Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění vyhlášky č. 296/1999 Sb

Provede se Stanovení tříslovin v rostlinných drogách (2.8.14); použije se 0,750 g práškované drogy (180).

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

“

• 1. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, se za článek Hexachlorophenum doplňuje článek Hexamidini diisetionas, který zní:

„

† Hexamidini diisetionas [image omitted]

Hexamidiniumdiisetionat

[image omitted]

C24H38N4O10S2	Mr 606,72	CAS 659-40-5

Je to 4,4'-(1,6-hexandiyldioxy)bisbenzamidinium-bis(2-hydroxyethansulfonat). Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,5 % sloučeniny C24H38N4O10S2.

Vlastnosti

Bílý nebo nažloutlý krystalický prášek, hygroskopický. Je mírně rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem hexamidiniumdiisetionatu CRL.

B. 40 mg se rozpustí v 5 ml vody R, přidá se po kapkách za třepání 1 ml roztoku chloridu sodného R (100 g/l) a nechá se 5 min stát. Pomalu se tvoří objemná třpytivá bílá sraženina.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,5 g se rozpustí zahřátím na asi 70 °C ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 10 ml. Chladí se na pokojovou teplotu po dobu 10 min až 15 min. Roztok neopalizuje intenzivněji než porovnávací suspenze II (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než nejpodobnější barevný roztok intenzity 6 (2.2.2, Metoda II).

Kysele nebo zásaditě reagující látky. 2,0 g se rozpustí zahřátím asi na 50 °C ve vodě R a zředí se jí při asi 50 °C na 20 ml. Nechá se ochladit na asi 35 °C a přidá se 0,1 ml červeně methylové RS. Ke změně zbarvení indikátoru se spotřebuje nejvýše 0,25 ml kyseliny chlorovodíkové 0,05 mol/l VS nebo hydroxidu sodného 0,05 mol/l VS.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 20,0 mg se rozpustí v mobilní fázi A a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází A na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 mg zkoušené látky a 5 mg pentamidiniumdiisetionatu CRL se rozpustí v mobilní fázi A zředí se jí na 100 ml. 2 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází A na 5 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné styrendivinylbenzen-kopolymerem R (8 µm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:

• mobilní fáze A - smíchají se objemové díly acetonitrilu R a roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného R (6,8 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou R na hodnotu 3,0 (20 + 80),

• mobilní fáze B - smíchají se stejné objemové díly acetonitrilu R a roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného R (6,8 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou R na hodnotu 3,0,

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B %(V/V)	Poznámka
0 - 30	100 → 0	0 → 100	lineární gradient
30 - 35	0	100	izokraticky
35 - 40	0 → 100	100 →› 0	ustalování

• spektrofotometrického detektoru, 263 nm.

Nastříkne se 20 µl porovnávacího roztoku (a) a 20 µl porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebyla menší než 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je rozlišení mezi píky hexamidiniumdiisetionatu a pentamidiniumdiisetionatu nejméně 5,0.

Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1 %) a nejvýše jeden takový pík má plochu větší než polovina plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 1,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1,5 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %. 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,250 g se rozpustí v 50 ml dimethylformamidu R a titruje se tetrabutylamoniumhydroxidem 0,1 mol/l VS pod proudem dusíku R za potenciometrické indikace (2.2.20) bodu ekvivalence.

1 ml tetrabutylamoniumhydroxidu 0,1 mol/l VS odpovídá 30,35 mg C24H38N4O10S2.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech.

Separandum.

Nečistoty

[image omitted]

A. 4- {[6-(4-amidinofenoxy)hexyl]oxy}benzamid.

“

• 1. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, se za článek Hexobarbitalum doplňuje článek Hexylresorcinolum, který zní:

”

† Hexylresorcinolum [image omitted]

Hexylresorcinol

[image omitted]

C12H18O2	Mr 194,26	CAS 136-77-6

Je to 4-hexylbenzen-1,3-diol. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C12H1802.

Vlastnosti

Bezbarvý, nažloutlý nebo načervenalý krystalický prášek nebo jehličky. Působením světla nebo vzduchu se zbarvení látky mění na hnědorůžové. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 96% a v dichlormethanu.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

Základní zkouška: B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Teplota tání (2.2.14); 66 °C až 68 °C; tání se objevuje při asi 60 °C, následuje tuhnutí a druhé tání je v rozmezí 66 °C až 68 °C.

B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem hexylresorcinolu CRL. Pokud se spektra získaná v pevném stavu liší, rozpustí se odděleně zkoušená látka a referenční látka v methanolu R, odpaří se do sucha a se zbytky se zaznamenají nová spektra.

C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu G pro TLC R.

Zkoušený roztok. 0,1 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se zředí lihem 96% R na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg hexylresorcinolu CRL se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10 ml.

Porovnávací roztok (b). 10 mg hexylresorcinolu CRL a 10 mg resorcinolu CRL se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 µl každého roztoku a vyvíjí se směsí stejných objemových dílů 2-butanonu R a pentanu R do dvou třetin délky vrstvy.

Vrstva se 5 min suší na vzduchu, pak se postříká 3 ml anisaldehydu RS a zahřívá se 5 min při 100 °C až 105 °C. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně od sebe oddělené hlavní skvrny.

D. 0,1 g se rozpustí v 1 ml lihu 96% R, přidá se 1 kapka chloridu železitého RS1; vzniká zelené zbarvení, které se změní na hnědé přidáním amoniaku zředěného RS1.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 1,0 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1).

Kysele reagující látky (2.2.3). 0,5 g se rozpustí ve směsi 25 ml vody prosté oxidu uhličitého R a 25 ml etheru R předem zneutralizované na fenolftalein RS1. Titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS za intenzivního protřepávání po každém přídavku. Ke změně zbarvení indikátoru se spotřebuje nejvýše 0,4 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,1 g se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 200,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 20,0 mg fenolu R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 20,0 mg resorcinolu R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (d). K 8,0 ml porovnávacího roztoku (a) se přidají 2,0 ml porovnávacího roztoku (b), 2,0 ml porovnávacího roztoku (c) a zředí se mobilní fází na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografií R (5 µm),

• mobilní fáze, kterou je směs objemových dílů roztoku kyseliny octové ledové R (3,0 g/l), jehož pH bylo upraveno amoniakem zředěným RS1 na hodnotu 5,9 a methanolu R (25 + 75); průtoková rychlost je 1 ml/min,

• spektrofotometrického detektoru, 281 nm,

• injektorové smyčky.

Nastříkne se 20 µl porovnávacího roztoku (d). Citlivost systému se nastaví tak, aby výšky tří hlavních píků na chromatogramu byly nejméně 20 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi druhým pikem (fenol) a třetím pikem (hexylresorcinol) je nejméně 5,0.

Nastříkne se odděleně 20 µl zkoušeného roztoku, 20 µl porovnávacího roztoku (a) a chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času hexylresorcinolu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku nejsou plochy píků odpovídajících fenolu a hexylresorcinolu větší než plochy odpovídajících píků na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) (0,2 %); plocha žádného píku, kromě hlavního píku a píků odpovídajících fenolu a hexylresorcinolu, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %); součet ploch takových píků není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,1násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 0,5 %; stanoví se s 1,000 g zkoušené látky.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Ve skleněné baňce se zabroušenou zátkou se rozpustí 0,100 g v 10 ml methanolu R, přidá se 30,0 mg bromičnanu draselného 0,0167 mol/l VS a 2 g bromidu draselného R. Třepe se do rozpuštění a přidá se 15 ml kyseliny sírové zředěné RS. Baňka se uzavře a nechá se 15 min stát ve tmě za stálého míchání. Pak se přidá 5 ml dichlormethanu R a roztok 1 g jodidu draselného R v 10 ml vody R, nechá se 15 min stát ve tmě za stálého míchání a titruje se thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 1 ml škrobu RS jako indikátoru. Za stejných podmínek se provede slepá zkouška.

1 ml bromičnanu draselného 0,0167 mol/l VS odpovídá 4,857 mg C12H18O2.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

A. fenol,

B. resorcinol.

“

• 1. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Hydrochlorothiazidum zní:

”

† Hydrochlorothiazidum [image omitted]

Hydrochlorothiazid

[image omitted]

C7H8CIN3O4S2	Mr 297,73	CAS 58-93-5

Je to 6-chlor-7-sulfamoyl-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazin-1,1-dioxid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 102,0 % sloučeniny C7H8ClN3O4S2.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v acetonu, mírně rozpustný v lihu 96%. Rozpouští se ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů.

