Orden de 31 de enero de 1977 por la que se establecen los Métodos Oficiales de Análisis de Aceites y Grasas, Cereales y Derivados, Productos Lácteos y Productos Derivados de la Uva

Siendo:

M = masa, en gramos de la muestra.

n = masa, en gramos, de la muestra después de secar.

4.5.2 Método de cálculo del extracto seco magro.‒Emplear la fórmula

Siendo:

A₁ = masa, en gramos, del crisol vacío.

A₂ = masa, en gramos, del crisol conteniendo sedimento.

B₁ = masa, en gramos, de la cápsula vacía.

B₂ = masa, en gramos, de la cápsula con sedimento residual.

M = masa, en gramos, de la muestra.

4.5.3 Método de cálculo del contenido de grasa.

Grasa % = 100 ‒ (E + S)

E = porcentaje, en masa, de agua (calculada en 4.5.1).

S = porcentaje, en masa, de extracto seco magro (calculado en 4.5.2).

Para la determinación del contenido de agua, la diferencia entre el resultado de determinaciones paralelas no deberá exceder de 0,1 g de agua para 100 g de mantequilla.

Para la determinación del contenido de extracto seco magro, la diferencia entre resultados de determinaciones paralelas no deberá exceder de 0,05 g de extracto seco magro para 100 g de mantequilla.

5. DETECCIÓN DE GRASA VEGETAL EN GRASA DE LECHE POR CROMATOGRAFÍA DE GASES DE ESTEROLES

5.1 Principio.

Los digitónidos de esterol se disuelven en una mezcla de formamida y dimetilformamida, y los esteroles liberados se extraen con pentano, y se separan por cromatografía de gases. Si se obtiene en el cromatograma un pico con el tiempo de retención del beta-sitosterol, se concluye la presencia de grasa vegetal en la muestra de grasa examinada.

5.2 Material y aparatos.

5.2.1 Cromatógrafo de gases, equipado de un detector de ionización de llama, con un inyector de plata o de vidrio con un sistema de inyección directa en la columna y con un registrador.

5.2.2 Columna de cromatografía de gases, de vidrio o de acero inoxidable, en forma de U o en espiral, de 1 ó 2 m de longitud, diámetro interior de 3-4 mm Se recomienda el vidrio, pues algunos tipos de acero inoxidable dan resultados erróneos por alteración de los esteroles.

5.2.3 Microjeringa, capaz de proporcionar dosis de 5 ó 10 microlitros.

5.3 Reactivos.

5.3.1 Mezcla de volúmenes iguales de formamida y dimetilformamida.

5.3.2 n-Pentano.

5.3.3 Relleno de la columna: fase estacionaria de goma de silicona (tipo metílico), estable hasta por lo menos 300 °C que impregna en m² a 4 por 100, una tierra de diatomeas calcinada, lavada al ácido y silanizada, de granulometría 80/100 ó 100/120 de malla.

5.3.4 Solución para el ensayo de sensibilidad: 1 mg de colesterol de 1 ml de n-pentano, recientemente preparado a partir de la grasa de leche, como se describe en 5.4.2.

5.3.5 Solución para el ensayo de resolución de los picos: 0,9 mg de fitosterol de aceite de colza y 0,1 mg de colesterol en 1 ml de n-pentano. Los esteroles deben estar recientemente preparados según el procedimiento descrito en 5.4.2.

5.3.6 Solución para el ensayo de referencia: 1 mg de fitosterol de aceite de soja en 1 ml de n-pentano recientemente preparado, según se describe en 5.4.2.

5.3.7 Gas portador, nitrógeno.

5.3.8 Hidrógeno.

5.3.9 Oxígeno o aire.

5.4 Procedimiento.

5.4.1 Preparación de la muestra.‒Fundir aproximadamente 50 g de la muestra de mantequilla en una estufa corriente a temperatura inferior a 50 °C hasta separación de las fases acuosa y grasa. Separar la capa grasa por decantación y clarificar la grasa en una estufa a una temperatura de aproximadamente 40 °C filtrando sobre un papel de filtro seco y evitando que pase la fase acuosa sobre el filtro.

5.4.2 Preparación de esteroles.‒Pesar en un matraz erlenmeyer de 500 ml, aproximadamente 15 g de materia grasa con una precisión de 0,1 g. Añadir 10 ml de la solución de hidróxido de potasio y 20 ml de etanol (95-96 por 100 v/v). Colocar sobre el matraz erlenmeyer el refrigerante de aire, calentar en baño de agua hirviendo, agitando por rotación, hasta que la solución se haga clara, y continuar la ebullición media hora más.

Añadir 60 ml de agua y luego 180 ml de etanol (95-96 por 100 v/v) y llevar la temperatura a aproximadamente 40 °C. Añadir 30 ml de la solución alcohólica de digitonina (1 por 100), agitar y dejar enfriar. Colocar el matraz en un refrigerante regulado a 5 °C, aproximadamente, durante 12 horas o una noche.

Recoger el precipitado del digitónido de esterol por filtración sobre un papel de filtro de velocidad media en un embudo Buchner (8 cm de diámetro). Lavar el precipitado con agua aproximadamente a 5 °C, hasta que el filtrado no forme espuma, luego lavar una vez con 25-50 ml de etanol (95-96 por 100 v/v) y después una vez con 25-50 ml de éter dietílico.

Desecar el papel de filtro con el precipitado en un vidrio de reloj en estufa a 102 ± 2 °C, durante 10 a 15 minutos. Separar el precipitado en forma de película, plegando en dos partes el papel de filtro.

