Orden de 31 de enero de 1977 por la que se establecen los Métodos Oficiales de Análisis de Aceites y Grasas, Cereales y Derivados, Productos Lácteos y Productos Derivados de la Uva

41. DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA

41.1 Principio.

El método está basado en la separación y determinación cromatográfica de los ésteres metílicos de los ácidos grasos.

Es aplicable a las grasas vegetales y animales con ácidos grasos de 12 a 24 átomos de carbono No es aplicable para la determinación de ácidos grasos oxidados y epoxiácidos.

41.2 Material y aparatos.

41.2.1 Matraz redondo, fondo plano, de 100 ml, boca esmerilada.

41.2.2 Refrigerante de reflujo, adaptable al matraz anterior.

41.2.3 Ampollas de decantación de 500 ml.

41.2.4 Matraz redondo, fondo plano, de 200 ml.

41.2.5 Cromatógrafo apto para separar los esteres metílicos, provisto de horno con regulación de temperatura hasta 250-300 °C, e inyector susceptible de ser calentado hasta 50 °C por encima de la temperatura del horno. Detector suficientemente sensible y aparato registrador continuo.

41.2.6 Botella con nitrógeno a presión; riqueza mínima 99,8 por 100.

41.2.7 Columna de acero inoxidable, aluminio, cobre o vidrio de 3-6 mm de diámetro interior, de 2 m de longitud, rellena con Chromosorb P o W (60-80 mallas) o Celite 545 (80-100 mallas), impregnada con 5 por 100 de succinato de polietilenglicol.

41.2.8 Jeringa, de 5 a 10 μl de capacidad.

41.3 Reactivos.

41.3.1 Metanol absoluto, reactivo para análisis.

41.3.2 Sodio metálico, reactivo para análisis.

41.3.3 Disolución de metilato sódico. Disolver 5 g de sodio metal en 1.000 ml de metanol absoluto (aprox. 0,2 N).

41.3.4 Éter de petróleo (p. e., 40°-60 °C) o hexano, para cromatografía.

41.3.5 Disolución de ácido clorhídrico anhidro en metanol absoluto al 3-4 por 100.

41.3.6 Cloruro sódico, reactivo para análisis.

41.3.7 Sulfato sódico, reactivo para análisis.

41.3.8 Disolución de fenolftaleína al 1 por 100 en metanol.

41.3.9 Disolución de rojo de metilo al 0,1 por 100 en etanol al 60 por 100

41.3.10 Nitrógeno gas puro (99,8 por 100).

41.4 Procedimiento.

41.4.1 Preparación de los ésteres metílicos.

41.4.1.1 Aceites y grasas de cualquier acidez e insaponificable no superior al 2 por 100.

Método rápido. Pasar la disolución obtenida en el matraz a otro de 100 ml con cuello estrecho y largo. Lavar el primero con 4-5 ml de hexano o heptano y pasarlos al segundo; calentar éste sin llegar a hervir, imprimiéndole movimiento de rotación durante 1 ó 2 minutos. Agregar disolución saturada de cloruro sódico en cantidad suficiente para situar la capa de hexano en el cuello del matraz; dicha capa presentará aspecto limpio y transparente. Tomar con una pipeta 2 ó 3 ml, pasarlos a un recipiente adecuado para su conservación o inyección directa en el cromatógrafo.

Método de referencia. Pasar la disolución contenida en el matraz a una ampolla de extracción de 500 ml, lavar aquél con unos 30 ml de éter de petróleo o hexano. Añadir a la ampolla 123 ml de agua destilada. Agitar fuertemente y dejar reposar. Extraer tres veces consecutivas la capa inferior con 30 ml de éter o hexano cada vez. Lavar repetidamente los tres extractos reunida: en una ampolla de extracción con 15 ml de agua des-rada cada vez, hasta eliminar completamente el ácido, empleando rojo de metilo como indicador. Secar la disolución con sulfato sódico anhidro Eliminar el disolvente en bario de agua bajo corriente de nitrógeno.

41.4.1.2 Aceites y grasas de acidez no superior al 0,3 por 100 en ácido oleico.

Omitir la metanolisis en medio ácido. Realizar la metanolisis alcalina según 41.4.1.1.a) y, estando aún caliente el matraz, agregar por la parte superior del refrigerante una gota de disolución de fenolftaleína y disolución de ácido clorhídrico en metanol en cantidad algo superior a la necesaria para neutralizar el metilado. Dejar enfriar. Pasar la disolución a la ampolla de extracción. Proceder a la extracción de los ésteres metílicos según 41.4.1.1.c).

41.4.1.3 Aceites y grasas de acidez superior al 80 por 100 en ácido oleico

Omitir la metanolisis alcalina. Realizar la metanolisis ácida, pesando en el matraz 2 g de muestra, previamente filtrada y seca. Agregar 60 ml de la disolución de ácido clorhídrico en metanol. Proseguir según 41.4.1.1.b) y 41.4.1.1.c).

41.4.1.4 Aceites y grasas con insaponificable superior al 2 por 100.

Eliminar la materia insaponificable según el método «Determinación de la materia insaponificable». La solución hidroalcohólica de jabones resultantes se concentra en evaporador rotario hasta unos 50 ml. Pasar éstos a una ampolla de extracción. Acidificar con ácido clorhídrico 2 N hasta reacción ácida al rojo de metilo. Extraer con éter de petróleo o hexano. Proseguir como en 41 4 1 3.

41.4.2 Preparación de la columna.

41.4.2.1 Soporte: En un vaso de 600 ml colocar 100 g de Chromosorb W o P, o Celita 545, preferentemente el primero, agregar ácido clorhídrico al 20 por 100 en cantidad suficiente hasta cubrir el producto. Dejar en reposo durante 15 horas. Decantar el ácido. Agregar agua destilada, agitando fuertemente, y dejar reposar 5 minutos. Decantar el agua y volver a cubrir con ácido clorhídrico al 20 por 100 y reposar durante 2 horas. Filtrar sobre embudo de vidrio y lavar con agua destilada hasta neutralidad. Extender seguidamente el soporte en capa delgada en cápsulas de porcelana o cubeta de vidrio. Desecar en estufa a 110 °C durante 2 horas.

