Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění pozdějších předpisů

Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu TLC F254 pro chromatografii R. Zkoušený roztok. 1,0 g se smíchá v 50ml baňce s kulatým dnem se 16,0 ml vody R a 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové RS a zahřívá se 30 min na vodní lázni pod zpětným chladičem. Po ochlazení se zfiltruje. Filtr i baňka se suší 60 min při 105 °C. Filtr se vloží zpět do baňky, smíchá se s 20 ml etheru R a zahřívá se 5 min ve vodní lázni pod zpětným chladičem při 40 °C. Po ochlazení se zfiltruje. Filtrát se odpaří do sucha a zbytek se rozpustí v 5,0 ml etheru R. Porovnávací roztok. 5,0 mg kyseliny glycyrrhetinové R a 5,0 mg thymolu R se rozpustí v 5 ml etheru R.

Na vrstvu se nanese do pruhů po 10 μl obou roztoků. Vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, vody R, lihu 96% R a ethylacetatu R (1 +9 + 25 + 65) po dráze 15 cm. Vrstva se suší 5 min na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramech zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku je v dolní polovině skvrna zhášející fluorescenci (kyselina glycyrrhetinová). Vrstva se postříká anisaldehydem RS, suší se 5 min až 10 min při 100 °C až 105 °C a pozoruje se v denním světle. Na chromatogramu porovnávacího roztoku je v dolní polovině fialová skvrna (kyselina glycyrrhetinová), v horní třetině červená skvrna (thymol). Na chromatogramu zkoušeného roztoku je v dolní polovině fialová skvrna odpovídající polohou a zbarvením skvrně kyseliny glycyrrhetinové na chromatogramu porovnávacího roztoku a v horní třetině v poloze odpovídající poloze pod skvrnou thymolu na chromatogramu porovnávacího roztoku je žlutá skvrna (isoliquiritigenin). Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou další skvrny.

Zkoušky na čistotu

Ethanol (2.9.10). 52 % (V/V) až 65 % (V/V).

Methanol a 2-propanol (2.9.11). Nejvýše 0,05 % (V/V) methanolu a nejvýše 0,05 % (V/V) 2-propanolu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 1,000 g se zředí směsí objemových dílů amoniaku zředěného RS1 a vody R (8 + 92) na 100 ml a odstředí se. 2,0 ml supernatantní tekutiny se zředí směsí objemových dílů amoniaku zředěného RS1 a vody R (8 + 92) na 100,0 ml.

Základní roztok. 0,130 g monoamoniumglycyrrhizinatu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů amoniaku zředěného RS1 a vody R (8 + 92) a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 5,0 ml základního roztoku se zředí směsí objemových dílů amoniaku zředěného RS1 a vody R (8 + 92) na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 10,0 ml základního roztoku se zředí směsí objemových dílů amoniaku zředěného RS1 a vody R (8 + 92) na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 15,0 ml základního roztoku se zředí směsí objemových dílů amoniaku zředěného RS1 a vody R (8 + 92) na 100,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,10 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

• mobilní fáze, kterou je směs objemových dílů kyseliny octové RS, acetonitrilu R a vody R (6 + 30 + 64); průtoková rychlost je 1,5 ml/min,

• spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (c). Citlivost přístroje se nastaví tak, aby výšky píků činily nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříknou se odděleně porovnávací roztoky a stanoví se plochy píků.

Sestrojí se kalibrační křivka za použití koncentrací porovnávacích roztoků (g/100 ml) na ose x a odpovídajících ploch píků na ose y.

Nastříkne se 10 μl zkoušeného roztoku. Za použití retenčních časů a ploch píků na chromatogramech porovnávacích roztoků se identifikuje a stanoví plocha píku kyseliny glycyrrhizinové na chromatogram zkoušeného roztoku.

Obsah kyseliny glycyrrhizinové (C42H62O16) v procentech se vypočítá podle vzorce:

A . 5m . B . 822840 ,

v němž značí:

A - koncentraci monoamoniumglycyrrhizinatu ve 100 ml zkoušeného roztoku, odečtenou z kalibrační křivky v gramech,

B - deklarovaný obsah monoamoniumglycyrrhizinatu CRL v procentech,

m - hmotnost zkoušené látky v gramech,

822 - molekulovou hmotnost kyseliny glycyrrhizinové,

840 - molekulovou hmotnost monoamoniumglycyrrhizinatu (bezvodého).

Uchovávání

Chráněn před světlem.

“

• 1. V příloze části 6 Speciání část, kapitola 6.2 Léčivé přípravky, kapitola 6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky, se za článek Macrogoli unguentum doplňuje článek Matricariae extractum fluidim, který zní:

„

Matricariae extractum fluidum [image omitted]

Heřmánkový extrakt tekutý

Vyrábí se z drogy Matricariae flos. Obsahuje nejméně 0,30 % modré zbytkové silice.

Výroba

Vyrábí se z drogy a směsi 2,5 dílů roztoku amoniaku R (10%), 47,5 dílů vody R a 50 dílů lihu 96% R vhodným způsobem uvedeným v článku Extracta.

Vlastnosti

Nahnědlá čirá tekutina intenzivního charakteristického pachu a charakteristické hořké chuti. Je mísitelný s vodou a s lihem 96% za vzniku zákalu, dobře se rozpouští v lihu 50% (V/V).

Zkoušky totožnosti

A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu F254 pro TLC R.

Zkoušený roztok. 10 ml extraktu se protřepe v dělicí nálevce dvakrát 10 ml pentanu R. Spojené pentanové vrstvy se vysuší 2 g síranu sodného bezvodého R a zfiltrují se. Filtrát se odpaří na vodní lázni do sucha a zbytek se rozpustí v 0,5 ml toluenu R.

Porovnávací roztok. 4 mg guajazulenu R, 20 mg levomenolu R a 20 mg bornylacetatu R se rozpustí v 10 ml toluenu R.

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů ethylacetatu R a toluenu R (5 + 95) po dráze 10 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku je několik skvrn zhášejících fluorescenci, z nichž dvě hlavní skvrny jsou ve střední třetině (en-yn-dicykloether). Pozoruje se v ultrafialovém světle při 365 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku je ve střední části intenzivně modře fluoreskuující skvrna (herniarin). Vrstva se postříká anisaldehydem RS, suší se 5 min až 10 min při 100 °C až 105 °C a pozoruje se v denním světle. Na chromatogramu porovnávacího roztoku je ve spodní třetině červenofialová až modrofialová skvrna (levomenol), ve střední třetině žlutohnědá až šedozelená skvrna (bornylacetat) a v horní třetině červená až červenofialová skvrna (guajazulen). Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou v dolní třetině žloutohnědé až zelenožluté a fialové skvrny a červenofialová až modrofialová skvrna odpovídající levomenolu na chromatogramu porovnávacího roztoku; nahnědlá skvrna (en-yn-dicykloether) odpovídá polohou bornylacetatu na chromatogramu porovnávacího roztoku; Červená nebo červenofialová skvrna (chamazulen) odpovídá polohou guajazulenu na chromatogramu porovnávacího roztoku a těsně nad ní je jedna nebo dvě modré až modrofialové skvrny. Na chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být přítomny další slabě zbarvené skvrny.

B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok. Zkoušený extrakt.

Porovnávací roztok. 1,0 mg kyseliny chlorogenové R, 2,5 mg hyperosidu R a 2,5 mg rutinu R se rozpustí v 10 ml methanolu R.

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 10 μl obou roztoků a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny mravenčí bezvodé R, kyseliny octové ledové R, vody R a ethylacetatu R (7,5 + 7,5 + 18 + 67) po dráze 15 cm. Vrstva se suší při 100 °C až 105 °C a ještě teplá se postříká roztokem difenylboryloxyethylaminu R (10 g/l) v methanolu R a potom roztokem makrogolu 400 R (50 g/l) v methanolu R, suší se asi 30 min na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 365 nm. Na chromatogramu porovnávacího roztoku je ve střední části světle modře fluoreskující skvrna (kyselina chlorogenová), pod ní žlutohnědě fluoreskující skvrna (rutin) a nad ní žlutohnědě fluoreskující skvrna (hyperosid). Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou: žlutohnědě fluoreskující skvrna odpovídající skvrně rutinu na chromatogramu porovnávacího roztoku, světle modře fluoreskující skvrna odpovídající skvrně kyseliny chlorogenové na chromatogramu porovnávacího roztoku, žlutohnědě fluoreskující skvrna odpovídající polohou hyperosidu na chromatogramu porovnávacího roztoku; nad žlutohnědě fluoreskující skvrnou je zeleně fluoreskující skvrna, několik namodrale nebo nazelenale fluoreskujících skvrn a v blízkosti čela nažloutle fluoreskující skvrna.

Zkoušky na čistotu

Ethanol (2.9.10). 38 % (V/V) až 53 % (V/V).