Disolver en un pequeño tubo de ensayo, aproximadamente, 10 mg de digitónido de esterol en 0,5 ml de una mezcla de volúmenes iguales de formamida y dimetil-formamida. Calentar ligeramente, si es necesario. Después enfriar, añadir 2,5 ml de n-pentano y agitar. Dejar reposar hasta que la separación entre las capas sea neta y usar la capa superior, que contiene los esteroles liberados, para el análisis cromatográfico.

5.4.3 Condiciones de la cromatografía de gases.‒Temperatura de la columna: 220-250 °C. Temperatura del sistema de inyección, si puede calentarse por separado: 20-40 °C por encima de la temperatura de la columna. Gasto de nitrógeno: 30/60 ml/min. Desconectar el detector y equilibrar las columnas nuevas en estas condiciones durante 16-24 horas. Conectar el detector, encender la llama y regular el gasto de hidrógeno y oxigeno o aire para obtener una altura de llama y una sensibilidad adecuada. Poner en marcha el registrador y dejar que el papel se desenrolle a una velocidad adecuada, ajustar el cero y el atenuador. Si la línea de base es estable, el aparato está listo para usarse.

5.4.4 Ensayo de sensibilidad.‒Inyectar 3 a 5 mcl de la solución para el ensayo de sensibilidad (5.3.4). Sólo aparecerá un pico de colesterol en el cromatograma (fig. 5.1). Ajustar el atenuador de modo que se utilice aproximadamente toda la escala del registrador.

5.4.5 Ensayo de resolución de los picos.‒Inyectar 3 a 5 mcl de la solución para el ensayo de resolución de los picos (5.3.5). Aparecerán en el cromatograma los picos de colesterol, brasicosterol, camposterol (fig. 5.II) Medir las distancias de retención (distancia desde el punto de inyección hasta el punto de altura máxima del pico) de los picos, d_ch para el colesterol, d_b para el brasicosterol, d_c para el camposterol y el d_s para el beta-sitosterol y las anchuras de la base de los picos (dimensión de retención entre las intersecciones con la línea de base de las tangentes en los puntos de inflexión situados en la parte anterior y posterior del pico). W_ch para el colesterol y W_b para el brasicosterol. La resolución de los picos, expresada por la fórmula

PR = 2(d_b ‒ d_ch) (W_b + W_ch)

debe ser por lo menos igual a 1.

Calcular los tiempos de retención relativos (colesterol 1,00) para el brasicosterol, el camposterol y el beta-sitosterol.

5.4.6 Ensayo de referencia.‒Inyectar 3 a 5 mcl de la solución para el ensayo de referencia (5.3.6). Los picos de camposterol, estigmasterol y de beta-sitosterol deben aparecer sobre el cromatograma (fig. 5.III). Medir las distancias de retención de los picos, d_c para el camposterol, d_st para el estigmasterol y d_s para el beta-sitosterol.

Calcular los tiempos de retención relativos, que son, aproximadamente:

Colesterol: 1,00 (aproximadamente 15 min.).

Brasicosterol: 1,13-1,15.

Camposterol: 1,32-1,34.

Estigmasterol: 1,44-1,46.

Beta-sitosterol: 1,66-1,68.

5.4.7 Análisis.‒Inyectar 3 a 5 mcl de la solución a analizar y dar al botón del atenuador hasta obtener un factor de atenuación cuatro veces inferior (se obtiene generalmente en dos pases del botón). Registrar el cromatograma.

5.5 Cálculo.

Si en el cromatograma un pico tiene un tiempo de retención relativo igual al de beta-sitosterol y una altura que corresponde al menos a un 2 por 100 de la escala, se concluye la presencia de beta-sitosterol y la muestra de grasa examinada, a partir de la cual se han aislado los esteroles, se considera que contiene grasa vegetal. La presencia en el cromatograma de picos de otros fitosteroles, como el camposterol o el estigmasterol, refuerza esta conclusión.

Por este método se puede demostrar la presencia de al menos un 0,5 por 100 de beta-sitosterol en la mezcla de esteroles. El límite de detección de la grasa vegetal en la grasa de leche no se puede indicar porque depende del contenido en betasitosterol de la grasa añadida, es decir, de la naturaleza de esta grasa o de la mezcla de grasas añadidas a la grasa de leche.

5.6 Referencia.

6. FOSFATASA RESIDUAL EN MANTEQUILLA

6.1 Principio.

El ensayo se basa en la acción del enzima fosfatasa sobre el substrato fenil fosfato disódico, con liberación del fenol y fosfato. La cantidad de fenol liberada se determina por adición de un reactivo que da color azul en presencia de fenol.

Cantidades superiores a dos equivalentes de fenol en 0,5 g de mantequilla indican una pasterización insuficiente.

6.2 Material y aparatos.

6.2.1 Cuchillo o espátula de acero inoxidable.

6.2.2 Baño de agua a 37°-38 °C.

6.2.3 Termómetro.

6.2.4 Pipetas de 1 ml.

6.2.5 Embudo de 5 cm de diámetro.

6.2.6 Papel Whatman núm. 42 o núm. 2.

6.2.7 Tubos graduados a 5 y 10 ml.

6.2.8 Fotómetro con filtro de transmitancia máxima a 610 nm.

6.2.9 Centrífuga

6.2.10 Pera de goma para pipetar.

6.3 Reactivos.

6.3.1 Tampón hidróxido-borato de bario: Disolver 18 g de BA (OH)₂BH₂O y 8 B de H₃BO₃ en agua y diluir a 1 litro con agua.

6.3.2 Tampón de desarrollo de color: PH 9,8 ± 0,15 a 25 °C. Disolver 6,0 g de metaborato sódico (NaBO₂) y 20 g de NA Cl en agua y diluir a 1 litro con agua.

