Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Referenční kapalina	Δn/Δt (teplotní koeficient)
trimethylpentan CRL	-0,000 49
chlorid uhličitý CRL	-0,000 57
toluen CRL	-0,000 56
methylnaftalen CRL	-0,000 48

Při použití bílého světla je refraktometr vybaven příslušným kompenzačním zařízením. Přístroj umožňuje přesný odečet nejméně na tři desetinná místa a je vybaven zařízením umožňujícím práci při předepsané teplotě. Stupnice teploměru je dělena po 0,5 °C nebo přesněji.

• 2.2.7 Optická otáčivost

Optická otáčivost je vlastnost některých látek otáčet rovinu polarizovaného světla.

Specifická optická otáčivost αmλt je otáčivost vyjádřená v radiánech (rad), měřená při teplotě t, při vlnové délce λ a tloušťce vrstvy 1 metr, kterou vykazuje kapalina nebo roztok obsahující 1 kilogram opticky aktivní látky v krychlovém metru roztoku. Pro praktické využití se specifická optická otáčivost αmλt obvykle vyjadřuje v miliradiánech a čtverečných metrech na kilogram (mrad.m.^2kg^-1).

Lékopis přijal následující konvenční definice:

Úhel optické otáčivosti kapaliny je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm) měřený při 20 °C a tloušťce vrstvy 1 decimetr; pro roztok je postup přípravy popsaný v článku.

Specifická optická otáčivost αD20 kapaliny je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm), měřený při 20 °C ve zkoušené kapalině, vypočítaný pro vrstvu tloušťky 1 decimetr a dělený hustotou vyjádřenou v gramech na krychlový centimetr.

Specifická optická otáčivost αD20 látky v roztoku je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm), měřený při 20 °C v roztoku zkoušené látky a vypočtený pro vrstvu tloušťky 1 decimetr, obsahující 1 gram látky na mililitr. Specifická optická otáčivost pevné látky je vždy vyjádřena pro dané rozpouštědlo a pro danou koncentraci rozpuštěné látky.

V konvenčním systému přijatém lékopisem se specifická optická otáčivost vyjadřuje ve stupních krát mililitry na decimetr a gram [(°).ml.dm^-1.g^-1].

Přepočítávací faktor z mezinárodního systému na systém lékopisný je následující:

αmλt=αλt.0,1745.

V určitých případech specifikovaných v článcích smí být úhel otočení měřen při jiné teplotě než 20 °C a při jiných vlnových délkách.

Polarimetr umožňuje odečítání s přesností nejméně na 0,01 °. Stupnice je obyčejně kontrolovaná pomocí ověřených křemenných destiček. Linearita stupnice se může kontrolovat pomocí roztoků sacharosy.

Postup. Stanoví se nulová poloha polarimetru a úhel otočení roviny polarizovaného světla při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm) při (20 ± 0,5) °C. Měření se může uskutečnit při jiných teplotách jen tehdy, jestliže článek uvádí korekci naměřené optické otáčivosti na tuto teplotu.

Stanoví se nulová poloha přístroje s uzavřenou trubicí; pro kapaliny se nulová poloha stanoví s prázdnou trubicí a pro látky v roztoku s trubicí naplněnou předepsaným rozpouštědlem. Vypočítá se průměr alespoň z pěti měření.

Specifická optická otáčivost se vypočítá pomocí následujících vzorců, pravotočivost a levotočivost se označí (+), resp. (-).

Pro kapaliny:

αD20=αl.ρ20.

Pro pevné látky v roztoku:

αD20=1000αl.c.

Obsah opticky aktivní látky c vyjádřený v g/l nebo c‘ vyjádřený v procentech se vypočítá podle následujících vzorců:

c=1000αl.αD20, c‘=100αl.αD20.ρ20.

Ve všech uvedených vzorcích značí:

α - úhel otočení ve stupních při (20 ± 0,5) °C,

l - délku polarimetrické trubice v decimetrech,

ϱ20 - hustotu při 20 °C v gramech na krychlový centimetr; pro účely lékopisu je hustota nahrazena relativní hustotou (2.2.5),

c - koncentraci látky v g/l,

c‘- koncentraci látky v %.

• 2.2.8 Viskozita

Dynamická viskozita nebo koeficient viskozity η je tangenciální síla připadající na jednotku povrchu a vyjádřená jako smykové napětí τ v pascalech, potřebná k tomu, aby se dvě rovnoběžné vrstvy kapaliny o ploše 1 m^2 navzájem posunuly o vzdálenost 1 m (x) rychlostí (v) 1 m.s^-1.

Rychlostní gradient dv/dx udává smykový poměr D a vyjadřuje se v s^-1 Pro dynamickou viskozitu η platí vztah η = τ/D.

Jednotkou dynamické viskozity je pascalsekunda (Pa.s). Nejpoužívanější menší jednotkou je milipascalsekunda (mPa.s).

Kinematická viskozita v(m^2/s) je poměr dynamické viskozity η a hustoty ρ (kg/m^3) kapaliny při téže teplotě. Pro kinematickou viskozitu platí vztah v = η/ρ. Kinematická viskozita se obvykle vyjadřuje v mm^2.s^-1.

Kapilární viskozimetr lze používat pro stanovení viskozity newtonských kapalin a rotační viskozimetr pro stanovení viskozity newtonských i nenewtonských kapalin.

Jiné viskozimetry lze používat za předpokladu, že jejich přesnost není menší než ta, kterou poskytují viskozimetry popsané níže.

• 2.2.9 Měření kapilárním viskozimetrem

Stanovení viskozity pomocí vhodného kapilárního viskozimetru se provádí při teplotě (20 ± 0,1) °C, není-li předepsáno jinak. Čas potřebný k tomu, aby hladina kapaliny klesla od jedné značky ke druhé, se měří stopkami s přesností na 0,2 sekundy. Měření je platné, pokud se dvě po sobě jdoucí měření neliší o více než 1 %. Pro výpočet se bere průměr nejméně ze tří měření doby průtoku zkoušené kapaliny.

Dynamická viskozita η (2.2.8) v milipascalsekundách (mPa.s) se vypočítá podle vzorce:

η=kρt,

v němž značí:

k - konstantu viskozimetru (mm^2.s^-2),

ρ - hustotu zkoušené tekutiny (mg.mm^-3) získanou vynásobením relativní hustoty d2020 číslem 0,9982,

t - dobu průtoku zkoušené kapaliny v sekundách.

Konstanta k se stanoví za použití vhodné viskozimetrické kalibrační kapaliny předepsané v lékopise.

K výpočtu kinematické viskozity (mm^2.s^-1) se použije vzorec:

v=kt.

Stanovení může být provedeno přístrojem (viz obr.2.2.9-1, str. 105), který má parametry^1) uvedené v tab. 2.2.9-1.

Tab. 2.2.9-1

| Číslo velikosti | Nominální konstanta viskozimetru | Rozmezí kinematické viskozity | Vnitřní průměr trubice R | Objem části C | Vnitřní průměr trubice N | | | mm2.s-2 | mm2.s-1 | mm (±2 %) | ml (±5 %) | mm | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1 | 0,01 | 3,5 až 10 | 0,64 | 5,6 | 2,8 až 3,2 | | 1A | 0,03 | 6 až 30 | 0,84 | 5,6 | 2,8 až 3,2 | | 2 | 0,1 | 20 až 100 | 1,15 | 5,6 | 2,8 až 3,2 | | 2A | 0,3 | 60 až 300 | 1,51 | 5,6 | 2,8 až 3,2 | | 3 | 1,0 | 200 až 1000 | 2,06 | 5,6 | 3,7 až 4,3 | | 3A | 3,0 | 600 až 3000 | 2,74 | 5,6 | 4,6 až 5,4 | | 4 | 10 | 2000 až 10 000 | 3,70 | 5,6 | 4,6 až 5,4 | | 4A | 30 | 6000 až 30 000 | 4,07 | 5,6 | 5,6 až 6,4 | | 5 | 100 | 20 000 až 100 000 | 6,76 | 5,6 | 6,8 až 7,5 |

Minimální doba průtoku pro velikost číslo 1 musí být 350 s; pro všechny další velikosti 200 s.

Postup. Trubicí (L) viskozimetru se naplní část A dostatečným množstvím zkoušené kapaliny vytemperované na teplotu 20 °C, pokud není uvedeno jinak. Hladina kapaliny v části (B) nesmí zasahovat do ústí ventilační trubice (M). Viskozimetr se ponoří do vodní lázně o teplotě (20 ±0,1) °C, není-li uvedeno jinak, ve svislé poloze a nechá se temperovat nejméně 30 min, aby se teploty vyrovnaly. Trubice (M) se uzavře a hladina kapaliny v trubici (N) se vytlačí asi 8 mm nad značku (E). V této poloze se kapalina zadrží uzavřením horního ústí trubice (N) a otevřením trubice (M). Při vlastním měření se otevře trubice (N) a s přesností 0,2 s se změří stopkami časový interval mezi poklesem hladiny kapaliny od značky (E) po značku (F).

• 2.2.10 Měření rotačním viskozimetrem

Běžně užívané typy rotačních viskozimetrů jsou založeny na měření smykových sil v kapalném prostředí, umístěném mezi dva souosé válce, z nichž jeden je poháněn motorem a druhý je přinucen k otáčení rotací prvého. Za těchto podmínek se mírou viskozity nebo zdánlivé viskozity stává úhlová odchylka (M) válce přinuceného k otáčení, což odpovídá momentu síly vyjádřenému v newtonmetrech.

Pro laminární proudění je dynamická viskozita η vyjádřená v pascalsekundách dána vzorcem:

η=1ωM4π.h·1RA2-1RB2,

v němž značí:

h - výšku ponoření válce přinuceného k otáčení v kapalném prostředí vyjádřenou v metrech,

RA, RB - poloměry válců v metrech, přičemž RA je menší než RB,

ω - úhlovou rychlost v radiánech za sekundu.