Zkoušky totožnosti

Základní zkouška: B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. 50,0 mg se rozpustí v 10 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS a zředí se vodou R na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS na 100,0 ml a měří se absorbance roztoku při 250 nm až 350 nm (2.2.25); roztok vykazuje absorpční maximum při 273 nm a při 323 nm. Poměr absorbance naměřené při 273 nm k absorbanci naměřené při 323 nm je 5,4 až 5,7.

B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem hydrochlorothiazidu CRL.

C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok. 50 mg se rozpustí v acetonu R a zředí se jím na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 50 mg hydrochlorothiazidu CRL se rozpustí v acetonu R a zředí se jím na 10 ml.

Porovnávací roztok (b). 25 mg chlorothiazidu R se rozpustí v porovnávacím roztoku (a) a zředí se jím na 5 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 2 µl každého roztoku a vyvíjí se ethylacetatem R po dráze 10 cm. Vrstva se vysuší v proudu vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

D. Asi 1 mg se opatrně zahřívá s 2 ml čerstvě připraveného roztoku kyseliny chromotropové sodné soli R (0,5 g/l) v ochlazené směsi objemových dílů vody R a kyseliny sírové R (35 + 65); vzniká fialové zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Kysele nebo zásaditě reagující látky. 0,5 g upráškované zkoušené látky se 2 min třepe s 25 ml vody R a zfiltruje se. K 10 ml filtrátu se přidá 0,2 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS a 0,15 ml červeně methylové RS; roztok je žlutý. Do vzniku červeného zbarvení indikátoru se spotřebuje nejvýše 0,4 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Rozpouštěcí roztok. 50,0 ml směsi stejných objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R se zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 3,2 (1) na 200,0 ml.

Zkoušený roztok. 30,0 mg se rozpustí v 5 ml směsi stejných objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R, je-li třeba za použití ultrazvuku, a zředí se tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 3,2 (1) na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 15,0 mg hydrochlorothiazidu CRL a 15,0 mg chlorothiazidu CRL se rozpustí ve 25,0 ml směsi stejných objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R, je-li třeba za použití ultrazvuku, a zředí se tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 3,2 (1) na 100,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí rozpouštěcím roztokem na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí rozpouštěcím roztokem na 50,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí rozpouštěcím roztokem na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (3 µm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,8 ml/min a s následujícími podmínkami lineárního gradientového programu:

• mobilní fáze A - k 940 ml tlumivého fosforečnanového roztoku o pH 3,2 (1) se přidá 60,0 ml methanolu R a 10,0 ml tetrahydrofuranu R a promíchá se,

• mobilní fáze B - ke směsi 500 ml methanolu R a 500 ml tlumivého fosforečnanového roztoku o pH 3,2 (1) se přidá 50,0 ml tetrahydrofuranu R a promíchá se,

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
0 - 17	100 → 55	0 → 45	lineární gradient
17 - 30	55	45	izokratická eluce
30 - 35	55 → 100	45 → 0	lineární gradiet
35 - 50	100	0	izokratická eluce
50 = 0	100	0	vrácení na počáteční složení

• spektrofotometrického detektoru, 224 nm.

Kolona se nejméně 20 min ustaluje promýváním mobilní fází A. Nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu získaném s 10 µl porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % rozsahu celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 10 µl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy: chlorothiazidu asi 7 min a hydrochlorothiazidu asi 8 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže je rozlišení mezi píkem odpovídajícím chlorothiazidu a pikem odpovídajícím hydrochlorothiazidu nejméně 2,5. Je-li třeba, upraví se složení mobilní fáze nebo se upraví časový program lineární gradientově eluce.

Nastříkne se odděleně 10 µl rozpouštěcího roztoku jako kontrolního roztoku, 10 µl zkoušeného roztoku a 10 µl porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Nepřihlíží se k pikům získaným s rozpouštěcím roztokem a k pikům s plochou menší než je 0,1násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Chloridy (2.4.4). 1,0 g se rozpustí ve 25 ml acetonu R a zředí se vodou R na 30 ml. 15 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (100 µg/g). Připraví se porovnávací roztok za použití 10 ml základního roztoku chloridů (5 µg Cl/ml) a 5 ml acetonu R obsahujícího 15 % (V/V) vody R.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,120 g se rozpustí v 50 ml dimethylsulfoxidu R a titruje se tetrabutylamoniumhydroxidem 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace (2.2.20) do druhého inflexního bodu.

1 ml tetrabutylamoniumhydroxidu 0,1 mol/l VS odpovídá 14,88 mg C7H8ClN3O4S2.

Uchovávání

Separandum.

Nečistoty

A. chlorothiazid,

[image omitted]

B. 4-amino-6-chlorbenzen-1,3-disulfonamid (salamid),

[image omitted]

C. 6-chlor-7- {[[(6-chlor-1,1-dioxido-7-sulfamoyl-2,3-dihydro-4H-1,2,4-benzothiadiazin-4-yl)methyl]amino]sulfonyl}-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazin-1,1-dioxid.

“

• 1. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Hydroxyzini dihydrochloridum zní:

”

† Hydroxyzini dihydrochloridum [image omitted]

Hydroxyziniumdichlorid

Synonymum. Hydroxyzini hydrochloridum

[image omitted]

C21H29CI3N2O2	Mr 447,83	CAS 2192-20-3

Je to (RS)-1-(4-chlorfenyl)fenylmethyl-4-[1-(1-hydroxyethyl)oxyethyl]piperazindiiumdichlorid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C21H29Cl3N2O2.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický hygroskopický prášek. Je snadno rozpustný ve vodě a v lihu 96%, těžce rozpustný v acetonu.

Taje při asi 200 °C, za rozkladu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a D.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety hydroxyziniumdichloridu CRL.

B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu G pro TLC R.

Zkoušený roztok. 0,50 g se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 0,50 g hydroxyziniumdichloridu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

Porovnávací roztok (b). 0,50 g mekloziniumchloridu R se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R a zředí se stejnou směsí na 10 ml. 1 ml tohoto roztoku se smíchá se 2 ml porovnávacího roztoku (a).

Na vrstvu se nanese odděleně po 2 µl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, lihu 96% R a toluenu R (1 + 24 + 75) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a postříká se jodobismutitanem draselným RS2. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, velikostí a zbarvením hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené hlavní skvrny.

C. 0,1 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 15 ml. Přidá se 15 ml nasyceného roztoku trinitrofenolu R v lihu 96% R a nechá se 15 min stát. Vzniklá sraženina se odfiltruje a rekrystalizuje z lihu 96% R. Pro začátek krystalizace je nezbytné třít stěny zkumavky skleněnou tyčinkou. Krystaly tají (2.2.14) při 189 °C až 192 °C.

D. Vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není intenzivněji zbarven než porovnávací barevný roztok Ž7 (2.2.2, Metoda II).

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 10,0 mg hydroxyziniumdichloridu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 3,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 200,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 25,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony 0,15 m dlouhé a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným deaktivovaným pro chromatografii bazických látek R (3 µm),

• mobilní fáze, kterou je směs připravená následujícím způsobem: 0,5 g methansulfonanu sodného R se rozpustí ve směsi objemových dílů triethylaminu R, acetonitrilu R a vody R (14 + 300 + 686); pH se upraví kyselinou sírovou R na hodnotu 2,7; průtoková rychlost je 1 ml/min,

• spektrofotometrického detektoru, 230 nm.

Nastříkne se 20 µl porovnávacího roztoku (a) 20 µl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) se měří výška (A) nad základní čárou píku těsně před hlavním píkem a výška (B) nad základní čárou nejnižšího bodu křivky (B) oddělujícího tento pík od píku hydroxyzinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže A je větší než desetinásobek B.