Methanol a 2-propanol (2.9.11). Vyhovuje požadavkům zkoušky Methanol a 2-propanol uvedené v článku Extracta, odstavec Extracta fluida.

Zbytek po odpaření. Nejméně 12,0 %; stanoví se způsobem uvedeným v článku Extracta, odstavec Extracta fluida.

Stanovení obsahu

20,0 g extraktu se v 1000ml baňce s kulatým dnem smíchá s 300 ml vody R a destiluje se do konečného objemu 200 ml destilátu. Destilát se převede do dělicí nálevky, přidá se 65 g chloridu sodného R a po rozpuštění se roztok protřepe třikrát vždy se 30 ml pentanu R, který byl použit k promytí zpětného chladiče a baňky. Spojené pentanové vrstvy se vysuší 2 g síranu sodného bezvodého R a zfiltrují se do vysušené (3 h v exsikátoru) a předem zvážené 100ml baňky s kulatým dnem. Vrstva síranu sodného bezvodého a filtr se promyjí dvakrát 20 ml pentanu R. Pentan se odpaří na vodní lázni při 45 °C. Zbytek pentanu se odstraní proudem vzduchu během 3 min. Baňka se 3 h suší v exsikátoru a zváží se. Zbytková silice je modrá (chamazulen).

Uchovávání

V dobře uzavřeném obalu, chráněn před světlem.

“

• 1. V příloze části 6 Speciání část, kapitola 6.2 Léčivé přípravky, kapitola 6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky, se za článek Plantaginis extractum fluidum doplňuje článek Plantaginis sirupus, který zní:

„

Plantaginis sirupus N

Jitrocelový sirup

Synonymum. Sirupus plantaginis

Je to koncentrovaný roztok sacharosy ve výluhu z jitrocelového listu konzervovaný methylparabenem.

Příprava

Plantaginis folium (5 600)	50,0 g
Aqua purificata	450,0 g
Sacharosum	640,0 g
Methylparabenum	1,5 g
Ethanolum 96% (V/V)	10,0 g

Na jitrocelový list se naleje vroucí čištěná voda a v dobře uzavřené nebo porcelánové nádobě se 4 h nechá stát za občasného promíchávání. Tekutina se zfiltruje vhodným filtrem, droga se ihned vylisuje a získaný výluh se rovněž zfiltruje. Obě tekutiny se spojí a doplní se na 360 g čištěnou vodou, kterou se promývala vylisovaná droga. Přidá se sacharosa a roztok methylparabenu v ethanolu 96% (V/V) a tato směs se svaří na sirup. Ten se zfiltruje vhodným filtrem a doplní se čerstvě převařenou a ještě horkou čištěnou vodou na 1000 g.

Vlastnosti

Tmavě hnědá hustá tekutina, charakteristického pachu a chuti.

Zkoušky totožnosti

A. Ke 2,5 ml se po částech přidá 10 ml lihu 96% R a protřepe se; směs se zfiltruje a zředí se 10 ml vody R. K 2 ml filtrátu se přidá asi 0,05 g resorcinolu R, 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové RS a zahřívá se na vodní lázni; tekutina se zbarví červeně (sacharosa).

B. Ke 2 ml se přidá 0,2 ml zkoumadla Milionova R a zahřeje se na vodní lázni; tekutina se zbarví červeně (parabeny).

C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

Zkoušený roztok. 25 ml se dvakrát vytřepe 10 ml ethylacetatu R. Ethylacetatové výtřepky se zfiltrují přes chomáček vaty s asi 2 g síranu sodného bezvodého R, spojí se a na vodní lázni se odpaří do sucha. Odparek se rozpustí v 1 ml methanolu R.

Porovnávací roztok. 5 mg žluti naftolové RS se rozpustí v 1,0 ml methanolu R.

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů (20 mm x 3 mm) 20 μl zkoušeného roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku. Vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, kyseliny octové ledové R a ethylacetatu R (20 + 20 + 60) po dráze 10 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pak se postříká dimethylaminobenzaldehydem RS2 a suší se 10 min při 100 °C až 105 °C.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku je intenzivní hnědošedá skvrna (aukubin), která se barví modrošedě, v poloze přibližně odpovídající skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být další, méně intenzivní skvrny odpovídající zbarvením aukubinu, na čele chromatogramu je intenzivně zbarvená skvrna (chlorofyl).

Zkoušky na čistotu

Hustota. ρ20 = 1,304 g/cm^3 až 1,320 g/cm^3.

Index lomu. nD20= 1,450 až 1,456.

Škrobový sirup. 10 ml se vaří s asi 10 mg aktivního uhlí R a 10 ml vody R do odbarvení. Zfiltruje se a 1 ml bezbarvého filtrátu okyseleného 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové RS se přidá 10 ml ethanolu R; filtrát se nezakalí ani po silném protřepání.

Uchovávání

Chráněn před světlem, při teplotě 8 °C až 15 °C.

Označování

V označení na obalu se uvede název použité protimikrobní přísady.

“

• 1. V příloze části 6 Speciání část, kapitola 6.2 Léčivé přípravky, kapitola 6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky, článek Solutiones ad conservationem partium corporis zní:

„

Solutiones ad conservationem partium corporis [image omitted]

Roztoky pro uchovávání orgánů

Jsou to sterilní vodné přípravky pro uchovávání, ochranu a/nebo promývání tělních orgánů savců, určených k transplantaci.

Obsahují elektrolyty, které koncentrací přibližně odpovídají složení nitrobuněčných elektrolytů.

Mohou obsahovat uhlovodíky (např. glukosu nebo mannitol), aminokyseliny, látky tvořící komplexy s vápníkem (např. citraty nebo fosforečnany), hydrokoloidy (např. škrob nebo deriváty želatiny) a další pomocné látky, např. látky určené k izotonizaci roztoku s krví, úpravě nebo nastavení hodnoty pH, k zamezení rozkladu složek, které však nesnižují účinnost přípravku, nebo v použitých koncentracích nejsou příčinou toxicity nebo zvýšené lokální dráždivosti. Roztoky pro uchovávání orgánů mohou také obsahovat léčivé látky, nebo tyto mohou být přidány těsně před použitím.

Při pozorování roztoků pro uchovávání orgánů za vhodných podmínek, jsou tyto roztoky čiré a prakticky prosté částic.

Mohou se připravovat také jako koncentrované roztoky, které se ředí na požadovaný objem předepsanou tekutinou těsně před použitím. Po naředění vyhovují požadavkům na roztoky pro uchovávání orgánů.

Před použitím se ochladí pod pokojovou teplotu, nejlépe na 2 °C až 6 °C, aby se dosáhlo snížení teploty orgánů a jejich metabolismu.

Kde je to vhodné, obaly na roztoky pro uchovávání orgánů vyhovují požadavkům článků Materiály používané na výrobu obalů (3.1 a další) a Obaly (3.2 a další). Roztoky pro uchovávání orgánů jsou dodávány ve skleněných obalech (3.2.1) nebo v jiných, např. plastových obalech (3.2.2 a 3.2.8). Těsnost obalů je zajištěna vhodným způsobem. Uzávěry zajišťují dostatečnou přilnavost, chrání před mikrobiálním a jiným znečištěním a obvykle umožňují bez otevření odebrání buď části, nebo celého obsahu. Plasty nebo elastomery, ze kterých jsou uzávěry vyrobeny, mají dostatečnou pevnost a pružnost, které umožňují proniknutí jehly bez nejmenšího uvolnění částic.

Výroba

Roztoky pro uchovávání orgánů se připravují za použití materiálů a metod zaručujících jejich sterilitu a za podmínek omezujících kontaminaci a růst mikroorganismů; podmínky jsou uvedeny v článku Metody přípravy sterilních výrobků (5.1.1).

Pokud není oprávněnou autoritou uvedeno jinak, k přípravě roztoků pro uchovávání orgánů se použije Aqua pro iniectione a nepřidávají se protimikrobní přísady.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 5,0 až 8,0; měří se zkoušený roztok. Zkouška se provádí za pokojové teploty.

Osmolalita (2.2.35). 250 mosmol/kg až 380 mosmol/kg; měří se zkoušený roztok.

Hydroxymethylfurfural. Jestliže zkoušený roztok obsahuje glukosu, vyhovuje následující zkoušce: k množství zkoušeného roztoku odpovídajícímu 25 mg glukosy se přidá 5,0 ml roztoku p-toluidinu R (100 g/l) ve 2-propanolu R obsahujícím 10 % (V/V) kyseliny octové ledové R a 1,0 ml roztoku kyseliny barbiturové R (5 g/l) a nechá se 2 min až 3 min stát. Absorbance tohoto roztoku (2.2.25) měřená při 550 nm není větší než absorbance porovnávacího roztoku připraveného současně stejným způsobem obsahujícího 10 μg hydroxymethylfurfuralu R ve stejném objemu jako zkoušený roztok.

