích Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu. Za předpokladu, že zkouška na virovou inaktivaci byla provedena s vyhovujícím výsledkem u každé monovalentní spojené sklizně a že zkoušky na volný formaldehyd, ovalbumin a celkové bílkoviny byly provedeny s vyhovujícím výsledkem v konečné várce vakciny, mohou se u šarže tyto zkoušky vynechat.

Zkouška totožnosti

Antigenní specifita se ověřuje při stanovení obsahu.

Zkoušky na čistotu

Virová inaktivace. 0,2 ml zkoušeného přípravku se vstříkne do alantoidní dutiny každého z deseti oplozených vajec a inkubuje se 3 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že přežije osm embryí z deseti. Z každého přežívajícího embrya se odebere 0,5 ml alantoidní tekutiny a tekutiny se smíchají. 0,2 ml směsného vzorku se vstříkne dalším deseti oplozeným vejcím a inkubuje se 3 dny při teplotě 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že přežije osm embryí z deseti. Z každého přežívajícího embrya se odebere 0,1 ml alantoidní tekutiny a s každou tekutinou se samostatně provede hemaglutinační zkouška na přítomnost živého viru.

Jestliže je v některé tekutině zjištěna hemaglutinace, provede se další pasáž na vejcích a zkouška hemaglutinace; nezjistí se žádná hemaglutinace.

Celkové bílkoviny. Nejvýše 40 μg jiné bílkoviny než hemaglutinin na virový kmen v lidské dávce a nejvýše celkem 120 μg bílkoviny jiné než hemaglutinin v lidské dávce.

Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látka. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah je nejméně minimální účinné množství a nejvýše 115 % deklarovaného množství.

Ovalbumin. Nejvýše 1 μg ovalbuminu v lidské dávce, stanoveno vhodnou metodou s použitím vhodného referenčního přípravku ovalbuminu.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 100 m.j. endotoxinu v lidské dávce.

Stanovení obsahu

Obsah hemaglutinačního antigenu se stanoví imunodifuzí (2.7.1), porovnáním s hemaglutinačním referenčním antigenem nebo s antigenem kalibrovaným podle referenčního antigenu. Zkouška se provede při 20 °C až 25 °C. Interval spolehlivosti (P = 0,95) této zkoušky je v rozmezí 80 % až 125 % zjištěného obsahu. Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) odhadu obsahu hemaglutinačního antigenu je nejméně 80 % množství deklarovaného v označení pro každý kmen.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

• že vakcína byla připravena na vejcích,

• kmen nebo kmeny chřipkových virů použitých k přípravě vakcíny,

• metoda inaktivace,

• obsah hemaglutininu v mikrogramech na virový kmen na dávku,

• sezóna, v níž je vakcína určena k ochraně.

Vaccinum influenzae inactivatum ex viris integris praeparatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti chřipce (celý virion)

Je to sterilní vodná suspenze kmene nebo kmenů chřipkového viru typu A nebo B nebo směs kmenů obou typů. Virové kmeny se pěstují odděleně v kuřecích embryích a inaktivují se tak, aby jejich antigenní vlastnosti zůstaly zachovány. Uvedené množství antigenu hemaglutininu každého kmene obsaženého ve vakcíně je 15 v dávce, pokud klinická situace nepodporuje použití jiného množství.

Vakcína je slabě opaleskující tekutina.

Výroba

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že bude-li výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro humánní imunní séra a vakcíny (2.6.9).

Výběr vakcinačního kmene

Světová zdravotnická organizace vydává každý rok přehled světové epidemiologické situace, a je-li třeba, doporučuje nové kmeny odpovídající aktuální epidemiologické situaci. Tyto kmeny se použijí v souladu s platnými pravidly signatářských států Konvence o přípravě Evropského lékopisu. Nyní je obecnou praxí užívat vybrané kmeny mající vysoké výtěžky vhodných povrchových antigenů. Původ a průběh pasážování virových kmenů schvaluje oprávněná autorita.

Substrát pro pomnožení viru

Inokulum pro výrobu vakcíny se pomnoží v kuřecích embryích z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4), například kuřecích embryonálních fibroblastech nebo kuřecích ledvinných buňkách získaných z chovů kuřat prostých specifikovaných patogenů. Pro výrobu se virus každého kmene pěstuje v alantoidní dutině oplozených slepičích vajec ze zdravého chovu.

