Orden de 31 de enero de 1977 por la que se establecen los Métodos Oficiales de Análisis de Aceites y Grasas, Cereales y Derivados, Productos Lácteos y Productos Derivados de la Uva

P' = peso en g del residuo.

P = peso en g de la muestra.

22(b).6 Observaciones.

En los certificados de análisis indicar: Método del éter de petróleo.

22(b).7 Referencias.

23. ÍNDICE DE ESCUALENO EN ACEITE DE OLIVA

23.1 Principio.

Se entiende por índice de escualeno el número de mg de este hidrocarburo contenido en 100 g de aceite.

Este método determina el índice de escualeno del aceite de oliva, o el de sus mezclas con otros aceites vegetales de composición análoga.

Los resultados obtenidos con otros aceites vegetales, con un contenido en insaponificable muy diferente al del aceite de oliva, se admitirán con reserva, no dando por segura la cifra obtenida sin asegurarse de que la separación cromatográfica de la fracción de hidrocarburos se ha verificado correctamente, comprobándose en todo caso la ausencia de esterinas, que garantiza en cierto modo la buena marcha de la operación.

23.2 Material y aparatos.

23.2.1 Matraz de saponificación, de fondo plano, de 100 ml, con refrigerante de reflujo, constituido por un tubo de 1 m de longitud.

23.2.2 Ampolla de extracción, de 500 ml de capacidad.

23.2.3 Aparato de destilación, con ajustes esmerilados y con matraz de 100 a 150 ml de capacidad.

23.2.4 Kitasato, de 250 ml.

23.2.5 Tubo de vidrio para la columna de absorción cromatográfica, con un diámetro interior de 13 mm y longitud aproximada de 400 mm. Deberá llevar en su extremo inferior un estrangulamiento o dispositivo para retener el algodón o lana de vidrio que soporta la alúmina; la parte superior irá provista de un tapón de corcho o vidrio con ajuste esmerilado, atravesado por un codo destinado a adaptar una pera de goma.

23.2.6 Embudo de vidrio de 4 cm de diámetro, aproximadamente.

23.2.7 Matraces erlenmeyer, con tapón esmerilado, de 150 ml, provistos de un codillo para destilación.

23.2.8 Buretas. Una de 25 ml, contrastada, graduada en décimas, y otra de 50 ml, graduada en décimas.

23.3 Reactivos.

23.3.1 Hidróxido potásico; reactivo para análisis.

23.3.2 Etanol de 96° exento de aldehídos

23.3.3 Éter de petróleo para análisis, p. e. 35° - 50 °C.

23.3.4 Disolución de fenolftaleína al 1 por 100 en etanol de 96°.

23.3.5 Disolución alcohólica de hidróxido potásico 0,5 N.

23.3.6 Sulfato sódico, anhidro.

23.3.7 Óxido de aluminio, para análisis cromatográficos.

23.3.8 Benceno, reactivo para análisis.

23.3.9 Cloroformo, reactivo para análisis.

23.3.10 Reactivo de Hanus. Se prepara como en 16(b).3.5.

23.3.11 Disolución de ioduro potásico al 10 por 100, exento de iodato.

23.3.12 Indicador engrudo de almidón.

23.3.13 Disolución de tiosulfato sódico 0,1 N.

23.4 Procedimiento.

23.4.1 Primera saponificación. Pesar 10 g de aceite en un matraz de 100 ml. Adicionar una disolución preparada disolviendo 3 g de hidróxido potásico en 40 ml de etanol de 96°. En general debe tomarse una cantidad de aceite que contenga de 30 a 40 mg de escualeno. Colocar el refrigerante y hervir durante una hora.

Verter la disolución de jabón, todavía caliente, en una ampolla de extracción de 500 ml; enjuagar el matraz con 100 ml de éter de petróleo e incorporarlos a la ampolla. Enfriar la ampolla y agitar fuertemente. Debe formarse una disolución homogénea. Agregar 40 ml de agua. Dejar reposar hasta la neta separación de las dos capas, aproximadamente dos horas.

Separar la capa alcohólica inferior. Pasar la capa etérea al matraz de destilación y destilar el éter.

23.4.2 Segunda saponificación. El residuo insaponificable obtenido hervirlo con 10 ml de potasa alcohólica 0,5 N, durante 20 a 30 minutos, bajo refrigerante de reflujo. Pasar la disolución alcohólica a la ampolla de extracción; agregar 50 ml de éter de petróleo y 10 ml de agua. Dejar reposar hasta separación de las dos capas; suele bastar con dos horas, aunque es más práctico dejar estar durante una noche. Separar la capa etérea y lavarla con alcohol de 50 por 100, adicionado de unas gotas de fenolftaleína, hasta eliminación total de álcali. Secar con sulfato sódico anhidro en la misma ampolla de extracción; suele bastar con 0,5 a 1 g.

Pasar la disolución de éter de petróleo por un filtro seco, recogiendo el filtrado en un matracito, tarado de 100 a 150 ml. Lavar la ampolla de extracción con 5 ml de éter de petróleo, que se hacen pasar por el mismo filtro. Lavar éste con dos porciones más, de 5 ml cada una, de éter de petróleo. Destilar el éter. Secar el residuo a 100 °C, y una vez seco, pesar Este residuo insaponificable contiene la totalidad de los hidrocarburos existentes, y una parte de las esterinas, además de otros compuestos solubles en el éter de petróleo.

23.4.3 Separación cromatográfica. Cargar el tubo de vidrio destinado a la columna de absorción con óxido de aluminio hasta una altura de 10 cm. El llenado puede hacerse en seco o en húmedo. Una vez cargada colocar un disco de papel de filtro encima de la alúmina, montándose el conjunto según se indica en 23.3.5 y 23.3.6. Agregar benceno por la parte superior de la columna, forzándolo a pasar con una ligera presión realizada con la pera de goma, hasta empapar la columna, bastando para ello unos 20 a 25 ml.

Absorbido el benceno por la alúmina, y restando sobre ésta una pequeña capa de disolvente, agregar el insaponificable disuelto en 10 ml de benceno. Lavar el matraz con 5 ml de benceno, e incorporarlo a la columna. Antes de que hayan desaparecido las últimas porciones de benceno, se agregan 55 ml de éste, y continúa el desarrollo, manteniendo la presión necesaria para que el eluyente fluya de la columna en la proporción de 2 ml por minuto aproximadamente.

Observar líquido recogido y columna bajo la luz de Wood. La disolución no deberá presentar fluorescencia marcada, como tampoco el líquido contenido en la parte inferior de la columna en una altura de 2 a 4 cm.

Pasar el líquido eluido a un matraz de 150 ml, previamente tarado. Destilar el benceno. Secar el residuo a 100 °C y pesar.

23.4.4 Valoración del escualeno. Disolver el residuo anterior en el mismo matraz con 5 ml de cloroformo; y adicionar 0,3 ml de reactivo Hanus por cada miligramo de sustancia pesada. Cerrar el matraz con el tapón de vidrio. Dejar en reposo en la oscuridad durante 15 minutos.

Añadir 5 ml de disolución de ioduro potásico al 10 por 100, y 50 ml de agua. Valorar el exceso de iodo con tiosulfato sódico 0,1 N, con engrudo de almidón como indicador.

23.4.5 Ensayo en blanco. Realizarlo en las mismas condiciones.

23.5 Cálculo.

N = normalidad del tiosulfato sódico.

V' = volumen en ml de tiosulfato sódico 0,1 N utilizados en el ensayo muestra.

V = volumen en ml de tiosulfato sódico 0,1 N utilizados en el ensayo blanco.

P = peso en g de la muestra de aceite.

23.6 Referencias.

24(a). DETERMINACIÓN DE LA FRACCIÓN DE ESTEROLES POR CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA

(Derogado).

24(b). DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ESTEROLES

24(b).1 Principio.

Los esteroles se determinan gravimétricamente, precipitándolos como digitónidos insolubles a partir de una solución alcohólica de la grasa saponificada, para liberar los esteroles combinados.

24(b).2 Material y aparatos.

24(b).2 (1, 2 y 3) Como 24(a).2 (1, 2 y 3).

24(b).2.4 Crisol de placa filtrante, G4.

24(b).3 Reactivos.

24(b).3.1 Disolución acuosa de hidróxido potásico, aproximadamente, al 40 por 100, p/v.

24(b).3.2 Disolución digitonina al 1 por 100, p/v. en etanol de 95 por 100 v/v.

24(b).3.3 Etanol de 95 por 100, v/v.

24(b).4 Procedimiento.

Si «s» es el tanto por ciento, p/p, previsible de esteroles en la muestra, pesar exactamente, con aproximación de 0,1 por 100, 5/s g, aproximadamente, de grasa.