Konstanta k přístroje^2) může být určena při různých rychlostech otáčení za použití viskozimetrické kalibrační kapaliny předepsané lékopisem. Viskozita pak odpovídá vzorci:

η=kMω,

Postup. Viskozita se měří podle pokynů pro obsluhu rotačního viskozimetru. Teplota pro měření viskozity je předepsána v článku. Pro pseudoplastické a jiné nenewtonské systémy uvádí článek typ viskozimetru, který se má použít, a úhlovou rychlost nebo smykový poměr, při kterém se měření provádí. Jestliže je nemožné získat předepsaný smykový poměr přesně, použije se smykový poměr poněkud nižší a vyšší a provede se interpolace.

[image omitted]

Obr. 2.2.9-1 Viskozimetr

Rozměry v milimetrech

• 2.2.11 Destilační rozmezí

Destilační rozmezí je teplotní interval vztažený na tlak 101,3 kPa (760 Torrů), ve kterém kapalina nebo její definovaná část destiluje za následujících podmínek.

Přístroj. Přístroj (viz obr. 2.2.11-1) se skládá z destilační baňky (A), k jejímuž postrannímu ramenu je vhodně připojen chladič (B) zakončený nebo nastavený hladce zahnutým nástavcem (C). Teploměr je vložený do hrdla baňky tak, aby horní konec rtuťové nádobky byl o 5 mm níže než spojení hrdla baňky se spodní stěnou boční trubice. Stupnice teploměru je dělená po 0,2 °C a její rozsah je asi 50 °C. Po dobu stanovení musí být baňka, včetně jejího hrdla, chráněna před průvanem vhodnou ochranou.

Postup. Do baňky (A) se dá 50,0 ml zkoušené kapaliny a několik kousků pórovité hmoty. Destilát se jímá do 50ml válce děleného po 1 ml. Chlazení tekoucí vodou je nevyhnutelné u kapalin destilujících níže než při 150 °C. Baňka se zahřívá tak, aby se rychle dosáhlo varu. Zaznamená se teplota, při které spadne do válce první kapka destilátu. Zahřívání se nastaví tak, aby kapalina destilovala konstantní rychlostí 2 ml/min až 3 ml/min. Zaznamená se teplota, při které předestiloval celý objem kapaliny nebo její předepsaná část. Objem předestilované kapaliny se měří při 20 °C.

Zjištěná teplota se koriguje na předepsaný barometrický tlak podle vzorce:

t1=t2+k101,3-b,

v němž značí:

t1 - korigovanou teplotu,

t2 - zjištěnou teplotu při barometrickém tlaku b,

k - korekční faktor dle tab. 2.2.11-1, pokud není uvedeno jinak,

b - barometrický tlak po dobu destilace (kPa).

[image omitted]

Obr. 2.2.11-1 Přistroj na stanovení destilačního rozmezí

Rozměry v milimetrech

Tab. 2.2.11-1 Korekční faktor teploty v závislosti na tlaku

Destilační teplota	Korekční faktor k
do 100 °C	0,30
101 °C až 140 °C	0,34
141 °C až 190 °C	0,38
191 °C až 240 °C	0,41
nad 240 °C	0,45

• 2.2.12 Teplota varu

Teplota varu je teplota, při které tlak páry nad kapalinou je 101,3 kPa (760 Torrů).

Přístroj. Použije se stejný přístroj jako při stanovení destilačního rozmezí (2.2.11) mimo teploměru. Ten je vložen do hrdla baňky tak, že dolní konec rtuťové nádobky je v jedné rovině s dolním koncem hrdla destilační baňky. Baňka je umístěna na desce z izolačního materiálu s otvorem o průměru 35 mm.

Postup. Do baňky (A) se dá 20,0 ml zkoušené tekutiny a několik kousků pórovité hmoty (varné kaménky). Baňka se zahřívá tak, aby se co nejrychleji dosáhlo varu. Zaznamená se teplota, při které začne stékat kapalina v místě bočního ramene baňky do chladiče.

Zjištěná teplota se koriguje na předepsaný barometrický tlak podle vzorce:

t1=t2+k101,3-b,

v němž značí:

t1 - korigovanou teplotu,

t2 - teplotu zjištěnou při barometrickém tlaku b,

k - korekční faktor (viz tab. 2.2.11-1),

b - barometrický tlak zjištěný v době stanovení (kPa).

• 2.2.13 Stanovení vody destilací

Přístroj (viz obr. 2.2.13-1) se skládá ze skleněné baňky (A), která je připojena skleněnou trubicí (D) k cylindrické kondenzační části (B) zakončené odměrnou trubicí (E) s uzávěrem dělenou po 0,1 ml. Na zabroušené hrdlo části (B) je nasazen zpětný chladič (C). Jako zdroj tepla je vhodnější použít elektrický vařič s reostatem nebo olejovou lázeň. Horní část baňky a spojovací trubice (D) mohou být opatřeny tepelnou izolací.

[image omitted]

Obr. 2.2.13-1 Přístroj pro stanovení vody destilací

Rozměry v milimetrech

Postup. Použije se přístroj dokonale vymytý a vysušený.

Do baňky se odměří 200 ml toluenu R a asi 2,0 ml vody R. Destiluje se dvě hodiny, potom se nechá asi 30 min chladit a odečte se množství předestilované vody s přesností na 0,05 ml.

Do baňky se kvantitativně vpraví množství zkoušené látky navážené s přesností 1 %, které obsahuje 2 ml až 3 ml vody R. Jestliže je zkoušená látka polotuhé konzistence, váží se na lodičce z kovové fólie. Přidá se několik kousků porézního materiálu a baňka se 15 min opatrně zahřívá. Když začne toluen vřít, destiluje se rychlostí asi 2 kapky/s, dokud se neoddestiluje většina vody, a potom se zvýší rychlost destilace asi na 4 kapky/s. Když byla předestilována všechna voda, opláchne se vnitřek chladiče toluenem R. Pokračuje se ještě 5 min v destilaci a pak se odstaví zdroj tepla. Odměrná trubice se nechá ochladit na pokojovou teplotu a nechají se stéci všechny kapky vody ze stěn do odměrné trubice. Když se voda a toluen úplně oddělí, odečte se množství vody a vypočte se procentuální podíl vody v substanci podle vzorce:

100n2-n1m,

v němž značí:

m - hmotnost zkoušené látky v gramech,

n1 - množství vody získané z první destilace v ml,

n2 - celkové množství vody z obou destilací v ml.

• 2.2.14 Teplota tání - kapilární metoda

Teplota tání stanovená kapilární metodou je teplota, při které roztaje poslední částice sloupce léčiva v kapiláře.

Pokud je v článku předepsáno, použije se stejné zařízení i postup pro stanovení dalších faktorů, jako je tvorba menisku, nebo rozmezí teploty tání, které charakterizují chování léčiva při tání.

Zařízení. Zařízení se skládá z:

• vhodné skleněné nádoby obsahující kapalinovou lázeň (např. vodu, tekutý parafín nebo silikonový olej) vybavenou vhodným zahříváním;

• vhodného míchadla zabezpečujícího stejnoměrnou teplotu lázně;

• vhodného teploměru s dělením stupnice nepřevyšujícím interval 0,5 °C a značkou ponoru. Rozsah teploměru je v rozmezí maximálně 100 °C;

• kapilár z tvrdého skla prostého alkálií o vnitřním průměru od 0,9 mm do 1,1 mm a v tloušťce stěny od 0,10 mm do 0,15 mm, zatavených na jednom konci.

Postup stanovení. Pokud není předepsáno jinak, jemně upráškované léčivo se suší ve vakuu nad silikagelem bezvodým R po dobu 24 hod. Do kapiláry se vpraví dostatečné množství látky tak, aby vznikl sloupec o výšce 4 mm až 6 mm. Lázeň se zahřeje na teplotu asi o 10 °C nižší než předpokládaná teplota tání a pak se nastaví rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. Je-li teplota lázně asi 5 °C pod předpokládanou teplotou tání, umístí se kapilára do zařízení. Ve výše popsaném zařízení je kapilára umístěna tak, že její uzavřený konec je u středu rtuťové baňky teploměru a značka ponoru teploměru je při hladině kapaliny lázně. Zaznamená se teplota, při které poslední částice substance přejde do kapalné fáze.

Kalibrace zařízení. Zařízení může být kalibrováno pomocí teplot tání vhodných referenčních látek, jako např. látek doporučených Světovou zdravotnickou organizací.

• 2.2.15 Teplota tání - metoda otevřené kapiláry

Následující metodou se u určitých látek stanoví teplota zkapalnění, běžně nazývaná teplotou tání.

Používá se skleněných kapilár otevřených na obou koncích, dlouhých asi 80 mm, o vnějším průměru 1,4 mm až 1,5 mm a o vnitřním průměru 1,0 mm až 1,2 mm.

Pro stanovení se použije pět kapilár. Každá se naplní do výše asi 10 mm zkoušenou látkou připravenou předepsaným způsobem. Kapilára se ponechá vhodnou dobu při předepsané teplotě. Potom se jedna kapilára připevní na teploměr dělený po 0,2 °C, aby sloupec zkoušené látky byl těsně u rtuťové nádržky teploměru. Teploměr s kapilárou se umístí v kádince, aby nádržka se rtutí byla ve vzdálenosti 1 cm od dna kádinky. Kádinka se naplní vodou do výše 5 cm. Voda se zahřívá tak, aby její teplota stoupala rychlostí 1 °C/min.

Jako teplota tání se zaznamenává teplota, při níž sloupec látky v kapiláře začne stoupat.

Tento postup se opakuje i s dalšími čtyřmi kapilárami. Výslednou teplotu tání udává průměr všech pěti stanovení.