Kontaminace částicemi. S 50 ml zkoušeného roztoku se provede zkouška na částice pod hranicí viditelnosti (2.9.19). Roztok obsahuje nejvýše 50 částic větších než 10 μm v mililitru a nejvýše 5 částic větších než 25 μm v mililitru.

Výrobky, u kterých je v označení na obalu uvedeno, že se použijí s koncovým filtrem, nepodléhají těmto požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 0,5 m.j. endotoxinu v mililitru.

Pyrogenní látky (2.6.8). Zkoušené roztoky, u kterých nelze provést validovanou zkoušku na bakteriální endotoxiny, vyhovují zkoušce na pyrogenní látky. Vstřikuje se 10 ml roztoku na kilogram hmotnosti králíka, jestliže není oprávněnou autoritou uvedeno jinak.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• že roztok není určen pro injekce,

• složení roztoku vyjádřené v gramech na litr a v milimolech na litr,

• jmenovitý objem roztoku pro uchovávání orgánů v obalu,

• osmolalita vyjádřená v miliosmolech na kilogram,

• že nespotřebovaná část právě připraveného roztoku, koncentrovaného nebo zředěného roztoku se nesmí dále použít,

• podmínky uchovávání,

• kde je to vhodné, že roztok se používá ve spojení s koncovým filtrem.

V označení na obalu koncentrovaných roztoků se dodatečně uvede:

• že roztok musí být zředěn vhodnou tekutinou těsně před použitím.

“

• 1. V příloze části 6 Speciání část, kapitola 6.2 Léčivé přípravky, kapitola 6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky, články Vaccinum clostridii novyi B ad usum veterinarium, Vaccinum clostridii perfringentis ad usum veterinarium a Vaccinum clostridii septici ad usum veterinarium znějí:

„

Vaccinum clostridii novyi B ad usum veterinarium [image omitted]

Vakcína proti Clostridium novyi (typ B) pro veterinární použití

Připravuje se z tekuté kultury vhodného kmene Clostridium novyi (typ B).

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Celá kultura nebo její filtrát, nebo směs obou se inaktivuje tak, aby se odstranila toxicita, ale imunogenita zůstala zachována. K toxoidům nebo inaktivovaným kulturám se může přidat vhodné adjuvans po zahuštění, bylo-li nutné.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7). Imunogenita vakcíny pro každé cílové zvíře se prokáže, když aplikována podle doporučeného vakcinačního schématu stimuluje imunitní odpověď (např. tvorbu protilátek) shodnou s požadavky na přípravek.

Zkoušení šarže

Reziduální toxicita. Zkoušku na reziduální toxicitu může výrobce vynechat, pokud se zkouška detoxikace bezprostředně po detoxikačním procesu provádí. Je-li riziko návratu toxicity, provede se druhá zkouška v nejzazším možném stupni výrobního procesu (viz článek Vaccina ad usum veterinarium).

Zkouška účinnosti šarže. Zkoušku popsanou v odstavci Stanovení účinnosti není nezbytně nutné provádět při rutinním zkoušení šarží vakcíny. Provede se jednou nebo vícekrát podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Kde se neprovede tato zkouška, použije se vhodná validovaná zkouška. Kritéria pro přijetí se stanoví ve vztahu k šarži, která prokazatelně měla vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti a která je vyhovující z hlediska imunogenity pro cílové druhy zvířat. Může se používat následující zkouška, prokáže-li se její dostatečná shoda se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Vakcinují se králíci jak je popsáno v odstavci Stanovení účinnosti, a připraví se séra. V jednotlivých sérech se stanoví titr protilátek proti alfa-toxinu Cl. novyi vhodnou metodou, např. imunochemicky (2.7.1) nebo neutralizací v buněčných kulturách. Použije se homologní referenční sérum kalibrované v mezinárodních jednotkách Cl. novyi alfa-antitoxinu. Vakcína vyhovuje zkoušce účinnosti, není-li zjištěný titr protilátek nižší než jejich titr v šarži vakcíny, která dala vyhovující výsledek ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti a která byla prokazatelně uspokojivá z hlediska imunogenity pro cílové druhy zvířat.

Zkouška totožnosti

Vakcína po injekčním podání zvířatům, která nemají antitoxin novyi alfa podporuje tvorbu tohoto antitoxinu.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma ovcím se doporučeným způsobem vstříkne dvojnásobek nejvyšší dávky uvedené v označení. Zvířata se pozorují nejméně 14 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Zbytková toxicita. Pěti myším hmotnosti 17 g až 22 g se podkožně vstříkne po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Nejméně deseti zdravým králíkům starým tři až šest měsíců se podkožně vstříkne množství přípravku, které nepřesahuje nejnižší první dávku uvedenou v označení. Za 21 až 28 dní se tato zvířata přeočkují množstvím, které nepřesahuje nejnižší druhou dávku uvedenou v označení. Za 10 až 14 dní po přeočkování se králíkům odebere krev a vytvoří se směsný vzorek sér.

Účinnost směsného vzorku sér je nejméně 3,5 m.j. v mililitru.

Mezinárodní jednotka je specifická účinnost neutralizující alfa-toxin Cl. novyi obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který obsahuje určité množství sušeného imunního koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Účinnost směsného vzorku sér králíků se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší nebo jiných vhodných zvířat před toxickým účinkem neměnné dávky alfa-toxinu Cl. novyi s dávkou referenčního alfa-antitoxinu Cl. novyi kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, nezbytnou k vytvoření stejné ochrany. K tomuto porovnání je zapotřebí vhodný přípravek alfa-toxinu Cl. novyi, který se použije jako zkušební toxin. Dávka zkušebního toxinu se stanoví proti referenčnímu přípravku, účinnost zkoušeného séra se stanoví porovnáním s referenčním přípravkem za použití zkušebního toxinu.

Příprava zkušebního toxinu. Zkušební toxin se připraví ze sterilního filtrátu asi pětidenní kultury Cl. novyi typu B v tekuté živné půdě a vysuší se vhodnou metodou. Zkušební toxin se vybírá podle stanovení dávky L+/10 a LD50 pro myši. Doba pozorování je 72 h.

Vhodný alfa-toxin obsahuje nejméně jednu dávku L+/10 v 0,05 mg a nejméně 10 LD50 v jedné dávce L+/10.

Stanovení zkušební dávky toxinu. Ve vhodné tekutině se připraví roztok referenčního přípravku tak, aby v 1 ml obsahoval 1 m.j. Roztok zkušebního toxinu ve vhodné tekutině se připraví tak, aby v 1 ml obsahoval přesně známé množství, např. 1 mg. Připraví se směsi roztoků referenčního přípravku a zkušebního toxinu tak, aby každá směs obsahovala 1,0 ml roztoku referenčního přípravku (1 m.j.) a jeden z řady stoupajících objemů roztoku zkušebního toxinu. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 2,0 ml a nechají se 60 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši hmotnosti 17 g až 22 g, každé se nitrosvalově nebo podkožně vstříkne 0,2 ml a pozorují se 72 h. Uhynou-li všechny myši, je množství toxinu obsažené v 0,2 ml směsi vyšší než zkušební dávka. Neuhyne-li žádná myš, je množství toxinu obsažené v 0,2 ml směsi nižší než zkušební dávka. Potom se připraví čerstvé směsi tak, aby 2,0 ml každé směsi obsahovaly 1,0 ml roztoku referenčního přípravku (1 m.j.) a jeden z řady stoupajících objemů roztoku zkušebního toxinu (v řadě se sousedící objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod). Směsi se nechají 60 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši, každé se nitrosvalově nebo podkožně vstříkne 0,2 ml a pozorují se 72 h. Zkouška se nejméně jedenkrát opakuje a výsledky u jednotlivých směsí se sečtou. Tak se získá řada výsledných součtů, z nichž každý představuje úmrtnost způsobenou směsí stejného složení.

Zkušební dávka toxinu je množství obsažené v 0,2 ml té směsi, která způsobí úhyn poloviny celkového počtu myší, jimž se podala.

Stanovení účinnosti králičích sér

Předběžná zkouška. Ve vhodné tekutině se rozpustí takové množství zkušebního toxinu, aby 1 ml obsahoval desetinásobek zkušební dávky (roztok zkušebního toxinu). Připraví se řada směsí roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby každá směs obsahovala 1,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 2,0 ml a nechají se 60 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši, každé se nitrosvalově nebo podkožně vstříkne 0,2 ml a pozorují se 72 h. Neuhyne-li žádná myš, obsahuje 0,2 ml směsi více než 0,1 m.j. Uhynou-li všechny myši, obsahuje 0,2 ml směsi méně než 0,1 m.j.