Virové inokulum

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Pracovní inokula jsou nejvýše patnáctou pasáží od schváleného vybraného kmene nebo od schváleného virového izolátu. Finální vakcínu představuje jedna pasáž z pracovního inokula. Pro potvrzení správnosti kmene chřipky se vhodnou metodou ověřuje hemaglutininový a neuramidasový antigen každého inokula. K přípravě monovalentní spojené sklizně se použije pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům.

Bakteriální a plísňová kontaminace. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Provede se zkouška na mykoplazmata; použije se 10 ml.

Pomnožování a sklizeň viru

Do inokula se může přidat protimikrobní látka. Po inkubaci v kontrolované teplotě se odebere alantoidní tekutina a smíchá se do monovalentní spojené sklizně. Protimikrobní látka se může přidat i v době odběru. V žádném stupni výroby se nepoužije penicilin ani streptomycin.

Monovalentní spojená sklizeň

K omezení možnosti kontaminace se inaktivace zahájí co nejdříve možno po přípravě. Virus se inaktivuje metodou, u které byla výrobcem na třech po sobě jdoucích šaržích prokázána stejná účinnost. Inaktivační postup je prokazatelně schopný inaktivovat virus chřipky bez zničení jeho antigenity; postup může změnit hemaglutinační a neuraminidasový antigen co nejméně. Inaktiva ční postup je prokazatelně schopný inaktivovat virus ptačí leukózy a mykoplazmata. Jestliže se monovalentní spojená sklizeň uchovává po inaktivaci, použije se teplota (5 ± 3) °C. Při použití formaldehydového roztoku nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli inaktivace 0,2 g/l; při použití betapropiolaktonu jeho koncentrace nepřesahuje v žádné chvíli inaktivace 0,1 % (V/V).

Před nebo po inaktivačním postupu se monovalentní spojená sklizeň koncentruje a purifikuje vysokoobrátkovým odstřeďováním nebo jinou vhodnou metodou.

Jen taková monovalentní spojená sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Hemaglutnační antigen. Obsah hemaglutinačního antigenu se stanoví imunodifuzí (2.7.1), porovnáním s referenčním antigenem^7) nebo s antigenem kalibrovaným podle referenčního antigenu. Zkouška se provede při 20 °C až 25 °C.

Neuraminidasový antigen. Přítomnost a typ neuraminidasového antigenu se ověří vhodnou enzymatickou nebo imunologickou metodou na prvních třech monovalentních spojených sklizních z každého pracovního inokula.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Virová inaktivace. Provedou se zkoušky popsané v odstavci Zkoušky na čistotu.

Konečná várka vakcíny

Odpovídající množství monovalentních spojených sklizní se smíchá do konečné várky vakcíny. K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látka. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah je nejméně 85 % a nejvýše 115 % zamýšleného množství.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci. K použití se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje všem požadavkům uvedeným v odstavcích Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu. Za předpokladu, že zkouška na virovou inaktivaci byla provedena s vyhovujícím výsledkem u každé monovalentní spojené sklizně a že zkoušky na volný formaldehyd, ovalbumin a celkové bílkoviny byly provedeny s vyhovujícím výsledkem v konečné várce vakcíny, mohou se u šarže tyto zkoušky vynechat.

Zkouška totožnosti

Antigenní specifita se ověřuje při stanovení obsahu.

Zkoušky na čistotu

Virová inaktivace. 0,2 ml zkoušeného přípravku se vstříkne do alantoidní dutiny každého z deseti oplozených vajec a inkubuje se 3 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že přežije osm embryí z deseti. Z každého přežívajícího embrya se odebere 0,5 ml alantoidní tekutiny a tekutiny se smíchají. 0,2 ml směsného vzorku se vstříkne dalším deseti oplozeným vejcím a inkubuje se 3 dny při teplotě 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že přežije osm embryí z deseti. Z každého přežívajícího embrya se odebere 0,1 ml alantoidní tekutiny a s každou tekutinou se samostatně provede hemaglutinační zkouška na přítomnost živého viru.