41.4.2.2 Fase estacionaria: Succinato de polietilenglicol comercial.

41.4.2.3 Impregnación del soporte: Disolver, en cápsula de porcelana, 0,5 g de la fase estacionaria o fija de unos 50 ml de acetona o cloroformo. Añadir 9,5 g de soporte tratado. Regular el disolvente para obtener una papilla de fluidez adecuada para una buena homogeneización por agitación. Eliminar el disolvente sobre baño de agua, removiendo con espátula, hasta obtener el producto en forma de polvo suelto. Extenderlo en capa delgada e introducirlo en estufa a 100 °C durante 2 horas.

41.4.2.4 Llenado de la columna: Introducir el soporte impregnado con fase fija en la columna, haciéndola vibrar por percusión o con un vibrador magnético, hasta su llenado total. Es preciso que el material rellene la columna homogéneamente, evitando la formación de vías o canales, para que no pierda eficacia. Obturar los extremos con tapón de lana de vidrio y/o cilindros de malla metálica de cobre.

41.4.3 Condiciones operatorias.

Acoplar al cromatógrafo la columna preparada, o la suministrada por la firma comercial del aparato.

Regular la temperatura del horno entre 160-170 °C, la cámara de inyección 50 °C más alta que la del horno y el detector 25 °C sobre la de la columna.

Ajustar el flujo de gas portador, en principio del orden de 4 l/hora, y mantenerlo constante. Acondicionar la nueva columna para la temperatura de operación, fluyendo gas portador durante 24 horas o hasta estabilidad. Registrar la línea base para comprobar la estabilidad del aparato.

Operar con patrones, rectificando las condiciones operatorias a la vista de los resultados obtenidos, regulando el flujo de gas portador de forma que el linolenato de metilo sea eluido en 30 minutos, como máximo. Medirlo periódicamente con el medidor de flujo de burbuja de jabón y otro medio.

Preparar una disolución de los ésteres metílicos en acetona o hexano de pureza comprobada. Inyectar de 0,4 a 0,6 μl, con jeringa, descargando y retirando la aguja rápidamente.

El registro obtenido será admisible si cumple las siguientes condiciones: a) El área total de los picos registrados, referida a la sensibilidad máxima utilizada, no será inferior a 5.000 mm². De esta forma, los componentes presentes en la cuantía de 0,2 por 100 deberán dar picos de 10 mm², como mínimo. b) Todos los picos han de caer dentro del papel registrador.

Señalar en el cromatograma el punto de referencia de introducción de la muestra, los picos iniciales de salida del aire y la atenuación de registro de cada pico.

41.4.4 Comprobación de las condiciones de trabajo del instrumento y de la columna.

Se realiza cromatografiando una muestra de patrones conteniendo aproximadamente cantidades iguales de estearato y oleato de metilo, inyectando una cantidad de muestra tal que los picos registrados sean del 25 al 50 por 100 del ancho del papel de registro, y determinando la resolución de los dos ácidos según:

D = distancia entre los dos máximos de los picos del oleato estearato.

O = ancho de la base del oleato.

E = ancho de la base del estearato.

Si la resolución es igual o mayor de 1,0, el instrumento y columna están en condiciones de trabajo satisfactorias.

Todas las columnas experimentan con el uso una pérdida gradual de resolución; cuando ésta es menor de 1,0, la columna será reemplazada.

41.5 Cálculo.

41.5.1 Identificación de los picos. Los ésteres aparecen en orden creciente del número de átomos de carbono y de aumento de insaturación para un mismo número de átomos de carbono. El palmítico (C₁₆) aparece delante de los C₁₈, y éstos en el orden oleato (C₁₈ : 1), linoleato (C₁₈ : 2) y linoleato (C₁₈ : 3); el aráquico (C₂₀ : 0) aparece normalmente después del (C₁₈ : 3), pero pueden estar invertidos en algunos casos. Se establecerá la identidad para una columna dada inyectando muestras patrones.

Fijar los tiempos de retención, medidos en el cromatograma (distancia entre el máximo de cada pico y la posición del pico inicial de salida del aire, o del pico de salida del disolvente en el caso de detectores de llama de hidrógeno). Compararlos con los obtenidos con las mezclas patrones.

41.5.2 Determinación cuantitativa. Se considera que la superficie del triángulo formado por cada pico y la línea base es proporcional a la cantidad de componente identificado con dicho pico.

Determinar el área trazando líneas tangentes a los lados de cada pico prolongadas hasta cortar la línea base. Multiplicar la altura del triángulo (corregida para la atenuación empleada) por la mitad de la base.

Si se ha registrado con atenuación única, medir el área multiplicando la altura de] pico por su ancho a la mitad de la altura.

Sumar las áreas de todos los picos y calcular el tanto por ciento correspondiente a cada pico:

P_i = tanto por ciento de cada componente en la mezcla.

A1 = área de cada pico.

Normalmente se empleará este criterio y expresión.

41.5.2.1 Factores de corrección. En algunos casos, por no ser lineal la respuesta del instrumento y por las diferencias en los pesos moleculares, se determinan los factores de corrección de cada ácido, referidos al ácido palmítico, analizando mezclas conocidas de composición similar a la mezcla problema.

f_x = factor de corrección del ácido.

x = tanto por ciento del ácido en la mezcla.

A_x = área del pico x.

P = tanto por ciento del ácido palmítico en la mezcla patrón.

A_p = área del pico del ácido palmítico.

41.6 Referencias.

42. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN MATERIA GRASA DE LOS ALPECHINES

42.1 Principio.

Se considera materia grasa del alpechín el producto obtenido por extracción con éter de petróleo en condiciones determinadas.