Agregar 3/s ml de disolución acuosa de hidróxido potásico, y después 7/s ml de etanol de 95 por 100 v/v. Adaptar el refrigerante de reflujo, y calentar a ebullición suave, sobre baño de agua hirviente, agitando de vez en cuando, hasta saponificación completa (líquido homogéneo). Continuar calentando de 15 a 20 minutos. Agregar 60 ml de agua destilada y, aproximadamente, 180 ml de etanol de 95 por 100 v/v. Calentar y mantener a, aproximadamente, 50 °C.

Agregar de 25 a 30 ml de disolución etanólica de digitonina. Dejar enfriar y reposar durante algunas horas (preferiblemente durante una noche). Filtrar la masa cristalina a través de un crisol de placa filtrante G4 con vacío, y previamente tarado con una precisión de 1 mg. Lavar con agua destilada, después con etanol de 95 por 100 v/v, y por último con algunos ml de éter etílico. Secar en estufa a 103 °C (± 2 °C) y pesar a peso constante.

24(b).5 Cálculo.

P' = peso en g de la muestra.

P = peso en g del precipitado de digitónidos.

24(b).6 Referencias.

25. IMPUREZAS

25.1 Principio.

Se entiende por impurezas de una grasa el conjunto de sustancias insolubles en un disolvente volátil en las condiciones descritas, y que no hayan sido ya determinadas como «agua y materias volátiles».

Del peso total obtenido de impurezas habrá que deducir, eventualmente, el peso de algunas de ellas, que, según el convenio entre las partes o según la costumbre, no deban ser consideradas como tales.

Los jabones de cal se considerarán como impurezas, a menos que por acuerdo entre las partes se decida otra cosa. En este último caso no será considerado como impureza más que la cal que contenga, expresada en óxido de calcio.

Salvo indicaciones contrarias, los jabones alcalinos no serán considerados como impurezas más que por las bases que contengan, expresadas en óxidos.

25.2 Reactivos.

Para la determinación se podrá usar cualquiera de los disolventes citados posteriormente, condicionando su empleo a la naturaleza de la materia grasa tratada, y a la de las sustancias que deban ser consideradas como impurezas en relación con el destino o aplicación que deba darse a la grasa. Dicha elección podrá ser impuesta por razones o convenio entre las partes.

Las impurezas de las materias grasas comestibles y de las materias grasas brutas con destino comestible después de tratamiento adecuado se determinarán con éter de petróleo.

25.2.1 Éter de petróleo puro para análisis. En las condiciones del procedimiento descrito, el éter de petróleo deja insolubles: Impurezas mecánicas (tierra, arena y residuos diversos); parte de ácidos oxidados libres y sus productos de polimerización, lactonas-jabones de cal, hidratos de carbono, materias nitrogenadas, determinadas resinas, materias minerales, y no disuelve más que parcialmente los jabones alcalinos.

25.2.2 Éter técnico (C₂H₅)₂O, puro para análisis. En las condiciones del procedimiento descrito, el éter etílico deja insolubles: Las impurezas mecánicas (tierra, arena y residuos diversos), materias minerales, hidratos de carbono, materias nitrogenadas, ciertas resinas, jabones de cal y jabones alcalinos.

25.2.3 Sulfuro de carbono, S₂C, puro para análisis recién destilado. En las condiciones del procedimiento descrito, el sulfuro de carbono deja insolubles: Impurezas mecánicas (tierra, arena y residuos diversos), materias minerales, hidratos de carbono, materias nitrogenadas, ciertas resinas y jabones de cal. No disuelve más que parcialmente los jabones alcalinos.

25.3 Procedimiento.

Pesar exactamente, con una aproximación de 0,01 g, aproximadamente 20 g de materia grasa en un erlenmeyer, con tapón de vidrio esmerilado (la grasa solamente fundida, si es necesario) agregar 200 ml del disolvente elegido, tapar, agitar y dejar en reposo a, aproximadamente, 20 °C durante 30 minutos, si se trata de éter etílico o éter de petróleo, y 12 horas si se trata de sulfuro de carbono.

Filtrar sobre filtro sin cenizas, de 12 cm de diámetro, previamente secado y tarado, lavar el filtro con pequeñas porciones de disolvente, utilizando la cantidad estrictamente necesaria para que el filtrado esté exento de materia grasa, retirar el filtro del embudo, dejar evaporar el disolvente al aire libre, y terminar la evaporación en estufa a 103 °C (± 2 °C). Pesar el filtro.

25.4 Cálculo.

P" = peso en g del filtro seco.

P'= peso en g del filtro más impurezas.

P = peso en g de la muestra.

Indicar el disolvente utilizado y, eventualmente, los componentes que han sido deducidos de las impurezas.

25.5 Observaciones.

25.5.1 Si el filtrado contiene cenizas, eliminar el disolvente por destilación, incinerar el residuo, pesar y agregar esta pesada a las impurezas del filtro.

25.5.2 Para una determinación de gran exactitud deberá emplearse una cantidad de disolvente cincuenta veces superior al peso de grasa tomada.

25.5.3 En el caso de una materia grasa que contenga jabones, y en el caso de que estos jabones no deban ser considerados como impurezas, más que por las bases que contengan, separar el residuo insoluble del filtro y tratarlo a ebullición con refrigerante de reflujo, con ácido clorhídrico diluido (1:5), hasta que los jabones se hayan descompuesto totalmente. Extraer la materia grasa así liberada en una ampolla de decantación por medio del disolvente utilizado para la determinación de las impurezas. Después de pequeños lavados con agua, destinados a eliminar la acidez mineral, filtración y eliminación del disolvente, pesar los ácidos grasos, y deducir de las impurezas el tanto por ciento así obtenido.

25.6 Referencias.

26. CENIZAS

26.1 Principio.

Las cenizas representan el residuo mineral de las materias grasas, previamente filtradas.

Su tanto por ciento no debe añadirse al de las impurezas insolubles en un disolvente, para evitar que ciertos elementos sean considerados dos veces. Ahora bien, como continuación a la dosificación de las impurezas, se puede llegar a dosificar las cenizas sobre la materia grasa purificada después de la expulsión del disolvente. En tal caso, el tanto por ciento de cenizas se añade al de impurezas.

26.2 Material y aparatos.

26.2.1 Cápsula de incineración de, aproximadamente, 50 ml de capacidad.

26.3 Procedimiento.

Pesar exactamente, con una aproximación de 0,01 g, aproximadamente 10 g de materia grasa en la cápsula, previamente tarada.

Calentar prudentemente hasta el punto de inflamación y dejar arder a la sustancia espontáneamente, calcinar moderadamente hasta la obtención de un residuo que no emita más vapores, tomar el residuo con agua destilada, filtrar con la ayuda eventual de una ligera corriente de oxígeno o con algunas gotas de agua oxigenada, dejar enfriar la cápsula, verter cuantitativamente el filtrado anterior, evaporar a sequedad en baño de agua. Después calcinar, aproximadamente, a 400 °C y pesar.

Si fuera necesario se pueden recarbonatar las cenizas con carbonato amónico, o agua saturada de ácido carbónico.

26.4 Cálculo.

P' = peso en g de las cenizas.

P = peso en g de la muestra ensayada.

26.5 Referencia.

27. DETECCIÓN DE COMPUESTOS CLORADOS

27.1 Principio.

Este método determina cualitativamente la presencia de cloro procedente de solventes clorados u otros compuestos.

Es aplicable a los aceites vegetales normales.

27.2 Material y aparatos.

27.2.1 Alambre de cobre puro, de aproximadamente 1 mm de diámetro; bien pulido y acoplado a un soporte aislante del calor.

27.2.2 Mechero Bunsen, o quemador de gas equivalente

27.3 Procedimiento.

Calentar el alambre de cobre en la llama del Bunsen hasta que no sea visible color verde.

Mojar la parte calentada del alambre con la muestra de aceite y volver a introducir dicha parte en la llama; si ésta presenta un color verde definido, indica la presencia de cloro en la muestra.

27.4 Expresión de resultados.

Coloración verde, más o menos intensa: Positivo. Coloración no verde: Negativo.

27.5 Referencia.

28(a). RECONOCIMIENTO DE AZUFRE

(Ensayo del benzoato de plata)

28(a).1 Principio.

Este método determina cualitativamente la presencia de azufre.

Aplicable a la detección de azufre del sulfuro de carbono en la extracción del aceite de orujo de oliva.

28(a).2 Material y aparatos.

28(a).2.1 Tubos de ensayo de tamaño conveniente.

28(a).2.2 Baño de aceite, capaz de calentar la muestra a 150 °C en cinco minutos.