6.3.3 Tampón de dilución de color: Diluir 100 ml de tampón de desarrollo de color a 1 litro de agua.

6.3.4 Sustrato tampón: Disolver 0,10 g de fenil fosfato disódico cristalino libre de fenol en 100 ml de tampón hidróxido-borato de bario (6.3.1) (los cristales de Na₂C₆H₅PO₄ deben guardarse en congelador o en desecador). Si Na₂C₆H₅PO₄ no está libre de fenol, purificarlo como sigue: Disolver 0,5 g con 4,5 ml de agua, añadir 0,5 ml de tampón hidróxido-borato de bario (6.3.1) y dos gotas del reactivo BQC (6.3.5) y dejar reposar 30 minutos. Extraer el color con 2,5 ml de alcohol butílico (6.3.7) y dejar reposar hasta que el alcohol se separe. Retirar el alcohol con un cuentagotas y desecharlo. Diluir 1,0 ml de la solución acuosa a 100 ml de tampón hidróxido-borato de bario (6.3.1). Calentar la solución a 85 °C 2 minutos, tapar inmediatamente y conservar en refrigerador. La solución es estable un año si las porciones son recogidas con mínima exposición a la atmósfera.

6.3.5 Solución BQC (s,6-dibromoquinona cloroimida) o reactivo de Gibbs: Disolver 40 mg BQC en polvo en 100 ml de alcohol absoluto o metanol y pasarlo a un frasco cuentagotas oscuro. El reactivo permanece estable por lo menos un mes, si se guarda en congelador; no usarlo después de que empiece a ponerse pardo. Guardar BQC en polvo en congelador o en desecador (nota: ha habido explosiones del reactivo BQC guardado en botellas en la estantería de reactivos). Comprobar los nuevos lotes de BQC antes de usarlo, preparando una curva patrón con fenol y comparando la curva obtenida con la de BQC que se sabe es satisfactorio. Repetir la prueba al menos semestralmente.

6.3.6 Solución de sulfato de cobre para los patrones: Disolver 0,05 g CuSO₄5H₂O en agua y diluir a 100 ml.

6.3.7 Alcohol butílico: Usar alcohol butílico normal, punto de ebullición 116-118 °C. Para ajustar el pH, mezclar 1 litro con 50 ml de tampón de desarrollo de color. Guardar en recipiente con tapón de vidrio.

6.3.8 Solución patrón de fenol:

6.3.8.1 Solución madre: Pesar exactamente 1.000 g de fenol puro, llevarlo a un matraz aforado de 1 litro, diluirlo con agua hasta 1 litro y mezclar (1 ml = 1 mg de fenol). La solución es estable varios meses en refrigerador.

6.3.8.2 Patrones de trabajo: Diluir 10,0 ml de la solución madre con agua hasta 1 litro y mezclar (1 ml = 10/ug 0,00001 g o 10 unidades de fenol). Usar esta solución patrón para preparar soluciones patrón más diluidas; p. e., diluir 5, 10, 30, 50 ml con agua hasta 100 ml para preparar soluciones patrón, que contenga 0,5; 1,0; 3,0 y 5,0 mg o unidades de fenol ml, respectivamente. Guardar estas soluciones patrón en refrigerador no más de una semana.

Análogamente preparar, a partir de la solución madre (6.3.8.1), soluciones patrón que contengan 20, 30 y 40 unidades/ml.

Medir las cantidades adecuadas de las soluciones patrón de trabajo en una serie de tubos (preferiblemente graduados a 5,0 y 10,0 ml) para conseguir un intervalo adecuado de patrones, según se necesite, que contengan O (control o prueba en blanco), 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 y 40,0 unidades. Para aumentar el brillo de las soluciones azules y mejorar la estabilidad de los patrones, añadir 1,0 ml de solución de CuSO₄ (6.3.6) a cada tubo. Luego añadir 5,0 ml de tampón de solución de color (6.3.3) y diluir con agua hasta 10,0 ml, añadir 4 gotas (0,08 ml) de la solución BQC (6.3.5) con agua hasta 10,0 ml, añadir 4 gotas (0,08 ml) de la solución BQC (6.3.5), mezclar y dejar desarrollar el color azul 30 minutos a temperatura ambiente.

Leer las intensidades de color en el fotómetro con filtro de 610 nm, restar el valor de la prueba en blanco del color de cada patrón de fenol y preparar la curva patrón (debe ser una línea recta).

Si los patrones han de usarse para comparación visual, guardar en refrigerador. Preparar semanalmente una serie nueva.

6.4 Procedimiento.

Tomar la muestra por debajo de la superficie con cuchillo y espátula limpios y proceder como sigue:

Pesar 1,0 g de muestra (preferiblemente por duplicado) sobre un pedazo de papel encerado de aproximadamente 1 pulgada cuadrada e introducir el papel con la muestra dentro del tubo. Análogamente, pesar otra muestra y colocarla en un tubo como control o patrón.

Calentar el patrón aproximadamente 1 minuto a 85-90° en vaso de agua hirviendo (cubierto así el tubo entero se calienta a 85-90°) y se enfría a temperatura ambiente. A partir de este momento, tratar en la misma forma el patrón y el problema.

Añadir 10,0 ml de sustrato patrón (6.3.4). Tapar el tubo y mezclar. Inmediatamente después de añadir el sustrato, incubar 1 hora en baño de agua a 37-38°, mezclando o agitando el contenido de cuando en cuando.

Calentar en vaso de agua hirviendo casi 1 minuto, calentando hasta 85-90° (utilizar termómetro en otro tubo del mismo tamaño y forma que contenga el mismo volumen de líquido) y enfriar a temperatura ambiente en recipiente de agua fría.

Pipetar en 1 ml de solución de Zn SO₄H₂O de 6,0 g/100 ml y mezclar por completo (el pH de la mezcla debe ser de 9,0-9,1).