El procedimiento es aplicable a toda clase de alpechines, ya sean centrifugados o no.

42.2 Material y aparatos.

42.2.1 Ampollas de extracción de un litro y litro y medio de capacidad.

42.2.2 Vaso de precipitado de un litro y medio de capacidad.

42.2.3 Matraz redondo, de fondo plano, de 250 ml de capacidad.

42.2.4 Embudo de pico corto de 80 mm de diámetro.

42.3 Reactivos.

42.3.1 Éter de petróleo, para análisis (ver 42.6.1).

42.3.2 Sulfato sódico anhidro puro. 50 gr de este producto, introducido en un cartucho y extraído en un Sohxlet con éter de petróleo durante cinco horas, no debe dejar en el matraz, una vez desecado en estufa a 105°C durante dos horas, un residuo superior a un centigramo.

42.4 Procedimiento.

Pesar, en el vaso de precipitado de la muestra bien homogeneizada por agitación, un kilogramo de alpechín (42.6.2.).

Trasvasar a la ampolla de extracción de un litro y medio, lavando con pequeñas cantidades de agua destilada, con objeto de arrastrar los restos de alpechín que puedan quedar en el vaso. Medir 150 ml de éter de petróleo y verterlos en el vaso de precipitado, cuidando de que lave bien las paredes y fondo del vaso. Pasar a la ampolla de extracción y agitar fuertemente, tomando las precauciones necesarias. Dejar reposar el tiempo suficiente para que se separen perfectamente la capa de éter de petróleo del alpechín (42.3.3).

Pasar la capa de alpechín al vaso de precipitado. Trasvasar la solución de éter de petróleo por la parte superior de la ampolla de extracción a una segunda ampolla de un litro de capacidad, en la que se han introducido previamente unos 200 ml de agua destilada, cuidando de no arrastrar restos de alpechín.

Repetir la extracción del alpechín dos veces más, como mínimo (ver 42.6.4). Las tres fracciones de éter de petróleo reunidas en la segunda ampolla se lavan con agua destilada por agitación.

Repetir los lavados, si es necesario, hasta que el agua destilada decantada no presente coloración.

Una vez separada el agua del último lavado, se añade una pequeña cantidad de sulfato sódico anhidro a la solución de éter de petróleo, agitando y dejando reposar media hora, como mínimo. Se filtra sobre el matraz de 250 ml, previamente mantenido dos horas en estufa a 105 °C, enfriado en desecador y tarado, hasta ocupar la mitad del matraz; se destila el éter volviendo a filtrar otra porción de éter de petróleo, que se destila seguidamente, repitiendo sucesivamente estas operaciones hasta agotar la totalidad existente en la ampolla, que se enjuaga con 20ó 25 ml de éter de petróleo, que se adicionan también al matraz.

Una vez terminada la destilación, se introduce el matraz en una estufa regulada a 105 °C, en la que se mantiene durante dos horas. Dejar enfriar en un desecador y pesar con precisión de miligramo.

42.5 Cálculos.

El tanto por ciento de grasa se obtendrá mediante la fórmula:

en la que:

P₂ = peso en gramos del matraz con el aceite.

P₁ = peso en gramos del matraz vacío y desecado.

P₀ = peso en gramos de la muestra de alpechín.

42.6.1 Se puede sustituir el éter de petróleo, sin variación sensible en los resultados, por el hexano técnico.

42.6.2 En algunas muestras de alpechín, especialmente los de elevado contenido graso, resulta prácticamente imposible conseguir una homogeneización adecuada por simple agitación en el recipiente, En estos casos es aconsejable agregar una cantidad aproximada de 0,1 g de «Tween 80» por litro de muestra, provocándose una emulsión que facilita la homogeneización y toma de una muestra representativa, sin afectar prácticamente los resultados cuantitativos.

42.6.3 Las emulsiones persistentes que puedan originarse ocasionalmente pueden hacerse desaparecer añadiendo pequeñas cantidades de alcohol etílico.

42.6.4 En alpechines ricos en materia grasa, es aconsejable realizar mayor número de extracciones.

42.7 Referencia.

Se deroga el método 24.(a) por la disposición derogatoria de la Orden de 9 de octubre de 1985. Ref. BOE-A-1985-23450

ANEXO II. Métodos de análisis de cereales y derivados

1. DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE MATERIAS CELULÓSICAS

1.1 Principio.

Las «materias celulósicas» representan las sustancias no digestibles de origen vegetal que constituyen el residuo que queda después de un ataque ácido en condiciones bien definidas, con una mezcla de ácido acético, ácido nítrico y ácido tricloroacético. Después de hervir la muestra con la mezcla de ácidos se separa el residuo insoluble, se seca y se incinera.

El índice de materias celulósicas se calcula mediante la pérdida de masa en el curso de la incineración.

La aproximación debe ser del 0,1 por 100.

1.2 Material y aparatos.

1.2.1 Molino de laboratorio (se puede emplear cualquier tipo, excepto de bolas).

1.2.2 Matraces cónicos erlenmeyer de 200 ó 300 ml de boca normalizada.

1.2.3 Refrigerador de reflujo, de boca normalizada.

1.2.4 Mechero Bunsen.

1.2.5 Tela metálica con amianto o placa de material refractario.

1.2.6 Soporte de trípode o aparato análogo.

1.2.7 Matraz de vacío con tulipa (Kitasato).

1.2.8 Agitadores de vidrio. Un agitador de vidrio revestido de caucho en la extremidad.

1.2.9 Crisol filtrante de cuarzo o de vidrio (porosidad de 40 a 90 mm).

1.2.10 Placas filtrantes de porcelana que cubran totalmente la superficie filtrante.

1.2.11 Trompa de agua.

1.2.12 Desecador conteniendo silicagel coloreado en azul (diámetro aproximado 25 cm).

1.2.13 Balanza de precisión (sensibilidad 0,1 mg).

1.2.14 Estufa.

1.2.15 Horno eléctrico para incineración.

1.2.16 Placa de material refractario.

1.2.17 Cartuchos deshidratantes de silicagel coloreado de azul.

1.3 Reactivos.

1.3.1 Acido acético al 70 por 100 d. a 20 °C = 1,07 (730 g de ácido acético glacial del 96 por 100 diluido hasta 1.000 g con agua destilada).