Konečná zkouška. Připraví se řada směsí roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby 2,0 ml každé směsi obsahovaly 1,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra (v řadě se sousedící objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod stanovený v předběžné zkoušce). Aby se potvrdila zkušební dávka toxinu, připraví se další směsi tak, aby 2,0 ml každé směsi obsahovaly 1,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů roztoku referenčního přípravku. Všechny směsi se nechají 60 min stát při pokojové teplotě a pro každou se použijí nejméně dvě myši, přičemž se dále postupuje tak, jak je popsáno v předběžné zkoušce. Zkoušená směs, která obsahuje 0,1 m.j. v 0,2 ml, je ta směs, která usmrtí shodný nebo téměř shodný počet myší jako referenční směs, která obsahuje 0,1 m.j. v 0,2 ml. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a vypočítá se průměr všech platných stanovení. Zkouška je platná pouze tehdy, když výsledek referenčního přípravku je v rozmezí ±20 % od očekávané hodnoty.

Intervaly spolehlivosti (P = 0,95) jsou stanoveny takto:

• 85 % až 114 %, použila-li se dvě zvířata na dávku,

• 91,5 % až 109 %, použila-li se čtyři zvířata na dávku,

• 93 % až 108 %, použilo-li se šest zvířat na dávku.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

• je-li přípravek toxoid, nebo vakcína připravená z celé inaktivované kultury, nebo je-li to směs obou,

• že se před použitím přípravek roztřepe,

• vytvořený imunizující účinek pro každý cílový druh (např. tvorba protilátek, ochrana před příznaky nemoci nebo infekcí).

Vaccinum clostridii perfringentis ad usum veterinarium [image omitted]

Vakcína proti Clostridium perfringens pro veterinární použití

Připravuje se z tekuté kultury vhodných kmenů Clostridium perfringens typu B, Clostridium perfringens typu C nebo Clostridium perfringens typu D nebo ze směsi těchto typů.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Celé kultury nebo jejich filtráty, nebo směs obou se inaktivují tak, aby se odstranila toxicita, ale imunogenita zůstala zachována. K toxoidům a/nebo inaktivovaným kulturám se může přidat vhodné adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7). Imunogenita vakcíny pro každé cílové zvíře se prokáže, když aplikována podle doporučeného vakcinačního schématu stimuluje imunitní odpověď (např. tvorbu protilátek) shodnou s požadavky na přípravek.

Zkoušení šarže

Reziduální toxicita. Zkoušku na reziduální toxicitu může výrobce vynechat, pokud se zkouška detoxikace provádí bezprostředně po detoxikačním procesu. Je-li riziko návratu toxicity, provede se druhá zkouška v nejzazším možném stupni výrobního procesu (viz článek Vaccina ad usum veterinarium).

Zkouška účinnosti šarže. Zkoušku popsanou v odstavci Stanovení účinnosti není nezbytně nutné provádět při rutinním zkoušení šarží vakcíny. Provede se jednou nebo vícekrát podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Kde se neprovede tato zkouška, použije se vhodná validovaná zkouška. Kritéria pro přijetí se stanoví ve vztahu k šarži, která měla vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti a která je vyhovující z hlediska imunogenity pro cílové druhy zvířat. Může se používat následující zkouška, prokáže-li se její dostatečná shoda se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Vakcinují se králíci, jak je popsáno v odstavci Stanovení účinnosti, a připraví se séra. V jednotlivých sérech se stanoví titr protilátek proti alfa-toxinu Cl. perfringens vhodnou metodou, např. imunochemicky (2.7.1) nebo neutralizací v buněčných kulturách. Použije se homologní referenční sérum kalibrované v mezinárodních jednotkách Cl. perfringens alfa-antitoxinu. Vakcína vyhovuje zkoušce účinnosti, není-li zjištěný titr protilátek nižší než jejich titr v šarži vakcíny, která dala vyhovující výsledek ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti a která vyhovovala z hlediska imunogenity pro cílové druhy zvířat.

Zkoušky totožnosti

Typ B. Vakcína po injekčním podání zvířatům, která nemají beta- a epsilon-antitoxin, podporuje tvorbu těchto antitoxinů.

Typ C. Vakcína po injekčním podání zvířatům, která nemají beta-antitoxin, podporuje tvorbu tohoto antitoxinu.

Typ D. Vakcína po injekčním podání zvířatům, která nemají epsilon-antitoxin, podporuje tvorbu tohoto antitoxinu.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se dvě zdravá vnímavá zvířata jednoho z druhů, pro které je přípravek určen. Každému zvířeti se doporučeným způsobem vstříkne dvojnásobek nejvyšší dávky uvedené v označení na obalu. Zvířata se pozorují 14 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Zbytková toxicita. Pěti myším o hmotnosti 17 g až 22 g se podkožně vstříkne po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Nejméně deseti zdravým králíkům starým tři až šest měsíců se podkožně vstříkne zkoušený přípravek v dávce, která nepřesahuje nejnižší první dávku uvedenou v označení. Za 21 až 28 dní se tato zvířata přeočkují množstvím, které nepřesahuje nejnižší druhou dávku uvedenou v označení. Za 10 až 14 dní po přeočkování se králíkům odebere krev a vytvoří se směsný vzorek sér.

Typ B. Účinnost směsného vzorku sér je nejméně 10 m.j. beta-antitoxinu a nejméně 5 m.j. epsilon-antitoxinu v mililitru.

Typ C. Účinnost směsného vzorku sér je nejméně 10 m.j. beta-antitoxinu v mililitru.

Typ D. Účinnost směsného vzorku sér je nejméně 5 m.j. epsilon-antitoxinu v mililitru.

Mezinárodní standard pro Clostridium perfringens beta-antitoxin. Mezinárodní jednotka je specifická účinnost neutralizující beta-toxin Clostridium perfringens obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušeného imunního koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Mezinárodní standard pro Clostridium perfringens epsilon-antitoxin. Mezinárodní jednotka je specifická účinnost neutralizující epsilon-toxin Clostridium perfringens obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušeného imunního koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Účinnost směsného vzorku sér králíků se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší nebo jiných vhodných zvířat před toxickým účinkem neměnné zkušební dávky beta-toxinu Clostridium perfringens nebo epsilon-toxinu Clostridium perfringens s dávkou referenčního beta-antitoxinu Clostridium perfringens nebo epsilon-antitoxinu Clostridium perfringens (podle toho, co je vhodné) kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, nezbytnou k vytvoření stejné ochrany. K tomuto porovnání je zapotřebí vhodný přípravek beta- nebo epsilon-toxinu Clostridium perfringens. Dávka zkušebního toxinu se stanoví proti vhodnému referenčnímu přípravku; účinnost zkoušeného séra se stanoví porovnáním s referenčním přípravkem za použití vhodného zkušebního toxinu.

Příprava zkušebního toxinu. Zkušební toxin se připraví ze sterilního filtrátu čerstvé kultury Clostridium perfringens typu B, C nebo D v tekuté živné půdě a vysuší se vhodnou metodou. Podle potřeby se použije beta- nebo epsilon-toxin. Zkušební toxin se vybírá podle stanovení dávky L+ a LD50 u beta-toxinu nebo dávky L+/10 a LD50 u epsilon-toxinu. Stanovení se provádí na myších a doba jejich pozorování je 72 h.

Vhodný beta-toxin obsahuje nejméně jednu dávku L+ v 0,2 mg a nejméně 25 LD50 v jedné L+ dávce. Vhodný epsilon-toxin obsahuje nejméně jednu dávku L+/10 v 0,005 mg a nejméně 20 LD50 v jedné L+/10 dávce.

Stanovení zkušební dávky toxinu. Ve vhodné tekutině se připraví roztok referenčního přípravku tak, aby v 1 ml obsahoval 5 m.j. beta-antitoxinu Clostridium perfringens a 0,5 m.j. epsilon- antitoxinu Clostridium perfringens. Roztok zkušebního toxinu ve vhodné tekutině se připraví tak, aby 1 ml obsahoval přesně známé množství, např. 10 mg pro beta-toxin a 1 mg pro epsilon-toxin. Připraví se směsi roztoků referenčního přípravku a zkušebního toxinu tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku referenčního přípravku a jeden z řady stoupajících objemů roztoku zkušebního toxinu. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 5,0 ml a nechají se 30 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši hmotnosti 17 g až 22 g a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Uhynou-li všechny myši, je množství toxinu obsažené v 0,5 ml směsi vyšší než zkušební dávka. Neuhyne-li žádná myš, je množství toxinu obsažené v 0,5 ml směsi nižší než zkušební dávka. Potom se připraví čerstvé směsi tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku referenčního přípravku a jeden z řady stoupajících objemů zkušebního toxinu (v řadě se sousedící objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod). Směsi se nechají 30 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se nejméně 72 h. Zkouška se nejméně jedenkrát opakuje a výsledky u jednotlivých směsí se sečtou. Tak se získá řada výsledných součtů, z nichž každý představuje úmrtnost způsobenou směsí stejného složení.

Zkušební dávka toxinu je množství obsažené v 0,5 ml té směsi, která způsobí úhyn poloviny celkového počtu myší, jimž se podala.

Stanovení účinnosti králičích sér

Předběžná zkouška. Ve vhodné tekutině se rozpustí takové množství zkušebního toxinu, aby 2,0 ml obsahovaly desetinásobek zkušební dávky (roztok zkušebního toxinu). Připraví se řada směsí roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 5,0 ml a nechají se 30 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Neuhyne-li žádná myš, obsahuje 0,5 ml směsi více než 1 m.j. beta-antitoxinu nebo 0,1 m.j. epsilon-antitoxinu. Uhynou-li všechny myši, obsahuje 0,5 ml směsi méně než 1 m.j. beta-antitoxinu nebo 0,1 m.j. epsilon-antitoxinu.

Konečná zkouška. Připraví se řada směsí roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra (v řadě se stoupající objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod stanovený v předběžné zkoušce). Aby se potvrdila zkušební dávka toxinu, připraví se další směsi tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů roztoku referenčního přípravku. Všechny směsi se nechají 30 min stát při pokojové teplotě a pro každou se použijí nejméně dvě myši, při čemž se dále postupuje tak, jak je popsáno v předběžné zkoušce.

Beta-antitoxin. Zkoušená směs, která obsahuje 1 m.j. v 0,5 ml, je ta směs, která usmrtí shodný nebo téměř shodný počet myší jako referenční směs, která obsahuje 1 m.j. v 0,5 ml.

Epsilon-antitoxin. Zkoušená směs, která obsahuje 0,1 m.j. v 0,5 ml, je ta směs, která usmrtí shodný nebo téměř shodný počet myší jako referenční směs, která obsahuje 0,1 m.j. v 0,5 ml. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a vypočítá se průměr všech platných výsledků. Zkouška je platná pouze tehdy, když výsledek referenčního přípravku je v rozmezí ±20 % od očekávané hodnoty.

Intervaly spolehlivosti (P = 0,95) jsou stanoveny takto:

• 85 % až 114 %, použila-li se dvě zvířata na dávku,

• 91,5 % až 109 %, použila-li se čtyři zvířata na dávku,

• 93 % až 108 %, použilo-li se šest zvířat na dávku.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

• typ nebo typy Clostridium perfringens, ze kterých je vakcína připravena,

• je-li přípravek toxoid nebo vakcína připravená z celé inaktivované kultury, nebo je-li to směs obou,

• že se před použitím přípravek roztřepe,

• vytvořený imunizující účinek pro každý cílový druh (např. tvorba protilátek, ochrana před příznaky nemoci nebo infekcí).

Vaccinum clostridii septici ad usum veterinarium [image omitted]

Vakcína proti Clostridium septicum pro veterinární použití

Připravuje se z tekuté kultury vhodného kmene Clostridium septicum.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Celá kultura nebo její filtrát, nebo směs obou se inaktivuje tak, aby se odstranila toxicita, ale imunogenita zůstala zachována. K toxoidu a/nebo inaktivovaným kulturám se může přidat vhodné adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7). Imunogenita vakcíny pro každé cílové zvíře se prokáže, když aplikována podle doporučeného vakcinačního schématu stimuluje imunitní odpověď (např. tvorbu protilátek) shodnou s požadavky na přípravek.

Zkoušení šarže

Reziduální toxicita. Zkoušku na reziduální toxicitu může výrobce vynechat, pokud se zkouška detoxikace provádí bezprostředně po detoxikačním procesu. Je-li riziko návratu toxicity, provede se druhá zkouška v nejzazším možném stupni výrobního procesu (viz článek Vaccina ad usum veterinarium).

Zkouška účinnosti šarže. Zkoušku popsanou v odstavci Stanovení účinnosti není nezbytně nutné provádět při rutinním zkoušení šarží vakcíny. Provede se jednou nebo vícekrát podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Kde se neprovede tato zkouška, použije se vhodná validovaná zkouška. Kritéria pro přijetí se stanoví ve vztahu k šarži, která měla vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti a která je vyhovující z hlediska imunogenity pro cílové druhy zvířat. Může se používat následující zkouška, prokáže-li se její dostatečná shoda se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Vakcinují se králíci, jak je popsáno v odstavci Stanovení účinnosti a připraví se séra. V jednotlivých sérech se stanoví titr protilátek proti alfa-toxinu Cl. septicum vhodnou metodou, např. imunochemicky (2.7.1) nebo neutralizací v buněčných kulturách. Použije se homologní referenční sérum kalibrované v mezinárodních jednotkách Cl. septicum alfa antitoxinu. Vakcína vyhovuje zkoušce účinnosti, není-li zjištěný titr protilátek nižší než jejich titr v šarži vakcíny, která dala vyhovující výsledek ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti a která byla prokazatelně uspokojivá z hlediska imunogenity pro cílové druhy zvířat.

Zkouška totožnosti

Vakcína po injekčním podání zvířatům, které nemají antitoxin proti Cl. Septicum podporuje tvorbu tohoto antitoxinu.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se dvě zdravá vnímavá zvířata jednoho z druhů, pro které je přípravek určen. Každému zvířeti se doporučeným způsobem vstříkne dvojnásobek nejvyšší dávky uvedené v označení na obalu. Zvířata se pozorují 14 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Zbytková toxicita. Pěti myším hmotnosti 17 g až 22 g se podkožně vstříkne po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Nejméně deseti zdravým králíkům starým tři až šest měsíců se podkožně vstříkne množství přípravku, které nepřesahuje nejnižší první dávku uvedenou v označení. Za 21 až 28 dní se tato zvířata přeočkují množstvím, které nepřesahuje nejnižší druhou dávku uvedenou v označení. Za 10 až 14 dní po přeočkování se králíkům odebere krev a vytvoří se směsný vzorek sér.

Účinnost směsného vzorku sér je nejméně 2,5 m.j. v mililitru.

Mezinárodní jednotka je specifická účinnost neutralizující toxin Cl. septici obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který obsahuje určité množství sušeného imunního koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Účinnost směsného vzorku sér králíků se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší nebo jiných vhodných zvířat před toxickým účinkem dávky toxinu Cl. septicum s dávkou referenčního přípravku antitoxinu Cl. septicum kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, nezbytnou k vytvoření stejné ochrany. K tomuto porovnání je zapotřebí vhodný přípravek toxinu Cl. septicum, který se použije jako zkušební toxin. Dávka zkušebního toxinu se stanoví proti referenčnímu přípravku, účinnost zkoušeného séra se stanoví porovnáním s referenčním přípravkem za použití zkušebního toxinu.

Příprava zkušebního toxinu. Zkušební toxin se připraví ze sterilního filtrátu jednodenní až třídenní kultury Cl. septicum v tekuté živné půdě a vysuší se vhodnou metodou. Zkušební toxin se vybírá podle stanovení dávky L+/5 a LD50 pro myši. Doba pozorování je 72 h.

Vhodný toxin obsahuje nejméně jednu dávku L+/5 a 1,0 mg a nejméně 10 LD50 v každé dávce L+/5.

Stanovení zkušební dávky toxinu. Ve vhodné tekutině se připraví roztok referenčního přípravku tak, aby v 1 ml obsahoval 1,0 m.j. Roztok zkušebního toxinu ve vhodné tekutině se připraví tak, aby v 1 ml obsahoval přesně známé množství, např. 4 mg. Připraví se směsi roztoků referenčního přípravku a zkušebního toxinu tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku referenčního přípravku (2 m.j.) a jeden z řady stoupajících objemů roztoku zkušebního toxinu. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 5,0 ml a uchovávají se 60 min při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši hmotnosti 17 g až 22 g a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Uhynou-li všechny myši, je množství toxinu, obsažené v 0,5 ml směsi vyšší než zkušební dávka. Neuhyne-li žádná myš, je množství toxinu obsažené v 0,5 ml směsi nižší než zkušební dávka. Potom se připraví čerstvé směsi tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku referenčního přípravku (2 m.j.) a jeden z řady stoupajících objemů roztoku zkušebního toxinu (v řadě se sousedící objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod). Směsi se nechají 60 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Zkouška se nejméně jedenkrát opakuje a výsledky u jednotlivých směsí se sečtou. Tak se získá řada výsledných součtů, z nichž každý představuje úmrtnost způsobenou směsí stejného složení.

Zkušební dávka toxinu je množství obsažené v 0,5 ml té směsi, která způsobí úhyn poloviny celkového počtu myší, jimž se podala.

Stanovení účinnosti králičích sér

Předběžná zkouška. Ve vhodné tekutině se rozpustí takové množství zkušebního toxinu, aby 2,0 ml obsahovaly desetinásobek zkušební dávky (roztok zkušebního toxinu). Připraví se řada směsí roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 5,0 ml a nechají se 60 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně 2 myši a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Neuhyne-li žádná myš, obsahuje 0,5 ml směsi více než 0,2 m.j. Uhynou-li všechny myši, obsahuje 0,5 ml směsi méně než 0,2 m.j.