Filtrar (se recomienda embudo de 5 cm y papel Whatman número 42 o núm. 2) y recoger 5,0 ml de filtrado en el tubo, preferentemente graduado a 5,0 y 10,0 ml.

Añadir 5,0 ml de tampón de desarrollo de color (6.3.2). El pH de la mezcla ha de ser 9,3-9,4.

Añadir 4 gotas de la solución BQC (6.3.5) y dejar 30 minutos a temperatura ambiente para desarrollo de color (para detectar únicamente la pasteurización añadir solamente 2 gotas de solución BQC).

Determinar la intensidad del color azul por uno de los siguientes métodos:

En los problemas que se consideren muy positivos durante el desarrollo de color (p. ej., 20 unidades), en los que 4 gotas de solución BQC (6.3.5) pueden ser insuficientes para combinar con todo el fenol, pipetar proporción adecuada de contenidos dentro de otro tubo, diluir hasta 10,0 ml con tampón de dilución de color (6.3.3), y añadir 2 gotas adicionales de solución BQC (6.3.5). Con cada problema diluir y tratar la prueba en blanco análogamente. Si la prueba sobre la muestra diluida es todavía muy fuertemente positiva, diluir de nuevo en la misma forma hasta que el color final esté dentro del intervalo de los patrones visuales o de la curva patrón del fotómetro. Dejar 30 minutos para el desarrollo de color después de la última adición de la solución de BQC (6.3.5) antes de hacer la lectura final. Para corregir lecturas por dilución, multiplicar por 2 para dilución 5 + 5, por 10 para dilución 1 9 y por 50 dilución 1 + 9 seguida de dilución 2 + 8, etc.

6.5 Cálculo.

Cuando se utilice 1,0 g de mantequilla y se añadan 11,0 ml de líquido, multiplicar el valor de la lectura por 1,1 para convertir el resultado en equivalentes de fenol/0,5 g de mantequilla (valores mayores de 2 equivalentes/0,5 g de mantequilla indican pasteurización insuficiente).

6.6 Referencia.

7. ÍNDICES DE ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES SOLUBLES E INSOLUBLES

7.1 Principio.

El índice de ácidos grasos volátiles solubles (índice de Reichert o Reichert-Meissl-Mellny) es el número de ml de una solución acuosa de álcali 0,1 N, requerido para neutralizar los ácidos grasos volátiles solubles en agua de 5 g de grasa en las condiciones que se especifican.

El índice de ácidos grasos volátiles insolubles (índice de Polenske) es el número de ml de solución acuosa de álcali 0,1 N, requerido para neutralizar los ácidos grasos volátiles insolubles en agua, obtenidos en 5 g de grasa, en las condiciones especificadas en el método.

Después de saponificar la grasa con una solución de hidróxido sódico en glicerina, la solución jabonosa se diluye con agua y se acidifica con ácido sulfúrico. Los ácidos grasos volátiles se destilan y los ácidos grasos insolubles se separan de los solubles por filtración. La solución acuosa de ácidos solubles y la solución etanólica de ácidos insolubles se valoran separadamente con una solución de álcali normalizada.

El método es empírico porque sólo determina una parte de estos ácidos. Por tanto, las especificaciones referentes al procedimiento y aparatos se deben seguir rigurosamente para obtener resultados exactos y reproducibles.

7.2 Material y aparatos(figura 7.1).

7.2.1 Matraz de fondo plano de vidrio al borosilicato de 300 ml de capacidad (A).

7,2.2 Cabeza de destilación (E).

7.2.3 Refrigerante (C).

7.2.4 Receptor, que consiste en un matraz aforado con las rayas circulares de aforo a 100 y 110 ml (D).

7.2.5 Lámina de asbesto de 120 mm de diámetro, 6 mm de espesor con una abertura central circular de 40 a 50 mm de diámetro, para sostener el matraz durante el calentamiento (E).

7.2.6 Piedra pómez triturada que pasa a través de un tamiz de malla circular de 1,44 min.

En la figura se representan las dimensiones en mm y el montaje del aparato de destilación; para las conexiones se puede utilizar tapones de caucho, neoprano o silicona, o juntas de vidrio esmerilado «estandar» 24/40.

7.3 Reactivos.

7.3.1 Glicerina (d = 1,26; 98 por 100 p/p).

7.3.2 Solución acuosa de hidróxido sódico (44 por 100 p/p), conservada en botella protegida del dióxido de carbono. Usar la porción limpia libre de precipitado de carbonatos.

7.3.3 Agua destilada, hervida durante 15 minutos, para eliminar el dióxido de carbono.

7.3.4 Solución de ácido sulfúrico 1 N.

7.3.5 Solución acuosa de hidróxido sódico 3 potásico 0,1 N, exactamente normalizada.

7.3.6 Solución indicadora de fenolftaleína (1 por 100 en etanol de 95-96 por 100).

7.3.7 Etanol (95-96 por 100 v/v) neutro a la fenolfteína. El agua usada debe ser destilada o de una pureza por lo menos equivalente.