1.3.2 Acido nítrico concentrado, d. a 20 °C = 1,4.

1.3.3 Acido tricloroacético, p.p.a. cristalizado.

1.3.4 Acetona pura.

1.3.5 Éter etílico puro.

1.3.6 Arena de mar, diámetro inferior a 0,5 mm.

1.3.7 Fragmentos de tierra cocida (platos porosos machacados), diámetro de 0,5 a 2 mm.

1.4 Procedimiento.

1.4.1 Preparación de la solución ácida para la hidrólisis: Mezclar 900 ml de ácido acético con 60 ml de ácido nítrico y 24 g de ácido tricloroacético (d. 20 °C = 1,10).

1.4.2 Preparación de la arena de mar y de los crisoles.

Hacer hervir la arena de mar con ácido clorhídrico (4N) para eliminar el hierro, lavar con agua destilada para eliminar el cloruro y calcinar a 550 °C durante seis horas. Preparar las placas de porcelana y el polvo de tierra cocida de la misma forma.

Antes de la primera utilización de los crisoles filtrantes de cuarzo o vidrio, limpiarlos cuidadosamente e incinerarlos durante seis horas a 550 °C. Para evitar tensiones en la parte inferior deslustrada, colocar los crisoles filtrantes de vidrio en el horno de incineración frío y no retirarlos hasta después de enfriarlo alrededor de 200 °C. Los crisoles de cuarzo no experimentan tensiones y se pueden poner o sacar con toda seguridad en el horno caliente.

Introducir en los crisoles filtrantes de 5 a 6 g de arena de mar. Igualar la superficie. Introducir a continuación de 4 a 5 g de polvo de tierra cocida e igualar del mismo modo la superficie. Colocar a continuación la placa filtrante de porcelana encima de estas dos capas y apretar ligeramente. Se puede utilizar de nuevo el crisol así preparado, sin limpieza especial, pero es necesario verificar la permanencia de las capas.

1.4.3 Preparación de las muestras a ensayar.

Triturar la muestra de forma que el 95 por 100 del producto pase a través de un tamiz de 1,0 mm. Solamente para algunas sustancias fibrosas, tales como los granos de avena, no se alcanza tal grado de finura.

Está prohibido el empleo de molinos de bolas.

1.4.4 Cantidad inicial de la muestra a ensayar.

La cantidad de muestra a tomar depende del contenido en materias celulósicas del producto de forma que se obtenga finalmente una masa de materias celulósicas entre 50 y 150 mg. Para un producto que contenga materias celulósicas en cantidad inferior al 5 por 100, tomar 3 g de sustancia y utilizar 60 ml de solución ácida; para un contenido en materias celulósicas elevado, hacer hervir 102 g de materia en 40 ml de mezcla disolvente.

1.4.5 Dosificación.

Pesar la muestra a ensayar triturada y ponerla en suspensión en el matraz cónico erlenmeyer con un tercio de la solución ácida que debe corresponder a 20 veces el peso de la muestra. Deshacer los grumos con un agitador de vidrio que debe permanecer en el erlenmeyer. Lavar cuidadosamente la pared del erlenmeyer con el resto de la solución ácida para que no quede ninguna partícula de la sustancia adherida a la pared. Para evitar que la sustancia suba a lo largo de las paredes, acoplar cuidadosamente el erlenmeyer con el refrigerador de reflujo. Calentar de forma que se alcance la temperatura de ebullición en tres minutos. Regular la llama del mechero Bunsen para que la altura de la espuma formada no sobrepase 10 mm. Mantener la ebullición de la muestra durante 30 minutos exactamente, sin agitar el frasco ni la suspensión.

Filtrar a continuación bajo vacío la suspensión en ebullición con ayuda de una trompa de agua y a través del crisol filtrante preparado. Regular el vacío para asegurar la filtración continua. Lavar el erlenmeyer y el agitador de vidrio con agua destilada y caliente (de 70 a 80 °C) y trasvasar totalmente los residuos de materias celulósicas en el crisol filtrante con ayuda de un agitador revestido de caucho. Son necesarios, para un lavado cuidadoso y rápido, de 300 a 400 ml de agua destilada y caliente para obtener la reacción neutra (comprobar con papel tornasol en el agua de lavado filtrada).

Inmediatamente después del lavado, vaciar el matraz de vacío. Llenar el crisol filtrante tres veces con acetona y dejar filtrar sin ayuda del vacío (pero si el filtrado es demasiado lento, aspirar ligeramente sin sobrepasar la velocidad de una gota por segundo). Lavar a continuación dos veces con éter etílico y aspirar fuertemente los vapores residuales de éter. Secar previamente los crisoles filtrantes durante algunos minutos y pesarlos aproximadamente.

Secar los crisoles filtrantes en una estufa calentada a 130 °C durante 60 minutos exactos, introducir a continuación cuatro crisoles como máximo en un desecador y dejarlos enfriar algunos minutos antes de poner la tapa. Dejar enfriar el desecador cerrado durante una hora al lado de la balanza. En el transcurso del enfriamiento y de la pesada, colocar dos cartuchos deshidratantes de silicagel en la balanza de precisión. Pesar rápidamente (es por lo que hay que conocer previamente el peso de los crisoles llenos antes del secado).

Calcinar los crisoles filtrantes de cuarzo en el horno eléctrico previamente calentado a 550 °C, durante 30 minutos, colocarlos a continuación sobre una placa refractaria durante cinco minutos por lo menos, para que se enfríen hasta 100 °C, aproximadamente. Introducir de nuevo cuatro crisoles como máximo en un desecador, dejándolos enfriar al lado de la balanza durante una hora exactamente y pesar rápidamente.