• 2.2.16 Teplota tání - stanovení v kovovém bloku

Okamžitá teplota tání se vypočítá podle vzorce:

tt=t1+t22,

v němž značí:

t1 - první teplotu,

t2 - druhou teplotu odečtenou za dále popsaných podmínek.

Zařízení. Zařízení se skládá z kovového bloku odolného vůči zkoušeným látkám s dobrou tepelnou vodivostí (např. mosaz) a s velmi hladkou leštěnou vrchní plochou. Blok se rovnoměrně zahřívá jemně regulovatelným plynovým kahanem nebo pomocí elektrického ohřevu s jemnou regulací. V bloku je válcovitá dutina dostatečně široká pro vložení teploměru, jehož rtuťový sloupec by měl být ve stejné poloze při kalibraci přístroje i stanovení teploty tání zkoušené látky. Válcovitá dutina je rovnoběžná s horním hladkým povrchem bloku ve vzdálenosti asi 3 mm. Přístroj se kalibruje za použití vhodných látek o známé teplotě tání.

Postup stanovení. Blok se zahřeje vhodnou rychlostí na teplotu asi 10 °C pod očekávanou teplotou tání, potom se nastaví rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. V pravidelných intervalech se vkládá několik částeček upráškované zkoušené látky, pokud je třeba i vysušené za podmínek uvedených u kapilární metody, na blok v sousedství rtuťové nádržky teploměru. Po každém stanovení se povrch bloku očistí. Zaznamená se teplota t1, při které látka taje ihned při prvním kontaktu s povrchem bloku. Další zahřívání bloku se zastaví. Během ochlazování se vkládá opět v pravidelných intervalech několik částeček látky na blok. Povrch bloku se opět očistí po každém stanovení. Zaznamená se teplota t2, při níž zkoušená látka v kontaktu s blokem přestává okamžitě tát.

Kalibrace přístroje. Přístroj se kalibruje s použitím vhodných referenčních látek pro teplotu tání, např. doporučených látek WHO.

• 2.2.17 Teplota skápnutí

Teplota skápnutí je teplota, při níž skápne první kapka zkoumaného léčiva z nádobky za definovaných podmínek.

Zařízení. Zařízení (viz obr. 2.2.17-1) se skládá ze dvou navzájem sešroubovaných kovových pouzder (A) a (B). V pouzdru (A) je upevněn rtuťový teploměr. Kovová nádobka tvaru pohárku (F) je prostřednictvím dvou upínacích pásků (E) volně připevněna ke spodní části pouzdra (B). Pevné podpěry (D) délky 2 mm zaručují přesnou polohu nádobky a jsou současně využity pro zajištění správné polohy teploměru. Otvor (C) ve stěně pouzdra (B) slouží k vyrovnávání tlaku. Nádobka má hladký povrch a hrany výtokového ústí svírají se stěnou nádobky pravý úhel. Spodní část rtuťového teploměru má tvar a velikost odpovídající obrázku. Dělení teploměru je od 0 °C do 110 °C, kde vzdálenost 1 mm odpovídá 1 °C. Rtuťová nádržka teploměru má průměr (3,5 ± 0,2) mm a výšku (6,0 ± 3) mm. Zařízení je umístěno v ose zkumavky dlouhé asi 200 mm a vnějšího průměru asi 40 mm a upevněno ve zkumavce pomocí zátky, kterou prochází teploměr a jež je opatřena boční drážkou. Otvor nádobky má být ve vzdálenosti asi 15 mm ode dna zkumavky. Celé zařízení je ponořeno do kádinky o objemu asi 1 litru naplněné vodou. Dno zkumavky by mělo být asi 25 mm ode dna kádinky. Hladina vody by měla dosahovat k horní části pouzdra (A). K zabezpečení stejné teploty vody se použije míchadlo.

[image omitted]

Obr. 2.2.17-1 Zařízení pro stanovení teploty skápnutí

Rozměry v milimetrech

Postup stanovení. Pokud není uvedeno jinak, naplní se nádobka až po okraj zkoumanou látkou, aniž by se látka zahřívala. Pomocí kopistky se odstraní přebytek léčiva na okrajích nádobky. Po sešroubování pouzder (A) a (B) se nádobka zatlačí do krytu v pouzdře (B) až k pevné podpěře (D). Přebytečné léčivo vytlačené teploměrem se opět odstraní kopistkou. Zařízení se umístí do vodní lázně, jak bylo popsáno výše. Vodní lázeň se zahřívá, a když je teplota asi 10 °C pod očekávanou teplotou skápnutí, nastaví se rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. Zaznamená se teplota, při níž skápne první kapka. Měření se provede třikrát vždy s novým vzorkem léčiva. Rozdíl mezi jednotlivými hodnotami stanovení nesmí být výšší než 3 °C. Teplota skápnutí léčiva je aritmetický průměr ze tří stanovení.

• 2.2.18 Teplota tuhnutí

Teplota tuhnutí je nejvyšší teplota naměřená během tuhnutí podchlazené kapaliny.

Přístroj. Přístroj, viz obr. 2.2.18-1, se skládá ze zkumavky asi o průměru 25 mm a délce 150 mm umístěné uvnitř jiné zkumavky asi o průměru 40 mm a délce 160 mm. Vnitřní zkumavka je uzavřena zátkou, kterou prochází teploměr asi 175 mm dlouhý se stupnicí dělenou po 0,2 °C. Teploměr je upevněn tak, aby jeho spodní část (baňka se rtutí) byla asi 15 mm ode dna zkumavky. Zátka má další otvor, kterým prochází držadlo míchadla, vyrobeného ze skleněné tyčinky nebo jiného vhodného materiálu, vytvarované na jednom konci v pravém úhlu k tyčince do smyčky o vnějším průměru asi 18 mm. Vnitřní zkumavka se svým obalem je umístěna uprostřed kádinky o obsahu 1 l naplněné 20 mm od horního okraje vhodnou chladicí kapalinou. Do chladicí lázně je umístěn teploměr.

Postup. Do vnitřní zkumavky se vpraví dostatečné množství kapaliny nebo předem roztavené zkoušené látky tak, aby byla ponořena celá baňka teploměru, a rychlým ochlazením se stanoví přibližná teplota tuhnutí. Vnitřní zkumavka se přemístí do lázně asi o 5 °C teplejší než přibližná teplota tuhnutí a ponechá se v ní, dokud se všechna látka až na několik posledních krystalků neroztaví. Kádinka se naplní vodou nebo nasyceným roztokem chloridu sodného o teplotě asi o 5 °C nižší než předpokládaná teplota tuhnutí. Vnitřní zkumavka se zasune do vnější, ověří se přítomnost ponechaných zárodečných krystalů a důkladně se míchá, až nastane tuhnutí. Zaznamená se nejvyšší teplota pozorovaná během tuhnutí.

[image omitted]

Obr. 2.2.18-1 Přístroj na stanovení teploty tuhnutí

Rozměry v milimetrech

• 2.2.19 Ampérometrické titrace

Při ampérometrických titracích se bod ekvivalence stanoví měřením změny proudu mezi dvěma elektrodami (indikační elektrodou a srovnávací elektrodou nebo dvěma indikačními elektrodami) ponořenými ve zkoušeném roztoku a udržovanými při konstantním rozdílu napětí v závislosti na množství přidaného odměrného roztoku.

Potenciál indikační elektrody má být dostatečný k dosažení limitního proudu elektrochemicky aktivní látky.

Přístroj. Přístoj má regulovatelný zdroj napětí a citlivý mikroampérmetr. Měřicí systém obvykle sestává z indikační elektrody (např. platinové, rtuťové kapkové, rotující diskové nebo uhlíkové elektrody) a srovnávací elektrody (např. kalomelové nebo argentchloridové elektrody).

Může být také použito zařízení se třemi elektrodami, které obsahuje kromě indikační a srovnávací elektrody též polarizovatelnou pomocnou elektrodu.

Postup. Potenciál indikační elektrody se nastaví na předepsanou hodnotu a vynese se do grafu závislost počátečního proudu a proudu získaného během titrace na množství přidávaného odměrného roztoku. Odměrný roztok se přidá v minimálně třech následných množstvích, jejichž celkový objem se rovná asi 80 % teoretického objemu odpovídajícího předpokládanému bodu ekvivalence. Tyto tři hodnoty mají ležet na přímce. Odměrný roztok se přidává dále za předpokládaný bod ekvivalence v minimálně třech dalších množstvích. Získané hodnoty rovněž mají ležet na přímce. Bod ekvivalence se nachází na průsečíku obou přímek.

V případě amperometrické titrace se dvěma indikačními elektrodami se zaregistruje celá titrační křivka a použije se ke zjištění bodu ekvivalence.

• 2.2.20 Potenciometrické titrace

Při potenciometrických titracích se bod ekvivalence stanoví měřením změn rozdílu potenciálů mezi dvěma elektrodami (indikační elektrodou a srovnávací elektrodou nebo dvěma indikačními elektrodami) ponořenými do titrovaného roztoku v závislosti na množství přidávaného odměrného roztoku.

Měření potenciálu se obvykle provádí za nulového nebo prakticky nulového proudu.

Přístroj. Přístroj (jednoduchý potenciometr nebo elektronické zařízení) obsahuje voltmetr, který umožňuje přesnost odečtu nejméně na 1 mV.

Použitá indikační elektroda závisí na stanovované látce; může to být skleněná elektroda nebo kovová elektroda (platinová, zlatá, stříbrná, rtuťová atd.). Srovnávací elektrodou je obvykle kalomelová nebo argentchloridová elektroda.

Při acidobazických titracích, pokud není uvedeno jinak, se použijí kombinace skleněná - kalomelová elektroda nebo skleněná - argentchloridová elektroda.

Postup. Do grafu se vynesou změny rozdílu potenciálů v závislosti na přidaném množství odměrného roztoku, přičemž se pokračuje v přidávání odměrného roztoku až za očekávaný bod ekvivalence. Bod ekvivalence odpovídá náhlé změně rozdílu potenciálů.