7.4 Procedimiento.

7.4.1 Preparación de la muestra. Como en 5.4.1.

7.4.2 Determinación del índice de ácidos grasos volátiles solubles: Pesar 5 g con aproximación de 0,01 g de grasa en el matraz A. Añadir 20 g (16 ml de glicerina y 2 ml de solución de hidróxido sódico (44 por 100). Para añadir la solución de hidróxido sódico, usar una bureta protegida de la entrada de dióxido de carbono y limpiar la punta de la bureta desechando las primeras gotas. Calentar el matraz a fuego directo, evitando sobrecalentar y agitando continuamente, hasta que el líquido no forme espuma y se vuelva límpido Dejar enfriar el matraz hasta 90 °C. Añadir 90 ml de agua destilada recientemente hervida a la misma temperatura aproximadamente y mezclar. El líquido debe quedar límpido. Añadir de 0,6 a 0,7 g de piedra pómez y después 50 ml de solución de ácido sulfúrico 1 N. Conectar inmediatamente el matraz al aparato de destilación y calentarlo ligeramente hasta que los ácidos grasos libres formen una capa superficial limpia. Empezar a calentar y regular la llama de modo que se recojan en el matraz aforado 110 ml de destilado en 19-21 minutos, tomando como principio del período de destilación el momento en que se forma la primera gota en el refrigerante. Regular el flujo de agua del refrigerante de modo que se mantenga la temperatura del agua que sale del refrigerante a 20 ± 1 °C.

Cuando se hayan recogido exactamente 110 ml de destilado, quitar el mechero inmediatamente y sustituir el matraz aforado por un pequeño vaso. Mezclar el contenido del matraz aforado agitando suavemente y sumergir el matraz en un baño de agua a 20 ± 1 °C durante 10-15 minutos, estando la señal de 110 ml del matraz aforado por debajo del nivel del agua del baño. Agitar el matraz de cuando en cuando. Tapar el matraz y mezclar invirtiéndolo 4 ó 5 veces sin agitar. Filtrar los 110 ml de destilado por un papel filtro seco de velocidad media (diámetro 80-90 mm), que se ajusta cómodamente en un embudo. El filtrado debe ser límpido (el filtro debe ser de tales dimensiones, que un volumen de 15 ml lo llene completamente). Pipetar 100 ml de filtrado y pasarlos a un matraz erlenmeyer de 300 ml. añadir 0,5 ml de la solución indicadora de fenolftaleína y valorar con la solución acuosa de álcali «estandar» 0,1 N hasta un color rosa persistente durante 0,5-1 minuto.

7.4.3 Ensayo en blanco: Hacer un ensayo en blanco sin grasa y en lugar de saponificar a fuego directo calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos.

No se requerirán para la, valoración más de 0,5 ml de la solución de álcali normalizada. En otro caso, se deben preparar nuevas soluciones del reactivo.

7.4.4 Determinación del índice de ácidos grasos volátiles insolubles (Polenske): Lavar el filtro con tres porciones sucesivas de 15 ml de agua destilada a la temperatura de 20 ± 1 °C, habiendo pasado previamente cada una a través del refrigerante del vaso pequeño y del matraz aforado. Poner el embudo y el filtro en el cuello de un matraz cónico, limpio y seco, de 200 ml de capacidad. Disolver los ácidos grasos insolubles repitiendo los lavados, usando ahora porciones de 15 ml de etanol (95-96 por 100 v/v). Valorar con la solución acuosa de álcali normalizada (0,1 N) el conjunto de los lavados con etanol usando 0,5 ml de solución indicadora de fenolftaleína, hasta un color rosa persistente durante 0,5-1 minuto.

7.5 Cálculo.

7.5.1 Índice de ácidos grasos volátiles solubles (índice de Reichert).

Índice de Reichert = 11 · t · (V₁ ‒ b)

Siendo:

V₁ = volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali, utilizados en la valoración de la muestra.

b = volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali, utilizados en el ensayo en blanco.

t = normalidad exacta de la solución normalizada (0,1 N) de álcali.

Redondear el resultado a la primera cifra decimal.

7.5.2 Índice de ácidos grasos volátiles insolubles (índice de Polenske).

Índice de Polenske = 10 ∙ t · V₂

Siendo:

V₂ = volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali utilizada en la valoración de la muestra.

t = normalidad exacta de la solución normalizada (0,1 N) de álcali.

Redondear el resultado a la primera cifra decimal.

7.5.3 Reproducción de resultados: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones duplicadas (resultados obtenidos simultáneamente o inmediatamente uno detrás de otro por el mismo analista) no debe exceder de 0,5 para el índice de Reichert o de 0,3 para el índice de Polenske.

7.6 Referencia.

8. ÍNDICE DE KIRSCHNER

8.1 Método operatorio.

1.° Neutralizar 100 ml del destilado Reichert-Meissl con solución de Ba (OH)₂ 0,1 N, con toda precisión hasta lograr un débil color rosado empleando 0,5 ml del indicador. Realizar la titulación en un matraz cerrado para evitar la absorción de CO₂.

2.º Añadir 0,3 g de Ag₂SO₄, en forma de polvo fino. Dejar reposar la mezcla una hora, agitando con frecuencia y filtrándola después.

3.º Recoger 100 ml del filtrado, colocarlo en un frasco de destilación de 300 ml, añadir 35 ml de agua destilada y 10 ml de H₂SO₄ diluido. Añadir un trozo de alambre de aluminio o varios trozos de piedra pómez para evitar que el líquido rebose. Únase al destilador y comiéncese la destilación a la velocidad de 110 ml en unos 20 minutos.

4.º Después de recoger 110 ml del destilado, filtrar esta cantidad total y titular 100 ml con NaOH, 1 N, empleando 0,5 ml del indicador hasta lograr un tono rosado que persista durante 2-3 minutos.

5.º Preparar y realizar una prueba en blanco semejante a la anterior en todos sus aspectos.

8.2 Cálculo.

A = titulación de la muestra ‒ titulación en blanco.

B = volumen, en ml, de Ba (OH)₂ 0,1 N, requeridos para neutralizar los 100 ml originales del destilado de Reichert-Meissl.

8.3 Referencia.

Se derogan los métodos coincidentes que figuran en la presente Orden por la disposición derogatoria de la Orden de 26 de enero de 1989. Ref. BOE-A-1989-2695

ANEXO IV. Métodos de análisis de productos derivados de la uva

Vinos

1. EXAMEN ORGANOLÉPTICO

1.1 Examen del color.

Determinar mediante apreciación visual las características, bien definidas, del color del vino.