Si se emplean crisoles filtrantes de vidrio, ponerlos en el horno frío, a fin de evitar las tensiones en la parte inferior deslustrada. Después de alcanzar la temperatura de 550 °C, incinerar durante treinta minutos, dejar enfriar los crisoles en el horno abierto hasta 200 °C, colocarlos a continuación algunos minutos sobre la placa refractaria para dejarlos enfriar hasta 100 °C, aproximadamente, y operar después como para los crisoles filtrantes de cuarzo.

No es necesario hacer una prueba en vacío, ya que todo el material filtrante es inalterable al calor como consecuencia del tratamiento previo.

1.5 Cálculos.

El índice de materias celulósicas viene dado por la expresión:

siendo:

C = índice de materias celulósicas en porcentaje de materia seca.

a = peso, en g, del crisol y del residuo después del ataque ácido y secado a 130 °C.

b = peso, en g, del crisol después de la incineración del residuo.

E = peso, en g, de la muestra.

H = humedad de la muestra en porcentaje.

1.6 Observaciones.

1.6.1 En el caso de los cereales y productos derivados, no es necesario extraer la grasa antes del ataque ácido.

1.6.2 Los materiales filtrantes (crisoles filtrantes, arena de mar, placas de porcelana, polvo de tierra cocida) pueden ser utilizados nuevamente. Se separa por tamizado la arena de mar del polvo de tierra cocida; no es necesario limpiar de nuevo con el ácido clorhídrico los crisoles filtrantes, la arena de mar, el polvo de tierra cocida y las placas filtrantes de porcelana.

1.6.3 El tiempo necesario para la determinación del índice de materias celulósicas mediante el empleo de crisoles filtrantes de cuarzo, es aproximadamente de cinco horas, y mediante los crisoles filtrantes de vidrio alrededor de ocho horas.

1.7 Referencia.

2. HUMEDAD

Téngase en cuenta, que éste método se sustituye por el descrito en la norma UNE-EN ISO 712 “Cereales y productos derivados. Determinación del contenido de humedad. Método de referencia”, según establece la disposición final 1.1º del Real Decreto 1615/2010, de 7 de diciembre. Ref. BOE-A-2010-19103#dfprimera

3. CENIZAS

Téngase en cuenta que éste método se sustituye por el descrito en la norma UNE-EN ISO 2171 “Cereales, legumbres y subproductos. Determinación del rendimiento de cenizas por incineración", según establece la disposición final 1.2º del Real Decreto 1615/2010, de 7 de diciembre. Ref. BOE-A-2010-19103#dfprimera

4. PROTEÍNA

Téngase en cuenta que éste método se sustituye por el descrito en la norma UNE-EN ISO 20483 “Cereales y legumbres. Determinación del contenido de nitrógeno y cálculo del contenido de proteína bruta. Método de Kjeldahl”, según establece la disposición final 1.3º del Real Decreto 1615/2010, de 7 de diciembre. Ref. BOE-A-2010-19103#dfprimera

5. GRASA

5.1 Principio.

El contenido en grasa bruta de un producto se define convencionalmente como la parte del mismo extraíble por éter etílico en condiciones determinadas. Incluye, además de la grasa, otras muchas sustancias solubles en éter etílico, como son: ceras, pigmentos, vitaminas, etc.

Este método es aplicable a los granos, harinas y otros productos derivados de los cereales.

5.2 Material y aparatos.

5.2.1 Extractor tipo Soxhlet.

5.2.2 Balanza analítica con precisión de 0,1 mg.

5.2.3 Estufa de desecación, graduada a 100 °C.

5.2.4 Desecador con placa de porcelana o metálica perforada, conteniendo un agente deshidratante, como anhídrido fosfórico o silicagel.

5.2.5 Cartuchos de extracción.

5.2.6 Matraces de 100 a 150 ml, adaptables al extractor.

5.2.7 Batería de extracción, baño de agua.

5.3 Reactivos.

Éter etílico.

5.4 Procedimiento.

Pesar de 5 a 10 g de muestra, molida de forma que pase por un tamiz de 500 µ y desecada a 100 °C, e introducirlos en un cartucho que se tapona con algodón. Tarar el matraz, desecado en la estufa y enfriado en el desecador. Introducir el cartucho en el extractor, añadir éter etílico una vez conectado el matraz y proceder a la extracción, continuándola hasta que el éter sea incoloro; son suficientes 4 horas a una velocidad de destilación de 4 a 5 gotas/s, y 16 horas para 2 a 3 gotas/s.

Sacar el cartucho del extractor y recuperar el éter. Llevar el matraz con el extracto y el resto del disolvente a la estufa de desecación a 100 °C y tenerlo media hora. Dejar enfriar el matraz en el desecador y, en cuanto alcance la temperatura ambiente, pesarlo.

5.5 Cálculo.

El porcentaje de grasa bruta sobre sustancia seca viene dado por la fórmula:

En la que:

P₁ = peso, en g, del matraz con el extracto etéreo.

P₂ = peso, en g, del matraz vacío.

P = peso, en g, de la muestra empleada.

5.6 Referencia.

6. ÍNDICE DE MALTOSA

6.1 Principio.

El índice de maltosa es una medida relacionada con la capacidad de producción de gas de un trigo.

6.2 Material y aparatos.

6.2.1 Matraz erlenmeyer con tapón de 250 ml.

6.2.2 Baño de agua.

6.2.3 Bureta graduada de 50 ml de capacidad.

6.2.4 Matraz erlenmeyer de 100 ml.

6.2.5 Mechero Bunsen y trípode.

6.3 Reactivos.

6.3.1 Ácido sulfúrico al 20 por 100.