• 2.2.21 Fluorimetrie

Fluorimetrie je metoda, které se používá k měření intenzity fluorescenčního záření emitovaného zkoušenou látkou ve vztahu k intenzitě fluorescenčního záření standardu.

Pracovní postup. Zkoušená látka se rozpustí v rozpouštědle nebo ve směsi rozpouštědel udaných v článku, roztok se přenese do kyvety nebo fluorimetrické trubice (průtokové kyvety) a osvětlí se excitačním, co nejvíce monochromatickým světlem o vlnové délce předepsané v článku.

Měří se intenzita emitovaného záření v úhlu 90° vzhledem k excitačnímu paprsku po průchodu filtrem, který propouští zejména záření při vlnové délce fluorescence. Může být použit také jiný typ zařízení, pokud je zajištěno, že získané výsledky jsou identické.

Pro stanovení se nejprve umístí do přístroje rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel použitých k rozpouštění stanovované látky a přístroj se nastaví na nulu. Vloží se roztok standardu a nastaví citlivost přístroje tak, aby odečtená hodnota byla větší než 50. Při změně šířky štěrbiny je třeba znovu nastavit nulu a měřit intenzitu fluorescence standardu. Nakonec se vloží roztok neznámé koncentrace a odečte se na přístroji intenzita fluorescence. Koncentrace cx zkoušené látky v měřeném roztoku se vypočítá ze vztahu:

cx=IxcsIs,

v němž značí:

cs - koncentraci roztoku standardu,

Ix - intenzitu fluorescence emitované roztokem zkoušené látky,

Is - intenzitu fluorescence emitované roztokem standardu.

Pokud intenzita fluorescence není přímo úměrná koncentraci, je vhodnější použít pro měření kalibrační křivku. V některých případech může být měření provedeno vzhledem k pevnému standardu (např. fluorescenčnímu sklu nebo roztoku jiné fluorescenční látky). V takových případech se koncentrace zkoušené látky stanoví s použitím předem sestrojené kalibrační křivky za stejných podmínek.

• 2.2.22 Atomová emisní spektrometrie

Atomová emisní spektrometrie je metoda na stanovení koncentrace prvku v látce měřením intenzity jedné z emisních čar atomové páry prvku generované z látky. Stanovení se provádí při vlnové délce odpovídající této emisní čáře.

Přístroj. Skládá se hlavně z atomizátoru stanovovaného prvku (plamen, plazma, oblouk atd.), monochromátoru a detektoru. Pokud je atomizátorem plamen, je vhodné použít vodu R jako rozpouštědlo na přípravu zkoušených a porovnávacích roztoků. Také lze použít organická rozpouštědla, zjistí-li se, že rozpouštědlo nebude ovlivňovat stabilitu plamene.

Pracovní postup. Atomový emisní spektrometr se obsluhuje ve shodě s výrobními předpisy při předepsané vlnové délce. Roztok slepé zkoušky se aplikuje do atomizátoru a signál přístroje se nastaví na nulu. Vnese se nejkoncentrovanější porovnávací roztok a citlivost se nastaví tak, aby se získal vhodný signál.

Stanovení se provádějí porovnáváním s porovnávacími roztoky o známých koncentracích stanovovaného prvku buď metodou přímé kalibrace (Metoda I), nebo metodou standardních přídavků (Metoda II).

Metoda I - Přímá kalibrace

Připraví se roztok analyzované látky (zkoušený roztok), jak je předepsáno, a nejméně tři porovnávací roztoky stanovovaného prvku, jejichž koncentrace zahrnují očekávanou hodnotu ve zkoušeném roztoku. Zkoumadla používaná k přípravě zkoušeného roztoku se přidávají k porovnávacím roztokům ve stejné koncentraci.

Zkoušený roztok a každý porovnávací roztok se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Po každém stanovení se přístroj propláchne roztokem slepé zkoušky a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.

Sestrojí se kalibrační křivka z průměru signálů získaných z porovnávacích roztoků a z takto získané křivky se zjistí koncentrace prvku ve zkoušeném roztoku.

Metoda II - Standardní přídavky

Do nejméně třech stejných odměrných baněk se přidají stejné objemy roztoků analyzované látky (zkoušený roztok) připravené, jak je předepsáno. Do každé baňky kromě jedné se přidá postupně zvětšující se objem porovnávacího roztoku obsahujícího známou koncentraci stanovovaného prvku, aby se zhotovila série roztoků obsahujících stále stoupající koncentrace známého prvku, které dají odezvy v lineární části křivky. Obsah každé baňky se zředí rozpouštědlem a doplní po značku.

Každý z roztoků se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Po každém stanovení se přístroj propláchne rozpouštědlem a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.

Vypočítá se lineární rovnice grafu použitím metody nejmenších čtverců a z toho se odvodí koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.

Alternativně se vynese do grafu průměr signálů proti přidanému množství stanovovaného prvku. Extrapoluje se čára spojující body na grafu do přetnutí osy koncentrace. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os představuje koncentraci stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.

Pokud je požadována technika pevného vzorku,podrobné detaily postupu jsou uvedeny v článku.

• 2.2.23 Atomová absorpční spektrometrie

Atomová absorpční spektrometrie je metoda na stanovení koncentrace prvku v látce měřením absorpce záření atomovými parami prvku generovanými z látky. Stanovení se provádí při vlnové délce jedné z absorpčních čar stanovovaného prvku.

Přístroj. Skládá se ze zdroje záření, atomizátoru stanovovaného prvku (plamen, pícka atd.), monochromátoru a detektoru.

Způsob zavádění analyzované látky závisí na typu používaného atomizátoru. Pokud je to plamen, látka se zmlžuje a voda R je vhodné rozpouštědlo na přípravu zkoušených a porovnávacích roztoků. Organická rozpouštědla se též mohou použít, pokud je splněna podmínka, že rozpouštědlo neovlivňuje stabilitu plamene. Jestliže se použije pícka, látky mohou být navážené a rozpuštěné ve vodě R nebo v organickém rozpouštědle, ale s touto technikou je možné analyzovat též přímo pevné vzorky.

Atomová pára může být též generovaná mimo spektrometr, např. metoda studených par pro rtuť nebo určité hydridy. U rtuti jsou atomy generované chemickou redukcí a vzniklé atomové páry jsou transportovány proudem inertního plynu do absorpční kyvety instalované v optické dráze přístroje. Hydridy jsou buď míšeny s plynem napájejícím hořák, nebo jsou transportovány inertním plynem do vyhřívané kyvety, v níž jsou disociovány na atomy.

Pracovní postup. Atomový absorpční spektrometr se obsluhuje ve shodě s předpisy výrobce při nastavené vlnové délce. Roztok slepé zkoušky se aplikuje do atomizátoru a signál přístroje se nastaví tak, že ukazuje maximum propustnosti. Vnese se nejkoncentrovanější porovnávací roztok a citlivost se nastaví tak, aby se získal vhodný signál absorbance. Stanovení se provádí porovnáním s porovnávacími roztoky známých koncentrací stanovovaného prvku buď metodou přímé kalibrace (Metoda I), nebo metodou standardních přídavků (Metoda II).

Metoda I - Přímá kalibrace

Připraví se roztok analyzované látky (zkoušený roztok), jak je předepsáno, a nejméně tři porovnávací roztoky stanovovaného prvku, jejichž koncentrace zahrnují očekávanou hodnotu ve zkoušeném roztoku. Zkoumadla používaná k přípravě zkoušeného roztoku se přidávají k porovnávacím roztokům a použijí se i při slepé zkoušce ve stejné koncentraci.

Zkoušený roztok a každý porovnávací roztok se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Přístroj se vždy propláchne roztokem slepé zkoušky a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.

Použije-li se pícky, mezi měřením signálů se vypaluje.

Sestrojí se kalibrační křivka z průměru signálů získaných porovnávacích roztoků a ze získané křivky se vypočte koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.

Pokud je požadována technika pevného vzorku, podrobné detaily postupu jsou uvedeny v článku.

Metoda II - Standardní přídavky

Do nejméně tří stejných odměrných baněk se přidají stejné objemy roztoku analyzované látky (zkoušený roztok) připravené, jak je předepsáno. Do každé baňky kromě jedné se přidá postupně zvětšující se objem porovnávacího roztoku obsahujícího známou koncentraci stanovovaného prvku, aby se připravila série roztoků obsahujících stoupající koncentraci známého prvku, které dají odezvu v lineární části křivky. Obsah každé baňky se zředí rozpouštědlem a doplní se jím po značku. Každý z roztoků se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Pokaždé se přístroj propláchne rozpouštědlem a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.

Použije-li se pícka, mezi měřením signálů se vypaluje.

Vypočítá se lineární rovnice grafu použitím metody nejmenších čtverců a z toho se odvodí koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.

Alternativně se vynese do grafu průměr signálů proti přidanému množství stanovovaného prvku. Extrapoluje se čára spojující body na grafů do přetnutí osy koncentrace. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os udává koncentraci stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.

Pokud je požadována technika pevného vzorku, všechny podrobnosti postupu jsou uvedeny v článku.

2.2.24 Absorpční spektrofotometrie v infračervené oblasti [image omitted]

Spektrofotometry v infračervené oblasti se používají pro záznam spekter v oblasti od 4000 cm^-1 do 670 cm^-1 (2,5 μm až 15 μm) nebo v některých případech až do 200 cm^-1 (50 μm). Spektrofotometry s Fourierovou transformací využívají polychromatické záření a Fourierovou transformací se převádí spektrum z původních dat do frekvenční reprezentace. Mohou být také použity spektrofotometry opatřené optickým systémem schopným vytvářet monochromatické záření v měřené oblasti. Normálně je spektrum dáno jako funkce transmitance, poměrem intenzity propuštěného a dopadajícího záření.