Observar el vino colocado en copas de cristal fino e incoloro, o bien en tazas de plata o de fondo plateado, el cual presentará diferentes formas convexas o abolladas, para apreciar el vino en diferentes espesores y sobre fondo brillante.

Utilizar las siguientes calificaciones del color para vinos tintos: rojo rubí, rojo violáceo o morado, viraje a tono cebolla o amarillento.

Según la intensidad del color, el vino tinto puede calificarse en: vino tinto, rosado, clarete, y si tiene mucho o poco color dentro de estos tipos, se dirá que tiene mucha o poca capa.

En vinos blancos, utilizar las calificaciones de tono verdoso, casi incoloro, amarillo, amarillo-oro, ambarino, pajizo claro u oscuro (rancia), etc., y en todos los tipos, si el color es blanco, o si azulea, pardea o ennegrece.

1.2 Formación de espuma.

Observar el aspecto de la espuma que se forma al agitar el vino en la copa y determinar si es o no abundante, si desaparece rápidamente o, en caso de vinos tintos, si persiste unos momentos el color más o menos intenso. El vino de mucha capa o el vino enyesado produce espuma que tarda mucho en desaparecer.

1.3 Presencia de gas carbónico.

Verter vino en una copa. La formación de burbujas indica la presencia de gas carbónico en el vino. Este gas carbónico debe eliminarse para continuar el examen de la muestra, agitando o en la forma que se indica en los métodos analíticos.

1.4 Limpieza.

Apreciar en copa o en taza de plata, al mismo tiempo que el color, si el vino está turbio, claro o brillante.

Observar también si hay depósito y si al agitar tiene aspecto cristalino o pulverulento que enturbie el vino.

1.5 Degustación o cata.

Proceder a la degustación recién destapada la botella, consignando datos, referentes a calidad, origen, edad y posibles alteraciones del vino.

Coger una copa de cristal ovoide por su platillo con los dedos pulgar, índice y central de la mano derecha, quedando la copa libre para examinar el vino. Llenar con vino sólo 1/3 ó 1/4 de la copa., para poder agitar bien y tener un espacio vacío donde se concentren los aromas. Agitar haciendo girar el vino y apreciar el aroma.

Apreciar y caracterizar el olor a «vinoso», que acusa vino nuevo, el «afrutado», el de vino que comenzó la «crianza», la riqueza alcohólica, olores ácidos volátiles, olores que acusen defectos de elaboración, etc., y la presencia de enfermedades y alteraciones.

En degustación de más precisión, como será, la necesaria para definir características de un tipo de vino y que han de servir de referencia, es necesaria reunir un grupo determinado de buenos catadores, y realizar un número de catas suficientes para obtener resultados satisfactorios estadísticamente según las normas específicas existentes.

1.6 Referencia.

2. ENSAYOS PREVIOS DE CONSERVACIÓN

2.1 Prueba del aire.

2.1.1 «Quiebras» tánico-férricas o fosfato-férricas.‒Dejar el vino en contacto con el aire (en una copa mediada), en sitio fresco y al resguardo de la luz. Observar al cabo de 12 o más horas. El enturbiamiento o el ennegrecimiento pone de manifiesto la posibilidad de «quiebras» tánico-férricas o fosfato-férricas.

2.1.2 «Quiebra oxidásica».‒Proceder como en 2.1.1, utilizando dos muestras de vino, una pasterizada, para destruir la oxidasa, y la otra sin pasterizar. La formación de color pardo y precipitado pulverulento oscuro son señales características de la «quiebra oxidásica».

2.1.3 Quiebra cuprosa».‒Poner la muestra en botella cerrada, calentar en baño de agua a 35º, y exponer a la luz. Si la riqueza en cobre es suficiente, aparece enturbiamiento característico de la «quiebra cuprosa».

2.2 Prueba del frío.

Enfriar el vino a la temperatura que normalmente se suponga va a estar expuesto, y comprobar si se produce precipitación de bitartrato.

2.3 Prueba de la estufa.

Mantener una muestra de vino en estufa a 22-25° durante 3-4 días. Examinar al microscopio el posible desarrollo microbiano distinguiendo si se trata de levaduras o de bacterias. Si es necesario, proceder al conteo y la identificación de los microorganismos.

2.4 Examen microscópico.

Realizar el examen microscópico sobre preparación del poso de la muestra, que puede aparecer después de reposo en estufa o a temperatura ambiente.

Si el vino se presenta turbio en el envase original, hacer una preparación directamente del vino o del poso obtenido por centrifugación de ese vino. Si no se presenta depósito y el vino está poco turbio, hacer una preparación del poso obtenido por centrifugación.

Determinar en el examen microscópico si el depósito es microbiano, distinguiendo levaduras y bacterias.

3(a). COLOR DE LOS VINOS

3(a).1 Principio.

El color de los vinos se determina por transparencia como se percibe por la vista, pero por un procedimiento independiente de la apreciación personal, valiéndose de métodos espectrofoto métricos triestimulares de ordenadas seleccionadas de Hardy, fundado en el sistema de la Commision Internationale de l'Eclairage (C. I. E.), con relación a la luz producida por un cielo nublado (fuente C).

3(a).2 Material y aparatos.

3(a).2.1 Espectrofotómetro para medida en el espectro visible. Los valores de transmitancia correspondientes a una misma muestra no deben acusar diferencias superiores a 0,005, y cuando la escala del aparato esté graduada en valores de transmitancia multiplicados por 100, no debe haber diferencia superior a 0,5.

Las cubetas serán de cuarzo, de paredes paralelas y espesor interno b, que se expresa en centímetros, y con una aproximación de ± 0,002.b.