6.3.2 Tungstato sódico al 15 por 100.

6.3.3 Solución de sulfato de cobre (69,28 g/l).

6.3.4 Solución de 350 g de sal de Seignette (tartrato sódico potásico) y 100 g de sosa cáustica en 1 litro de agua.

6.3.5 Indicador: Solución acuosa de azul de metileno al 1 por 100.

6.4 Procedimiento.

Pesar 15 g de harina y colocarlos en un matraz erlenmeyer con tapón. Añadir 95 ml de agua destilada e introducir el matraz en un baño de agua manteniendo a 27 °C de temperatura. Dejar en el baño durante una hora, agitar bien a intervalos de 15 minutos. Sacar el matraz del baño y añadir 15 ml de ácido sulfúrico al 20 por 100 y 3,5 ml de tungstato sódico al 15 por 100. Filtrar. Prescindir del residuo y colocar el líquido en una bureta graduada de 50 ml de capacidad. Introducir en un matraz erlenmeyer 5 ml de solución de sulfato de cobre (69,28 g/l) y 6 ml de una solución de 350 g de sal de Seignette (tartrato sódico potásico) y 100 g de sosa cáustica en un 1 litro de agua Colocar el matraz en un trípode sobre un mechero Bunsen y verter en él desde la bureta 20 ml del líquido filtrado. Cuando hierva, añadir 5 gotas de indicador (solución acuosa de azul de metileno al 1 por 100). Verter gradualmente líquido desde la bureta hasta que la solución del matraz ha perdido por completo la coloración azul. Observar en la probeta la cantidad de líquido vertido y buscar en la tabla 6.1 el índice de maltosa de la harina.

6.5 Referencia.

TABLA 6.1

Índice de maltosa

Líquido vertido	Índice de maltosa	Líquido vertido	Índice de maltosa
20,0	2,69	35,5	1,49
20,5	2,63	36,0	1,47
21,0	2,56	36,5	1,46
21,5	2,50	37,0	1,45
22,0	2,44	37,5	1,42
22,5	2,38	38,0	1,40
23,0	2,33	38,5	1,38
23,5	2,28	39,0	1,36
24,0	2,23	39,5	1,34
24,5	2,18	40,0	1,32
25,0	2,14	40,5	1,30
25,5	2,10	41,0	1,29
26,0	2,06	41,5	1,27
26,5	2,02	42,0	1,26
27,0	1,99	42,5	1,24
27,5	1,95	43,0	1,23
28,0	1,91	43,5	1,21
28,5	1,87	44,0	1,20
29,0	1,84	44,5	1,18
29,5	1,80	45,0	1,17
30,0	1,77	45,5	1,16
30,5	1,74	46,0	1,15
31,0	1,72	46,5	1,13
31,5	1,69	47,0	1,12
32,0	1,66	47,5	1,11
32,5	1,63	48,0	1,10
33,0	1,61	48,5	1,09
33,5	1,58	49,0	1,08
34,0	1,56	49,5	1,06
34,5	1,54	50,0	1,05
35,0	1,52

7. ACIDEZ GRASA

7.1 Principio.

Neutralización de los ácidos grasos libres con hidróxido sódico. Se mide la rancidez hidrolítica que se utiliza como índice de deterioro en almacenamiento.

Aplicable a granos de cereales y harinas.

7.2 Material y aparatos.

7.2.1 Extractor tipo Soxhlet.

7.2.2 Balanza analítica con precisión de 0,1 mg.

7.2.3 Cartuchos de extracción.

7.2.4 Matraces de 100 a 150 ml adaptables al extractor.

7.2.5 Batería de extracción con baño de agua.

7.2.6 Pipetas de 50 ml.

7.2.7 Bureta de 50 ml.

7.3 Reactivos.

7.3.1 Éter de petróleo p.e. 35-60 °C.

7.3.2 Benceno-alcohol-fenolftaleína (BAF). Mezclar partes iguales en volumen de benceno y de alcohol etílico del 95 por 100. Añadir 0,2 g de fenolftaleína por litro para obtener una solución al 0,02 por 100.

7.3.3 Hidróxido potásico. Preparar una solución 0,0178N (1 ml = 1 mg KOH) con hidróxido potásico libre de CO₂.

7.3.4 Patrón de color.

7.3.4.1 Colocar 50 ml de agua en un matraz del mismo tipo en que se va a hacer la valoración. Añadir gota a gota una solución de dicromato potásico al 0,05 por 100 hasta que tome la coloración de la solución que se va a valorar. Añadir 2,5 mililitros de una solución recién preparada de permanganato potásico al 0,01 por 100 y se mezcla. El color final de la valoración debe ser semejante a éste.

7.3.4.2 El color patrón para la valoración de la prueba en blanco se obtiene añadiendo 2,5 ml de permanganato al 0,01 por 100 a 50 ml de agua.

7.4 Procedimiento.

Para que los resultados sean más precisos, el contenido en humedad de los granos no debe exceder del 11 por 100. Se ha comprobado que mayores contenidos en humedad en el momento de la extracción aumentan significativamente los valores de acidez grasa.

Moler por los menos 40 g de una muestra representativa para granos pequeños, tales como el trigo, o 200 g para granos más grandes, tales como el maíz. Preferiblemente, moler la muestra de tal forma que el 90 por 100 o más pase a través del tamiz de 500 μ. Una vez molida la muestra se somete a extracción antes de 1 hora para evitar cambios causados por enzimas lipolíticos. Extraer 10 g de muestra sólida, como en 5.4, utilizando éter de petróleo, Evaporar el éter de petróleo del extracto y redisolver el extracto en el matraz de extracción con 50 ml de solución de BAF. Valorar la solución extraída con hidróxido potásico 0,0178N hasta alcanzar el punto de color patrón.

7.4.1 Hacer la prueba en blanco valorando 50 ml de solución BAF, hasta alcanzar el punto de color patrón 7.3.4.2.

7.5 Cálculo.

Expresar la acidez grasa como los mg de KOH requeridos para neutralizar los ácidos grasos libres de 100 g de grano sobre sustancia seca por la fórmula

donde:

V = volumen en ml de KOH 0,0178N utilizado para valorar la muestra extraída.