28(a).3 Reactivos.

28(a).3.1 Benzoato de plata: Mezclar cantidades equivalentes de nitrato de plata y benzoato sódico, filtrar, lavar el precipitado con varias porciones de agua destilada, secar en estufa a 60-70 °C. Preservarlo de la luz. Pulverizar el benzoato de plata seco, antes del uso,

28(a).4 Procedimiento.

Filtrar la muestra, tomar en dos tubos de ensayo 5 ml en cada uno, calentar en el baño de aceite, alcanzando 150 °C en, aproximadamente, cinco minutos, para evitar sobrecalentamientos

Retirar del baño uno de los tubos, agregarle aproximadamente 0,2 g de benzoato de plata y agitar inmediatamente. Observar el aspecto del tubo, comparándolo con el de ensayo en blanco. La aparición de un ennegrecimiento indica la presencia de azufre.

28(a).5 Referencia.

28(b). RECONOCIMIENTO DE AZUFRE

(Ensayo de la moneda)

28(b).1 Principio.

Este método determina cualitativamente la presencia de azufre.

Aplicable a la detección de azufre en el sulfuro de carbono empleado en la extracción del aceite de oliva.

28(b).2 Material y aparatos.

28(b).2.1 Tubo de ensayo o vaso de tamaño conveniente.

28(b).2.2 Varilla o bolas de vidrio para soportar la moneda.

28(b).2.3 Una moneda pulida, preferiblemente nueva.

28(b).2.4 Baño de aceite capaz de calentar la muestra a 210 °C en unos 30 minutos.

28(b).3 Procedimiento.

Colocar la moneda en un tubo de ensayo o vaso, soportada por bolas o trozos de varilla de vidrio. Agregar 20 ml de la muestra, que han de cubrir la moneda.

Colocar el tubo de ensayo o vaso en el baño de aceite, calentar de forma que la muestra alcance 210 °C en, aproximadamente, 30 minutos, mantener a esta temperatura durante 10 minutos más.

Enfriar y retirar la moneda, colocar sobre una superficie limpia y examinar cuidadosamente si presenta despulido o ennegrecimiento.

Si éste es evidente, la presencia de azufre es positiva.

28(b).4 Referencia.

1 American Oil Chemists' Society. Official and Tentative Methods. Ca. 8a. 35.

29. DETERMINACIÓN DE JABÓN EN ACEITE DE OLIVA

29.1 Principio.

Este método tiene por objeto el reconocimiento de jabones alcalinos, magnésicos o cálcicos, e identificación de los iones de estos últimos elementos en aceites de oliva que hayan sido total o parcialmente neutralizados con compuestos básicos de estos metales y sometidos a una decantación o centrifugación.

29.2 Material y aparatos.

29.2.1 Ampolla de decantación de 100 ml, con tapón esmerilado.

29.2.2 Probeta graduada, de 10 ml.

29.2.3 Embudo de filtración de 5 a 6 cm de diámetro.

29.2.4 Cápsulas de vidrio Pyrex o Jena, redondas o fondo plano, de 5 a 6 cm de diámetro.

29.2.5 Tubos de ensayo, de 100 mm de longitud y 10 mm de diámetro.

29.2.6 Cápsulas redondas de porcelana de 4 a 5 cm de diámetro.

29.2.7 Vidrios de reloj de 4 cm de diámetro.

29.2.8 Papel de filtro sin cenizas de 9 cm de diámetro.

29.3 Reactivos.

29.3.1 Ácido clorhídrico, reactivo para análisis, al 10 por 100.

29.3.2 Ácido nítrico, reactivo para análisis, 2 N.

29.3.3 Hidróxido sódico, reactivo para análisis, 2 N.

29.3.4 Nitrato de plata, reactivo para análisis, al 5 por 100.

29.3.5 Quinalizarina, reactivo para análisis, disolución saturada en etanol de 96°, recientemente preparada.

29.3.6 Sal sódica de la osazona del ácido dihidroxitartárico.

29.4 Procedimiento.

29.4.1 Extracción. Medir 10 ml de aceite con la probeta graduada y verterlos en la ampolla de decantación, previamente mojada con agua. Añadir 10 ml de disolución de ácido clorhídrico. Agitar durante 15 ó 20 segundos. Dejar reposar hasta separación de las dos capas, aproximadamente de 10 a 15 minutos.

29.4.2 Centrifugación. La capa acuosa decantada centrifugada entre 4.000 y 5.000 r.p.m. Si no se dispone de centrífuga, filtrar a través de papel de filtro, sin cenizas, previamente humedecido.

29.4.3 Ensayo general de jabones. Verter en cápsulas de vidrio 2 ml de la disolución filtrada o centrifugada. Evaporar a sequedad en bario de arena o de agua. Disolver el residuo con unas gotas de agua destilada y volver a evaporar. Repetir esta operación dos veces. Agregar el residuo de la tercera evaporación, una gota de ácido nítrico y 2 ml de agua destilada, calentar ligeramente hasta disolver el residuo, pasar a un tubo de ensayo, agregar tres gotas de disolución de nitrato de plata. Un precipitado coposo de cloruro de plata o una turbidez para pequeñas cantidades, revela la existencia de jabones en el aceite.

Realizar el ensayo en blanco, evaporando 2 ml de la disolución de ácido clorhídrico utilizada, o mejor todavía operando sobre un aceite virgen garantizado. El resultado se interpretará comparando la turbidez obtenida en el ensayo en blanco con la del problema. Ligeras diferencias no deben interpretarse positivamente.

29.4.4 Identificación del magnesio. Verter 15 gotas de la disolución filtrada en 29.4.2 en una cápsula de porcelana de fondo redondo, agregar dos gotas de disolución de quinalizarina, agitar mediante ligero movimiento de rotación, agregar, gota a gota, disolución de hidróxido sódico, agitando a cada adición con movimiento de rotación, hasta que se produzca un cambio de color y después tres o cuatro más. La existencia de magnesio origina un precipitado fino de color azul; la ausencia de magnesio se acusa por no producirse el color azul y quedar la solución de un color violeta azulado.

Paralelamente, realizar un ensayo en blanco con la disolución de ácido clorhídrico. Un resultado positivo obliga a preparar otra disolución de ácido clorhídrico y repetir la extracción de la muestra como en 29.4.1.

29.4.5 Identificación del calcio. Depositar 0,5 ml de la disolución filtrada 29.4.2 en una cápsula de vidrio, neutralizar lo más exactamente posible con la disolución de hidróxido sódico, utilizando papel de tornasol. Tomar dos gotas en un vidrio de reloj, agregar dos o tres granitos del reactivo sólido 29.3.6. El reactivo se difundirá a través de la gota, comunicando a ésta un color naranja amarillento. Si al cabo de diez o quince minutos la disolución permanece transparente, no existe calcio. Si la disolución se enturbia, formándose un precipitado amarillo, se acusa la presencia de calcio.

Realizar el ensayo en blanco con la disolución clorhídrica, repitiendo las operaciones de 29.4.5. Un resultado positivo obliga a preparar otra disolución de ácido clorhídrico y repetir las operaciones indicadas en 29.4.1.

29.5 Referencia.

30. RECONOCIMIENTO DE JABÓN EN ACEITE REFINADO

30.1 Principio.

Este método tiene por objeto identificar la presencia de jabón en aceites refinados.

30.2 Material y aparatos.

30.2.1 Tubos de ensayo de 150 x 15 mm.

30.3 Reactivos.

30.3.1 Disolución al 0,1 por 100 de azul de bromofenol en etanol de 96°.

30.3.2 Acetona, recientemente destilada, con un 2 por 100 de agua.

30.4 Procedimiento.

Los tubos de ensayo deben limpiarse escrupulosamente antes del uso. La acetona al 2 por 100 de agua con la adición de algunas gotas de la disolución de azul de bromofenol debe dar coloración del amarillo al amarillo-verdoso; si adquiere un matiz verdoso, repetir la operación.

Colocar en un tubo de ensayo 10 ml de acetona y una gota de disolución de azul de bromofenol; la disolución debe quedar amarilla. Agregar 10 g de aceite, cerrar con un tapón limpio, agitar y dejar decantar. La capa acetónica superior no debe presentar una coloración azul, ésta revelaría la presencia de jabón.

30.5 Expresión de los resultados.

30.5.1 Coloración amarilla: negativa. Coloración azul: positiva.

30.5.2 Observando por reflexión, color azul ultramar claro, y por transparencia, color azul violeta intenso; contenido de jabón superior al 0,001 por 100, expresado en hidróxido sódico.