Jestliže je v některé tekutině zjištěna hemaglutinace, provede se další pasáž na vejcích a zkouška hemaglutinace; nezjistí se žádná hemaglutinace.

Celkové bílkoviny. Nejvýše šestinásobek celkového obsahu hemaglutininu zjištěného ve Stanovení obsahu, ale nejvýše 100 μg bílkoviny na virový kmen v lidské dávce a nejvýše celkem 300 μg bílkoviny v lidské dávce.

Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látka. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah je nejméně minimální účinné množství a nejvýše 115 % deklarovaného množství.

Ovalbumin. Nejvýše 1 μg ovalbuminu v lidské dávce, stanoveno vhodnou metodou s použitím vhodného referenčního přípravku ovalbuminu.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 100 m.j. endotoxinu v lidské dávce.

Stanovení obsahu

Obsah hemaglutinačního antigenu se stanoví imunodifuzí (2.7.1), porovnáním s hemaglutinačním referenčním antigenem nebo s antigenem kalibrovaným podle referenčního antigenu. Zkouška se provede při 20 °C až 25 °C. Interval spolehlivosti (P = 0,95) této zkoušky je v rozmezí 80 % až 125 % zjištěného obsahu. Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) odhadu obsahu hemaglutinačního antigenu je nejméně 80 % množství deklarovaného v označení pro každý kmen.

Uchovávám

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

• že vakcína byla připravena na vejcích,

• kmen nebo kmeny chřipkových virů použitých k přípravě vakcíny,

• metoda inaktivace,

• obsah hemaglutininu v mikrogramech na virový kmen na dávku,

• sezóna, v níž je vakcína určena k ochraně.

Vaccinum influenzae inactivatum ex virorum fragmentis praeparatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti chřipce (štěpený virion)

Je to sterilní vodná suspenze kmene nebo kmenů chřipkového viru typu A nebo B nebo směs kmenů obou typů. Virové kmeny se pěstují odděleně v kuřecích embryích, inaktivují se a ošetří tak, že se virové částice rozštěpí bez zmenšení antigenních vlastností antigenů hemaglutininu a neuraminidasy. Určené množství antigenů hemaglutininu každého kmene obsaženého ve vakcíně je 15 μg v dávce, pokud klinická situace nepodporuje použití jiného množství.

Vakcína je slabě opaleskující tekutina.

Výroba

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že bude-li výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro humánní imunní séra a vakcíny (2.6.9).

Výběr vakcinačního kmene

Světová zdravotnická organizace vydává každý rok přehled světové epidemiologické situace, a je-li třeba, doporučuje nové kmeny odpovídající aktuální epidemiologické situaci. Tyto kmeny se použijí v souladu s platnými pravidly signatářských států Konvence o přípravě Evropského lékopisu. Nyní je obecnou praxí užívat vybrané kmeny mající vysoké výtěžky vhodných povrchových antigenů. Původ a průběh pasážování virových kmenů schvaluje oprávněná autorita.

Substrát pro pomnožení viru

Inokulum pro výrobu vakcíny se pomnoží v kuřecích embryích z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4), například kuřecích embryonálních fibroblastech nebo kuřecích ledvinných buňkách získaných z chovů kuřat prostých specifikovaných patogenů. Pro výrobu se virus každého kmene pěstuje v alantoidní dutině oplozených slepičích vajec ze zdravého chovu.

Virové inokulum

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Pracovní inokula jsou nejvýše patnáctou pasáží od schváleného vybraného kmene nebo od schváleného virového izolátu. Finální vakcínu představuje jedna pasáž z pracovního inokula. Pro potvrzení správnosti kmene chřipky se vhodnou metodou ověřuje hemaglutininový a neuramidasový antigen každého inokula. K přípravě monovalentní spojené sklizně se použije pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům.

Bakteriální a plísňová kontaminace. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Provede se zkouška na mykoplazmata; použije se 10 ml.

Pomnožování a sklizeň viru

Do inokula se může přidat protimikrobní látka. Po inkubaci v kontrolované teplotě se odebere alantoidní tekutina a smíchá se do monovalentní spojené sklizně. Protimikrobní látka se může přidat i v době odběru. V žádném stupni výroby se nepoužije penicilin ani streptomycin.

Monovalentní spojená sklizeň