V₁ = volumen en ml de KOH 0,0178N utilizado para la valoración en blanco.

H = peso en g de agua en 100 g de muestra.

7.6 Observaciones.

En caso de granos con altos valores de acidez grasa se forman a veces emulsiones durante la valoración que enmascaran parcialmente el punto de color final. Cuando aparecen emulsiones, añadir 50 ml adicionales de solución BAF para asegurar una solución clara. En este caso el valor de la prueba en blanco es el doble del valor determinado sobre 50 ml.

7.7 Referencia.

8. AGENTES OXIDANTES

(Reacción con yoduro potásico)

8.1 Principio.

Este método detecta todos los agentes oxidantes que se adicionan generalmente a la harina, para mejorar sus propiedades de panificación, excepto percloratos y peróxido de benzoilo.

8.2 Material y aparatos.

8.2.1 Matraz erlenmeyer de 500 ml.

8.2.2 Centrífuga.

8.3 Reactivos.

8.3.1 Yoduro potásico 10 por 100.

8.3.2 Ácido sulfúrico (1 ± 10) v/v.

8.4 Procedimiento.

Colocar 50 g de muestra en un matraz erlenmeyer de 500 mililitros, añadir 200 ml de agua a la temperatura ambiente, agitar bien y dejar reposar 1 hora, aproximadamente, con agitados frecuentes. Filtrar o centrifugar. A 5 ml del filtrado añadir 5 mililitros de solución de KI y 5 ml de H₂SO₄ (1 + 10) v/v. Soluciones amarillas o pardas indican la presencia de agentes oxidantes.

8.5 Referencia.

9. BROMATOS Y IODATOS EN LA HARINA

(Método cualitativo)

9.1 Principio.

Este método sirve para determinar la presencia de bromato y iodato en la harina, que actúan como mejorantes.

9.2 Material y aparatos.

9.2.1 Placa de Petri de un área aproximada de 100 cm².

9.2.2 Tamiz número 60.

9.3 Reactivos.

9.3.1 Para el bromato y iodato solución de HCl en agua (1 + 7) v/v y KI (1 por 100) mezclados a volúmenes iguales.

9.3.2 Para iodato solución de 1 volumen de KSCN (1 por 100) y 4 volúmenes de solución de HC1 en agua (1 + 32) v/v mezclados.

9.4 Procedimiento.

9.4.1 Bromatos y iodatos.

Cubrir el fondo del recipiente con el reactivo KI-HCl. Cerner uniformemente con el tamiz número 60 sobre el reactivo, aproximadamente 4 g de harina a ensayar. Alternativamente, cerner harina sobre la superficie del recipiente seco y esparcir la mezcla de reactivo sobre la harina con un frasco pulverizador hasta que todas las partículas estén humedecidas. La aparición de manchas negras o purpúreas después de la adición del reactivo indica la presencia de bromato o iodato.

9.4.2 lodatos.

9.4.2.1 (Aplicable a 10 p.p.m. o más). Distribuir suavemente, aproximadamente, g de harina sobre el fondo de una placa de Petri y cubrir completamente con el reactivo KSCN-HC1 recientemente preparado.

9.4.2.2 (Aplicable a 1-10 p.p.m.) Proceder como para bromatos y iodatos, pero usar el reactivo KSCN-HC1.

9.5 Referencia.

10. PERÓXIDO DE BENZOILO

(Método cualitativo con bencidina)

10.1 Principio.

El peróxido de benzoilo da con solución etanólica de bencidina, coloración pardo-verdosa.

10.2 Material y aparatos.

10.2.1 Placa de vidrio

10.2.2 Pulverizador.

10.3 Reactivos.

Disolver 1,5 g de bencidina (base libre) en 50 ml de etanol 96 por 100. Calentar la solución a 50-60° en un baño de agua antes de usarla.

10.4 Procedimiento.

Verter el reactivo sobre una capa de harina en una placa de vidrio. Si aparecen manchas pardo-verdosas indica que la harina está tratada con peróxido de benzoilo. Observar mejor las manchas por detrás del vidrio y, en general, verter el reactivo pulverizando.

10.5 Referencia.

11. ÍNDICE DE PELSHENKE

11.1 Principio.

El índice de Pelshenke proporciona una valoración indirecta de la calidad panadera de los trigos, estando relacionado tanto con la capacidad de producción de gas como con la capacidad de retención del mismo.

11.2 Material y aparatos.

11.2.1 Bario de agua.

11.2.2 Vasos de forma baja de 150 ml.

11.3 Reactivos.

11.3.1 Suspensión de levadura panaria. Formar una papilla espesa con 10 g de levadura y agua destilada, añadiendo más agua hasta completar 100 ml.

11.4 Procedimiento.

Pesar 10 g de trigo molido que pase por el tamiz de 1 mm y colocarlo en una cápsula de porcelana. Añadir 5,5 ml de la suspensión de levadura y amasar con una espátula. Dividir la masa en dos partes aproximadamente iguales y darle forma de bola compacta entre las palmas de las manos.

Introducir las bolas así formadas en sendos vasos de forma baja de 150 ml, que contengan 75 ml de agua a 32 °C. Colocar los vasos en un baño de agua a dicha temperatura. Por la acción de los gases producidos en la fermentación, las bolas suben a la superficie, en la cual permanecen un tiempo variable, hasta que se rompen y caen pedazos al fondo del vaso.

11.5 Cálculo.

Medir el tiempo en minutos transcurrido desde el momento de introducir la bola en el vaso hasta que se produce la disgregación. La media de las dos determinaciones constituye el «índice de Pelshenke».