30.5.3 Capa acetónica con coloración verde claro: contenido de jabón comprendido en 0,001 por 100 y 0,0001 por 100.

30.6 Observaciones.

Para que el ensayo tenga la sensibilidad indicada, el aceite debe tener una acidez libre inferior al 1 por 100 (expresada en ácido oleico).

30.7 Referencia.

31. ABSORCIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA ULTRAVIOLETA

31.1 Principio.

Este método se fundamenta en la medida espectrofotométrica ultravioleta del coeficiente de extinción a las longitudes de onda 232 y 270 mμ representados por K₂₃₂ y K_{2 7 0}, respectivamente.

Ambos coeficientes se emplean como criterio de calidad de los aceites.

31.2 Material y aparatos.

31.2.1 Espectrofotómetro ultravioleta. La escala de longitudes de onda permitirá medir entre 220 y 350 nm con precisión de 1 nm.

31.2.2 Cubeta prismática de cuarzo, de 1 cm de espesor o paso ópticamente transparente entre 220 y 350 nm. La transmisión a 220 nm será, como mínimo, de un 80 por 100. Las cubetas en uso tendrán, entre sí, una desviación no superior al 2 por 100 a 220 nm.

31.2.3 Matraces aforados con tapón de vidrio esmerilado de 10, 500 y 1.000 ml.

31.3 Reactivos.

31.3.1 Ciclohexano. Para espectrofotometría, cuyos valores minutos de transmisión serán: 40 por 100 a 220 nm y 95 por 100 a 250 nm.

31.3.2 Disolución de hidróxido potásico, para análisis, 0,05 N.

31.3.3 Disolución patrón de cromato potásico. Disolver 2.000 miligramos de cromato potásico, para análisis, en 1 litro de disolución de hidróxido potásico 0,05 N. Tomar 25 ml de esta solución en un matraz aforado de 500 ml, completando hasta el enrase con disolución de hidróxido potásico 0,05 N.

La densidad óptica de esta última disolución a 275 nm, medida en cubeta de 1 cm, tomando como referencia la disolución de hidróxido potásico 0,05 N, deberá ser de 0,200 ± 0,005.

31.4 Procedimiento.

Comprobar la escala de transmisión a absorbancia.

Si el aceite no está completamente limpio y transparente se filtra a la temperatura ambiente, a través de papel de filtro adecuado.

Pesar exactamente, en un matraz aforado de 10 ml, aproximadamente, las siguientes cantidades de muestra: 90 mg de aceite de oliva virgen, 60 mg de aceite refinado o su mezcla con vírgenes, 40 mg de aceite de orujo bruto o refinado, 40 miligramos de aceite de semilla; disolver en ciclohexano y completar hasta el enrase

En cubeta de 1 cm de paso, medir la extinción a 232 y 270 nm utilizando ciclohexano como patrón de comparación.

La lectura debe estar comprendida entre 0,2 y 0,8 de absorbancia; en caso contrario se repetirá la medida, bien diluyendo convenientemente o procediendo a una nueva pesada.

31.5 Cálculo.

λ = extinción específica a la longitud de onda λ.

A λ = absorción leída en el espectrofotómetro.

c = concentración de la disolución en g/100 ml.

e = espesor en cm de la cubeta.

31.6 Observación.

Los aceites de oliva vírgenes que sea necesario purificar para realizar esta determinación se someterán al siguiente tratamiento en columna de alúmina:

Preparar una columna rellenando con 30 g de alúmina activada, para cromatografía, de actividad I, según Brockman, un tubo de vidrio para cromatografía, cuya parte superior tenga 230 mm de longitud y 35 mm de diámetro interior, y la parte inferior sea de la misma longitud y 10 mm de diámetro interior. Esta parte inferior estará provista de un estrangulamiento o dispositivo para retener el algodón o lana de vidrio que actúa como retén o soporte del absorbente. La alúmina activada ocupará aproximadamente toda la parte inferior de la columna, y puede adicionarse seca o humedecida con el disolvente, que puede ser éter de petróleo ligero o ciclohexano para cromatografía.

Verter en la columna una disolución de 10 g de aceite, pesados con una aproximación de 0,01 g, en 100 ml de disolvente. Recoger la solución oleosa a la salida de la columna sobre un filtro Jena de placa filtrante, previamente secado en estufa a 105 °C, recogiendo el filtrado en un matraz pequeño. Destilar el disolvente en vacío, a temperatura inferior a 25 °C.

El aceite libre de disolvente se utiliza inmediatamente para determinar los coeficientes de extinción en el ultravioleta.

31.7 Referencias.

1 J. P. Wolf. Rev. Francaise Corps Gras, 1954. 1, 215.

2 Consejo Oleícola Internacional, 1957.

32(a). ÍNDICE DE BELLIER

32(a).1 Principio.

El índice de Bellier de un aceite es la temperatura a la que se produce la precipitación de las sales de los ácidos grasos de dicho aceite cuando está saponificado y disuelto con arreglo a las condiciones de este método.

32(a).2 Material y aparatos.

32(a).2.1 Tubos de ensayo de 26-27 mm de diámetro y 220 mm de longitud.

32(a).2.2 Refrigerante constituido por un tubo de vidrio de aproximadamente 800 mm de longitud con un tapón en el extremo.

32(a).2.3 Termómetro graduado de 0 °C a 50 °C, con divisiones de décimas de grado, adaptado a un tapón que sirve de cierre al tubo de ensayo.

32(a).2.4 Pipetas graduadas.

32(a).3 Reactivos.

32(a).3.1 Disolución hidro-alcohólica de hidróxido potásico. Disolver 42,5 g de KOH puro en 72 ml de agua destilada y llevar a 500 ml con etanol de 95°.

32(a).3.2 Disolución de alcohol etílico: título 70° (utilizar alcohol etílico puro indiferente a los hidróxidos alcalinos).

32(a).3.3 Disolución acuosa de ácido acético: 1 + 2 (en volúmenes); ajustada de manera tal que 1,5 ml neutralicen exactamente (indicador fenolftaleína), 5 ml de la disolución hidroalcohólica de hidróxido potásico.

32(a).4 Procedimiento.

Eliminar el agua del aceite por decantación y filtración sobre papel, efectuada a una temperatura ligeramente superior al punto de fusión de determinados componentes sólidos que hubieran podido separarse de la materia grasa fluida.

Colocar en un tubo de ensayo 1 ml de grasa y 5 ml de disolución de potasa. Cubrir con el refrigerante y calentar moderadamente agitándolo por rotación, de cuando en cuando, hasta completar saponificación, es decir, hasta obtener una disolución perfectamente límpida.

Dejar enfriar. Separar el refrigerante. Añadir 1,5 ml de la disolución de ácido acético y 50 ml de la disolución de alcohol de 70°. Colocar el termómetro y homogeneizar.

Poner el tubo en un vaso lleno de agua a una temperatura de 23-25 °C. En el caso de que se produzca un precipitado en forma de copos, dejar durante una hora a dicha temperatura y filtrar en un tubo de ensayo.

Introducir el termómetro en el tubo de ensayo que tiene la disolución transparente filtrada. Colocar unos instantes en un vaso de agua cuya temperatura sea inferior a 10 °C, aproximadamente, a la supuesta para el índice de Bellier.

Retirarlo y homogeneizar la temperatura, para lo cual se agita dicho tubo invirtiéndolo (la velocidad de enfriamiento debe ser aproximadamente 1 °C por minuto); repetir esta operación tantas veces como sea necesario hasta que aparezca turbidez. En ese momento anotar la temperatura.

Dejar que la temperatura de la disolución aumente algunos grados con el fin de disolver el precipitado. Homogeneizar invirtiendo el tubo y enfriar. El enfriamiento debe ser lento y las agitaciones más frecuentes a medida que la temperatura se aproxima a la apuntada en el ensayo anterior. La temperatura que servirá para fijar el índice de Bellier será la correspondiente a la reaparición de la turbidez.

32(a).5 Cálculo.

Índice de Bellier (ácido acético) = t °C

32(a).6 Observaciones.

Los resultados de dos determinaciones paralelas no deben variar en más de 0,25 °C.

32(a).7 Referencias.

32(b). ÍNDICE DE BELLIER

(Método ácido clorhídrico)

32(b).1 Principio.

Como 32(a).1.

32(b).2 Material y aparatos.

Como 32(a).2.

32(b).3 Reactivos.

32(b).3.1 Solución hidro-alcohólica de hidróxido potásico. Disolver 10 g de KOH en 100 ml de etanol.

32(b).3.2 Disolución de alcohol etílico; título 70° (utilizar etanol puro indiferente a los hidróxidos alcalinos).

32(b).3.3 Solución de ácido clorhídrico (d = 1,16). Diluir 83 ml de ácido clorhídrico concentrado (d = 1,19) a 100 ml de agua.

32(b).4 Procedimiento.

Como en 32(a).4, excepto que se saponificará con solución alcalina 32(b).3.1, y se emplearán 0,8 ml de disolución ácida 32(b).3.3, en lugar de los 1,5 ml de disolución de ácido acético.

32(b).5 Cálculo.

Índice de Bellier (método ácido clorhídrico) = t °C

32(b).6 Referencias.

33. RECONOCIMIENTO DE ACEITE DE ORUJO DE ACEITUNA

(Bellier-Marcille)

33.1 Principio.

Este método se emplea para detectar la presencia de aceite de orujo de aceituna en mezcla con aceites de oliva.

33.2 Material y aparatos.

33.2.1 Matraz de 100 ml provisto de refrigerante de reflujo, con cierres esmerilados.

33.2.2 Pipeta de 5 ml graduada en décimas de grado.

33.2.3 Pipeta de 5 ml.

33.2.4 Probeta de 50 ml.

33.2.5 Bloque de calefacción que permita mantener el matraz a unos 80 °C.

33.2.6 Termómetro de 0 °C a 60 °C, graduado en décimas.

33.3 Reactivos.

33.3 (1, 2 y 3). Como en 32.3 (1, 2 y 3).

33.4 Procedimiento.

Preparar la muestra como en 32.4.

Verter en el matraz 1 g aproximadamente de aceite. Agregar 5 ml de disolución alcohólica de hidróxido potásico. Ajustar el refrigerante y mantener a ebullición durante diez minutos, agitando de cuando en cuando, dejar enfriar hasta la temperatura ambiente, agregar 1,5 ml de disolución de ácido acético y 50 ml de etanol de 70°, calentando previamente a 50 °C. Mezclar mediante agitación, introducir el termómetro y dejar enfriar, observando el aspecto de la disolución cuando alcance la temperatura de 45 °C. Si se forma un precipitado floconoso a temperatura superior a 40r C, el ensayo es positivo.

Dejar enfriar a temperatura ambiente (no inferior a 18 °C) durante 12 horas, como mínimo. Observar de nuevo la disolución: La formación de un precipitado floconoso, flotando en el centro del líquido, indica que la reacción es positiva. Una turbidez no resuelta en copos no indica la presencia de aceite de orujo.

33.5 Expresión de los resultados.

Positivo o negativo.

33.6 Observación.

Excepcionalmente, puede suceder que algunos aceites de oliva vírgenes, de segunda presión, den un resultado positivo.

33.7 Referencias.

34. DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE LOS ÁCIDOS GRASOS SITUADOS EN LA POSICIÓN B DE LOS TRIGLICÉRIDOS

34.1 Principio.

El procedimiento se basa en someter la muestra de grasa neutra, previamente purificada mediante tratamiento con alúmina activada, a una hidrólisis bajo la acción de la lipasa pancreática, que actúa selectivamente sobre los radiales acilo situados en la posición α de los triglicéridos, con una acumulación de β-monoglicéridos inalterados.

Se separan estos β-monoglicéridos por cromatografía en capa fina de gel de sílice, efectuándose el análisis cualitativo y cuantitativo de los ácidos por cromatografía en fase gaseosa de sus ésteres metílicos.

Es aplicable a los aceites y grasas comestibles que se encuentran normalmente en el comercio tanto al estado bruto como refinados.

Es utilizable, con reserva, en grasas que contengan ácidos con funciones oxigenadas o de cadena no lineales, cuyo comportamiento ante la lipasa ha de ser previamente investigado.

34.2 Material y aparatos.

34.2.1 Tubo para cromatografía, el cual consta de dos partes: La parte superior tiene un diámetro interior de 35 mm, y la parte inferior, un diámetro interior de 10 mm. Cada una de estas partes tiene una longitud de 23 cm, lo que da al tubo cromatográfico una longitud total de 46 cm. La mitad inferior tiene, en su extremidad, una estrangulación o el dispositivo conveniente para retener el tapón de algodón o lana de vidrio que ha de servir de soporte al absorbente; o bien, una placa filtrante de vidrio de porosidad 2.

34.2.2 Filtro de vidrio Jena 11 G2 u otro equivalente.

34.2.3 Matraz redondo de fondo plano y boca esmerilada, de 100 ml de capacidad.

34.2.4 Ampolla de extracción de 500 ml.

34.2.5 Vasito de vidrio, cilíndrico de fondo plano y boca esmerilada, con las siguientes dimensiones aproximadas: 18 milímetros ∅; 60 mm de altura total, incluida la boca, constituida por un cono esmerilado, normalizado, con una altura de 10 milímetros; irá provisto de tapón de teflón, aunque puede sustituirse por tapón de vidrio.

34.2.6 Pipetas de 0,2-0,5-1 y 2 ml de capacidad.

34.2.7 Vibrador en el cual pueda agitarse fuertemente el vaso descrito en 34.2.5; debe dar, aproximadamente, unas 50 vibraciones por segundo.

34.2.8 Equipo de cromatografía en capa fina; placas de gel de sílice G de 20 x 20 cm y 0,25 mm de espesor y cubeta para el desarrollo de dichas placas.

34.2.9 Matraz de 50 ml de forma análoga a un matraz aforado con cuello de 10 mm ∅ exterior y boca esmerilada, cono normalizado 12/21.

34.2.10 Embudo de vidrio soplado.

34.2.11 Varilla de reflujo, provista de cono esmerilado macho 12/21.

34.2.12 Medidor de pH de lectura directa. En el caso de operar con indicador interno según se indica en 34.5.1, puede prescindirse de este aparato, aunque es preferible su utilización.

34.2.13 Termostato de agua que permita mantener una constancia de temperatura ± 0,5 °C.

34.2.14 Bureta de 5 ml con divisiones de 1/20 ml, y bureta de 25 ml graduada en décimas.

34.2.15 Vaso de 50 ml de capacidad.

34.2.16 Agitador pequeño de hélice.

34.2.17 Cronómetro.

34.3 Reactivos.

34.3.1 Alúmina activada, para cromatografía, actividad I según Brockman. Un tipo de alúmina que da muy buenos resultados es el «óxido de aluminio FLUKA para cromatografía», tipo 507C neutro.

34.3.2 Etanol de 96° exento de aldehídos.

34.3.3 Disolución de hidróxido sódico 2N. Disolver 100 g de hidróxido sódico en lentejas, calidad R. A., en agua destilada, recientemente hervida, completando el volumen hasta 1.000 mililitros.

34.3.4 Lipasa pancreática de cerdo, cuya actividad esté comprendida entre 0,8 y 2 unidades lipásicas por mg.

34.3.5 Disolución acuosa de Tris (hidroximetil) ‒amino-metano 1 M‒ ajustada a pH = 8 con ácido clorhídrico 6N.

34.3.6 Disolución acuosa de cloruro cálcico al 22 por 100.

34.3.7 Disolución acuosa de colato sódico al 0,1 por 100.

34.3.8 Ácido clorhídrico, aproximadamente 6 N.

34.3.9 Éter etílico.

34.3.10 Éter de petróleo, o hexano normal.

34.3.11 Mezcla de éter de petróleo-éter etílico, en la proporción de 2 a 1, a la cual se adiciona 1,6 por 100 de ácido fórmico (aproximadamente de 98 por 100).

34.3.12 Disolución de metilato sódico en metanol. Disolver sodio en metanol, con las precauciones habituales en la cuantía necesaria para obtener una concentración 0,2 M.

34.3.13 Disolución de ClH gaseoso en metanol aproximadamente al 4 por 100.

34.3.14 Disolución acuosa saturada de cloruro sódico.

34.3.15 Suspensión de goma arábiga al 10 por 100 en agua.

34.3.16 Disolución acuosa de colato sódico al 20 por 100.

34.3.17 Hidróxido sódico 0,1 N.

34.3.18 Disolución acuosa de rojo cresol al 1 por 100.

34.3.19 Aceite de oliva neutralizado.

34.3.20 Fenolftaleína al 1 por 100 en metanol.

34.3.21 Acetona o cloroformo, calidad para análisis.

34.4 Procedimiento.

Preparación de la lipasa pancreática: Aunque este producto puede adquirirse en el mercado, damos a continuación un método para su preparación: 5 kg de páncreas frescos de cerdo, se enfrían a 0 °C; se liberan de la grasa sólida y del tejido conjuntivo que los rodean, y se trituran en un molino de cuchillas hasta obtener una pasta fluida. Esta pasta se agita en frío, durante 4-6 horas, con 2,5 litros de acetona anhidra y después se centrifuga. El residuo se extrae otras tres veces con el mismo volumen de acetona, dos veces con una mezcla de acetona-éter etílico (1:1) y dos veces con éter etílico. El producto se seca durante 48 horas al vacío, obteniéndose un polvo estable que debe conservarse en refrigerador.

Valoración de la actividad lipolítica del polvo de lipasa: Se prepara una emulsión de aceite de oliva agitando, en un mezclador adecuado durante unos 10 minutos, una mezcla constituida por 165 ml de suspensión de goma arábiga al 10 por 100; 15 g de hielo picado en trozos finos; y 20 ml de aceite de oliva, previamente neutralizado.

Diez ml de la emulsión anterior se introducen en un vaso de 50 ml. Se añaden 0,3 ml de disolución de colato sódico al 20 por 100 y 20 ml de agua destilada.

Se coloca el vaso en el termostato, regulado a 37 °C, y se introducen los electrodos de un medidor de pH y un agitador de hélice (34.5.1).

Con la bureta de 5 ml se añade, gota a gota, disolución de hidróxido sódico 0,1 N hasta conseguir un pH de 8,5. Se añade un volumen conveniente de suspensión de polvo de lipasa en agua, según se indica en el párrafo siguiente y, tan pronto como el medidor de pH acuse un pH de 8,3, se pone en marcha el cronómetro y se va añadiendo la disolución de hidróxido sódico 0,1 N, al ritmo necesario para mantener constante el valor 8,3 de pH, anotando cada minuto el volumen de disolución alcalina consumida que acusa la bureta.

Los datos obtenidos se llevan a un sistema de ejes coordenados, marcando, en abscisas, los tiempos y, en ordenadas, los mililitros de disolución alcalina consumida para mantener el pH constante; debe obtenerse una gráfica lineal.

La suspensión de lipasa a que se alude en el párrafo anterior, se prepara al 0,1 por 100 en agua, tomando para cada ensayo la cantidad necesaria para que en 4 ó 5 minutos se consuma alrededor de 1 ml de disolución alcalina. Normalmente se consigue este resultado con 1 a 5 mg de polvo.

La unidad lipásica se define como la cantidad de enzima que libera 10/μ-equiv, de ácido por minuto. La actividad del polvo utilizado, medida en unidades lipásicas por mg, se calcula por la fórmula:

A = actividad en unidades lipásicas por mg

V = ml de disolución de hidróxido sódico 0,1 N, consumidos por minuto, calculados a partir de la gráfica.

P = peso tomado de polvo, expresado en mg.

La lipasa utilizada ha de tener una actividad comprendida entre 0,8 y 2 unidades lipásicas por miligramo.

Preparación de la muestra. Si la grasa tuviera una acidez libre igual o inferior a 3 por 100, se someterá directamente a la purificación en columna de alúmina, según se describe más adelante.

Si la grasa tuviese una acidez superior al 3 por 100 se someterá a una neutralización alcalina en hexano, según se describe más adelante, y la grasa neutra obtenida se purificará en columna de alúmina siguiendo el procedimiento descrito a continuación:

Purificación con alúmina: Se toman 15 g de alúmina activada y se disponen en el tubo cromatográfico (34.2.1), alojándose en la mitad inferior de diámetro más estrecho, pudiéndose efectuar el llenado en seco o en húmedo, utilizando para ello el disolvente que se disponga para el desarrollo, bien sea el éter de petróleo o el hexano. Una vez preparada la columna, se vierten 5 g de muestra, pesada con exactitud del centigramo y disuelta en 50 ml de éter de petróleo o hexano (34.5.2).

La disolución oleosa que pasa por la columna se filtra a través del filtro de vidrio (34.2.2) previamente desecado en estufa a 105 °C.

La disolución filtrada se recoge en un matracito redondo de unos 100 ml y se destila el disolvente al vacío, operando a una temperatura no superior a 30 °C. Para esta operación resulta muy ventajosa la utilización de un evaporador rotatorio (34.5.3).

El aceite obtenido, libre de disolvente, se utilizará para la hidrólisis por la lipasa pancreática, según se describe más adelante.

Neutralización con hidróxido sódico en hexano. En una ampolla de extracción de 500 ml se introducen unos 20 g de muestra, 100 ml de hexano, 50 ml de etanol, una gota de disolución alcohólica de fenolftaleína al 1 por 100, y el volumen de disolución de hidróxido sódico 2N, correspondiente a la acidez libre de la muestra, medido con pipeta o bureta graduada en décimas de milímetro (34.5.4).

Se agita la mezcla enérgicamente; se agregan 50 ml de agua destilada, se agita nuevamente y se deja en reposo hasta que la mezcla se separe en dos capas bien definidas.

Se extrae por la llave la capa hidroalcohólica inferior conteniendo los jabones.

La disolución de hexano conteniendo la grasa neutra se lava con porciones sucesivas de 25 ml de una mezcla de etanol de 96° y agua destilada 1:1 (v/v), hasta que el líquido de lavado no coloree en rosa a la fenolftaleína.

La disolución en hexano, libre de jabones, se deseca agregando 3-4 gramos de sulfato sódico anhidro; y se evapora el disolvente en evaporador rotatorio al vacío, o mediante una corriente de nitrógeno seco (pureza mínima 98 por 100). En todo caso, no debe calentarse por encima de 30 °C.

Hidrólisis por la lipasa pancreática. A 100 mg de la muestra de grasa, preparada como se ha indicado anteriormente (ver 34.5.5), pesados en el vasito descrito en 34.2.5, se añaden 20 miligramos de polvo de lipasa y 2 ml de la disolución 34.3.5. Se agita suavemente y se añaden 0,2 ml de disolución de cloruro cálcico al 22 por 100 y 0,5 ml de disolución de colato sódico al 0,1 por 100.

Se coloca el vasito, durante 1 minuto, en un baño a 40 °C. Se tapa y se agita fuertemente en el vibrador durante 2 minutos. Al cabo de este tiempo, se añade 1 ml de ácido clorhídrico 6N y 2 ml de éter etílico; se tapa y se agita con la mano. Se deja en reposo hasta que se separe la capa superior de éter etílico. Si se forma una emulsión, se rompe invirtiendo el tubo varias veces con suavidad.

Separación de los monoglicéridos por cromatografía en capa fina. Con ayuda de una jeringa adecuada, se coloca la mayor parte de la disolución etérea decantada en la parte inferior de una placa de gel de sílice de 20 x 20 cm, depositando las gotas de una forma regular en una línea horizontal situada a unos 15 mm del extremo inferior, dejando libre unos 10 mm en cada extremo. Una vez depositada la disolución, se introduce la placa en la cubeta, conteniendo el disolvente descrito en 34.3.11 en la cuantía necesaria para que la superficie quede unos 5 mm por debajo del producto depositado.

Cuando el frente del disolvente haya recorrido unos 15 centímetros, se saca la placa de la cubeta y se deja evaporar al aire el disolvente.

Observando la placa contra la luz de una ventana, se pueden ver perfectamente las bandas correspondientes a los productos formados en la liposis. La banda situada inmediatamente por encima de la posición original está constituida por los β-monoglicéridos. Con ayuda de una pequeña espátula, se raspa, recogiendo el polvo de sílice en un pequeño embudo de vástago ancho, colocado sobre el matraz de metilación (34.2.9).

Preparación de los ésteres metílicos Al matraz conteniendo la sílice raspada de la placa se agregan 10 ml de la disolución de metilato sódico (34.3.12), se coloca la varilla de reflujo, y se hierve durante 5 minutos.

Se añade una gota de fenolftaleína en metanol al 1 por 100 y, seguidamente, disolución de clorhídrico en metanol (34.3.15) gota a gota, hasta decoloración del indicador. Se hierve a re-flujo otros 5 minutos. Se deja enfriar añadiendo 1 ml de hexano o de éter de petróleo (34.3.10) y disolución acuosa saturada de cloruro sódico hasta que el hexano se sitúe en el cuello estrecho del matraz. Se agita fuertemente y se deja reposar. En pocos minutos se separa la disolución hexánica de los ésteres metílicos, que queda limpia y transparente en el cuello del matraz; pasándose, seguidamente, a inyectar esta disolución en el cromatógrafo para la determinación cualitativa y cuantitativa de los ácidos grasos.

Cromatografía en fase gaseosa de los ésteres metílicos. Los ésteres metílicos se determinan a continuación según el método número 41 ‒determinación de ácidos grasos por cromatografía en fase gaseosa‒ de los métodos oficiales de análisis de aceites y grasas.

34.5 Observaciones.

34.5.1 Si no se dispone de medidor de pH, puede utilizarse para su regulación en el medio reaccionante, el rojo cresol como indicador interno.

Para ello, al colocar el vaso en el termostato, según se indica en 34.4, se agregan 5 gotas de disolución acuosa al 1 por 100 del indicador (34.3.18) y se adiciona la disolución 0,1 N de hidróxido sódico, manteniendo una coloración rosa-violeta que corresponde, aproximadamente, a un pH de 8,3.

34.5.2 Con algunos aceites extraídos con disolventes, al efectuar la disolución en éter de petróleo o hexano puede formarse una turbidez que, si fuese muy intensa, podría perturbar el proceso cromatográfico de purificación. En estos casos, resulta aconsejable filtrar o centrifugar la disolución turbia, separando el sedimento y operando con la disolución transparente.

34.5.3 Si no se dispone de evaporador rotatorio, la eliminación del disolvente se puede realizar con análoga rapidez y eficacia, haciendo pasar por el interior del matraz una corriente de nitrógeno puro 98 por 100), calentando en baño de agua a temperatura que no exceda de 30 °C.

34.5.4 Teniendo en cuenta que se han tomado 20 g de muestra por cada 1 por 100 de acidez libre de oleico, se deberá adicionar 0,36 ml de la disolución de hidróxido sódico 2N. Si la fenolftaleína no acusase reacción alcalina, deberá adicionarse más disolución gota a gota, y agitando después de cada adición, hasta conseguir el viraje del indicador.

34.5.5 Con aceites comestibles de buena calidad aparente, y acidez reducida ≤3 por 100) en operaciones de rutina, se puede omitir el tratamiento previo de purificación con alúmina, ya que, en la inmensa mayoría de los casos, esta purificación no es necesaria. Sin embargo, como norma general, este tratamiento debe considerarse como necesario, y cualquier valor anormal obtenido efectuando una lipolisis directa no deberá ser aceptado sin confirmarlo previamente, con la grasa sometida al proceso de purificación.

34.6 Referencia.

35. RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE ORUJO DE ACEITUNA

(Prueba de Vizern)

35.1 Principio.

Este método tiene por objeto la identificación del aceite extraído por disolventes de los orujos grasos de aceituna.

Se aplica para determinar la pureza de los aceites de oliva vírgenes y refinados. En presencia de otros aceites, su aplicación e interpretación de resultados debe ser discrecional.

35.2 Material y aparatos.

35.2.(1, 2, 3 y 4) Como 22.2. (1, 2, 3 y 4).

35.2.5 Matraz erlenmeyer de 100 ml, con boca esmerilada, provisto de refrigerante de reflujo de aire, constituido por un tubo de 80 a 100 cm de longitud aproximadamente.

35.2.6 Tubo de ensayo de paredes gruesas, con dimensiones aproximadas de 160 mm de altura y 30 mm de diámetro interior.

35.2.7 Probeta de 10 ml.

35.3 Reactivos.

35.3.(1, 2, 3, 4, 5 y 6) Como 22.3. (1, 2, 3, 4, 5 y 6).

35.3.7 Alcohol etílico de 85 por 100 en volumen. Diluir 885 mililitros de etanol de 96° hasta 1.000 ml con agua destilada. La densidad será 0,8520. Comprobar con un alcohómetro.

35.4 Procedimiento.

Extraer el insaponificado de 5 g de aceite como en 22(a), empleando éter de petróleo.

La totalidad del insaponificable aislado recogido en el matraz de 100 ml se disuelve en 10 ml de etanol de 85°, en caliente con refrigerante de reflujo.

La disolución alcohólica se transvasa al tubo de ensayo 35.2.6 y se enjuaga el matraz con otros 10 ml de etanol de 85°, que se incorporan también al tubo de ensayo. Se homogeneiza la mezcla y se enfría a unos 25 °C; dejándolo en reposo durante una hora, a temperatura entre 20-25 °C. Observar al cabo de la hora.

La formación de un precipitado floconoso, que se deposita en el fondo del tubo, en forma de copos, acusa la presencia de aceite de orujo. Un precipitado más dividido o pulverulento, no resuelto en copos, no puede interpretarse como positivo, siendo muchos los aceites de oliva de presión que originan estos precipitados.

35.5 Expresión de los resultados.

Positivo o negativo.

35.6 Referencia.

36. TETRABROMUROS

(Prueba de Vizern-Guillot)

36.1 Principio.

Está fundamentada en la insolubilidad de los derivados tetrabromados de los ácidos grasos en éter de petróleo, en las condiciones especificadas en la prueba.

Se aplica al reconocimiento de aceites semisecantes en aceites de oliva.

La sensibilidad es del 5 por 100 para el aceite de soja y del 10 por 100 para los demás aceites.

36.2 Material y aparatos.

36.2.1 Tubo de vidrio con tapón esmerilado de aproximadamente 20 mm de diámetro y 180 mm de largo.

36.3 Reactivos.

36.3.1 Éter de petróleo (p. e. 40-70 °C) exento de productos reaccionables con los halógenos.

36.3.2 Bromo para análisis, exento de cloro.

36.3.3 Reactivo de bromación. Agregar gota a gota y agitando continuamente 4 ml de bromo a 100 ml de éter de petróleo, enfriado previamente a 0 °C. Conservar el reactivo en hielo fundente hasta el momento del ensayo.

36.4 Procedimiento.

Filtrar el aceite a ensayar que debe estar totalmente exento de humedad.

En el tubo de ensayo, desecado, introducir 1 ml de aceite seco y filtrado, disolverlo en 10 ml de éter de petróleo. Mantenerlo durante 5 minutos en hielo fundente, con el tubo cerrado. Agregar en pequeñas adiciones 10 ml de reactivo de bromación, agitar ligeramente y mantener el conjunto durante una hora en hielo fundente, al cabo de dicho tiempo el color de la disolución debe indicar la permanencia de exceso de bromo.

Observar el aspecto de la disolución. La presencia de aceite semisecante se acusa por la formación de un precipitado más o menos intenso, según la composición del aceite y su contenido en la mezcla, los aceites de oliva puros darán un ensayo limpio y transparente.

36.5 Expresión de los resultados.

Positivo o negativo.

36.6 Referencia.

37. MODIFICACIÓN SYNODINOS-KONSTAS

(Prueba de Hauchecorne)

37.1 Principio.

Se hace actuar el ácido nítrico concentrado sobre el aceite, el cual reacciona con productos de oxidación originados en las materias grasas parcialmente alteradas, hayan sido sometidas o no a un proceso de transformación industrial.

Es aplicable solamente a aceites de oliva «vírgenes» y refinados o a sus mezclas, pudiéndose obtener una coloración no satisfactoria en aceites no adulterados, cuya calidad deficiente o su conservación inadecuada sea responsable de la respuesta obtenida en el ensayo.

37.2 Material y aparatos.

37.2.1 Frascos de unos 50 ml de capacidad con tapón esmerilado

37.2.2 Probeta graduada con tapón esmerilado de 25 ml.

37.2.3 Embudo de 6 cm de diámetro.

37.2.4 Probeta graduada de 30 ml.

37.2.5 Papel de filtro corriente.

37.3 Reactivos.

37.3.1 Tierra decolorante para aceites de elevada actividad.

37.3.2 Ácido nítrico, para análisis, densidad 1,40.

37.4 Procedimiento.

Medir, con la probeta graduada, 30 ml de aceite de la muestra y verter en el frasco de 50 ml. Pesar 3 g de tierra decolorante y agregarlos al frasco, agitándose fuertemente durante 30 segundos.

El producto tratado con tierra se filtra, por filtro de pliegues, recogiéndose 10 ml en la probeta de tapón. Si se dispusiere de centrífuga, sería preferible centrifugar realizándose la operación en menos tiempo y con más eficacia.

Agregar, al aceite contenido en la probeta, 10 ml de ácido nítrico (d = 1,40) y agitar durante unos 30 segundos, dejándose reposar seguidamente y observándose el color desarrollado en la capa superior oleosa (ver 4.6).

37.5 Expresión de los resultados.

El aceite de oliva «virgen» de características normales y bien conservado, produce una coloración amarilla clara.

Los aceites de oliva refinados, procedentes de un «lampante» de buena calidad, suelen dar un color amarillo sucio que, frecuentemente, se acerca al amarillo tostado.

Los aceites de orujo refinados y, en general, los aceites de calidad deficiente, tanto «vírgenes» como refinados o las mezclas de ambos, dan una coloración marrón, obteniéndose una respuesta análoga con los aceites esterificados.

Los aceites de semillas refinados dan coloraciones muy diversas que no pueden considerarse como específicas para cada uno, pero que, sin embargo, un operador experto en la aplicación de la prueba los diferencia perfectamente de las coloraciones atribuibles a los aceites de oliva.