Absorbance A je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T a je vyjádřena vztahem:

A=log10⁡1T=log10⁡I0I,

v němž značí:

T - I/I0,

I0 - intenzitu dopadajícího monochromatického záření,

I - intenzitu prošlého monochromatického záření.

Příprava vzorku

Pro záznam s využitím propustnosti nebo absorpce. Látka se upraví jedním z následujících postupů.

Kapaliny. Kapalina se zkouší buď jako film mezi dvěma destičkami propustnými pro infračervené záření, nebo v kyvetě vhodné tloušťky rovněž propustné pro infračervené záření.

Kapaliny nebo pevné látky v roztoku. Připraví se roztok ve vhodném rozpouštědle. Zvolí se koncentrace a tloušťka kyvety tak, aby se získalo vhodné spektrum. Dobré výsledky se zpravidla získají s koncentracemi od 10 g/l do 100 g/l pro tloušťku kyvety 0,5 mm až 0,1 mm. Absorpce způsobená rozpouštědlem by měla být kompenzována vložením podobné kyvety s použitým rozpouštědlem do referenčního paprsku.

Pevné látky. Pevné látky se zkoušejí dispergované ve vhodné kapalině (suspenze) nebo v pevné látce (halogenidová tableta) podle toho, co je vhodnější. Je-li to v článku předepsáno, připraví se film z taveniny mezi dvěma destičkami propustnými pro infračervené záření.

(a) Suspenze. Rozetře se malé množství zkoušené látky s minimálním množstvím tekutého parafinu R nebo jiné vhodné kapaliny; k přípravě vhodné suspenze stačí zpravidla 5 mg až 10 mg zkoušené látky. Suspenze se stlačí mezi dvě destičky propustné pro infračervené záření.

(b) Tableta. Není-li uvedeno jinak, rozetřou se 1 mg až 2 mg zkoušené látky s 300 mg až 400 mg jemně práškovaného a vysušeného bromidu draselného R nebo chloridu draselného R. Tato množství postačují zpravidla k přípravě tablety o průměru 13 mm a k získání spektra vhodné intenzity. Směs se pečlivě rozetře, stejnoměrně se jí naplní vhodná forma a slisuje se ve vakuu tlakem asi 800 MPa (8 t.cm^-2). Z různých příčin mohou vzniknout špatné tablety: např. nedostatečné nebo přílišné roztírání, vlhkost nebo jiné nečistoty v dispergujícím prostředí a nedostatečné rozmělnění částeček. Tableta se nepoužije, vykazuje-li při vizuální kontrole nejednotnou propustnost, nebo je-li transmitance při asi 2000 cm^-1 (5 μm) v nepřítomnosti specifického absorpčního pásu menší než 75 % bez kompenzace.

Plyny. Plyny se zkoušejí v kyvetě propustné pro infračervené záření mající optickou dráhu asi 100 mm. Kyveta se evakuuje a naplní se na požadovaný tlak pomocí kohoutu nebo jehlového ventilu při použití vhodné trubice pro převod plynu mezi kyvetou a nádobou obsahující zkoušenou látku. Je-li to nutné, upraví se tlak v kyvetě na tlak atmosférický použitím plynu propustného pro infračervené záření (např. dusíku R nebo argonu R). K odstranění interference absorpce způsobené vodou, oxidem uhličitým nebo jinými atmosférickými plyny se vloží do referenčního paprsku stejná kyveta, která je buď evakuována, nebo naplněna plynem propustným pro infračervené záření.

Pro záznam s využitím mnohonásobné reflexe

Je-li tento záznam předepsán v článku, upraví se látka jednou z následujících metod.

Roztoky. Látka se rozpustí ve vhodném rozpouštědle za podmínek uvedených v článku. Roztok se odpaří na thalliumbromido-jodidové destičce nebo na jiné vhodné destičce.

Pevné látky. Látka se homogenně rozprostře na thalliumbromido-jodidové nebo jiné vhodné destičce.

Identifikace s použitím referenčních látek

Stejným způsobem se upraví jak zkoušená, tak i referenční látka a za stejných podmínek se zaznamenají spektra od 4000 cm^-1 do 670 cm^-1 (2,5 μm až 15 μm). Minima propustnosti (absorpční maxima) spektra zkoušené látky odpovídají polohou i relativní intenzitou hodnotám referenční látky (CRL).

Vykazují-li spektra zaznamenaná v pevném stavu rozdíly v polohách minim propustnosti (absorpčních maxim), zpracuje se stejným způsobem zkoušená i referenční látka tak, aby vykrystalizovaly nebo vznikly ve stejné formě, nebo se postupuje tak, jak je předepsáno v článku, a pak se zaznamenají spektra.

Identifikace s použitím referenčních spekter

Kontrola rozlišovací schopnosti. Zaznamená se spektrum 0,04 mm silného polystyrenového filmu. Rozdíl x (viz obr. 2.2.24-1) mezi procenty transmitance při maximu propustnosti A při 2870 cm^-1 (3,48 μm) a minimu propustnosti B při 2849,5 cm^-1 (3,51 μm) by měl být větší než 18. Rozdíly mezi procenty transmitance při maximu propustnosti C při 1589 cm^-1 (6,29 μm) a minimu propustnosti D při 1583 cm^-1 (6,32 μm) by měl být větší než 12.

Ověření stupnice vlnočtů. Stupnice vlnočtů může být ověřena použitím polystyrenového filmu, který má minima propustnosti (absorpční maxima) při vlnočtech v cm^-1 uvedených v tab. 2.2.24-1.

Tab. 2.2.24-1 Minima propustnosti (a přijatelná tolerance) polystyrenového filmu v cm^-1.

3060,0 (±1,5)
2849,5 (±1,5)
1942,9 (±1,5)
1601,2 (±1,0)
1583,0 (±1,0)
1154,5 (±1,0)
1028,3 (±1,0)

Pracovní postup. Zkoušená látka se připraví podle návodu uvedeného u referenčního spektra. Za pracovních podmínek, které byly použity při kontrole rozlišovací schopnosti, se zaznamená spektrum zkoušené látky a na něj se superponují absorpční pásy polystyrenu při 2849,5 cm^-1 (3,51 μm), 1601,2 cm^-1 (6,25 μm) a 1028,3 cm^-1 (9,72 μm). Porovnají se obě spektra a maxima polystyrenu uvedená výše. Použijí-li se polohy maxim polystyrenu jako referenční hodnoty, pak polohy význačných maxim spektra zkoušené látky musí odpovídat význačným maximům referenčního spektra s odchylkou nejvýše 0,5 % vlnočtové stupnice. Relativní intenzity maxim obou spekter by měly být shodné.

Nečistoty v plynech

Pro analýzu nečistot v plynech se použije kyveta propustná pro infračervené záření s vhodnou optickou dráhou (např. 1 m až 20 m). Naplní se způsobem uvedeným v odstavci Plyny. Detekce a kvantifikace nečistot se provede podle postupu uvedeného v článku.

[image omitted]

Obr. 2.2.24-1 Typické spektrum polystyrenu používané při kontrole rozlišovací schopnosti

• 2.2.25 Absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblastí

Stanovení absorbance. Absorbance A roztoku je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T pro monochromatické světlo a je vyjádřena vztahem:

A=log101/T=log10I0/I,

v němž značí:

T - I/I0,

I0 - intenzitu dopadajícího monochromatického světelného toku,

I - intenzitu prošlého monochromatického světelného toku.

V homogenním prostředí měřená absorbance (A) závisí na tloušťce měřené vrstvy (b), kterou světlo prochází, a na koncentraci absorbující látky v roztoku (c) podle vztahu:

A=ε.c.b.

v němž značí:

ε - molární absorpční koeficient (molární absorptivita), je-li koncentrace vyjádřena v mol/l (c) a tloušťka vrstvy v cm.

Výraz A1cm1% je specifická absorbance, která vyjadřuje absorbanci roztoku látky o koncentraci 10 g/l měřenou v 1 cm vrstvě při určité vlnové délce:

A1cm1%=10εMr.

Není-li uvedeno jinak, měří se absorbance při předepsané vlnové délce v 1 cm vrstvě při (20± 1) °C a měření se provádí proti použitému rozpouštědlu nebo směsi rozpouštědel. Absorbance použitého rozpouštědla měřená proti vzduchu při předepsané vlnové délce by neměla být vyšší než 0,4, a je přednostně menší než 0,2. Absorpční spektrum se vynese jako závislost absorbance nebo její funkce (osa úseček) na vlnové délce nebo na její funkci (osa pořadnic).

Jestliže je v článcích uváděna jedna hodnota vlnové délky pro maximum absorpce, může se nalezená hodnota od této lišit nejvýše o ±2 nm.

Zařízení. Spektrofotometry vhodné pro měření v ultrafialové a viditelné oblasti spektra se skládají z optického systému schopného poskytovat monochromatické světlo v rozsahu 200 nm až 800 nm a ze zařízení vhodného pro měření absorbance.

Kontrola vlnových délek. Správnost stupnice vlnových délek se ověřuje pomocí hodnot absorpčních maxim roztoku chloristanu holmitého R. Poloha čar pro vodíkovou, resp. deuteriovou lampu a poloha čar pro rtuťové páry jsou uvedeny v tab. 2.2.25-1. Povolená tolerance je ±1 nm pro ultrafialovou oblast a ±3 nm pro viditelnou oblast.

Tab. 2.2.25-1 Maxima absorpce roztoku chloristanu holmitého R a poloha čar pro vodíkovou a deuteriovou lampu

241,15 nm (Ho)	404,66 nm (Hg)
253,7 nm (Hg)	435,83 nm (Hg)
287,15 nm (Ho)	486,0 nm (Dbeta)
302,25 nm (Hg)	486,1 nm (Hbeta)
313,16 nm (Hg)	536,3 nm (Ho)
334,15 nm (Hg)	546,07 nm (Hg)
361,5 nm (Ho)	576,96 nm (Hg)
365,48 nm (Hg)	579,07 nm (Hg)

Kontrola absorbance. Správnost stupnice absorbanci se ověřuje roztokem dichromanu draselného R při vlnových délkách uvedených v tab. 2.2.25-2, v níž jsou pro každou vlnovou délku uvedeny přesné hodnoty specifické absorbance a povolené limity. Tolerance pro absorbanci je ±0,01.