Nastříkne se odděleně 20 µl zkoušeného roztoku a 20 µl porovnávacího roztoku (b) a chromatogramy se zaznamenávají po dobu odpovídající 2,5násobku retenčního času hlavního píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než třetina plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,1 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,3 %). Nepřihlíží se k píkům s plochou menší než 0,1násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Těžké kovy (2.4.8). 12 ml roztoku S vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 µg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití základního roztoku olova (1 µg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 5,0 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,200 g se rozpustí v 10 ml kyseliny octové bezvodé R, přidá se 40 ml acetanhydridu R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 22,39 mg C21H29Cl3N2O2.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

[image omitted]

A. 1-[(4-chlorfenyl)fenylmethyl]piperazin,

[image omitted]

B. 2-{2-[4-(difenylmethyl)piperazin-1-yl]ethoxy}ethanol (dekloxyzin).

“

• 1. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Hydroxyethylcellulosum zní:

”

Hyetellosum [image omitted]

Hyetelosa

Synonyma. Hydroxyethylcellulosum, hydroxyethylcelulosa

CAS 9004-62-0

Je to částečně O-(2-hydroxyethylovaná) celulosa.

Vlastnosti

Bílý nažloutle bílý nebo šedavě bílý prášek nebo granule. Je dobře rozpustná v horké vodě a ve studené vodě dává koloidní roztok. Je prakticky nerozpustná v acetonu, v lihu 96% a v toluenu.

Zkoušky totožnosti

A. 10 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se zahřeje k varu; roztok zůstane čirý.

B. K 10 ml roztoku S se přidá 0,3 ml kyseliny octové zředěné RS a 2,5 ml roztoku taninu R (100 g/l); vznikne nažloutle bílá vločkovitá sraženina, která se rozpouští v amoniaku zředěném RS1.

C. 1 g se ve zkumavce asi 160 mm dlouhé pečlivě smíchá se 2 g jemně upráškovaného síranu manganatého R. Do horní části zkumavky 2 cm hluboko se vloží proužek filtračního papíru, který je napuštěn čerstvě připravenou směsí objemových dílů roztoku diethanolaminu R (200 g/l) a roztoku nitroprussidu sodného R (50 g/l) (1 + 11), jejíž pH bylo upraveno kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na hodnotu asi 9,8. Zkumavka se ponoří 8 cm hluboko do lázně se silikonovým olejem vyhřáté na 190 °C až 200 °C; proužek filtračního papíru se během 10 min zbarví modře. Současně se provede slepá zkouška.

D. 0,2 g se bez zahřátí úplně rozpustí v 15 ml roztoku kyseliny sírové R (700 g/l). Roztok se za promíchávání převede do 100 ml ledové vody R a zředí se jí na 250 ml. K 1 ml tohoto roztoku se ve zkumavce za opatrného promíchávání a chlazení ve vodě s ledem přidá po kapkách 8 ml kyseliny sírové R. Poté se roztok zahřívá přesně 3 min na vodní lázni a ihned se ochladí ve vodě s ledem. K ochlazené směsi se opatrně přidá 0,6 ml ninhydrinu RS2, dobře se promíchá a nechá se stát při 25 °C; ihned vznikne růžové zbarvení, které se během 100 min nezmění na fialové.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. Množství odpovídající 1,0 g vysušené látky se za promíchávání disperguje v 50 ml vody prosté oxidu uhličitého R a po 10 min se zředí vodou prostou oxidu uhličitého R na 100 ml a míchá se do úplného rozpuštění.

Vzhled roztoku. Roztok S neopalizuje intenzivněji než porovnávací suspenze III (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž6 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 5,5 až 8,5; měří se roztok S.

Zdánlivá viskozita. 75 % až 140 % deklarované hodnoty. Množství odpovídající 2,00 g vysušené zkoušené látky se za promíchávání přenese do 50 ml vody R, zředí se jí na 100,0 g a míchá se do úplného rozpuštění. Stanoví se viskozita (2.2.10) pomocí rotačního viskozimetru při 25 °C a při:

• smykové rychlosti 100 s^-1 pro látku s předpokládanou viskozitou pod 100 mPa.s,

• smykové rychlosti 10 s^-1 pro látku s předpokládanou viskozitou 100 mPa.s až 20 000 mPa.s,

• smykové rychlosti 1 s^-1 pro látku s předpokládanou viskozitou nad 20 000 mPa.s.

Jestliže je použití smykové rychlosti 1 s^-1, 10 s^-1 nebo 100 s^-1 nevhodné, použije se smyková rychlost vyšší a smyková rychlost nižší a výsledku se dosáhne interpolací.

Chloridy (2.4.4). 1 ml roztoku S se zředí vodou R na 30 ml. 15 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (1,0 %).

Dusičnany. Jestliže hyetelosa má zdánlivou viskozitu 1000 mPa.s a nižší, vyhovuje zkoušce A.

A. 5 ml roztoku S se zředí vodou R na 10 ml. K 1 ml tohoto roztoku se přidá 19 ml vody R, 2 ml amoniaku 26% R, 0,5 ml roztoku síranu manganatého R (10 g/l) a 1 ml roztoku sulfanilamidu R (10 g/l). Přidá se 0,1 g granulovaného zinku R, nechá se 30 min stát ve vodě s ledem za občasného zamíchání a potom se zfiltruje přes filtr ze slinutého skla (40). 10 ml filtrátu ve zkumavce se okyselí 2,5 ml kyseliny chlorovodíkové R, přidá se 0,5 ml roztoku naftylethylendiamoniumdichloridu R (10 g/l) a nechá se 15 min stát; fialově červené zbarvení roztoku není intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku připraveného současně stejným způsobem za použití směsi 15 ml základního roztoku dusičnanů (10 μg NO3/ml) a 5 ml vody R (3,0 %).

Jestliže hyetelosa má zdánlivou viskozitu větší než 1000 mPa.s, vyhovuje zkoušce B.

B. 5 ml roztoku S se zředí vodou R na 10 ml. K 1 ml tohoto roztoku se přidá 19 ml vody R, 2 ml amoniaku 26% R, 0,5 ml roztoku síranu manganatého R (10 g/l) a 1 ml roztoku sulfanilamidu R (10 g/l). Přidá se 0,1 g granulovaného zinku R, nechá se 30 min stát ve vodě s ledem za občasného zamíchání a potom se zfiltruje přes filtr ze slinutého skla (40). 10 ml filtrátu ve zkumavce se okyselí 2,5 ml kyseliny chlorovodíkové R, přidá se 0,5 ml roztoku naftylethylendiamoniumdichloridu R (10 g/l) a nechá se 15 min stát; fialově červené zbarvení roztoku není intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku připraveného současně stejným způsobem za použití směsi 1 ml základního roztoku dusičnanů (10 μg NO3/ml) a 19 ml vody R (0,2 %).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Glyoxal. K 1,0 g se ve zkumavce se zabroušenou zátkou přidá 10,0 ml ethanolu R. Zkumavka se uzavře, mechanicky se třepe 30 min a odstřeďuje se. Ke 2,0 ml supernatantní tekutiny se přidá 5,0 ml roztoku methylbenzothiazolinonhydrazonhydrochloridu R (4 g/l) v roztoku kyseliny octové ledové R 80% (V/V) ve vodě R a homogenizuje se třepáním. Po 2 h není roztok zbarven intenzivněji než porovnávací roztok připravený současně stejným způsobem za použití 2,0 ml základního roztoku glyoxalu (20 μg C2H2O2/ml) místo 2,0 ml supernatantní tekutiny (200 μg/g).

Ethylenoxid. Nejvýše 1 μg/g; stanoví se head-space plynovou chromatografií (2.2.28).

Zkoušený roztok. 1,00 g zkoušené látky (MT) se přenese do 5ml lahvičky a přidá se 1,0 ml vody R.

Porovnávací roztok (a). 1,00 g (MR) zkoušené látky se přenese do 5ml lahvičky a přidá se 0,2 ml (odpovídá 225 mg) ochlazeného ethylenoxidu RS a 0,8 ml vody R.

Porovnávací roztok (b). K 0,1 ml ethylenoxidu RS v 5ml lahvičce se přidá 0,1 ml čerstvě připraveného roztoku acetaldehydu R (10 mg/l).

Lahvičky se ihned uzavřou zátkou s butyl-kaučukovou membránou a zátka se upevni hliníkovým nebo polytetrafluorethylenovým uzávěrem. Obsah lahviček se homogenizuje protřepáním.