37.6 Observaciones.

37.6.1 El tiempo de desarrollo de estas coloraciones es muy variable. Generalmente se puede observar a los 2 ó 3 minutos de haberse separado la capa oleosa de la capa ácida, pero no se debe dar el dictamen definitivo hasta observar la coloración transcurridos unos 15 minutos de reposo.

37.7 Referencia.

1 Instituto de Racionalización del Trabajo. Una Norma Española 55.053.

38. RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE ALGODÓN

(Reacción de Halphen)

38.1 Principio.

Este método detecta cualitativamente el aceite de algodón en mezcla con otros aceites o grasas vegetales o animales.

Puede considerarse específica del aceite de algodón, excepto en presencia de aceites de Kapok y de grasas procedentes de animales que hayan sido alimentados con harina de semilla de algodón o alguna materia que contenga ácidos ciclopropenoides; en ambos casos habrá que realizar pruebas discriminatorias.

38.2 Material y aparatos.

38.2.1 Tubos de ensayo de dimensiones 250 x 25 mm aproximadamente.

38.2.2 Baño de agua caliente con temperatura regulable

38.2.3 Baño de aceite o bloque de calefacción adecuado para los tubos de ensayo que han de ser utilizados, regulables a una temperatura de 110-115 °C. En lugar de aceite puede emplearse una disolución acuosa saturada de cloruro sódico.

38.3 Reactivos.

38.3.1 Preparar una disolución de azufre en bisulfuro de carbono al 1 por 100 y añadir un volumen igual de alcohol amílico.

38.4 Procedimiento.

Tomar en un tubo de ensayo de 10 ml de aceite muestra y agregar un volumen igual de reactivo. Agitar y calentar en un baño de agua a 70-80 °C durante unos cuantos minutos, agitando de cuando en cuando, hasta que el bisulfuro de carbono comience a hervir y la muestra comience a desprender vapores.

Colocar el tubo en un baño regulado a 110-115 °C durante 1-2 horas. La presencia de aceite de algodón se acusa por el desarrollo de un color rojo más o menos intenso; los aceites refinados suelen dar color rosa. En el caso de débiles contenidos de aceite de algodón por bajo del límite de sensibilidad del ensayo, el líquido toma color amarillo.

38.5 Expresión de resultados.

Positiva o negativa.

38.6 Observaciones.

38.6.1 La estructura del ciclopropeno responsable del desarrollo del color se destruye por calefacción, y a 200 °C la destrucción es prácticamente completa. Por tanto, los aceites refinados suelen dar, a lo sumo, una reacción débil y frecuentemente dan resultado negativo. Del mismo modo, la hidrogenación y los tratamientos con ácidos u otros agentes químicos reducen la intensidad y pueden anularla por completo.

38.6.2 Diferentes lotes de aceite de algodón pueden reaccionar con intensidades diferentes. La intensidad del color no puede tomarse como índice del contenido en aceite de algodón.

38.7 Referencias.

39. RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE SEMILLA DE TÉ EN ACEITE DE OLIVA

(Reacción de Fitelson)

39.1 Principio.

Este método, es aplicable solamente a la identificación de aceite de semilla de té en mezcla con aceite de oliva.

39.2 Material y aparatos.

39.2.1 Tubos de ensayo con dimensiones aproximadas de 150 × 15 mm.

39.2.2 Pipeta de 1,5 ml, graduada en décimas.

39.2.3 Pipeta cuentagotas, con orificio de salida de, aproximadamente, 2 mm de diámetro, calibrado de tal forma que siete gotas de aceite pesen, aproximadamente, 0,22 g.

39.3 Reactivos.

39.3.1 Cloroformo, reactivo análisis.

39.3.2 Acido sulfúrico, reactivo análisis, d = 1,84.

39.3.3 Anhídrido acético, reactivo análisis.

39.3.4 Éter etílico anhidro, reactivo análisis.

39.4 Procedimiento.

Colocar en un tubo de ensayo, medidos con pipeta, 0,8 ml de anhídrido acético, 1,5 ml de cloroformo y 0,2 ml de ácido sulfúrico. Mezclar y enfriar en un baño de agua con hielo a °C.

Añadir con la pipeta cuentagotas 0,22 g de la muestra de aceite. Si aparece turbidez, añadir anhídrido acético, gota a gota, agitando después de cada adición hasta que desaparezca. Mantener a 5 °C durante 5 minutos.

Añadir 10 ml de éter etílico, previamente enfriado a 5 °C, tapar el tubo de ensayo con un corcho y mezclar inmediatamente invirtiendo el tubo dos veces. Colocar nuevamente el tubo en el baño de agua-hielo y observar el color.

El aceite de semilla de té puro da una coloración roja intensa, alcanza un máximo y seguidamente desaparece.

39.5 Expresión de resultados.

Positiva o negativa.

39.6 Observaciones.

39.6.1 Muchas muestras genuinas de aceite de oliva dan coloraciones rosa de una intensidad comparable a un contenido de aceite de semilla de té del 10 por 100 o más. Por consiguiente, coloraciones rosadas débiles en muestras presentadas como aceite de oliva puro no pueden ser atribuidas a la presencia de aceite de semilla de té.

39.6.2 Algunas muestras de aceite de oliva, especialmente de calidad refinable o tipos industriales muestran una coloración oscura que tiende a enmascarar el color rojo característico de la reacción. Para evitar este inconveniente, proceder como sigue: Saponificar una mezcla de 5 g de la muestra y 5 g de parafina líquida blanca, utilizando un exceso de hidróxido potásico en disolución alcohólica (aproximadamente 5 ml de hidróxido potásico al 50 por 100 diluido con 30 ml de alcohol etílico). Una ebullición mantenida durante 10-15 minutos es generalmente suficiente. Pasar la disolución del producto saponificado a una ampolla de decantación y añadir un volumen igual de agua destilada, mezclar y dejar que decante, separándose en dos capas. Separar la capa inferior constituida por la disolución jabonosa. Lavar la capa oleosa varias veces con agua destilada con el fin de eliminar los restos de jabón. Secar el producto una vez lavado, añadiendo sulfato sódico anhidro y dejar en reposo durante unos minutos. Filtrar y operar como se indica en 39.4.

39.6.3 Es aconsejable trabajar simultáneamente y en forma idéntica con muestras especialmente preparadas que sirvan como patrones de comparación.

39.7 Referencias.

40. RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE SÉSAMO

(Reacción de Pavolini)

40.1 Principio.

Este método tiene por objeto el reconocimiento del aceite de sésamo en mezcla con otros aceites y grasas comestibles.

Es aplicable aunque el aceite de sésamo se haya sometido a un proceso de refinación alcalina, o hidrogenación parcial para la preparación de «shortenings» o margarinas.

40.2 Material y aparatos.

40.2.1 Tubo de ensayo de 20 × 110 mm de diámetro interior y longitud, respectivamente, con tapón esmerilado y llave de salida de vidrio en su parte inferior. Debe llevar una marca indicando los volúmenes de 10 ml y 15 ml.

40.2.2 Soporte para mantener el tubo anterior en posición vertical.

40.2.3 Cápsula de porcelana, fondo plano, de unos 60 mm de diámetro.

40.3 Reactivos.

40.3.1 Acido sulfúrico concentrado (d = 1,84).

40.3.2 Disolución de 0,35 ml de furfurol, recientemente destilado, en un litro de anhídrido acético. Esta disolución debe guardarse en frascos oscuros, de tapón esmerilado, preferiblemente provistos de capuchón protector, también con ajuste esmerilado. Manteniendo en debidas condiciones el reactivo, se conserva largo tiempo. No es necesario que el anhídrido ascético sea rigurosamente anhidro, pudiéndose tolerar hasta un 5 por 100 de agua.

40.4 Procedimiento.

En el tubo graduado se vierten 10 ml de la muestra de aceite, y seguidamente 5 ml de reactivo 40.3.2. Agitar durante 1 minuto aproximadamente, colocar el tubo en el soporte y dejar reposar hasta que se separen las dos capas.

Verter de 1 a 2 ml de la capa inferior a la cápsula de porcelana. Agregar 5 ó 8 gotas de ácido sulfúrico concentrado y mezclar imprimiendo a la cápsula un suave movimiento de rotación.

Para cantidades de aceite de sésamo superiores al 1 por 100 se desarrolla inmediatamente una coloración azul de Prusia oscura, con ligero tinte verdoso. Para contenidos menores, el color azul va siendo más débil, aumentando al mismo tiempo el período requerido para el desarrollo completo del color. En mezcla con aceites de oliva y soja, el límite de detección es de 0,25 por 100, acusándose la presencia por la aparición de un color gris azulado, que tarda en desarrollarse de 5 a 10 minutos.

40.5 Expresión de resultados.

Positivo o negativo.

40.6 Referencias.