Pro kontrolu absorbance se použije roztoku dichromanu draselného R připraveného takto: rozpustí se 57,0 mg až 63,0 mg dichromanu draselného R, předtím vysušeného při 130 °C do konstantní hmotnosti, v kyselině sírové 0,005 mol/l RS a doplní se jí na 1000,0 ml.

Tab. 2.2.25-2

Vlnová délka v nm	A1%1cm	Maxima tolerance
235	124,5	122,9 až 126,2
257	144,0	142,4 až 145,7
313	48,6	47,0 až 50,3
350	106,6	104,9 až 108,2

Absorbance roztoku dichromanu draselného obsahujícího přesně 60,06 mg K2Cr2O7 v 1000,0 ml roztoku kyseliny sírové 0,005 mol/l RS byly použity jako základ pro tab. 2.2.25-2. Hodnoty absorbance tohoto roztoku měřené při tloušťce vrstvy 1 cm jsou uvedeny v tab. 2.2.25-3.

Tab. 2.2.25-3

235 nm	0,748
257 nm	0,865
313 nm	0,292
350 nm	0,640

Limit rozptýleného záření může být sledován při daných vlnových délkách pomocí vhodných roztoků nebo filtrů. Např. absorbance roztoku chloridu draselného R (12 g/l) měřená v 1 cm vrstvě při 200 nm by měla být vyšší než 2 v porovnání s vodou A jako kontrolní kapalinou.

Rozlišovací schopnost (pro kvalitativní analýzu). Pokud je to předepsáno v článku, je třeba provést měření rozlišovací schopnosti přístroje takto: zaznamená se spektrum roztoku toluenu R (0,02% V/V) v hexanu R. Minimální poměr absorbance v maximu při 269 nm a absorbance v minimu při 266 nm je uveden v článku.

Spektrální šířka štěrbiny (pro kvantitativní analýzu). Abychom předešli při měření chybám způsobeným spektrální šířkou štěrbiny při použití přístroje, kde šířka štěrbiny při zvolené vlnové délce může být měněna, měla by být šířka štěrbiny malá ve srovnání s pološířkou absorpčního pásu, ale současně by měla být co největší, abychom získali vysokou hodnotu I0. V každém případě šířka štěrbiny přístroje by měla být vždy taková, aby při jejím dalším zmenšení nedocházelo ke změnám v odečtu absorbance.

Kyvety. Povolená tolerance vnitřní vzdálenosti protilehlých stěn používaných kyvet je ±0,005 cm. Naplní-li se týmž rozpouštědlem, měly by kyvety pro zkoušený roztok a pro porovnávací kapalinu mít stejnou transmitanci. V opačném případě je třeba zavést příslušnou korekci.

Kyvety je nutno čistit a zacházet s nimi opatrně.

• 2.2.26 Papírová chromatografie

Vzestupná papírová chromatografie

Zařízení. Zařízení se skládá ze skleněné komory vhodných rozměrů pro použitý chromatografický papír. Horní část komory je zabroušená a opatřená dobře těsnícím víkem. V horní části komory je zařízení umožňující zavěšení chromatografického papíru a jeho ponoření do mobilní fáze bez otevření komory. Na dně komory je umístěna miska obsahující mobilní fázi, do které může být papír ponořen. Jako chromatografický papír se použije vhodný filtrační papír nastříhaný do pruhů dostatečné délky, ne užších než 2,5 cm; papír je nastříhán tak, aby mobilní fáze protékala ve směru vláken papíru.

Pracovní postup. Mobilní fáze, která je předepsána v článku, se nalije do misky na dně komory do výšky 2,5 cm. Pokud je uvedeno v článku, nalije se stacionární fáze i mezi stěny komory a misku. Komora se uzavře a ponechá se stát po dobu 24 h při teplotě 20 °C až 25 °C. V uvedeném intervalu teplot se komora udržuje i v průběhu další analýzy. Na papír se vyznačí měkkou tužkou horizontální linie (start) ve vzdálenosti 3 cm od jednoho konce. Mikropipetou se nanese na start ve formě skvrny objem roztoku, který je uveden v článku. Jestliže celkový objem nanášeného roztoku by vytvořil skvrnu o větším průměru než 10 mm, roztok se nanáší po částech v opakovaných dílčích dávkách tak, aby se před každým dalším nanášením rozpouštědlo odpařilo. Chromatografuje-li se na stejném pruhu papíru více než jeden vzorek, vzdálenost mezi sousedními skvrnami na startu nemá být menší než 3 cm. Papír s naneseným vzorkem se vloží do komory, která se uzavře víkem, a ponechá stát 1 h 30 min. Potom se papír ponoří do mobilní fáze a vyvíjí se do předepsané vzdálenosti nebo po předepsanou dobu. Papír se vyjme a ponechá uschnout na vzduchu. Během vyvíjení se papír chrání před přímým světlem.

Sestupná papírová chromatografie

Zařízení. Zařízení se skládá ze skleněné komory vhodných rozměrů pro použitý chromatografický papír. Horní část komory je zabroušená a opatřená dobře těsnícím víkem. Víko má středový otvor o průměru asi 1,5 cm uzavíratelný těžkou skleněnou deskou nebo zátkou. V horní části komory je umístěn žlábek pro rozpouštědlo se zařízením k zavěšení chromatografického papíru. Na každé straně žlábku jsou paralelně nad jeho horními okraji umístěny dvě skleněné vodicí tyče podpírající papír tak, aby žádná jeho část se nedotýkala stěn komory. Chromatografický papír je tvořen vhodným filtračním papírem nastříhaným na pruhy dostatečné délky a vhodné šíře, tj. mezi 2,5 cm a délkou žlábku; papír je nastříhán tak, aby mobilní fáze protékala ve směru vláken papíru.

Pracovní postup. Na dno komory se nalije rozpouštědlo uvedené v článku do výše 2,5 cm. Komora se uzavře a ponechá stát 24 h při teplotě 20 °C až 25 °C. V tomto rozmezí teplot se komora v průběhu analýzy udržuje. Na papír se vyznačí měkkou tužkou horizontální linie (start) v takové vzdálenosti od jednoho konce, aby po zajištění tohoto konce papíru ve žlábku s rozpouštědlem zbytek papíru volně splýval přes vodicí tyč a start byl několik cm pod vodicí tyčí a paralelně s ní. Pomocí mikropipety se nanese na start objem roztoku, který je uveden v článku. Jestliže celkový objem, který je nutno nanést, by vytvořil skvrnu o větším průměru než 10 mm, je nutno nanášet roztok po částech tak, aby se před každým následujícím nanášením rozpouštědlo odpařilo. Chromatografuje-li se na tomtéž pruhu papíru více než jeden vzorek, pak vzdálenost mezi sousedními skvrnami nemá být menší než 3 cm. Papír s naneseným vzorkem se vloží do komory, která se uzavře víkem, a ponechá se stát 1 h 30 min. Do žlábku se otvorem ve víku vpraví dostatečné množství mobilní fáze, komora se uzavře a papír se vyvíjí do předepsané vzdálenosti nebo po předepsanou dobu. Papír se vyjme z komory a ponechá uschnout na vzduchu. Během vyvíjení se papír chrání před přímým světlem.

• 2.2.27 Tenkovrstvá chromatografie

Tenkovrstvá chromatografie je separační metoda, u které stacionární fázi tvoří vhodný materiál nanesený v rovnoměrné tenké vrstvě a fixovaný na skleněný, kovový nebo plastický podklad (deska nebo fólie). K separaci dochází migrací rozpuštěných látek tenkou vrstvou v rozpouštědle nebo vhodné směsi rozpouštědel (mobilní fáze).

Pokud není uvedeno jinak, použije se následující zařízení, desky a postup.

Zařízení

Zařízení se skládá:

• z desek nebo fólií s vrstvami hotovými nebo připravenými (jak je popsáno níže) vhodné velikosti (obvykle 100 mm x 100 mm nebo 200 mm x 200 mm) pro nanášení chromatografovaných roztoků a vyvíjení do předepsané vzdálenosti (dráhy). Tloušťka vrstvy je obvykle 0,1 mm až 0,3 mm,

• z chromatografické komory s plochým nebo dvojžlábkovým dnem z inertního transparentního materiálu vhodné velikosti pro použité desky nebo fólie a opatřené dobře těsnícím víkem,

• z mikropipet, mikroinjekčních stříkaček, kalibrovaných kapilár pro jedno použití nebo jiného nanášecího zařízení, které je vhodné pro správné nanášení roztoků.

Desky

Chromatografie se provádí s použitím desek s vrstvami hotovými nebo připravenými, jak je popsáno níže. Oba typy vrstev vyhovují požadavku ověření detekční schopnosti, je-li předepsáno, i požadavku ověření separační schopnosti. Tyto zkoušky se provádějí současně s chromatografií zkoušené látky nanesením předepsaných porovnávacích roztoků. Je-li nutné, vrstvy je možno před použitím aktivovat zahřátím při 100 °C až 105 °C po dobu 1 h.

Příprava vrstev

Připraví se homogenní suspenze stacionární fáze a vhodným zařízením se nanese na pečlivě vyčištěné desky vrstva o síle 0,1 mm až 0,3 mm. Desky s vrstvami se ponechají schnout na vzduchu a potom se zahřívají v sušárně při teplotě 100 °C až 105 °C po dobu 1 h. Před použitím desky se odstraní úzký pruh vrstvy stacionární fáze z obou stran desky, aby tyto pruhy byly v průběhu vyvíjení vertikálně.

Pracovní postup

Stěny chromatografické komory se vyloží filtračním papírem. Do chromatografické komory se podle její velikosti nalije takové množství mobilní fáze, aby po impregnaci filtračního papíru byla na dně komory vrstva mobilní fáze o výšce 5 mm až 10 mm. Komora se uzavře víkem a ponechá se stát při 20 °C až 25 °C po dobu 1 h.

Na vrstvu se nanese ve vzdálenosti asi 15 mm až 20 mm od spodního okraje a nejméně 10 mm od bočního okraje předepsaný objem roztoků v dostatečně malých dávkách, aby vznikly kruhové skvrny (o průměru 2 mm až 6 mm) nebo, je-li předepsáno, skvrny tvaru proužků (10 mm až 20 mm x 2 mm až 6 mm). Roztoky se nanášejí na start paralelně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 10 mm.

Po odpaření rozpouštědla z nanášených roztoků se deska vloží do chromatografické komory tak, aby byla co nejvíce ve vertikální poloze a skvrny byly nad hladinou mobilní fáze. Chromatografická komora se uzavře a udržuje při teplotě 20 °C až 25 °C. Deska se vyjme z komory, když mobilní fáze dosáhne vzdálenosti předepsané v článku, vysuší se a chromatogram se deteguje předepsaným způsobem.

Pro dvojrozměrnou chromatografií se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.

Ověření separační schopností

Požadavky na ověření separační schopnosti jsou uvedeny v příslušných článcích.

Ověření detekční schopností

Detekční schopnost je dostatečná, jsou-li skvrny získané na chromatogramu s nejzředěnějším porovnávacím roztokem jasně viditelné.

• 2.2.28 Plynová chromatografie

Plynová chromatografie je separační metoda, ve které mobilní fází je plyn (nosný plyn) a stacionární fází naplněnou do kolony je buď pevná látka, nebo kapalina, kterou je pokryt pevný inertní nosič, nebo kapalný film rovnoměrně nanesený na stěnách kolony.

Plynová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce a/nebo rozdělování.

Přístroj. Přístroj se skládá ze zdroje plynu, dávkovacího zařízení, chromatografické kolony, detektoru a vyhodnocovacího zařízení. Kolona je obvykle skleněná nebo z nerezové oceli a obsahuje stacionární fázi. Nosný plyn protéká kolonou kontrolovanou rychlostí do detektoru.

Stanovení je prováděno buď při konstantní teplotě, nebo podle daného teplotního programu.

Použitý detektor musí umožňovat stanovení množství sledovaných látek přítomných v eluátu z kolony. Obvykle je založen na principu plamenné ionizace, tepelné vodivosti, tepelné ionizace nebo elektronového záchytu.

Pracovní postup. Kolona, dávkovači zařízení a detektor se stabilizují při předepsaných teplotách. Připraví se roztok zkoušené látky a porovnávací roztok nebo roztoky, jak je předepsáno. Použitím porovnávacích roztoků se určí vhodné nastavení parametrů přístroje a množství, které má být nastřikováno, aby byla získána vhodná odezva. Provedou se opakované nástřiky, aby byla ověřena reprodukovatelnost odezvy, a je-li zapotřebí, určí se počet teoretických pater.

Nastříknou se roztoky a zaznamenají se výsledné chromatogramy. Provedou se opakované nástřiky, aby byla ověřena reprodukovatelnost odezvy. Určí se plochy píků nebo alternativně výšky píků odpovídajících sledovaným složkám, je-li faktor symetrie píku vypočítán, jak je uvedeno níže, mezi 0,80 a 1,20. Při měřeních vyžadujících teplotní program má být určována plocha píků. Je-li použit vnitřní standard, prověří se, zda žádný pík sledované látky není překryt píkem vnitřního standardu.

Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li předepsáno, vypočte se procentuální obsah jedné nebo více složek sledované látky určením plochy píku nebo píků z celkové plochy všech píků, vyjma píků rozpouštědla nebo kterýchkoliv přidaných látek (normalizační postup). V tomto případě je doporučeno použití zesilovače se širokým rozsahem a automatického integrátoru.

Faktor symetrie píku se vypočte z výrazu:

b0,052A,

v němž značí:

b0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky,

A - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině výšky píku.

Rozlišení (Rs) se vypočte ze vzorce:

Rs=1,18tRb-tRab0,5a+b0,5b,

tRb>tRa

v němž značí:

tRb a tRa- vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),

b0,5a a b0,5b šířky píků v polovině jejich výšky (mm).

Výsledky stanovení lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi měřenými píky v chromatogramu je větší než 1,0, pokud není předepsáno jinak.

Počet teoretických pater (n) se vypočte z údajů získaných za izotermických podmínek ze vzorce:

n=5,54tRb0,52,

v němž značí:

tR - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku (mm),

b0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky (mm).

Kapacitní poměr (Dm) (známý též jako kapacitní faktor) je definován jako:

Dm=množství rozpuštěných látek ve stacionární fázimnožství rozpuštěných látek v mobilní fázi=KVsVm,

v němž značí:

K - rovnovážný rozdělovači koeficient,

Vs - objem stacionární fáze,

Vm - objem mobilní fáze.

Kapacitní poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím vzorce:

Dm=tR-tR'tR',

v němž značí:

tR - vzdálenost v mm podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího složce,

tR‘, - vzdálenost v mm podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.

Poměr signálu k šumu (S/N) je počítán ze vzorce:

S/N=2Hhn,

v němž značí:

H - výšku píku odpovídajícího dané složce na chromatogramu získaném s předepsaným porovnávacím roztokem,

hn - absolutní hodnotu největší výchylky signálu šumu od základní linie na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce a sledovaného v rozsahu úměrném 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku a pozorovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.

Head-space plynová chromatografie

Head-space plynová chromatografie je metoda zvláště vhodná pro rozdělení a stanovení těkavých látek přítomných v pevných nebo kapalných vzorcích. Metoda je založena na analýze plynné fáze, která je v rovnováze s pevnou nebo kapalnou fází.

Přístroj. Přístroj se skládá z plynového chromatografu opatřeného zařízením pro zavádění zkoušeného vzorku, které může být připojeno k modulu, jenž automaticky ovládá tlak a teplotu. Je-li to nutné, může být připojeno zařízení pro eliminaci rozpouštědel. Analyzovaný vzorek je umístěn do lahvičky opatřené vhodným uzávěrem. Další částí je systém ventilů umožňující průchod nosného plynu. Lahvička je umístěna do termostatované nádobky vyhřívané na vhodnou teplotu dle povahy zkoušeného vzorku. Vzorek je zahříván na tuto teplotu dostatečně dlouho, aby byla ustavena rovnováha mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou fází.

Nosný plyn je zaváděn do nádobky a po předepsaném čase se otevře vhodný ventil, který umožní expanzi plynu unášejícího zplynitelné látky do chromatografické kolony.

Místo chromatografu speciálně vybaveného pro zavádění vzorků je též možné použít vzduchotěsnou stříkačku a běžný chromatograf. Ustavení rovnováhy pak probíhá v oddělené komůrce a plynná fáze je vedena na kolonu při zajištění podmínek zaručujících, že nedojde k porušení rovnováhy.

Pracovní postup. Použitím porovnávacích vzorků se určí vhodné instrumentální podmínky k dosažení vhodné odezvy.

• a) Přímá kalibrace

Do stejných lahviček se umístí odděleně zkoušené látky a všechny porovnávací vzorky, jak je předepsáno v článku, přičemž se zabrání kontaktu mezi dávkovacím zařízením a vzorky. Lahvičky se hermeticky uzavřou a vloží do termostatovaného prostoru udržovaného na teplotě a tlaku předepsaných v článku.

Po ustavení rovnováhy se provede chromatografická analýza za předepsaných podmínek.

• b) Standardní přídavek

Do sady stejných vhodných lahviček se umístí stejné objemy zkoušeného přípravku. Do všech lahviček kromě jedné se přidají vhodná množství porovnávacích vzorků, které obsahují známé koncentrace stanovované látky, takže vznikne série přípravků obsahujících postupně vzrůstající koncentrace této látky. Lahvičky se hermeticky uzavřou a vloží se do termostatovaného prostoru udržovaného na teplotě a tlaku předepsaných v článku. Po ustavení rovnováhy se provede chromatografická analýza za předepsaných podmínek.

Metodou nejmenších čtverců se vypočítá lineární rovnice přímky a z ní se určí koncentrace stanovované látky ve zkoušeném přípravku.

Alternativně se vynesou do grafu střední hodnoty naměřených dat proti přidaným množstvím stanovované látky. Extrapoluje se přímka vycházející z bodu na grafu k ose koncentrací. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os představuje koncentraci stanovované látky ve zkoušeném přípravku.

• c) Postupný odběr

V případě, že je požadována metoda postupného odběru, je podrobně popsána v článku.

• 2.2.29 Kapalinová chromatografie

Kapalinová chromatografie je separační metoda, kde mobilní fází je kapalina a stacionární fází naplněnou do kolony je buď jemně rozptýlená pevná látka, nebo kapalina nanesená na pevný nosič, nebo pevný nosič, který je chemicky modifikován navázáním organických skupin.

Kapalinová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce, rozdělování, iontové výměny nebo vylučování.

Zařízení. Přístroj se obvykle skládá z čerpacího systému, dávkovacího zařízení (injekční stříkačka nebo nastřikovaní ventil), chromatografické kolony, detektoru a zapisovače. Mobilní fáze je obvykle přiváděna pod tlakem z jednoho nebo více zásobníků a protéká kolonou konstantní rychlostí a potom detektorem.

Teplota chromatografické kolony je udržována konstantní. Složení předepsané mobilní fáze může být buď konstantní během celého chromatografického procesu (izokratická eluce), nebo se může měnit podle definovaného programu (gradientová eluce).