Conviene disponer de cuatro pares de cubetas en las que los espesores b sean de 0,1 cm, 0,2 cm, 0,5 cm y 1 cm.

Según la intensidad del color se escogerán un par de cubetas de tal forma que la absorbancia A quede comprendida entre 0,3-0,7 (transmitancia 0,5-0,2).

3(a).3 Procedimiento.

Si el vino no está limpio, centrifugar previamente. Eliminar el gas carbónico, si es necesario, por agitación con vacío parcial.

Medir directamente con el espectrofotómetro las transmitancias del vino a las cuatro longitudes de onda = 625, 550, 495 y 445 mμ, empleando la cubeta de espesor conveniente, según intensidad del color del vino.

3(a).4 Cálculo y expresión de los resultados.

Utilizar agua destilada como líquido de referencia.

3(a).4.1 Calcular las coordenadas (x, y) del punto representativo del color del vino en el diagrama tricromático de la C. I. E.

X = 0,42 ∙ T₆₂₅ ‒ 4 ‒ 0,35 ∙ T₅₅₀ + 0,21 ∙ T₄₄₅.

Y = 0,20 ∙ T₆₂₅ + 0,63 ∙ T₅₅₀ + 0,17 ∙ T₄₉₅.

Z = 0,24 ∙ T₄₉₅ + 0,94 ∙ T₄₄₅.

Los valores triestimulares X, Y, Z expresan las proporciones de colores rojos, verde y azul que dan por mezcla el color del vino.

Cuando el espesor o de la cubeta sea inferior a 1 cm, referir la transmitancia a 1 cm en la siguiente forma: T = T^1/b, y si la transmitancia viene expresada en porcentaje

T = transmitancia referida a 1 cm de espesor de cubeta.

T' = transmitancia obtenida para b cm de espesor de cubeta.

b = espesor en cm de la cubeta utilizada.

3(a).4.2 Luminosidad relativa.‒Es el valor de Y, expresado en porcentaje (siendo el negro Y = 0 y el incoloro Y = 100).

3(a).4.3 Cromaticidad.‒El color del vino por transparencia a la fuente C con el espesor de 1 cm viene dado por el punto del diagrama de cromaticidad de la C. I. E. (fig. 3(a),I), definido por las coordenadas x e y.

3(b). COLOR DE LOS VINOS

(Aplicable a vinos tintos y rosados)

3 (b).1 Principio.

La intensidad de color se mide por la suma de las absorbencias del vino para un espesor de 1 cm, correspondientes a las longitudes de onda de absorbancia mínima (420 mμ) del vino tinto.

La tonalidad se expresa por el ángulo que forma con el eje de longitudes de onda la cuerda que une los puntos de la curva espectrofotométrica representativos de las absorbancias correspondientes a las longitudes de onda de 420 y 520 mμ.

3(b).2 Material y aparatos.

Como en 3(a).2.

3(b).3 Procedimiento.

Como en 3(a).3, excepto que las longitudes de onda utilizadas serán de 420 mμ y 520 mμ.

3(b).4 Cálculos.

Calcular la intensidad colorante y la tonalidad.

3(b).4.1 Intensidad colorante:

A₄₂₀ = absorbancia a 420 mμ.

A₅₂₀ = absorbancia a 520 mμ.

b = espesor en cm de la cubeta.

3(b).4.2 Tonalidad.‒La tonalidad se mide por el ángulo cuya tangente es igual a la diferencia del valor numérico de las dos absorbancias A₅₂₀ ‒ A₄₂₀. Conocido este valor, se puede determinar el valor del ángulo por tablas expresadas en grados sexagesimales.

3(b).5 Observaciones.

Con este método no se determina el color, sino la intensidad y la tonalidad del color, que son características cromáticas convencionales. Por su rapidez y sencillez, es muy práctico para comprobar la evolución de la materia colorante durante su «crianza» o añejamiento.

3(b).6 Referencias.

4(a). MASA VOLÚMICA Y DENSIDAD RELATIVA

(Método picnométrico)

4(a).1 Principio.

La masa volúmica es el cociente de la masa de un cierto volumen de vino o de mosto por este volumen. Se expresa en g por ml y su símbolo es ρ₂₀.

La densidad relativa es el cociente de la masa volúmica del vino por la masa volúmica del agua. Su símbolo es d₂₀ ó simplemente d, cuando no haya posibilidad de confusión.

La masa volúmica y la densidad relativa de un vino se determina a 20°.

El método picnométrico consiste en la determinación ponderal del contenido en alcohol de un destilado por medio de un picnómetro.

4(a).2 Material y aparatos.

4(a).2.1 Picnómetro de vidrio de 50 ml de capacidad, de cuello con diámetro interior de 3,5 mm. Embudo y sifón para picnómetros.

4(a).2.2 Termómetro contrastado dividido en 1/5 ‒ 1/10 de grado Celsius graduado de 10 a 30 °C.

4(a).2.3 Termostato regulado a 20 ± 0,2 °C.

4(a).2.4. Balanza con aproximación de 0,1 mg.

4(a).3 Procedimiento.

Lavar bien el picnómetro y enjuagarlo después con alcohol y luego con éter, escurrir bien y secar cuidadosamente con paño de hilo o papel filtro el exterior, y con corriente de aire seco el interior, tapar, dejar en reposo en la caja de la balanza durante 30 minutos aproximadamente, y pesar.

Llenar después con agua a 20° recién destilada, con cuidado de evitar burbujas de aire en el interior del picnómetro. Sumergir en el agua a la temperatura comprobada de 20°.