Podmínky statického head-space nástřiku jsou obvykle následující:

• rovnovážná teplota: 70 °C,

• doba ohřevu: 45 min,

• teplota převodové kapiláry: 75 °C,

• nosný plyn: helium pro chromatografii R nebo dusík pro chromatografii R,

• doba tlakování: 30 s,

• objem nástřiku: 1 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kapilární skleněné nebo křemenné kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřním povrchem potaženým 1,0 μm vrstvou polydimethylsiloxanu R,

• helia pro chromatografii R nebo dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové lineární rychlosti asi 20 cm/s a dělicím poměru 1 : 20,

• plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje 5 min na 50 °C, pak se zvyšuje rychlostí 30 °C/min do 230 °C a 5 min se udržuje na 230 °C, přičemž teplota nástřikového prostoru se udržuje na 150 °C a teplota detektoru na 250 °C.

Nastříkne se 1,0 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) a nastaví se citlivost systému tak, aby výšky dvou hlavních píků na chromatogramu byly nejméně 15 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky acetaldehydu a ethylenoxidu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je nejméně 3,5.

Nastříkne se odděleně po 1,0 ml plynné fáze zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku odpovídajícího ethylenoxidu není větší než polovina plochy píku ethylenoxidu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Obsah ethylenoxidu v μg/g se vypočítá podle vztahu:

AT.MEO.C0,25.AR.MT-AT.MR, kde C=CEOMEO.10,

v němž značí:

AT - plochu píku ethylenoxidu na chromatogramu zkoušeného roztoku,

AR - plochu píku ethylenoxidu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a),

MEO - hmotnost absorbovaného ethylenoxidu (použitého pro přípravu etylenoxidu RS) v gramech,

MT - hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku v gramech,

MR - hmotnost zkoušené látky v porovnávacím roztoku (a) v gramech,

C - korekční faktor, viz vzorec,

CEO - obsah ethylenoxidu v mg/ml stanovený titračně.

2-Chlorethanol. Nejvýše 10 μg/g; stanoví se head-space plynovou chromatografií (2.2.28).

Zkoušený roztok. K 50 mg zkoušené látky (MT) se do 20ml lahvičky přidají 2 μl 2-propanolu R.

Porovnávací roztok. K 50 mg (MR) zkoušené látky se do 20ml lahvičky přidají 2 μl 2-chlorethanolu RS.

Lahvičky se ihned uzavřou zátkou s butyl-kaučukovou membránou a zátka se upevní hliníkovým nebo polytetrafluorethylenovým uzávěrem. Obsah lahviček se homogenizuje protřepáním.

Podmínky head-space nástřiku jsou obvykle následující:

Baňka se propláchne heliem při průtokové rychlosti 20 ml/min. Lahvičky se zahřívají 40 min při 110 °C. Doba trvání nástřiku je 5 min. Plynové extrakty se převedou do odlučovače tvořeného z trubičky 13,6 cm dlouhé a vnitřního průměru 4 mm naplněné ethylvinylbenzen-divinylbenzen kopolymerem R (150 μm) udržovaného při 50 °C.

Odlučovač se rychle zahřeje na 210 °C a promývá se heliem s průtokovou rychlostí 5 ml/min a tlakuje se plynem analytická kolona.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kapilární křemenné kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,53 mm s vnitřním povrchem potaženým 1,0 μm vrstvou makrogolu 20 000 R pro chromatografii,

• helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové lineární rychlosti asi 60 cm/s,

• plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje 6 min na 60 °C, pak se zvyšuje rychlostí 5 °C/min do 110 °C, potom se zvyšuje rychlostí 8 °C/min do 230 °C a 5 min se udržuje na 230 °C, přičemž teplota nástřikového prostoru se udržuje na 150 °C a teplota detektoru na 260 °C.

Zaznamenají se chromatogramy zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku.

Obsah 2-chlorethanolu v μg/g se vypočítá podle vztahu:

AT.C.AR.MT-(AT.MR) ,

v němž značí:

AT - plochu píku 2-chlorethanolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,

AR - plochu píku 2-chlorethanolu na chromatogramu porovnávacího roztoku,

MT - hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku v gramech,

MR - hmotnost zkoušené látky v porovnávacím roztoku v gramech,

C - obsah 2-chlorethanolu v mikrogramech ve 2,0 μl 2-chlorethanolu RS.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 1,000 g se suší 3 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 4,0 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Označování

V označení na obalu se uvede zjevná viskozita 2% roztoku v mPa.s.

“

• 1. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Hyperici herba zní:

„

Hyperici herba [image omitted]

Třezalková nať

Synonymum. Herba hyperici

Jsou to celé nebo řezané usušené kvetoucí vrcholky druhu Hypericum perforatum L.

Obsahuje nejméně 0,08 % hypericinů, počítáno jako hypericin (C30H16O8; Mr 504,4), vztaženo na vysušenou drogu.

Vlastnosti

Makroskopický a mikroskopický popis, viz Zkoušky totožnosti A a B.

Zkoušky totožnosti

A. Stonek jen nahoře větvený, lysý, se dvěma podélnými více nebo méně vyniklými tenkými lištami. Listy vstřícné, vejčitě oválné, přisedlé, 15 mm až 30 mm dlouhé, celokrajné, bez palistů. Na okrajích listů černé žláznaté chlupy, čepel s četnými malými olejovými nádržkami, prosvítavě tečkovaná. Květy pětičetné, pravidelné, uspořádané v koncovém širokém vrcholíku vidlanů. Kališní lístky zelené, s ušty kopinatými, na okrajích s černými žláznatými chlupy, korunní lístky oranžově žluté, na okrajích s černými žláznatými chlupy, četné oranžově žluté tyčinky uspořádané ve třech svazečcích. Semeník třípouzdrý, blizna trojčetná, červená.

B. Droga se upráškuje (355). Prášek je zelenožlutý. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Droga je charakteristická těmito znaky: úlomky mnohohranných buněk pokožky se stěnami růžencovitě ztlustlými a paracytickými nebo anomocytickými průduchy (2.8.3); úlomky listu a kalicha s velkými olejovými nádržkami a červeně zbarvenými pigmentovými buňkami; tenkostěnné protáhlé buňky pokožky koruny s rovnými nebo vlnitými antiklinálními stěnami; cévy a cévice s tečkovanými stěnami a skupiny ztlustlých vláken; úlomky čtyřhranného zdřevnatělého tečkovaného parenchymu; vláknitá vrstva prašníků a protáhlé, tenkostěnné buňky tyčinky s rýhovanou kutikulou; četná pylová zrna se třemi klíčními póry a hladkou exinou, jednotlivá nebo shloučená; drúzy šťavelanu vápenatého.

C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok. 0,5 g práškované drogy (500) se míchá s 10 ml methanolu R 10 min ve vodní lázni při 60 °C a po ochlazení se zfiltruje.

Porovnávací roztok. 5 mg rutinu R a 5 mg hyperosidu R se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

Na vrstvu se nanese do pruhů (10 mm) 10 μl zkoušeného roztoku a 5 μl porovnávacího roztoku. Vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny mravenčí bezvodé R, vody R a ethylacetatu R (6 + 9 + 90) po dráze 10 cm. Vrstva se suší 10 min při 100 °C až 105 °C a pak se postříká roztokem difenylboryloxyethylaminu R (10 g/l) v methanolu R a pak roztokem makrogolu 400 R (50 g/l) v methanolu R. Po 30 min se pozoruje v ultrafialovém světle při 365 nm. Na chromatogramu porovnávacího roztoku je v dolní třetině skvrna odpovídající rutinu a nad ní skvrna odpovídající hyperosidu, obě skvrny fluoreskují žlutooranžově. Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou v dolní třetině červenooranžově fluoreskující skvrny (rutin a hyperosid) a v dolní části horní třetiny chromatogramu je skvrna pseudohypericinu a nad ní skvrna hypericinu, obě fluoreskují červeně. Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou další žlutě nebo modře fluoreskující skvrny.

Zkoušky na čistotu

Cizí příměsi (2.8.2). Nejvýše 3 % stonků o průměru více než 5 mm a nejvýše 2 % ostatních cizích příměsí.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %. 1,000 g práškované drogy (500) se suší 2 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 7,0 %.

Stanovení obsahu

Zkoušený roztok. 0,800 g práškované drogy (500) se ve 100ml baňce s kulatým dnem smíchá se 60 ml směsi objemových dílů vody R a tetrahydrofuranu R (20 + 80) a vloží se magnetické míchadlo. Směs se vaří 30 min ve vodní lázni při 70 °C pod zpětným chladičem. Odstředí se (2 min při 700 gn) a supernatantní tekutina se převede do 250ml baňky. Zbytek drogy se smíchá s 60 ml směsi objemových dílů vody R a tetrahydrofuranu R (20 + 80). Směs se opět zahřívá 30 min pod zpětným chladičem. Odstředí se (2 min při 700 gn) a supernatantní tekutina se převede do téže odměrné baňky. Spojené roztoky se odpaří do sucha. Zbytek se převede 15 ml methanolu R za pomoci ultrazvuku do 25ml odměrné baňky. 250ml baňka se promyje methanolem R; promývací tekutina se přidá k roztoku v odměrné baňce a spojené tekutiny se zředí methanolem R na 25,0 ml. Opět se odstředí, 10 ml roztoku se zfiltruje filtrem ze slinutého skla (0,2 μm), první 2 ml filtrátu se odstraní. 5,0 ml filtrátu se převede do odměrné baňky a zředí se methanolem R na 25,0 ml.

Měří se absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku při 590 nm za použití methanolu R jako kontrolní tekutiny.

Obsah hypericinů v procentech, vyjádřen jako hypericin (C30H16O8), se vypočítá podle vztahu:

A.125m.870,

v němž značí:

A - absorbanci při 590 nm,

m - navážku drogy v gramech.

Specifická absorbance hypericinu má hodnotu 870.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

“

• 1. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, článek Interferoni alfa-2 solutio concentrata zní:

„

† Interferoni alfa-2 solutio concentrata [image omitted]

Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2

[image omitted]

Je to roztok bílkoviny vytvořené podle informace kódované genem pro alfa-interferon, subtyp alfa-2, která vykazuje alespoň v homologních buňkách nespecifickou protivirovou účinnost v průběhu metabolických buněčných procesů syntézy ribonukleové kyseliny a bílkovin. Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2 vykazuje také antiproliferační účinnost. Různé typy interferonu alfa-2 se liší ve zbytku aminokyseliny v poloze 23 a označují se písmeny.

Označení	Zbytek v poloze 23 (X)
alfa-2a	Lys
alfa-2b	Arg

Tento článek se vztahuje na koncentrované roztoky interferonů alfa-2a a alfa-2b.

Účinnost koncentrovaného roztoku interferonu alfa-2 je nejméně 1,4.10^8 m.j. v miligramu bílkoviny. Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2 obsahuje nejméně 2.10^8 m.j. interferonu alfa-2 v mililitru.

Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2 vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

Výroba

Vyrábí se metodou založenou na rekombinantní DNK (rDNK) technologii za použití bakterií jako hostitelských buněk. Vyrábí se v podmínkách určených ke snížení kontaminace výrobku mikroby na minimum.

Vyhovuje následujícím dodatečným požadavkům:

Bílkoviny odvozené z hostitelských buněk. Limity schvaluje oprávněná autorita.

DNK odvozená z hostitelských buněk nebo vektoru. Limity schvaluje oprávněná autorita.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá nebo slabě nažloutlá tekutina.

Zkoušky totožnosti

A. Stanovení účinnosti je zároveň zkouškou totožnosti.

B. Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1 mg/ml.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok vhodného interferonu alfa-2 CRL (1 mg/ml) ve vodě R.

Kalibrační roztok izoelektrických bodů v oblasti pH 3,0 až 10,0. Připraví se a použije podle návodu výrobce.

Použije se vhodný přístroj spojený s recirkulační vodní lázní s kontrolovanou teplotou při 10 °C a gely pro izoelektrickou fokusaci s gradientem pH 3,5 až 9,5. S přístrojem se pracuje podle návodu výrobce. Jako anodový roztok se použije roztok kyseliny fosforečné R (98 g/l H3PO4) a jako katodový roztok hydroxid sodný 1 mol/l RS. Vzorky se nanášejí na gel filtračními papírky. Filtrační papírky pro nanášení vzorku se umístí na gel těsně u katody.

Nanáší se odděleně 15 μl zkoušeného roztoku a 15 μl porovnávacího roztoku. Spustí se izoelektrická fokusace při 1500 V a 50 mA. Po 30 min se vypne proud, odstraní se filtrační papírky a znovu se připojí zdroj napětí na 1 h. Během fokusačního procesu se udržuje konstantní napětí. Po fokusaci se gel ponoří do vhodného objemu roztoku kyseliny trichloroctové R (115 g/l) a kyseliny sulfosalicylové R (34,5 g/l) ve vodě R a nádobou se 60 min opatrně pohybuje. Gel se přenese do směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R, ethanolu R a vody R (32 + 100 + 268) a promývá se 5 min. Pak se gel na 10 min ponoří do barvicího roztoku modři kyselé 83 R (1,2 g/l) ve stejné směsi kyseliny octové ledové, ethanolu a vody předehřáté na 60 °C. Gel se promyje v několika nádobách stejnou směsí kyseliny octové ledové, ethanolu a vody a v této směsi se ponechá, dokud není pozadí bezbarvé (12 h až 24 h). Po odpovídajícím odbarvení se gel ponoří na 1 h do roztoku glycerolu R 10% (V/V) ve směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R, ethanolu R a vody R (32 + 100 + 268).

Hlavní pásy na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou hlavním pásům na elektroforeogramu porovnávacího roztoku. Do grafu se vynese závislost migračních vzdáleností ukazatelů izoelektrických bodů na jejich izoelektrických bodech a určí se izoelektrické body hlavních složek zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku; neliší se o více než 0,2 hodnoty pI. Zkoušku lze hodnotit, jestliže ukazatele izoelektrických bodů jsou distribuovány po celé délce gelu a izoelektrické body hlavních pásů na elektroforeogramu porovnávajícího roztoku leží mezi 5,8 a 6,3.

C. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Nečistoty lišící se od interferonu alfa-2 molekugovými hmotnostmi, viz Zkoušky na čistotu, získané za redukčních podmínek. Hlavní pás na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá svojí polohou hlavnímu pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).

D. Provede se peptidové mapování.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1,5 mg/ml. 25 μl se přenese do 1,5ml polypropylenové nebo skleněné zkumavky. Přidá se 1,6 μl tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 8,0 (1 mol/l), 2,8 μl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1,0 mg/ml) ve vodě R a 3,6 μl vody R a silně se promíchá. Zkumavka se uzavře a nechá se 18 h ve vodní lázni při 37 °C, pak se přidá 100 μl roztoku guanidiniumchloridu R (573 g/l) a dobře se promíchá. Přidá se 7 μl roztoku dithiothreitolu R (154,2 g/l) a dobře se promíchá. Uzavřená zkumavka se na 1 min ponoří do vroucí vody, pak se ochladí na pokojovou teplotu.

Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití roztoku příslušného interferonu alfa-2 CRL (1,5 mg/ml) ve vodě R.

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,10 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm) s póry o velikosti 30 nm,

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou jsou následující směsi:

• mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,

• mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,

• gradientového programu:

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
0 - 8	100	0	izokraticky
8 - 68	100 → 40	0 → 60	lineární gradient
68 - 72	40	60	izokraticky
72 - 75	40 → 100	60 → 0	lineární gradient
75 - 80	100	0	znovuustálování

• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 30 °C.

Kolona se ustaluje mobilní fází A nejméně 15 min.

Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku a 100 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže se chromatogramy obou roztoků kvalitativně podobají vhodnému referenčnímu chromatogramu Ph.Eur. rozštěpeného interferonu alfa-2. Profil chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá profilu chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Nečistoty lišící se od interferonu alfa-2 molekulovými hmotnostmi. Zkouší se SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (2.2.31). Zkouška se provádí v redukčních i v neredukčních podmínkách na rozlišovacích gelech s 14 % akrylamidu; k detekci se používá barvení stříbrem.

Roztok pro vzorek (pro neredukční podmínky). Použije se SDS-PAGE koncentrovaný roztok pro vzorek RS.

Roztok pro vzorek (pro redukční podmínky). Použije se SDS-PAGE koncentrovaný roztok pro vzorek pro redukující podmínky RS obsahující 2-merkaptoethanol jako redukční činidlo.

Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí roztokem pro vzorek na koncentraci bílkoviny 0,5 mg/ml.

Zkoušený roztok (b). 0,20 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok vhodného interferonu alfa-2 CRL (0,625 mg/ml) v roztoku pro vzorek.

Porovnávací roztok (b). 0,20 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.

Porovnávací roztok (c). 0,20 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.

Porovnávací roztok (d). 0,20 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.

Porovnávací roztok (e). 0,20 ml porovnávacího roztoku (d) se zředí roztokem pro vzorek na 1 ml.

Porovnávací roztok (f). Použije se roztok standardů molekulových hmotností vhodný pro kalibraci SDS-PAGE gelů v rozmezí 15 kDa až 67 kDa.

Zkoušené a porovnávací roztoky se na 2 min vloží v uzavřených zkumavkách na vodní lázeň.

Do jamek zaostřovacího gelu se nanese 10 μl porovnávacího roztoku (f) a po 50 μl z ostatních roztoků. Provede se elektroforéza za podmínek doporučených výrobcem přístroje a bílkoviny v gelu se obarví stříbrem.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněna validační kritéria (2.2.31); na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) je vidět pás a na elektroforeogramech zkoušených roztoků (a) a (b) i na elektroforeogramech porovnávacích roztoků (a) až (e) je zřejmé odstupňování intenzity vybarvení.

Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) za redukčních podmínek mohou, kromě hlavního pásu, být méně intenzivní pásy s nižšími molekulovými hmotnostmi než hlavní pás; žádný takový pás není intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) (1,0 %) a nejvýše tři takové pásy jsou intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) (0,2 %).

Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) za neredukčních podmínek mohou být, kromě hlavního pásu, méně intenzivnější pásy s vyšší molekulovou hmotností než hlavní pás; žádný takový pás není intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) (1,0 %) a nejvýše tři takové pásy jsou intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) (0,2 %).

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1 mg/ml.

0,25% roztok peroxidu vodíku. Peroxid vodíku zředěný RS se zředí vodou R na 0,25% roztok.

Porovnávací roztok. Zkoušený roztok se zředí vhodným množstvím 0,25% roztoku peroxidu vodíku tak, aby konečná koncentrace peroxidu vodíku byla 0,005% a nechá se stát při pokojové teplotě 1 h nebo po dobu, za kterou vznikne asi 5 % oxidovaného interferonu. Přidá se 12,5 mg L-methioninu R na mililitr roztoku a nechá se 1 h stát při pokojové teplotě. Roztoky se neuchovávají déle než 24 h při 2 °C až 8 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm) s póry o velikosti 30 nm,

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou jsou následující směsi:

• mobilní fáze A - k 700 ml vody R se přidají 2 ml kyseliny trifluoroctové R a 300 ml acetonitrilu pro chromatografii R,

• mobilní fáze B - k 200 ml vody R se přidají 2 ml kyseliny trifluoroctové R a 800 ml acetronitrilu pro chromatografii R,

• gradientového programu:

Čas (min)	Mobilní fáze A %(V/V)	Mobilní fáze B %(V/V)	Poznámka
0 - 1	72	28	izokraticky
1 - 5	72 → 67	28 → 33	lineární gradient
5 - 20	67 → 63	33 → 37	lineární gradient
20 - 30	63 → 57	37 → 43	lineární gradient
30 - 40	57 → 40	43 → 60	lineární gradient
40 - 42	40	60	izokraticky
42 - 50	40 → 72	60 → 28	lineární gradient
50 - 60	72	28	znovuustálování

• spektrofotometrického detektoru, 210 nm.

Kolona se ustaluje nejméně 15 min mobilními fázemi v poměru počátečních podmínek gradientu. Nastřikuje se po 50 μl obou roztoků.

Na získaných chromatogramech se interferon alfa-2 eluuje při retenčním čase asi 20 min. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se pík oxidovaného interferonu objeví při asi 0,9 hodnoty retenčního času vztaženého k hlavnímu píku. Zkoušku lze hodnotit, pokud rozlišení mezi píky odpovídající oxidovanému interferonu a interferonu je nejméně 1,0. Přihlíží se pouze k pikům, jejichž relativní retenční časy vzhledem k hlavnímu píku jsou v rozmezí 0,7 až 1,4. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku, kromě hlavního píku, větší než 3,0 % celkové plochy všech píků. Součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 5,0 % celkové plochy všech píků.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 100 m.j. endotoxinu v objemu obsahujícím 1,0 mg bílkoviny.

Stanovení účinnosti

Bílkovina

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci interferonu alfa-2 asi 0,5 mg/ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se zásobní roztok albuminu hovězího R (0,5 mg/ml), z něhož se připraví osm ředění v rozmezí koncentrací 3 μg/ml až 30 μg/ml hovězího albuminu R.

Připraví se třicetinásobné a padesátinásobné ředění zkoušeného roztoku. Do zkumavek obsahujících 1,5 ml vody R (slepá zkouška) nebo 1,5 ml různých ředění zkoušeného roztoku nebo 1,5 ml porovnávacích roztoků se přidá po 1,25 ml v ten den připravené směsi, vzniklé smícháním 2,0 ml roztoku síranu měďnatého R (20 g/l) ve vodě R, 2,0 ml roztoku vínanu sodného R (40 g/l) ve vodě R a 96,0 ml roztoku uhličitanu sodného R (40 g/l) v hydroxidu sodném 0,2 mol/l RS. Po každém přidání se promíchá. Po asi 10 min se do každé zkumavky přidá 0,25 ml v ten den připraveného zkoumadla fosfomolybdenanwolframového R a po každém přidání se opět promíchá. Asi za 30 min se měří absorbance (2.2.25) každého roztoku při 750 nm proti kontrolní tekutině získané při slepé zkoušce. Z absorbancí osmi porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahů bílkoviny se sestrojí kalibrační křivka, z níž se odečte obsah bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Účinnost

Účinnost interferonu alfa-2 se stanoví porovnáním jeho ochranného působení proti virovému cytopatickému účinku s působením vhodného mezinárodního standardu lidského rekombinantního interferonu alfa-2 nebo referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství vhodného mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnické organizace.

Zkouška se provádí vhodnou metodou založenou na následujícím uspořádání.

Použije se určená buněčná kultura citlivá na cytopatické působení vhodného viru (vhodná je buněčná linie lidských diploidních fibroblastů prostá mikrobiální kontaminace a citlivá na interferon, která je citlivá na virus encefalomyokarditidy) za standardních kultivačních podmínek.

Vhodné jsou následující buněčné kultury a viry: buňky MDBK (ATCC č. CCL22) nebo myší L-buňky (NCTC klon 929; ATCC č. CCL 1) jako buněčná kultura a virus vezikulární stomatitidy VSV, kmen Indiana (ATCC č VR-158) jako infekční agens. Lze použít také buňky lidských diploidních fibroblastů FS-71, odpovídající na působení interferonu jako buněčná kultura a virus encefalomyokarditidy (ATCC č. VR-129B) jako infekční agens.

Použijí se tři nebo více různých zředění zkoušeného přípravku a porovnávacího přípravku v nejméně čtyřech souběžných stanoveních na mikrotitračních destičkách. Každé stanovení obsahuje kontrolní buňky, které nejsou vystaveny působení interferonu. Zvolí se taková ředění přípravku, kde nejnižší ředění již poskytuje ochranu a nejvyšší koncentrace poskytuje menší než maximální ochranu proti cytopatickému účinku viru. Ve vhodném čase se přidá cytopatický virus do všech jamek s výjimkou dostatečného počtu jamek v každém souběžném stanoveni s neinfikovanými kontrolními buňkami. Cytopatický účinek viru se určí kvantitativně vhodnou metodou. Účinnost zkoušeného přípravku se vypočítá obvyklými statistickými metodami pro model rovnoběžnosti.

Stanovená účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) je 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě nižší než -20 °C.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• druh interferonu (alfa-2a nebo alfa-2b),

• způsob výroby.

“

• 1. V příloze části 6 Speciální část, kapitola 6.1 Léčivé a pomocné látky, se za článek Interferoni alfa-2 solutio concentrata doplňuje článek Interferoni gamma-1b solutio concentrata, který zní:

„

† Interferoni gamma-1b solutio concentrata [image omitted]

Koncentrovaný roztok interferonu gama-1b

C734H1166N204O216S5	Mr 16 464,76

Je to roztok N-terminální methionylové formy interferonu gama, bílkoviny, jež je vytvářena a vylučována lidskými T lymfocyty stimulovanými antigenem jako odpověď na virové infekce a na různá jiná agens. Má specifické imunomodulační vlastnosti, jako např. silné účinky při aktivaci fagocytů.

Bílkovina se skládá z nekovalentních dimerů dvou identických monomerů.

Vzorec monomeru:

MQDPYVKEAEN	LKKYFNAGHS	DVADNGTLFL
GILKNWKEES	DRKIMQSQIV	SFYFKLFKNF
KDDQSIQKSV	ETIKEDMNVK	FFNSNKKKRD
DFEKLTNYSV	TDLNVQRKAI	HELIQVMAEL
SPAAKTGKRK	RSQMLFRGR

Účinnost interferonu gama-1b je nejméně 20.10^6 m.j. v miligramu bílkoviny. Koncentrovaný roztok interferonu gama-1b obsahuje nejméně 30.10^6 m.j. interferonu gama-1b v mililitru.

Koncentrovaný roztok interferonu gama-1b vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

Výroba

Vyrábí se metodou založenou na rekombinantní DNK technologii za použití bakterií jako hostitelských buněk. Vyrábí se v podmínkách určených ke snížení kontaminace mikroby na minimum.

Vyhovuje následujícím dodatečným požadavkům:

Bílkoviny odvozené z hostitelských buněk. Limit schvaluje oprávněná autorita.

DNK odvozená z hostitelských buněk nebo vektoru. Limit schvaluje oprávněná autorita.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá nebo slabě nažloutlá tekutina.

Zkoušky totožnosti

A. Stanovení účinnosti je zároveň zkouškou totožnosti.

B. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Nečistoty lišící se od interferonu gama-1b molekulovými hmotnostmi. Hlavní pásy na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou hlavním pásům na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).

C. Provede se peptidové mapování.

Roztok A. Připraví se roztok obsahující trometamol R (1,2 g/l), octan sodný bezvodý R (8,2 g/l) a chlorid vápenatý R (0,02 g/l) a jeho pH (2.2.3) se upraví kyselinou octovou zředěnou RS na hodnotu 8,3. Přidá se polysorbát 20 R do koncentrace 0,1 % (V/V).

Zkoušený roztok. Vhodným postupem se odsolí objem zkoušeného přípravku obsahující 1 mg bílkoviny. Např. se zfiltruje do mikrocentrifugační zkumavky a rekonstituuje se 500 μl roztoku A. Přidá se 10 μl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1 mg/ml) ve vodě R a jemně se míchá kroužením. Inkubuje se 24 h při 30 °C až 37 °C, přidá se 100 μl kyseliny fosforečné R na mililitr rozštěpeného vzorku a míchá se kroužením.

Porovnávací roztok. Interferon gama-1b CRL se zředí vodou R na koncentraci 1 mg/ml. Postupuje se jako u zkoušeného roztoku a zajistí se, aby všechny postupy byly provedeny současně a ve stejných podmínkách.

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (10 μm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min:

• mobilní fáze A - (tlumivý roztok fosforečnanový o pH 3,3 (0,05 mol/l)). Roztok I: 7,80 g dihydrogenfosforečnanu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. Roztok II: 0,33 ml kyseliny fosforečné R se zředí vodou R na 100,0 ml. Smíchá se 920 ml roztoku I a 80 ml roztoku II. Je-li třeba, upraví se pH (2.2.3),

• mobilní fáze B - acetonitril pro chromatografii R,

• následujících podmínek eluce (je-li třeba, může se gradient upravit, aby se zlepšilo dělení rozštěpené látky):

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
0 - 30	100 → 80	0 → 20
30 - 50	80 → 60	20 → 40
50 - 51	60 →30	40 → 70
51 - 59	30	70
59 - 60	30 → 100	70 → 0

• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází s počátečním složením. Provede se slepá zkouška za použití výše uvedeného gradientu.

Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku a 100 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže se chromatogramy obou roztoků kvalitativně podobají referenčnímu chromatogramu Ph.Eur. rozštěpeného interferonu gama-1b. Profil chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá profilu chromatogramu porovnávacího roztoku.

D. Provede se N-terminální sekvenční analýza. Použije se automatický sekvenátor v pevné fázi v souladu s návodem výrobce. Vhodným způsobem se ustálí ekvivalent 100 μg interferonu gama-1b v roztoku hydrogenuhličitanu amonného R (10 g/l) o pH 9,0.

Reverzní fází kapalinové chromatografie se identifikují fenylthiohydantoin (PHT)-aminokyseliny uvolněné při každém sekvenčním cyklu. Postup se může provést s použitím kolony a zkoumadel doporučenými výrobcem sekvenčního zařízení při separaci PHT-aminokyselin.

Separační postup se kalibruje za použití:

• směsi PHT-aminokyselin poskytnutým výrobcem s podmínkami gradientu nastavenými tak, jak se uvádí k získání nejlepšího rozložení všech aminokyselin,

• vzorku ze slepého sekvenčního cyklu získaného podle doporučení výrobce zařízení.

Prvních patnáct aminokyselin je:

Met-Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr.

Zkoušky na čistotu

Vzhled. Zkoušený přípravek je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž7 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 5,5; měří se zkoušený přípravek.

Kovalentní dimery a oligomery. Nejvýše 2 %; stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí mobilní fází na koncentraci bílkovin 0,1 mg/ml.

Porovnávací roztok (a). Interferon gama-1b CRL se zředí mobilní fází na koncentraci bílkovin 0,1 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). Připraví se směs následujících standardů molekulových hmotností: albumin hovězí, ovalbumin, trypsinogen, lysozym o koncentraci 0,1 mg/ml až 0,2 mg/ml pro každý standard.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 7,8 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografií R stupně vhodného pro frakcionaci globulárních bílkovin v rozpětí molekulových hmotností od 10 000 do 500 000 (5 μm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou je směs připravená následujícím postupem (tlumivý roztok fosforečnanu sodného o pH 6,8 (0,2 mol/l)). Roztok I: 31,2 g dihydrogenfosforečnanu sodného R a 1,0 g dodecylsíranu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. Roztok II: 28,4 g hydrogenfosforečnanu sodného bezvodého R a 1,0 g dodecylsíranu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. Smíchá se 450 ml roztoku I a 550 ml roztoku II. Je-li třeba, upraví se pH (2.2.3),

• spektrofotometrického detektoru, 210 nm až 214 nm.

Nastříkne se po 200 μl ze všech roztoků. Zkoušku lze hodnotit, jestliže: standardy molekulové hmotnosti porovnávacího roztoku (b) jsou zřetelně rozděleny; retenční čas hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je mezi retenčním časem trypsinogenu a lysozymu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Porovnají se chromatogramy zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a). V porovnání s porovnávacím roztokem (a) není na zkoušeném roztoku žádná další prodleva ani pík.

Obsah kovalentních dimerů a oligomerů se vypočítá v procentech.

Monomery a agregáty. Nejvýše 2 %; stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Roztok A. Připraví se roztok kyseliny jantarové R (0,59 g/l) a mannitolu R (40 g/l) a jeho pH (2.2.3) se upraví hydroxidem sodným RS na hodnotu 5,0.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem A na koncentraci bílkovin 1 mg/ml.

Porovnávací roztok. Interferon gama-1b CRL se zředí roztokem A na koncentraci bílkovin 1 mg/ml.

Roztok pro rozlišení. Připraví se 500 μl směsi obsahující albumin hovězí R (0,04 mg/ml) a interferon gama-1b CRL (0,2 mg/ml) v roztoku A. Tento roztok se použije do 24 h od přípravy.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 7,8 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R stupně vhodného pro frakcionaci globulárních bílkovin v rozpětí molekulových hmotností 10 000 až 300 000 (5 μm),

• mobilní fáze, kterou je roztok chloridu draselného R 1,2 mol/l (89,5 g/l). Průtoková rychlost je 0,8 ml/min,

• detektoru spektrofotometrického, 214 nm.

Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení. Na získaném chromatogramu retenční čas hlavního píku odpovídá nativnímu dimeru interferonu gama-1b, asi 10 min; pík hovězího albuminu se eluuje při relativním retenčním čase asi 0,85 vzhledem k hlavnímu píku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky hovězího albuminu a interferonu gama-1b je nejméně 1,5.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku. Získané chromatogramy vykazují hlavní píky se shodnými retenčními časy. Obsah monomeru a agregátů v procentech se vypočítá z plochy píku monomeru a píků, které se eluují před píkem nativního interferonu gama-1b na chromatogramu zkoušeného roztoku, obvyklým postupem (metodou normalizace). Nepřihlíží se k pikům rozpouštědla.

Deamidované a oxidované formy a heterodimery. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29); obsah deamidovaných a oxidovaných forem je nejvýše 10 %, heterodimerů jsou nejvýše 3 %.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkovin 1 mg/ml.

Porovnávací roztok. Interferon gama-1b CRL se zředí vodou R na koncentraci bílkovin 1 mg/ml.

Roztok pro rozlišení. Použije se validační roztok interferonu gama-1b CRL.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,075 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné vhodným hydrofilním polymethakrylátem, silně kationty měnícím gelem (10 μm, 100 nm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,2 ml/min:

• mobilní fáze A - (tlumivý roztok octanu amonného o pH 6,5 (0,05 mol/l)); roztok octanu amonného R (3,86 g/l), jehož pH se upraví kyselinou octovou zředěnou RS na hodnotu 6,5,

• mobilní fáze B - (tlumivý roztok octanu amonného o pH 6,5 (1,2 mol/l)]; roztok octanu amonného R (92,5 g/l), jehož pH se upraví kyselinou octovou zředěnou RS na hodnotu 6,5,

• gradientového programu s následujícími podmínkami (je-li třeba, upraví se pro zlepšení separace stoupání gradientu):

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
0 - 1	100	0
2 - 30	100 → 0	0 → 100
31 - 35	0	100
36 - 37	0 → 100	100 → 0
38 - 47	100	0

• spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Teplota kolony se udržuje při 35 °C.

Nastříkne se 25 μl roztoku pro rozlišení. Na získaném chromatogramu je retenční čas hlavního píku asi 26 min. Deamidované a oxidované formy se eluují společně při relativním retenčním čase asi 0,95 vzhledem k hlavnímu píku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení definované poměrem výšky píku odpovídajícího deamidovaným a oxidovaným formám k výšce nad základní linií dělící oba píky je nejméně 1,2.

Nastříkne se 25 μl zkoušeného roztoku a 25 μl porovnávacího roztoku. Získané chromatogramy vykazují hlavní píky se shodnými retenčními časy. Obsah deamidovaného a oxidovaného interferonu gama-1b v procentech se vypočítá jako procenta z plochy hlavního píku. Relativní retenční čas heterodimerů je 0,7 až 0,85 vzhledem k hlavnímu píku. Obsah heterodimerů v procentech se vypočítá jako procenta ze součtu ploch všech píků.

Nečistoty lišící se od interferonu gama-1b molekulovými hmotnostmi. Stanoví se polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (2.2.31). Zkouška se provádí za redukčních i neredukčních podmínek na rozlišovacích gelech s 15 % akrylamidu; k detekci se používá barvení stříbrem.

Roztok pro vzorek (pro neredukční podmínky). 3,78 g trometamolu R, 10,0 g dodecylsíranu sodného R a 0,100 g modři bromfenolové R se rozpustí ve vodě R. Přidá se 50,0 ml glycerolu R a zředí se vodou R na 80 ml. Upraví se pH (2.2.3) kyselinou chlorovodíkovou R na hodnotu 6,8 a zředí se vodou R na 100 ml.

Roztok pro vzorek (pro redukční podmínky). 3,78 g trometamolu R, 10,0 g dodecylsíranu sodného R a 0,100 g modři bromfenolové R se rozpustí ve vodě R. Přidá se 50,0 ml glycerolu R a zředí se vodou R na 80 ml. Upraví se pH (2.2.3) kyselinou chlorovodíkovou R na hodnotu 6,8 a zředí se vodou R na 100 ml. Bezprostředně před použitím se přidá dithiothreitol R do konečné koncentrace 0,250 mol/l.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1 mg/ml. K 150 μl tohoto roztoku se přidá 38 μl roztoku pro vzorek.

Porovnávací roztok (a). Připraví se stejně jako zkoušený roztok, ale místo zkoušeného přípravku se použije interferon gama-1b CRL.

Porovnávací roztok (b) (5 ng kontrola). 50 μl roztoku albuminu hovězího R (0,01 mg/ml) se smíchá s 2000 μl vody R a 450 μl roztoku pro vzorek.

Porovnávací roztok (c) (2 ng kontrola). 20 μl roztoku albuminu hovězího R (0,01 mg/ml) se smíchá s 2000 μl vody R a 450 μl roztoku pro vzorek.

Porovnávací roztok (d). Použije se roztok standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidových gelů v rozpětí 10 kDa do 70 kDa.

Každý roztok se ve zkumavce nechá 15 min při pokojové teplotě a pak se uchovává na ledu.

Do jamek zaostřovacího gelu se nanese po 25 μl každého roztoku. Za podmínek doporučených výrobcem zařízení se provede elektroforéza a bílkoviny se detegují barvením stříbrem.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže splňuje validační kritéria (2.2.31); na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b) a (c) je vždy vidět pás.

Hlavní pás na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídá intenzitou hlavnímu pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a). Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku není vidět žádný významný pás, který by nebyl přítomen na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a) (0,01 %). Jako významný pás je definován jakýkoliv pás, jehož intenzita je stejná nebo větší než intenzita pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (c).

Norleucin. Nejvýše 0,2 molu norleucinu na mol interferonu gama-1b; stanoví se analýzou aminokyselin.

Zkoušený roztok. 2,5 ml zkoušeného přípravku se nanese na kolonu vhodnou pro odsolení bílkovin, která byla předtím ustálena 25 ml roztoku kyseliny octové R 10 % (V/V). Vzorek se eluuje 2,5 ml roztoku kyseliny octové R 10 % (V/V). Stanoví se obsah bílkovin měřením absorbance tohoto roztoku, jak je popsáno v odstavci Stanovení bílkovin. Objem obsahující množství odpovídající 100 μg interferonu gama-1b se napipetuje do každé ze tří reakčních lahviček a odpaří se do sucha za sníženého tlaku.

Hydrolýza tří vzorků se provede takto: do každé reakční lahvičky se přidá 200 μl roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50 % (V/V) obsahující fenol R 1 % (V/V); vzorky se evakuují a vyčistí dusíkem, potom se hydrolyzují v plynné fázi. Lahvičky se 22 h zahřívají při 110 °C. Po hydrolýze se odpaří do sucha za sníženého tlaku.

Derivatizace vzorků se provede takto: bezprostředně před použitím se připraví směs objemových dílů ethanolu R, vody R a triethylaminu R (2 + 1 + 1). 50 μl tohoto roztoku se přidá do každé reakční lahvičky, lehce se protřepe a odpaří se za sníženého tlaku do sucha. Do každé lahvičky se přidá 50 μl směsi objemových dílů ethanolu R, vody R, triethylaminu R a fenylisothiokyanat R (7 + 1 + 1 + 1). Lehce se protřepe a nechá se stát asi 15 min při pokojové teplotě. Odpaří se do sucha za sníženého tlaku a vzorky se rekonstituují v 250 μl mobilní fáze A.

Zásobní roztok norleucinu. Připraví se roztok DL-norleucinu R (250 nmol/ml) v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Tento roztok se může uchovávat 2 měsíce při 4 °C.

Zásobní roztok leucinu. Připraví se roztok leucinu R (250 nmol/ml) v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Tento roztok se může uchovávat 2 měsíce při 4 °C.

Porovnávací roztok. V každé ze tří reakčních lahviček se smíchá 10 μl zásobního roztoku norleucinu a 100 μl zásobního roztoku leucinu. Odpaří se do sucha za sníženého tlaku a provede se derivatizace vzorku, jak je předepsáno pro přípravu zkoušeného roztoku.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 3,9 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (4 μm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min,