11.6 Referencias.

12. GLUTEN

Téngase en cuenta que este método se sustituye por el descrito en la norma UNE-EN ISO 21415-2 “Trigo y harina de trigo. Contenido de gluten. Parte 2: Determinación de gluten húmedo por medios mecánicos”, según establece la disposición final 1 del Real Decreto 190/2013, de 15 de marzo. Ref. BOE-A-2013-3630

13. FARINÓGRAFO BRABENDER

13.1 Principio.

El método se aplica para la determinación de la absorción de agua y el comportamiento al amasado de una harina de trigo. El farinógrafo mide y registra la resistencia de una masa al amasado. Esta resistencia se llama consistencia. La absorción de agua se define como el porcentaje de agua respecto al peso de harina que es necesario añadir para obtener una masa de consistencia determinada.

13.2 Material y aparatos.

13.2.1 Farinógrafo Brabender con tanque de circulación de agua.

Calibración del farinógrafo.

Velocidad de la paleta rápida: 90 ± 3 r.p.m.

Par: 100 ± 2 g cm/U.B.

Velocidad del papel: 1,00 ± 0,03 cm/min.

Bureta graduada de 135 ml a 225 ml.

13.2.2 Balanza de sensibilidad: ± 0,1 g.

13.2.3 Espátula de plástico blanco.

13.3 Reactivos.

13.3.1 Agua destilada.

13.4 Procedimiento.

Determinar el contenido de humedad de la harina como en 2. Hacer circular el agua por el termostato y el farinógrafo al menos 1 hora antes de usar el instrumento. Durante el ensayo, la temperatura del agua y de la amasadora deberá ser de 30° ± 0,2°.

Lubricar la amasadora con una gota de agua entre la pared posterior y cada una de las paletas. Ajustar la posición de los pesos de la balanza paca obtener una deflección cero del indicador con las paletas girando en vacío. Ajustar el brazo de la pluma de tal forma que coincidan las lecturas en el sector de la balanza y en el pape móvil. Ajustar el amortiguador de tal manera que con el motor girando el tiempo requerido por el indicador de la balanza para ir de 1.000 a 100 U.B. sea de 1,0 ± 0,2 s.

Poner en la amasadora el peso equivalente a 300 ± 0,1 g de harina con el 15 por 100 de humedad. Tapar la amasadora. Llenar la bureta con agua a 30° ± 5°.

Si fuese necesario, llevar la harina a 30° ± 10°.

Colocar el papel de tal manera que la pluma esté en contacto con una línea de 9 min. Mezclar durante 1 minuto. Comenzar a añadir agua de la bureta en la esquina delantera de la derecha de la amasadora cuando la pluma cruce la línea de 0 minutos. Añadir agua en cantidad suficiente para que la consistencia máxima de la masa sea de 500 U.B.

Cuando la masa se adhiera a las paredes de la amasadora, rasparla con una espátula de plástico. Cubrir la amasadora hasta el final del ensayo.

Si la cantidad de agua utilizada en el ensayo no se ha añadido en un intervalo de 25 segundos o si la consistencia máxima de la masa difiere de 500 ± 20 U.B., se repite el ensayo corrigiendo la cantidad de agua y añadiéndola en 25 segundos de forma que la masa adquiera una consistencia máxima de 500 ± 20 U.B.

Una vez alcanzada la consistencia máxima, continuar el ensayo durante 12 minutos.

13.5 Cálculo.

13.5.1 Absorción de agua. Calcular la absorción de agua sobre una base del 15 por 100 de humedad como sigue:

V = volumen en ml de agua añadida para obtener una masa con una consistencia máxima de 500 U.B.

P = peso en g de harina utilizada, equivalente a 300 g con el 15 por 100 de humedad.

Determinar la absorción con una aproximación de 0,1 por 100.

13.5.2 Tiempo de desarrollo. Es el período de tiempo comprendido desde el comienzo del amasado hasta el punto de la curva inmediatamente anterior al primer signo de decaimiento. Expresar este tiempo con una aproximación de 0,5 minutos. En el caso, poco frecuente, de que aparezcan dos máximos, emplear el segundo para medir el tiempo de desarrollo.

13.5.3 Grado de decaimiento. Es la diferencia en U.B. entre el centro de la curva en el máximo y el centro de la curva 12 minutos después de este máximo. Expresar el decaimiento con una aproximación de 5 U.B.

13.6 Observaciones.

Se obtienen los siguientes valores para el coeficiente de variación de la determinación simple correspondiente a un solo farinógrafo:

Absorción de agua: 0,55%.

Tiempo de desarrollo de la masa: 8,9%.

Grado de decaimiento: 7,5%.

13.7 Referencia.

14. ALVEÓGRAFO CHOPIN

Téngase en cuenta que éste método se sustituye por “Propiedades alveográficas” y el método establecido en dicho apartado por el descrito en la norma UNE-EN ISO 27971 "Cereales y productos a base de cereales. Trigo común (“Triticum aestivum L.”). Determinación de las propiedades alveográficas de la masa a hidratación constante preparada a partir de harinas comerciales o harinas para ensayo y la metodología del ensayo de molienda", según según establece la disposición final 1.5º del Real Decreto 1615/2010, de 7 de diciembre. Ref. BOE-A-2010-19103#dfprimera

15. DETERMINACIÓN DEL GRADO DE SEDIMENTACIÓN

(Según Zeleny)

15.1 Principio.

El esponjamiento de la fracción de gluten de harina en solución de ácido láctico afecta al grado de sedimentación de una suspensión de harina en el medio de ácido láctico. Más alto contenido en gluten y mejor calidad de éste, conduce a sedimentación más lenta y a más altos valores de la prueba de sedimentación.

El grado de sedimentación de una harina suspendida en una solución de ácido láctico durante un intervalo de tiempo estándar se toma como medida de su calidad panadera.

Es aplicable a harina de trigo.

15.2 Material y aparatos.

15.2.1 Pipeta de 25 ml

15.2.2 Pipeta de 50 ml

15.2.3 Cilindro graduado de 100 ml de vidrio o teflón, preferiblemente hecho de vidrio de precisión con una distancia de 180-185 mm, entre la marca cero y la marca 100 ml.

15.2.4 Reloj avisador o medida de intervalos de tiempo.

15.2.5 Bastidor mezclador movido por motor (agitador de vaivén).