Konečná zkouška. Připraví se řada směsí roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra (v řadě se sousedící objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod stanovený v předběžné zkoušce). Aby se potvrdila zkušební dávka toxinu, připraví se další směsi tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů roztoku referenčního přípravku. Všechny směsi se nechají 60 min stát při pokojové teplotě a pro každou se použijí nejméně dvě myši, přičemž se dále postupuje tak, jak je popsáno v předběžné zkoušce. Zkoušená směs, která obsahuje 0,2 m.j. v 0,5 ml, je ta směs, která usmrtí shodný nebo téměř shodný počet myší jako referenční směs, která obsahuje 0,2 m.j. v 0,5 ml. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a vypočítá se průměr všech platných výsledků. Zkouška jsou platná pouze tehdy, když výsledek referenčního přípravku je v rozmezí ±20 % od očekávané hodnoty.

Intervaly spolehlivosti (P = 0,95) jsou stanoveny takto:

• 85 % až 114 %, použila-li se dvě zvířata na dávku,

• 91,5 % až 109 %, použila-li se čtyři zvířata na dávku,

• 93 % až 108 %, použilo-li se šest zvířat na dávku.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

• je-li přípravek toxoid, nebo vakcína připravená z celé inaktivované kultury, nebo je-li to směs obou,

• že se před použitím přípravek roztřepe,

• vytvořený imunizující účinek pro každý cílový druh (např. tvorba protilátek, ochrana před příznaky nemoci nebo infekcí).

“

• 1. V příloze části 6 Speciání část, kapitola 6.2 Léčivé přípravky, kapitola 6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky, článek Vaccinum erysipelatis suillae inactivatum zní:

„

Vaccinum erysipelatis suillae inactivatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti července prasat

Je to suspenze jednoho nebo více vhodných kmenů Erysipelothrix rhusiopathiae (E. insidiosa) inaktivovaných vhodnou metodou. Tento článek se vztahuje na vakcíny určené k aktivní imunizaci prasat.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Vakcína může obsahovat adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7).

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Zkouška účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity vakcíny, pokud se týká k sérotypu 1 a sérotypu 2 E. rhusiopathiae. Jsou-li učiněny požadavky na jiný sérotyp, pak je nutná další zkouška k průkazu imunogenity proti tomuto sérotypu.

Zkoušení šarže

Zkouška účinnosti šarže. Zkouška popsaná v odstavci Zkouška účinnosti se při běžném zkoušení šarží vakcíny neprovádí. Provede se u dané vakcíny jednou nebo vícekrát podle rozhodnutí nebo se souhlasem oprávněné autority. Kde se tato zkouška neprovádí, provádí se vhodná validovaná alternativní zkouška, jejíž kritéria pro přijetí se stanovila ve vztahu k šarži vakcíny, která měla vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Zkouška účinnosti. Následující zkouška se může použít, pokud byl prokázán uspokojivý vztah se zkouškou popsanou v odstavci Zkouška účinnosti.

Použijí se myši o hmotnosti 17 g až 20 g stejného původu a bez protilátek proti E. rhusiopathiae. Zkoušená vakcína a referenční přípravek se přidělí jednotlivým odděleným skupinám po deseti myších a vstříkne se subkutánně každé myši vhodná dávka (obvykle v rozsahu 1/25 až 1/100 dávky pro prase) přípravku přiděleného určité skupině. Jako kontrola čelenžní suspenze se použije skupina deseti myší

K čelenži se použije dostatečné množství virulentní kultury E. rhusiopathiae v aktivní růstové fázi nebo z ní připravené ředění, postačující k usmrcení myší během dvou až pěti dnů. Za 21 dní po vakcinaci se každé myši ve všech třech skupinách intraperitoneálně vstříkne 0,3 ml čelenžní suspenze. Myši se sledují 8 dnů a zaznamenává se počet úhynů. Zvířata mající těžké příznaky onemocnění se mohou humánně utratit a považují se pak za uhynulá po čelenži.

Zkouška je neplatná, jestliže jedna nebo více kontrolních myší přežije více než 5 dnů po čelenži nebo jestliže počet myší, které byly vakcinovány referenčním přípravkem a přežily čelenž, není v přijatelném rozmezí definovaném pro tento referenční přípravek.

Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže počet myší, které byly vakcinovány zkoušenou šarží a přežily čelenž, je rovný nebo vyšší než odpovídající počet myší vakcinovaných šarží vakcíny, která měla vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Zkouška účinnosti.

Zkouška totožnosti

Injekční podání přípravku zvířatům, která nemají protilátky proti E. rhusiopathiae, vyvolá tvorbu těchto protilátek.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma prasatům nejnižšího stáří doporučeného k vakcinaci a bez protilátek proti E. rhusiopathiae se doporučeným způsobem vstříkne dvojnásobná vakcinační dávka. Zvířata se sledují 14 dnů. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Použije se nejméně patnáct prasat alespoň 12 týdnů starých o hmotnosti nejméně 20 kg a bez protilátek proti E. rhusiopathiae. Zvířata se rozdělí do dvou skupin. Skupina o počtu nejméně deseti prasat se vakcinuje podle doporučeného schématu. Druhá skupina o počtu nejméně pěti prasat se udržuje jako nevakcinovaná kontrola. Tři týdny po vakcinaci se zvířata vakcinované i kontrolní skupiny čelenžují intradermální injekcí virulentních kmenů sérotypu 1 a sérotypu 2 E. rhusiopathiae, odděleně po 0,1 ml každého sérotypu. Zvířata se sledují 7 dnů. Vakcína vyhovuje zkoušce, pokud alespoň 90 % vakcinovaných zvířat zůstane bez příznaků onemocnění. Zkouška je neplatná, pokud má méně než 90 % kontrolních zvířat typické příznaky onemocnění, tj. kožní změny tvaru kosočtverce v místě vpichu. Pokud má zvíře typické příznaky onemocnění, předejde se jeho zbytečnému utrpení buď humánním utracením, nebo poskytnutím vhodné léčby.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označení na obalu se uvedou sérotypy E. rhusiopathiae obsažené ve vakcíně.

“

• 1. V příloze části 6 Speciání část, kapitola 6.2 Léčivé přípravky, kapitola 6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky, článek Vaccinum febris typhoidis polysaccharidicum zní:

„

Vaccinum febris typhoidis polysaccharidicum [image omitted]

Polysacharidová vakcína proti tyfu

Je to přípravek z purifikováného Vi kapsulárního polysacharidu Salmonella typhi kmene Ty2 nebo jiného vhodného kmene, který má schopnost vytvářet Vi polysacharid.

Kapsulární Vi polysacharid sestává z částečně 3-O-acetylováných opakujících se jednotek 2-aceamido-2-deoxy-D-galaktopyranuronové kyseliny s α-(1→4) vazbami.

Výroba

Výroba Vi polysacharidu je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stejnorodé tyfové polysacharidové vakcíny přiměřené svojí imunogenitou a bezpečností pro člověka.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví ve zkoušce na neškodnost pro imunní séra a vakcíny pro humánní použití (2.6.9).

Bakteriální inokula

Kmen S. typhi použitý jako matečné inokulum je určen podle průvodních záznamů, které zahrnují informace o jeho původu a biochemické a sérologické charakteristiky. Kultury pracovního inokula vykazují tytéž charakteristiky jako kmen, který byl použit k přípravě matečného inokula.

Pouze kmen, který má následující charakteristiky, se může použít pro přípravu vakcíny: a) barvené nátěry z kultury jsou typické pro enterobakterie; b) kultury zužitkovávají glukosu bez tvorby plynu; c) kolonie na agaru jsou oxidasa-negativní; d) suspenze z kultur se specificky aglutinují s vhodným Vi antisérem nebo kolonie na agarové plotně obsahující vhodné Vi antisérum tvoří prstence.

Kultivace a sklizeň

Pracovní inokulum se kultivuje na pevné půdě, která může obsahovat substance krevních skupin, nebo v tekuté půdě; získané inokulum se přenese do tekuté živné půdy, která se použije k naočkování konečné živné půdy.

Použitá tekutá půda a konečná živná půda jsou semisyntetické, prosté látek, které se srážejí cetrimoniumbromidem a neobsahují krevní skupinové substance ani vysokomolekulární polysacharidy, pokud není prokázáno jejich odstranění purifikačním procesem.

Bakteriální čistota kultury se ověří mikroskopickým vyšetřením nátěru obarveného podle Grama a vyočkováním na vhodné živné půdy; několik polí se pozoruje při velkém zvětšení tak, aby se vyšetřilo nejméně 10 000 organismů. Kultura se pak na začátku stacionární fáze inaktivuje přidáním formaldehydu. Bakteriální buňky se odstraní odstředěním; polysacharid se z média precipituje přidáním hexadecyltrimethylamoniumbromidu (cetrimoniumbromid). Precipitát se sklidí a může se před purifikací uchovávat při -20 °C.

Purifikovaný Vi polysacharid

Po rozštěpení polysacharid/cetrimoniumbromidového komplexu se polysacharid purifikuje za použití vhodných postupů k odstranění zbylých nukleových kyselin, bílkovin a lipopolysacharidů. Polysacharidy se srážejí jako vápenatá sůl v přítomnosti ethanolu a suší se při 2 °C až 8 °C; získaný prášek tvoří Vi polysacharid. Ztráta sušením se stanoví termogravimetricky (2.2.34) a získaná hodnota se použije k přepočtu výsledků dále uvedených chemických zkoušek na vysušenou látku.

Pouze purifikovaný Vi polysacharid, který vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Bílkovina (2.5.16). Nejvýše 10 mg v 1 g polysacharidu, počítáno na vysušenou látku.

Nukleové kyseliny (2.5.17). Nejvýše 20 mg v 1 g polysacharidu, počítáno na vysušenou látku.

O-Acetyl skupiny (2.5.19). Nejméně 2 mmol v 1 g polysacharidu, počítáno na vysušenou látku.

Molekulová velikost. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30) s použitím agarosy síťované pro chromatografii R. Použije se kolona délky 0,9 m a vnitřního průměru 16 mm, jejíž rovnováha byla ustavena rozpouštědlem s iontovou silou 0,2 mol/kg a hodnotou pH 7,0 až 7,5. Na kolonu se nanese asi 5 mg polysacharidu v objemu 1 ml a eluuje se asi 20 ml/h. Odebírají se frakce asi po 2,5 ml. Stanoví se bod odpovídající K0 = 0,25 a udělají se dvě směsi sestávající z frakcí eluovaných před a po tomto bodě. Stanoví se O-acetyl skupiny v těchto dvou směsích (2.5.19). Ve směsi obsahující frakce eluované před bodem K0 = 0,25 je nalezeno nejméně 50 % polysacharidu.

Zkouška totožnosti. Provede se zkouška totožnosti za použití vhodné imunochemické metody (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14, Metoda D). Nejvýše 150 m.j. endotoxinu v mikrogramu polysacharidu.

Konečná várka vakcíny

Jedna nebo více šarží purifikovaného Vi polysacharidu se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, které může obsahovat protimikrobní konzervační látku tak, aby objem odpovídající jedné dávce obsahoval 25 mg polysacharidu a roztok byl izotonický s krví (od 250 mosmol/kg do 350 mosmol/kg).

Pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím zkouškám, se může použít pro výrobu šarže.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu, na každou půdu se použije 10 ml.

Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou fyzikálně-chemickou metodou. Obsah je v rozmezí 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů, které se potom uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům předepsaným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu může být uvolněna k použití. Pokud byly zkoušky na volný formaldehyd a protimikrobní konzervační látky provedeny v konečné várce vakcíny, mohou se u šarže vypustit.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá tekutina, prostá viditelných částic.

Zkouška totožnosti

Provede se zkouška totožnosti použitím vhodné imunochemické metody (2.7.1).

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). pH vakcíny je 6,5 až 7,5.

O-Acetyl skupiny. 0,085 μmol (±25 %) v dávce (25 μg polysacharidu).

Zkoušený roztok. Do každé ze tří zkumavek se převede po 3 ml vakcíny (dva reakční roztoky a jeden korekční roztok). Porovnávací roztoky. 0,150 g acetylcholiniumchloridu R se rozpustí v 10 ml vody R (základní roztok obsahující 15 g/l acetylcholiniumchloridu). Bezprostředně před použitím se 0,5 ml základního roztoku zředí vodou R na 50 ml (pracovní ředění obsahující 150 μg/ml acetylcholiniumchloridu). Do deseti zkumavek ve dvojicích (reakční a korekční roztok) se rozplní 0,1 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml pracovního ředění.

Kontrolní roztok se připraví ze 3 ml vody R.

Objem v každé zkumavce se doplní vodou R na 3 ml. Přidá se 0,5 ml směsi objemových dílů vody R a kyseliny chlorovodíkové zředěné RS (1 + 2) do každé korekční zkumavky a ke kontrolnímu roztoku. Do každé zkumavky se přidá 1,0 ml hydroxylamoniumchloridu alkalického RS. Reakce se nechá probíhat přesně 2 min a do každé z reakčních zkumavek se přidá 0,5 ml směsi objemových dílů vody R a kyseliny chlorovodíkové zředěné RS (1 + 2). Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku chloridu železitého R (200 g/l) v kyselině chlorovodíkové 0,2 mol/l RS, zkumavky se zazátkují a silně se protřepou k odstranění bublin.

Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 540 nm proti kontrolnímu roztoku. Pro každý reakční roztok se odečte absorbance příslušného korekčního roztoku. Sestrojí se kalibrační křivka z korigovaných absorbancí pěti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahů acetylcholiniumchloridu. Z křivky se odečte obsah acetylcholiniumchloridu ve zkoušených roztocích pro každý zkoušený objem. Vypočítá se průměr ze dvou hodnot.

1 mol acetylcholiniumchloridu (181,7 g) odpovídá 1 mol O-acetylu (43,05 g).

Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se obsah protimikrobních konzervačních látek vhodnou fyzikálně-chemickou metodou. Obsah není nižší než nejnižší prokazatelně účinné množství a není vyšší než 115 % množství uvedeného v označení na obalu. Pokud byl při přípravě použit fenol, nepřesahuje jeho množství 2,5 g/l (2.5.15).

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14, Metoda D). Nejvýše 3750 m.j. endotoxinu v jednotlivé lidské dávce.

Stanovení obsahu

Vi polysacharid se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) s použitím referenčního purifikovaného polysacharidu. Stanovené množství polysacharidu v dávce je 80 % až 120 % deklarovaného množství. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanoveného obsahu je v rozmezí 80 % až 120 %.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

• počet mikrogramů polysacharidu v lidské dávce (25 μg),

• celkové množství polysacharidu v obalu.

“

• 1. V příloze části 6 Speciání část, kapitola 6.2 Léčivé přípravky, kapitola 6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky, se za článek Vaccinum febris typhoidis vivum perorale doplňuje článek Vaccinum furunculosidis ad salmonideos inactivatum cum adiuvatione oleosa ad iniectionem, který zní:

„

Vaccinum furunculosidis ad salmonideos inactivatum cum adiuvatione oleosa ad iniectionem [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti furunkulóze lososovitých ryb (injekční) s olejovým adjuvans

Je to přípravek z kultur jednoho nebo více vhodných kmenů Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Kmeny A. salmonicida se kultivují a sklízejí odděleně. Získané sklizně se inaktivují vhodnou metodou. Mohou se purifikovat a koncentrovat. Mohou se použít neporušené nebo dezintegrované buňky a vakcína může obsahovat extracelulární produkty bakterií uvolněné do živné půdy. Vakcína obsahuje olejové adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Ve vakcíně jsou zařazeny kmeny prokazatelně vhodné z hlediska schopnosti tvorby imunologicky významných antigenů. Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7) pro ty druhy ryb, pro které je určena.

Při průkazu bezpečnosti a imunogenity vakcíny se mohou použít následující zkoušky:

Bezpečnost

A. V průběhu vývoje vakcíny se bezpečnost zkouší na třech různých šaržích vakcíny. Zkouška se provádí na každém druhu ryb, pro který je vakcína určena. Ryby použité ve zkoušce pocházejí z populace bez specifických protilátek proti A. salmonicida subsp. Salmonicida a nebyly vakcinovány proti furunkulóze, ani nebyly vystaveny této infekci. Zkouška probíhá v podmínkách doporučených pro použití vakcíny při teplotě vody nejméně 10 °C. Vakcína v objemu odpovídajícím dvojnásobku dávky doporučené na jednotku hmotnosti se intraperitoneálně vstříkne nejméně padesáti rybám o nejmenší hmotnosti doporučené pro vakcinaci. Ryby se pozorují 21 dní. Nezjistí se žádné abnormální místní nebo systémové reakce. Zkouška je neplatná, uhyne-li více než 6 % ryb z příčin, které nelze přisoudit vakcíně.

B. Bezpečnost se dokazuje také v terénních podmínkách aplikací doporučené dávky dostatečnému počtu ryb nejméně ve dvou provozech. Ve třech obdobích (po vakcinaci, v polovině chovného období a při konečném výlovu) se odebírají vzorky od třiceti ryb a vyšetří se na přítomnost místních změn v tělní dutině.

Jsou přípustné pouze mírné léze včetně lokalizovaných srůstů mezi vnitřnostmi nebo mezi vnitřnostmi a stěnou břišní a rovněž slabé zakalení nebo ojedinělé pigmentace na peritoneu. Naopak nepřijatelné jsou rozsáhlé léze, včetně srůstů větších částí břišních orgánů, masivní pigmentace nebo nápadné zesílení a zakalení větších ploch peritonea, jestliže se vyskytly u více než 10 % ryb z některého vzorku. Takové změny, včetně srůstů, mění vzhled orgánů nebo způsobí perforace peritonea s následným vyhřeznutím orgánů.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity vakcíny.

Zkoušení šarže

Zkouška účinnosti šarže. Pro rutinní zkoušení šarží vakcíny se může provést zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti za použití skupiny nejméně třiceti ryb. Alternativně se může použít vhodná validovaná metoda založená na protilátkové odpovědi, kritéria se stanoví s ohledem na šarži vakcíny, která prokázala vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Následující zkouška se může použít po průkazu uspokojivé korelace se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Použijí se ryby z populace, která nemá specifické protilátky proti A. salmonicida subsp. salmonicida a hmotnost ryb splňuje stanovené limity. Zkouška se provádí při stanovené teplotě.

Nejméně dvaceti pěti rybám se intraperitoneálně vstříkne vakcína podle návodu pro použití. Nejméně deseti rybám v kontrolní skupině se vstříkne placebo. Ve stanoveném období po vakcinaci se odeberou vzorky krve. V každém vzorku se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) stanoví titr specifických protilátek proti A. salmonicida subsp. salmonicida. Vakcína vyhovuje, není-li průměrný titr protilátek významně nižší než titr zjištěný u šarže vakcíny, která vyhověla ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Zkouška je neplatná, jsou-li v kontrolní skupině prokázány protilátky proti A. salmonicida subsp. salmonicida.

Zkouška totožnosti

Vakcína podporuje tvorbu specifických protilátek proti A. salmonicida po aplikaci rybám, které neměly tyto protilátky.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset ryb jednoho z druhů, pro které je vakcína určena. Použité ryby by měly mít nejmenší tělesnou hmotnost podle pokynů k vakcinaci. Nejsou-li ryby o této hmotnosti k dispozici, použijí se ryby o hmotnosti nejvýše dvojnásobné. Lze použít jen ryby z populace bez specifických protilátek proti A. salmonicida subsp. salmonicida, které nebyly vakcinovány proti furunkulóze ani nebyly vystaveny této infekci. Zkouška se provede v podmínkách doporučených pro použití vakcíny při teplotě vody nejméně 10 °C.

Vakcína se všem rybám vstříkne intraperitoneálně v objemu odpovídajícím dvojnásobku doporučené dávky na jednotku hmotnosti. Ryby se pozorují 21 dní. Nezjistí se žádné abnormální místní nebo systémové reakce. Zkouška je neplatná, uhyne-li více než 10 % ryb z příčin, které nelze přisoudit vakcíně.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Zkouška se provádí podle protokolu definujícího limity hmotnosti ryb, zdroje, průtok a teplotu vody a přípravu standardní čelenže.

Vakcinuje se nejméně sto ryb doporučenou metodou podle návodu k použití. Nejméně stu ryb v kontrolní skupině se vstříkne placebo. Vakcinované i kontrolní ryby se pro identifikaci označí. Všechny ryby se drží v jedné nádrži, případně se do více nádrží nasadí stejný počet vakcinovaných a kontrolních ryb. Ve stanoveném časovém intervalu po vakcinaci definovaném podle údajů s ohledem na vývoj imunity se ryby injekčně čelenžují. Pro čelenž se použije kultura A. salmonicida subsp. salmonicida, jejíž virulence byla ověřena. Ryby se pozorují denně, dokud není dosaženo nejméně 60 % specifických úhynů v kontrolní skupině. Pro obě skupiny - vakcinovanou i kontrolní - se sestrojí křivka specifické mortality v závislosti na době po čelenži. Interpolací se stanoví doba odpovídající 60% specifické mortalitě kontrol.

Zkouška je neplatná, je-li v kontrolní skupině do 21 dnů po prvním úhynu ryb zjištěna specifická mortalita nižší než 60 %. Z křivky pro vakcinované ryby se zjistí mortalita (M) v době odpovídající 60% mortalitě kontrol.

Vypočte se relativní procento přežití (RPP) ze vzorce:

1-M60.100.

Vakcína vyhovuje, jestliže hodnota RPP je nejméně 80 %.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede informace o době potřebné k vývoji imunity po vakcinaci při dodržení podmínek odpovídajících doporučenému použití.

“

• 1. V příloze části 6 Speciání část, kapitola 6.2 Léčivé přípravky, kapitola 6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky, článek Vaccinum haemophili stirpe b conjugatum zní:

„

Vaccinum haemophili stirpe b conjugatum^1) [image omitted]

Konjugovaná vakcína proti hemofilu typu b

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující polysacharid získaný z vhodného kmene Haemophilus influenzae typ b, kovalentně vázaný na bílkovinný nosič. Polysacharid polyribosylribitolfosfat, označovaný jako PRP, je lineární kopolymer složený z opakujících se jednotek 3-ß-D-ribofuranosyl-(l→l)-ribitol-5-fosfátu [(C10H19O12P)n] s definovanou molekulovou hmotností. Bílkovinný nosič, je-li konjugován s PRP, je schopen navodit na T-buňkách závislou B-buněčnou imunitní odpověď na tento polysacharid.

Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanuni.

Výroba

Všeobecná ustanovení

Výrobní proces má prokazatelně poskytovat stále stejné vakcíny, které jsou u lidí dostatečně imunogenní a neškodné. Výroba PRP a nosiče je založena na systému jednotné inokulace.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Během vývojových studií a kdykoli je nezbytná revalidace výrobního procesu, prokazuje se zkouškami na zvířatech, že vakcína pravidelně indukuje na T-buňkách závislou B-buněčnou imunitní odpověď.

Stabilita šarže a odpovídajících meziproduktů se hodnotí jednou nebo více vybranými zkouškami. Tyto zkoušky mohou zahrnovat stanovení velikosti molekul, stanovení volného PRP v konjugátu a stanovení imunogenity u myší. Na základě výsledků stabilitních zkoušek se vytyčí pro tyto zkoušky požadavky na propuštění, aby se zajistilo, že vakcína bude na konci doby platnosti ještě uspokojivá.

Bakteriální inokula

Barvením podle Grama a inokulací na vhodné půdy se prokáže, že matečné inokulum H. influenzae typu b neobsahuje kontaminující látky. Několik zorných polí se při velkém zvětšení vyšetří tak, aby bylo prohlédnuto nejméně 10 000 mikroorganismů.

V tekutinách použitých pro udržení životnosti kmene se nepoužijí složité produkty živočišného původu, a to ani pro lyofilizaci nebo pro zmražování.

Doporučuje se PRP připravený jednotnou inokulací charakterizovat použitím nukleární magnetické rezonanční spektrometrie (2.2.33).

Polysacharid H. influenzae typu b (PRP)

H. influenzae typu b se pomnoží v tekuté půdě, která neobsahuje vysokomolekulární polysacharidy; jestliže některá složka půdy obsahuje krevní substance, postup se validuje, aby se dokázalo, že po purifikačních krocích nejsou tyto substance dále detegovatelné. Bakteriální čistota kultury se prokazuje vhodnými metodami. Kultura může být inaktivovaná. PRP je separován z tekuté kultury a purifikován vhodnou metodou. Těkavé látky, včetně vody, se v purifikovaném polysacharidu stanoví vhodnou metodou, jako je termogravimetrie (2.2.34); výsledek se použije k přepočtu výsledků jiných zkoušek na vysušenou látku, jak je popsáno dále.

Pouze PRP, který vyhoví následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konjugátu.

Totožnost. PRP se dokáže imunochemickou metodou (2.7.1) nebo jinou vhodnou metodou, např.^1H nukleární magnetickou rezonanční spektrometrií (2.2.33).

Distribuce molekulové velikosti. Procento PRP vymývané před danou hodnotou K0 nebo v rozsahu hodnot K0 se stanoví vylučovací chromatografií (2.2.30). Přijatelná hodnota je stanovena pro jednotlivé přípravky a každá šarže PRP prokazatelně vyhovuje této hodnotě. Pro informaci jsou v tabulce 1 uvedeny limity pro schvalované výrobky za použití uvedených stacionárních fází. Kde je to vhodné, stanoví se také distribuce velikosti molekul po chemické modifikaci polysacharidu.

Pro stanovení distribuce molekulové velikosti se může použít také kapalinová chromatografie (2.2.29) s detektorem na bázi víceúhlového rozptylu světla.

Validované stanovení stupně polymerizace nebo váženého průměru hmotnosti molekul a disperze molekulových hmotností se mohou použít místo stanovení distribuce molekulové velikosti.

Ribosa (2.5.31). Nejméně 32 %; počítáno na vysušenou látku.