Použitý detektor umožňuje stanovení množství sledovaných látek eluovaných z kolony. Detekce je obvykle založena na absorpční spektrofotometru. Diferenční refraktometrie, fluorimetrie; spalovací a elektrochemické metody jsou také používány.

Pracovní postup. Kolona se uvede do rovnovážného stavu s předepsanou mobilní fází. Připraví se roztok zkoušené látky a porovnávací roztok nebo roztoky tak, jak je předepsáno. Roztoky nesmí obsahovat pevné částice. Za použití porovnávacích roztoků se určí vhodné nastavení přístroje a nastřikované množství potřebné pro přiměřenou odezvu. Provedou se opakované nástřiky pro ověření reprodukovatelnosti odezvy, a je-li to požadováno, stanoví se počet teoretických pater.

Nastříknou se roztoky a zaznamenají se výsledné chromatogramy. Provedou se opakované nástřiky k ověření reprodukovatelnosti odezvy. Stanoví se plochy píků sledovaných látek, případně výšky píků, leží-li hodnota faktoru symetrie píku vypočtená podle vzorce uvedeného níže mezi 0,80 a 1,20. V aplikacích vyžadujících gradientovou eluci je třeba použít stanovení ploch píků. Je-li použit vnitřní standard, zkontroluje se, zda není žádný pík zkoušené látky překryt Pikem vnitřního standardu.

Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li požadován procentuální obsah jedné nebo více složek zkoušené látky, vypočte se stanovením plochy píku nebo píků jako procenta celkové plochy všech píků vyjma píků rozpouštědla nebo jakéhokoliv přidaného činidla (metoda normalizace). Pak se doporučuje použití automatického integrátoru a zesilovače s širokým rozsahem.

Faktor symetrie píku se vypočte z výrazu:

b0,052A,

v němž značí:

b0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky (mm),

A - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině výšky píku (mm).

Rozlišení (RS) se vypočte ze vzorce:

Rs=1,18tRb-tRab0,5a+b0,5b,

tRb>tRa

v němž značí:

tRb a tRa - vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),

b0,5a a b0,5b - šířky píků v polovině jejich výšky (mm).

Výsledky stanovení lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi měřenými píky v chromatogramu je větší než 1,0, pokud není předepsáno jinak.

Počet teoretických pater (n) se vypočte z údajů, získaných za izotermických podmínek ze vzorce:

n=5,54tRb0,52,

v němž značí:

tR - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku (mm),

b0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky (mm).

Kapacitní poměr (Dm) (známý též jako kapacitní faktor) je definován jako:

Dm=množství rozpuštěných látek ve stacionární fázimnožství rozpuštěných látek v mobilní fázi=KVsVm,

v němž značí:

K - rovnovážný rozdělovači koeficient,

Vs - objem stacionární fáze,

Vm - objem mobilní fáze.

Kapacitní poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím vzorce:

Dm=tR-tR'tR',

v němž značí:

tR - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího složce (mm),

tR - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce (mm).

Poměr signálu k šumu (S/N) je počítán ze vzorce:

S/N=2Hhn,

v němž značí:

H- výšku píku odpovídajícího dané složce na chromatogramu získaném s předepsaným porovnávacím roztokem,

hn - absolutní hodnotu největší výchylky signálu šumu od základní linie na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce a sledovaného v rozsahu úměrném 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku a pozorovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.

• 2.2.30 Vylučovací chromatografie

Vylučovací chromatografie (s organickou mobilní fází je známá jako gelová chromatografie a s vodnou mobilní fází se používá název gelová filtrace) je chromatografická technika, která rozděluje molekuly v roztoku podle jejich velikosti. Vzorek je vnesen na kolonu naplněnou gelem nebo náplní s porézními částicemi a je nesen mobilní fází kolonou. K separaci podle velikosti dochází opakovanou výměnou rozpuštěných molekul (rozpuštěné látky) mezi rozpouštědlem v mobilní fázi a týmž rozpouštědlem v nepohyblivé kapalné fázi (stacionární fázi), která je v pórech náplně. Rozmezí velikosti pórů náplně určuje rozmezí velikosti molekul, ve kterém může dojít k separaci.

Molekuly, které jsou tak malé, že mohou pronikat do všech pórů, jsou eluovány s celkovým permeačním objemem (Vt). Molekuly výrazně větší než maximální velikost pórů náplně se pohybují v koloně jen prostory mezi částicemi náplně bez zadržování a jsou eluovány s vylučovacím objemem (Vo). K separaci podle velikosti molekul dochází mezi vylučovacím a celkovým permeačním objemem, přičemž použitelná je obvykle separace v prvních dvou třetinách tohoto rozmezí.

Zařízení. Základem zařízení je chromatografická kolona vhodných rozměrů, v případě potřeby termostatovaná, naplněná separačním materiálem schopným dělení ve vhodném rozsahu velikosti molekul, kterou protéká konstantní rychlostí eluent. Jeden konec kolony je obvykle připojen ke vhodnému zařízení pro nástřik vzorku, jako je adaptér průtoku, septový dávkovač nebo nastřikovací ventil, a může být také připojen ke vhodnému čerpadlu pro kontrolu průtoku eluentu. Případně může být vzorek nastřikován přímo na vstup kolony (povrch náplně kolony zbavený kapaliny), nebo je-li vzorek hustší než eluent, může být převrstven eluentem. Výstup z kolony je obvykle připojen k vhodnému detektoru spojenému s automatickým zapisovačem, který umožňuje záznam relativních koncentrací separovaných složek vzorku. Detektory jsou většinou založeny na fotometrických, refraktometrických nebo luminiscenčních vlastnostech. V případě potřeby může být připojen automatický sběrač frakcí.

Náplní může být měkký nosič, jako je nabobtnalý gel, nebo tuhý nosič tvořený sklem, silikagelem nebo zesíťovaným organickým polymerem kompatibilním s rozpouštědlem. Tuhé nosiče obvykle vyžadují tlakovaný systém umožňující rychlejší separace. Mobilní fáze je volena podle typu vzorku, separačního prostředí a způsobu detekce.

Před provedením separace by měla být náplň upravena a naplněna do kolony tak, jak je popsáno v článku nebo podle návodu výrobce.

V případě potřeby jsou v článcích uvedeny postupy pro ověření způsobilosti systému. Účinnost kolony může být vyhodnocena z počtu teoretických pater (n), vypočteného ze vzorce:

5,54Vrb0,52,

v němž značí:

Vr - retenční objem v maximu píku,

b0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky vyjádřenou ve stejných jednotkách jako retenční objem.

Stanovení distribučního koeficientu KD

Eluční charakteristika látky na určité koloně může být dána distribučním koeficientem, KD, který se vypočte ze vzorce:

Vr-V0Vt-V0.

Stanovení se provede měřením retenčních objemů nezadržované složky (V0), jiné složky, která může pronikat do všech pórů nosiče, (Vt), a látky, jejíž rozdělovači koeficient je stanovován, ( Vr). Retenční objem se měří od nástřiku do maxima píku.

Stanovení poměrného složení směsi

Provede se separace podle článku. Je-li to možné, průběžně se zaznamenává eluce složek a měří se odpovídající plochy píků. Je-li zaznamenávána fyzikálně-chemická vlastnost a mají-li všechny stanovované složky vzorku stejnou odezvu (např. mají-li stejnou specifickou absorbanci), spočítá se relativní množství každé složky jako podíl příslušné plochy píku a součtu ploch píků všech stanovovaných složek. Nejsou-li detekční odezvy stanovovaných složek stejné, spočítá se obsah pomocí kalibračních křivek získaných s použitím kalibračních referenčních látek předepsaných v článku.

Stanovení molekulových hmotností

Vylučovací chromatografii lze použít pro stanovení molekulových hmotností po srovnání s vhodnými kalibračními referenčními látkami, specifikovanými v článku.

Do grafu se vynese závislost retenčních objemů kalibračních referenčních látek na logaritmu jejich molekulových hmotností. Křivka se obvykle blíží přímce mezi vylučovací mezí a mezí úplné permeace pro použité separační prostředí. Z kalibrační křivky se stanoví molekulové hmotnosti. Kalibrace pro molekulové hmotnosti je platná jen pro určitý makromolekulární systém látka/rozpouštědlo za daných experimentálních podmínek.

Stanovení distribuce velikosti molekul polymerů

Vylučovací chromatografii lze použít pro stanovení distribuce velikosti molekul polymerů. Avšak porovnání vzorků je možné jen s výsledky získanými za stejných experimentálních podmínek. Látky použité pro kalibraci a metody stanovení distribuce velikosti molekul polymerů jsou uvedeny v článku.

• 2.2.31 Elektroforéza

Elektroforéza je fyzikálně-analytická metoda založená na pohybu elektricky nabitých částic rozpuštěných nebo dispergovaných v roztoku elektrolytu v elektrickém poli.

Elektroforetická pohyblivost je rychlost pohybu nabitých částic v m/s v elektrostatickém poli o intenzitě 1 V/m. Vyjadřuje se v m^2.V^-1.s^-1. Z praktických důvodů se používá cm^2.V^-1.s^-1. Pohyblivost může být definována pouze pro daný elektrolyt za určitých experimentálních podmínek. Je ovlivněna mnoha faktory, např.:

• charakteristikou nabitých částic: druhem, velikostí, tvarem, elektrickým nábojem, koeficientem tření;

• charakteristikou kapaliny, ve které se nabité částice pohybují: rozpouštědlem, druhem a koncentrací elektrolytu, iontovou silou, pH, viskozitou roztoku.

Směr pohybu závisí na druhu elektrického náboje; nabité částice se pohybují k elektrodě s opačným nábojem.

Volná elektroforéza neboli elektroforéza s pohyblivým rozhraním