Mantener el picnómetro en el termostato durante 30 minutos, y enrasar el nivel del agua con la marca del cuello. Tapar el picnómetro, secar exteriormente con las precauciones expuestas, dejar nuevamente 30 minutos en la caja de la balanza y después pesar.

Vaciar el picnómetro, enjuagar nuevamente, primero con agua y después con alcohol y éter, y secar como anteriormente, llenar con el vino a temperatura de 20 °C, aproximadamente, cuidando que no quede ninguna burbuja de aire (en caso de que el vino tenga carbónico, se eliminará previamente como luego se indica). Dejar el picnómetro con el vino en el termostato a 20 °C ± 0,2° durante 30 minutos, llenar hasta volumen con el vino y pesar.

4(a).4. Cálculo.

4(a).4.1 Cálculo de la densidad relativa a 20 °C.

P = peso en g del picnómetro vacío.

P' = peso en g del picnómetro más agua a 20 °C.

P" = peso en g del picnómetro más vino a 20 °C.

4(a).4.2 Cálculo de la masa volúmica ρ₂₀.

o bien

El valor de c se encuentra en las tablas 4(a),I y 4(a),II.

La aproximación de los resultados será de 0,0003. Para mayor precisión, se tendrá en cuenta el empuje del aire como en 5(a).5.

4(a).5 Observaciones.

Si el vino contiene cantidad sensible de gas carbónico, se eliminará todo lo posible agitando un volumen de unos 250 mililitros del vino, en matraz de 1.000 ml.

Si el vino está turbio, se filtrará por papel de filtración rápida, de pliegues y procurando airear lo menos posible, tapando también el embudo con vidrio de reloj.

Si el enturbiamiento es por suspensión de levadura, la filtración corriente aludida no lo aclarará, siendo conveniente en este caso, dejar decantar el vino en probeta tapada, durante dos o tres días en sitio fresco.

4(a).6 Referencia.

TABLA 4(a).I

Cálculo de la masa volúmica (ρ₂₀) a partir de la densidad relativa 20/20 y recíprocamente

Densidades	0,960	0,980	1,000	1,020	1,040	1,060	1,080	1,100
Correcciones c	1,73	1,76	1,80	1,84	1,87	1,91	1,94	1,98
Densidades	1,120	1,140	1,160	1,180	1,200	1,220	1,240	1,260
Correcciones c	2,02	2,05	2,09	2,12	2,16	2,20	2,23	2,27
Densidades		1,280	1,300	1,320	1,340	1,360	1,380	1,400
Correcciones c		2,30	2,34	2,38	2,41	2,45	2,48	2,52

TABLA 4(a).II

Cálculo de la masa volúmica (ρ₁₆) a partir de la densidad relativa 15/15 y recíprocamente

Densidades	0,960	0,980	1,000	1,020	1,040	1,060	1,080	1,100
Correcciones c	0,86	0,88	0,90	0,92	0,94	0,95	0,97	0,99
Densidades	1,120	1,140	1,160	1,180	1,200	1,220	1,240	1,280
Correcciones c	1,01	1,03	1,04	1,06	1,08	1,10	1,12	1,13
Densidades		1,280	1,300	1,320	1,340	1,360	1,380	1,400
Correcciones c		1,15	1,17	1,19	1,21	1,22	1,24	1,25

4(b). MASA VOLÚMICA Y DENSIDAD RELATIVA

(Método areométrico)

4(b).1 Principio.

Determinación de la masa volúmica a partir de la lectura del areómetro que flota introducido en el vino.

4(b).2 Material y aparatos.

4(b).2.1 Areómetro. Los areómetros empleados deben responder a las siguientes normas (I. S. O.):

Parte cilíndrica sumergible y tallo de sección circular de 3 mm de diámetro como mínimo. Para vinos secos, la graduación será de 0,983 a 1,003 en milésimas y 0,2 milésimas. Las divisiones de milésimas deben ser de 5 mm como mínimo. Para vinos desalcoholizados y vinos dulces, y eventualmente para mostos, se recomienda un juego de 5 areómetros graduados de 1,000-1,030; 1,030-1,060; 1,060-1,090; 1,090-1,120; 1,120-1,150. Estos aparatos estarán graduados en masas volúmicas a 20°, en milésimas y 0,5 milésimas por lo menos. Cada división de una milésima será de 3 mm como mínimo. En los aparatos se indicará que las lecturas deben hacerse por la parte superior del menisco.

4(b).2.2 Termómetro contrastado graduado por lo menos en 1/2 grados.

4(b).2.3 Probeta cilíndrica de 36 mm de diámetro interior y 320 mm de altura.

4(b).2.4 Plataforma con tornillos de nivelación, para mantener vertical la probeta sobre ella colocada.

4(b).3 Procedimiento.

Colocar en la probeta descrita 250 ml del vino e introducir el areómetro y el termómetro.

El areómetro y especialmente el tallo graduado deberán estar limpios y desengrasados.

Agitar para uniformar la temperatura. Un minuto después, hacer la lectura del termómetro. Retirar el termómetro y hacer la lectura de la masa aparente sobre el tallo del areómetro.

4(b).4 Cálculo.

Calcular la masa volúmica referida a 20 °C.

(‒ si t es inferior a 20 °C)

(+ si t es superior a 20 °C)

ρ₂₀ = masa volúmica referida a 20°.

ρ_t = lectura del tallo graduado del areómetro.

c = valor de la corrección correspondiente a la temperatura del vino en el momento de la lectura. Este valor se encuentra en las tablas 4(b).1 y 4(b),II.

t = temperatura del vino en el momento de la lectura. Los resultados se obtendrán con una precisión de 0,0003.

4(b).5 Observaciones.

Si se utilizan areómetros que den ó , hay que corregir la lectura en las tablas correspondientes, y después expresar los resultados en ó ρ₂₀, siguientes: