Orden de 31 de enero de 1977 por la que se establecen los Métodos Oficiales de Análisis de Aceites y Grasas, Cereales y Derivados, Productos Lácteos y Productos Derivados de la Uva

Colocar el termómetro suspendido con la mayor exactitud posible en el eje del tubo de ensayo y su extremidad inferior a 1 cm del fondo del tubo. Observar la columna de mercurio; en principio baja rápidamente y después cada vez más lentamente. Simultáneamente, se observa una cristalización de los ácidos grasos que parte del fondo del tubo y va recubriendo, poco a poco, la parte inferior del depósito del termómetro. Cuando la columna de mercurio parece pararse, después de cuatro observaciones, con cinco segundos de intervalo, inmediatamente se imprime al termómetro un movimiento circular, tres veces a la derecha y tres veces a la izquierda, teniendo cuidado de romper bien los cristales que se forman en el tubo.

Volver a colocar rápidamente el termómetro en el eje del tubo y observar de nuevo.

La columna de mercurio, después de haber bajado bruscamente durante la agitación, vuelve a subir, alcanzando un máximo, para descender de nuevo.

Este máximo se toma como punto de solidificación de los ácidos grasos o títulos.

Se realizan determinaciones hasta obtener valores concordantes, que no difieran en más de 0,2 °C.

14.4 Expresión de resultados.

En grados centígrados, indicando el método seguido.

14.5 Referencias.

15. ÍNDICE DE ÁCIDOS VOLÁTILES SOLUBLES E INSOLUBLES

15.1 Principio.

Se entiende por índice de ácidos volátiles solubles (o índice de Reichert-Meissl-Wollny) al número de ml de solución alcalina 0,1 N necesarios para la neutralización de los ácidos grasos volátiles solubles en agua obtenidos en las condiciones del método a partir de 5 g de grasa.

Se entiende por índice de ácidos volátiles insolubles (o índice de Polenske) al número de ml de solución alcalina 0,1 N necesarios para la neutralización de los ácidos grasos insolubles en agua, obtenidos en las condiciones del método, a partir de 5 g de materia rasa.

El método tiene carácter convencional; por tanto, exige observar rigurosamente las condiciones, prescritas, a fin de obtener resultados reproductibles.

15.2 Material y aparatos.

15.2.1 Aparato de vidrio, según la figura 15.1, compuesto esencialmente de las partes siguientes:

15.2.1.1 Matraz de fondo plano, de aproximadamente 300 mililitros (A).

15.2.1.2 Tubo de doble codo, adaptable a matraz y refrigerante (B).

15.2.1.3 Refrigerante (C).

15.2.1.4 Matraz de fondo plano, con tapón esmerilado, marcados en su cuello los enrases de 100 y 110 ml, tarado (D).

15.2.1.5 Placa de amianto o similar, para proteger la periferia del matraz del contacto directo de la llama (E). Dimensiones: Diámetro 120 mm (± 5 mm). Espesor, 6 mm. Orificio central circular de 45 mm de diámetro, que soporta el matraz durante el calentamiento.

15.2.2 Fuente de calor, que permite efectuar sin modificación de régimen la destilación en el tiempo prescrito.

15.3 Reactivos.

15.3.1 Glicerina (d = 1,26), correspondiente a 98 por 100, p/p, de glicerol neutro a la fenolftaleína.

15.3.2 Solución acuosa de hidróxido sódico, 44 por 100 p/p.

Eventualmente dejar calentar o filtrar al abrigo del CO₂. La solución empleada debe estar perfectamente limpia y clara.

15.3.3 Agua destilada, exenta de CO₂ por reciente ebullición.

15.3.4 Solución de ácido sulfúrico N.

15.3.5 Solución acuosa de hidróxido sódico o potásico, 0,1 N, de normalidad conocida exactamente.

15.3.6 Piedra pómez en granos. Tamaño de grano, entre 1,5 y 2 mm.

15.4 Procedimiento.

15.4.1 Ácidos volátiles solubles. Pesar exactamente en el matraz tarado 5 g de materia grasa a la 0,01 de gramo. Agregar 20 g (aproximadamente 16 mi) de glicerol. Agregar 2 ml de la solución de hidróxido sódico al 44 por 100 p/p, utilizando una bureta protegida contra el CO₂, descartando las primeras gotas. Calentar el matraz sobre una llama libre, agitando continuamente hasta que la grasa sea completamente saponificada, en este punto el líquido no formará más espuma, y su aspecto será limpio. Se evitará todo sobrecalentamiento durante la saponificación.

Dejar enfriar hasta aproximadamente 90 °C. Agregar 93 ml de agua destilada caliente. Homogeneizar por agitación; el líquido estará limpio. Agregar de 0,6 a 0,7 g de piedra pómez en granos, después 50 ml de la solución acuosa de ácido sulfúrico N. Montar el matraz en el aparato. Calentar muy moderadamente hasta que los ácidos grasos liberados se reúnan en la superficie, formando una capa limpia. Establecer el régimen de calefacción de forma que en 19 a 21 minutos se recojan 110 ml de destilado. El destilado se recoge en el matraz aforado. La temperatura del agua a la salida del refrigerante debe estar comprendida entre 15 °C y 20 °C. La destilación comienza cuando se forma la primera gota en la extremidad del tubo acodado unida al refrigerante.

Interrumpir la calefacción cuando el destilado alcance, exactamente, el enrase de 110 ml en el matraz. Retirar rápidamente éste y colocar una probeta pequeña en su lugar.

Colocar el matraz en un termostato regulado a 15 °C, durante 10 minutos; el enrase de 110 debe estar un centímetro por debajo del nivel del líquido termostático.

Cerrar el matraz con el tapón esmerilado y homogeneizar el destilado invirtiendo 4 ó 5 veces, con suavidad, para evitar la formación de espuma. Filtrar el líquido sobre filtro sin pliegues (diámetro 8 cm). El filtrado ha de ser totalmente limpio. Medir 100 ml. Agregar 5 gotas de solución de fenolftaleína y valorar con solución alcalina 0,1 N.

Simultáneamente realizar un ensayo en blanco sin materia grasa, sustituyendo la saponificación sobre llama libre, por un calentamiento en baño de agua hirviente durante 15 minutos.

15.4.2 Ácidos volátiles insolubles. Después de la valoración de los ácidos volátiles solubles, lavar el refrigerante, el matraz aforado y la probeta pequeña, tres veces sucesivas, empleando cada vez 15 ml de agua destilada, exenta de carbónico y fría (15 °C). Las tres porciones de 15 ml se emplean para lavar, a continuación, tres veces el filtro, llenando éste hasta el borde. El último lavado recogido aparte debe ser neutralizado por una gota de solución alcalina 0,1 N.

Lavar el refrigerante, matraz aforado, probeta y filtro, tres veces sucesivas, empleando en cada operación 15 ml de etanol neutralizado. Se reúnen los líquidos alcohólicos de lavado (unos 45 ml), y se valoran con solución alcalina 0,1 N, utilizando una gota de disolución alcohólica de fenolftaleína.

15.5 Cálculo.

Índice de ácidos volátiles solubles o de Reichert-Meissl.

Índice de ácidos volátiles insolubles, o índice Polenske.

V = volumen en ml de solución alcalina 0,1 N, utilizados para el ensayo con la materia grasa.

V' = volumen en ml de solución alcalina 0,1 N, utilizados para el ensayo en blanco.

V'' -= volumen en ml de solución alcalina 0,1 N, utilizados para valorar los líquidos alcohólicos de lavado.

P = peso en g de la muestra ensayada.

N = normalidad exacta de la solución alcalina 0,1 N.

15.6 Observaciones.

Si la cantidad de muestra de que se dispone no pemite pesar 5 g, se puede realizar el análisis con una cantidad menor, siempre que se mantenga por encima de 2,5 g. En estos casos se completarán los 5 g con un aceite que tenga índices de ácidos volátiles solubles e insolubles inferior a 0,5. Se efectuará en los cálculos las correspondientes correcciones.

15.7 Referencias.

18(a). ÍNDICE DE IODO

(Método de Wijs)

16(a).1 Principio.

El índice de iodo de un cuerpo graso es función de su grado de insaturación. Se determina añadiendo a la muestra un exceso de reactivo halogenado, valorando el reactivo que no reacciona.

Se expresa convencionalmente por el peso de iodo absorbido por cien partes en peso de la materia grasa.

16(a).2 Material y aparatos.

16(a).2.1 Navecillas de vidrio de 2 a 3 ml de capacidad.

16(a).2.2 Matraces erlenmeyer de vidrio, de boca ancha, con tapón esmerilado, de aproximadamente 300 ml.

Todo el material debe estar perfectamente limpio y seco.

16(a).3 Reactivos.

16(a).3.1 Solución acuosa de ioduro potásico al 10 por 100 p/v, Esta solución debe estar exenta de iodo y de iodato potásico.

16(a).3.2 Solución acuosa de tiosulfato sódico, 0,1 N,

16(a).3.3 Tetracloruro de carbono puro. Comprobar que está exento de materias oxidables. Agitando 10 ml con 1 ml de solución acuosa saturada de dicromato potásico y 2 ml de ácido sulfúrico concentrado, no debe aparecer coloración verde.

16(a).3.4 Engrudo de almidón.

16(a).3.5 Reactivo de Wijs.

16(a).3.5.1 Con tricloruro de iodo.

Pesar 9 g de tricloruro de iodo ICl₃ en un matraz de vidrio topacio de 1.500 ml; disolver en un litro de una mezcla compuesta de 700 ml de ácido acético y 300 ml de tetracloruro de carbono.

Determinar el contenido en halógeno de la forma siguiente: Tomar 5 ml y agregar 5 ml de la solución acuosa de ioduro potásico y 30 ml de agua. Valorar con solución de tiosulfato sódico, 0,1 N en presencia de engrudo de almidón como indicador.

Agregar al reactivo 10 g de iodo pulverizado, y disolver agitando.

Determinar el contenido en halógeno como anteriormente; debe ser igual a vez y media de la primera determinación. Agregar todavía una pequeña cantidad de iodo, de forma que sobrepase ligeramente el límite de vez y media, por ser necesario que no quede ninguna traza de tricloruro de iodo, cuya presencia provocaría reacciones secundarias.

Dejar decantar después de verter el líquido claro en un matraz o frasco de color topacio La solución, bien conservada al abrigo de la luz, puede ser utilizada durante varios meses.

16(a).3.5.2 Con monocloruro de iodo.

Disolver 19 g de monocloruro de iodo en 1 litro de una mezcla de 700 ml de ácido acético y 30 ºC ml de tetracloruro de carbono. Después de agregar una pequeña cantidad de iodo puro (algunos miligramos), determinar el contenido en halógeno, como se realizó anteriormente, y diluir si es necesario con la mezcla de disolventes hasta que 5 ml de reactivo correspondan aproximadamente a 10 ml de solución de tiosulfato sódico 0,1 N.

16(a).4 Procedimiento.

Según el índice de iodo previsto, la toma de muestra variará de la forma siguiente:

índice de iodo previsto	Toma de maestra g
< 5	3,00
5 a 20	1,00
21 a 50	0,60
51 a 100	0,30
101 a 150	0,20
151 a 200	0,15

En una pequeña navecilla de vidrio, pesar exactamente la cantidad necesaria con una aproximación de 1 mg. Introducir la navecilla y su contenido en un erlenmeyer con tapón esmerilado de aproximadamente 300 ml. Agregar 15 ml de tetracloruro de carbono y disolver. Agregar exactamente 25 ml del reactivo. Tapar el matraz, agitar ligeramente y protegerlo de la luz.

Dejar estar 1 hora para grasas cuyo índice sea inferior a 150 y 2 horas para las de índice superior a 150 y los aceites polimerizados u oxidados.

Agregar 20 ml de la solución de ioduro potásico y 150 ml de agua.

Valorar con solución de tiosulfato sódico 0,1 N, con engrudo de almidón como indicador, hasta desaparición justa del color azul después de agitación intensa.

Hacer un ensayo en blanco sin materia grasa en las mismas condiciones.

16(a).5 Cálculo.

P = peso en g de la muestra.

V = volumen en ml de la solución de tiosulfato sódico 0,1 N utilizados para el ensayo en blanco.

V' = volumen en ml de solución de tiosulfato sódico 0,1 N utilizados para la materia grasa.

N = normalidad de la solución de tiosulfato sódico utilizada.

16(a).6 Referencias.

16(b) ÍNDICE DE IODO

(Método de Hanus)

16(b).1 Principio.

Como 16(a).1.

16(b).2 Material y aparatos.

16(b).2.1 Frasco de boca ancha, de 200 a 220 ml de capacidad, con tapón esmerilado.

16(b).2.2 Buretas graduadas de 0,1 de ml, comprobadas y contrastadas.

16(b).2.3 Buretas o pipetas de 25 ml de salida rápida.

16(b).3 Reactivos.

16(b).3.1 Tetracloruro de carbono, inerte a la solución de Hanus.

16(b).3.2 Solución de ioduro potásico al 10 por 100, exenta de iodo y de iodatos.

16(b).3.3 Solución de tiosulfato sódico 0,1 N.

16(b).3.4 Engrudo de almidón.

16(b).3.5 Reactivo de Hanus: Disolver en un frasco de color amarillo, con tapón esmerilado, 10 g de monobromuro de iodo en 500 ml de ácido acético cristalizable (99-100 por 100), exento de etanol.

16(b).4 Procedimiento.

Trabajar en luz difusa.

En el frasco limpio y seco, pesar de 0,25 a 0,30 g de materia grasa limpia y filtrada sobre papel (tomar una cantidad de grasa tal que, una vez finalizada la reacción, deberá quedar sin absorber una cantidad de iodo igual, por lo menos, al 70 por 100 de la cantidad total de iodo añadida.

Disolver la materia grasa en 10 ml de tetracloruro de carbono. Añadir, mediante bureta o pipeta de salida rápida, 25 mililitros exactos del reactivo de Hanus.

Tapar el frasco, mezclar por agitación suave. Dejar reposar al abrigo de la luz durante una hora, a una temperatura de 20°± 5 °C.

Añadir 20 ml de solución de ioduro potásico, y 100 ml de agua destilada. Mezclar.

Valorar con la solución de tiosulfato sódico 0,1 N (utilizando engrudo de almidón como indicador), agitando constantemente. Añadir el engrudo de almidón poco antes de finalizar la valoración.

Realizar una prueba en blanco en idénticas condiciones.

16 (b).5 Cálculo.

V = volumen en ml de solución de tiosulfato sódico 0,1 N utilizados en la prueba en blanco.

V' = volumen en ml de solución de tiosulfato sódico 0,1 N utilizados en el ensayo con la muestra.

P = peso en g de la muestra utilizados en la determinación.

16 (b).6 Referencias.

17. ÍNDICE DE TIOCIANÓGENO

17.1 Principio.

El índice de tiocianógeno de una materia grasa es función de su grado de insaturación. En la práctica se determina por la fijación de tiocianógeno, y convencionalmente se expresa por el peso de iodo equivalente al tiocianógeno absorbido por 100 partes en peso de la grasa.

El tiocianógeno (SCN)₂ se fija sobre los dobles enlaces como los halógenos. Es menos reactivo que los halógenos y su fijación sólo es cuantitativa con el ácido oleico

Se considera que aproximadamente el (SCN)₂ se fija sobre un doble enlace del ácido linoleico y sobre dos dobles enlaces del ácido linolénico.

17.2 Material y aparatos.

17.2.1 Navecillas de vidrio de 2 a 3 ml.

17.2.2 Matraces de vidrio de boca esmerilada.

17.2.3 Embudo Büchner.

Todo el material debe estar perfectamente lavado y seco.

17.3 Reactivos.

17.3.1 Ácido acético glacial puro. Antes de su empleo calentarle a ebullición con refrigerante de reflujo, durante 3 horas, con 10 por 100 v/v de anhídrido acético. Destilar sobre anhídrido fosfórico.

17.3.2 Tiocianato de plomo. Disolver 250 g de acetato de plomo, químicamente puro (CH₃COO)₂ Pb, 3H₂O en 500 ml de agua destilada; disolver 250 g de tiocianato potásico en 500 mililitros de agua destilada, mezclar las dos soluciones, filtrar el tiocianato de plomo precipitado sobre embudo Büchner. Lavar con agua destilada, después con etanol de 95 por 100 v/v, y por último con óxido de etilo. Secar el precipitado tan completamente como sea posible, mediante aspiración por vacío; recoger el precipitado en una cápsula de porcelana, y colocar ésta en un desecador con anhídrido fosfórico, durante ocho o diez días. El tiocianato de plomo así obtenido debe presentar color débilmente amarillo blanquecino o verduzco. Si se presenta coloración más intensa, volver a someterle al mismo tratamiento. Guardando en frasco amarillo-pardo, al abrigo de la luz, puede conservarse hasta dos meses. Si se ha coloreado intensamente no utilizarlo.

17.3.3 Bromo puro, previamente desecado.

17.3.4 Tetracloruro de carbono; agitar dos veces el tetracloruro de carbono empleando cada vez el 5 por 100 v/v de ácido sulfúrico concentrado. Separar el tetracloruro de carbono. Lavar con agua destilada, después con 5 por 100 v/v de una solución acuosa de hidróxido potásico al 50 por 100 p/v. Agitar con hidróxido potásico en pastillas. Destilar sobre anhídrido fosfórico.

17.3.5 Ioduro potásico exento de iodo y iodato.

17.3.6 Solución acuosa de tiosulfato sódico 0,1 N de normalidad conocida.

17.3.7 Solución de tiocianógeno aproximadamente 0,2 N. Poner en suspensión 50 g de tiocianato de plomo en 500 ml de ácido acético. Disolver, por separado, 5,1 ml de bromo en 100 ml de ácido acético. Verter por pequeñas porciones la solución de bromo en la solución de tiocianato de plomo, agitando vigorosamente después de cada adición hasta decoloración completa. Dejar decantar. Filtrar tan rápidamente como sea posible por embudo Büchner, previamente secado, recogiendo el filtrado en un matraz seco.

Colocar el embudo Büchner sobre un segundo matraz y filtrar de nuevo; el filtrado debe ser limpio e incoloro. Conservarle en un frasco de vidrio de color amarillo o pardo, de tapón esmerilado, perfectamente seco, y en lugar fresco (temperatura inferior a 20 °C). De no observar estas condiciones se altera rápidamente. Antes de su utilización, comprobar que permanece incoloro.

17.4 Procedimiento.

Pesar con una precisión de 1 mg, en una navecilla de vidrio, la cantidad necesaria de materia grasa, según las indicaciones de la tabla siguiente (la cantidad de solución de tiocianógeno será de un 150 por 100 en exceso):

Índice previsto	Peso de la muestra g	Reactivo ml
0 a 30	≅ 0,50	25
30 a 50	≅ 0,30	25
50 a 100	≅ 0,25	25
100 a 150	≅ 0,20	50
Superior a 150	≅ 0,15	50

Introducir la navecilla y su contenido en un matraz de boca esmerilada. Agregar 10 ml de tetracloruro de carbono. Disolver. Agregar 25 ó 50 ml exactamente medidos de la solución de tiocianógeno. Tapar el matraz. Mezclar por agitación. Dejar en la oscuridad durante 24 horas, a una temperatura de aproximadamente 20 °C.

Agregar 2 g de ioduro potásico pulverizado. Agitar durante 3 minutos. Agregar 30 ml de agua destilada. Valorar en presencia de engrudo de almidón, con la solución de tiosulfato sódico 0,1 N, hasta desaparición del color azul después de enérgica agitación.

Realizar un ensayo en blanco, sin materia grasa, en las mismas condiciones.

La solución de tiocianógeno debe valorarse antes de iniciar los ensayos. Si la diferencia entre esta valoración y la del ensayo en blanco es superior 0,2 ml, significa que la solución se descompone muy rápidamente; repetir las operaciones con otra solución más correcta.

Los ensayos sobre materia grasa y en blanco se realizarán al menos por duplicado. Si entre ambos ensayos, sobre materia grasa y en blanco, se obtienen diferencias superiores a 2 unidades del índice de tiocianógeno, repetir la determinación.

17.5 Cálculo.

V = volumen en ml de solución de tiosulfato sódico 0,1 N utilizados en el ensayo en blanco.

V' = volumen en ml de solución de tiosulfato sódico 0,1 N utilizados en un ensayo con materia grasa.

P = peso en g de la muestra ensayada.

N = normalidad exacta de la solución de tiosulfato sódico 0,1 N.

17.6 Referencias.

18. ÍNDICE DE POLIBROMUROS

18.1 Principio.

El índice de polibromuros de una sustancia grasa es el peso en g de polibromuros obtenidos, en las condiciones descritas a partir de 100 g de grasa.

El método tiene carácter convencional, por lo que sus prescripciones han de ser observadas rigurosamente.

18.2 Material y aparatos.

18.2.1 Matraz de saponificación, de unos 200 ml, con boca esmerilada adaptable a un tubo refrigerante de reflujo de aproximadamente 1 m de largo.

18.2.2 Matraz aforado de 100 ml.

18.2.3 Matraz erlenmeyer de unos 100 ml de capacidad.

18.2.4 Ampollas de decantación de 500 ml.

18.2.5 Crisol con placa filtrante G3, con dispositivo para refrigerar y kitasato para recoger el filtrado.

18.3 Reactivos.

18.3.1 Disolución alcohólica de hidróxido potásico 1 N.

18.3.2 Disolución de ácido clorhídrico 1 N.

18.3.3 Disolución acuosa de anaranjado de metilo al 0,1 por 100.

18.3.4 Éter etílico, seco.

18.3.5 Solución acuosa al 10 por 100 de cloruro sódico.

18.3.6 Sulfato sódico anhidro.

18.3.7 Disolución de bromo. Agregar 4 ml de bromo puro y seco, enfriados a 0 °C, a 100 ml de éter etílico seco, previamente enfriados a la misma temperatura. Realizar la adición de bromo por pequeñas porciones, dejándolas resbalar por las paredes del recipiente y agitando en cada adición. Mantener a 0° hasta el momento de su utilización.

18.4 Procedimiento.

18.4.1 Preparación de los ácidos grasos. Pesar con precisión de 10 mg, 5 g de grasa en el matraz de saponificación. Agregar 25 ml de potasa alcohólica 1 N. Acoplar el refrigerante y calentar a ebullición, con una pequeña llama, durante 30 minutos.

Al principio de la calefacción agitar el matraz por rotación suave, para homogeneizar su contenido, a fin de evitar el sobrecalentamiento de la grasa. Terminada la saponificación, separar el refrigerante. Agregar 50 ml de agua destilada y pasar el contenido del matraz a la ampolla de decantación, utilizando en varias veces, 80 ml de agua en total. Agregar 50 ml de éter etílico y ligero exceso de ácido clorhídrico 1 N, calculado mediante la adición de dos gotas de anaranjado de metilo. Agitar fuertemente la ampolla para disolver totalmente los ácidos grasos liberados. Dejar reposar hasta que se separen netamente las dos capas. Pasar la disolución hidroalcohólica a otra ampolla de decantación y extraer nuevamente con otros 50 ml de éter etílico, repitiendo la operación anterior. Reunir los dos extractos etéreos en una misma ampolla y lavar tres veces, con 50 ml cada una, con la disolución de cloruro sódico. En los tres lavados se obtendrá una buena decantación, por adecuada separación de las dos capas.

Pasar la disolución etérea a un matraz aforado de 100 ml y completar hasta el enrase con éter etílico. Añadir una pequeña cantidad de sulfato sódico anhidro (de 1 a 2 g) para asegurar la deshidratación. Tapar el matraz y agitar para homogeneizar.

En el caso de que la bromación no vaya a realizarse inmediatamente, llenar el matraz con CO₂ o con N₂, tapar y conservar en lugar oscuro.

18.4.2 Bromuración. Pesar el matraz erlenmeyer de 100 mililitros, previamente secado en estufa y enfriado en desecador. Agregar una cantidad de polibromuros del orden de 0,1 g, obtenidos a partir del mismo aceite u otro de naturaleza análoga; pesar nuevamente el matraz. Los polibromuros han de estar perfectamente divididos.

Agregar al matraz 20 ml, exactamente medidos con pipeta, de la disolución etérea de los ácidos grasos. Agitar para asegurar la disolución de los polibromuros. Tapar el matraz e introducirlo en hielo fundente durante 15 minutos, agitando de cuando en cuando, para saturar el líquido de polibromuros.

Añadir 20 ml de la disolución de bromo, poco a poco y resbalando por la pared, agitar en cada adición, cuidando de que la temperatura no exceda nunca de + 2 °C. Una vez que se han agregado los dos tercios del reactivo, se puede añadir el resto más rápidamente, utilizando las últimas porciones para limpiar las paredes del matraz. Tapar y dejar en hielo fundente durante 3 horas,

Realizar un ensayo en blanco, en las mismas condiciones.

18.4.3 Filtración y lavados. Al cabo de las 3 horas, filtrar la disolución de los ácidos grasos por el crisol de placa filtrante, previamente desecado en estufa a 105°, enfriado en desecador y tarado. El crisol estará rodeado de hielo fundente; facilitar 1 filtración mediante un débil vacío, que será eliminado antes de que se consuma el líquido sobre la placa filtrante.

Lavar cuatro veces la torta de polibromuros con disolución de polibromuros en éter etílico (0,06 g en 100 ml), enfriada a 0 °C. En los dos primeros lavados utilizar 20 ml cada vez, y en los dos últimos, 10 ml cada vez. Adicionar estos volúmenes de éter sucesivamente al matraz donde se ha efectuado la precipitación, cuidando de lavar bien las paredes y agitando enérgicamente para desprender las partículas adheridas. Después de efectuar estas operaciones conviene introducir el matraz en hielo fundente, y no verter el éter en el crisol hasta asegurarse de haberlo enfriado a 0 °C. Cuando se opera con aceite de índice de polibromuros bajo pueden reducirse los lavados a tres solamente, utilizando en cada uno un volumen de 10 ml.

18.4.4 Desecación y pesada. Colocar en estufa los crisoles y erlenmeyer que se han utilizado en la precipitación; elevar progresivamente la temperatura hasta alcanzar de 95° a 100 °C. Dejar 30 minutos a esta temperatura; enfriar en desecador y pesar.

18.5 Cálculo.

P' = aumento de peso en g del conjunto matraz y crisol, empleados en el ensayo de la muestra.

P" = pérdida de peso en g del conjunto crisol y matraz, empleados en el ensayo en blanco.

P = peso en g de la muestra.

18.6 Referencia.

19. ÍNDICE DE DIENOS

19.1 Principio.

El índice de dienos representa la cantidad de iodo expresada en g equivalente al anhídrido maleico, fijado por los dobles enlaces presentes en 100 g de grasa.

19.2 Material y aparatos.

19.2.1 Matraz de 250 ml de boca esmerilada y refrigerante de reflujo.

19.2.2 Baño de aceite o manta eléctrica.

19.2.3 Pipeta de 25 ml.

19.2.4 Embudo de separación de 250 ml.

19.2.5 Matraz de 300 ml.

19.3 Reactivos.

19.3.1 Solución al 6 por 100 de anhídrido maleico (p.f. 52-54 °C), en toluol puro; dejar en reposo 24 horas. Filtrar con papel de filtrado rápido antes de su uso.

19.3.2 Disolución de hidróxido sódico N.

19.3.3 Éter etílico.

19.4 Procedimiento.

Filtrar la grasa a través de un filtro seco.

Pesar con precisión de 1 mg aproximadamente 3 g de materia grasa en el matraz de 250 ml, agregar 25 ml de solución de anhídrido maleico, hervir moderadamente a reflujo durante 3 horas, dejar enfriar unos minutos, agregar a través del refrigerante 5 ml de agua destilada, y volver a hervir durante 15 minutos. Dejar enfriar a la temperatura ambiente, agregar a través del refrigerante 5 ml de éter etílico, y después 20 ml de agua destilada. Quitar el refrigerante y pasar el contenido del matraz al embudo de separación. Lavar el matraz tres veces, con 7 ml de éter etílico cada vez, y después otras tres veces, con 8 ml de agua destilada cada vez, incorporando todos los lavados al embudo de separación. Agitar y dejar reposar hasta la separación de las dos capas. Pasar la capa acuosa al matraz erlenmeyer de 300 ml. Repetir la extracción del extracto etéreo contenido en el embudo de separación, con 25 ml y después con 10 ml de agua destilada, incorporar la capa acuosa al matraz de 300 ml.

Valorar todos los extractos acuosos reunidos con disolución de hidróxido sódico N, usando fenolftaleína como indicador. Realizar simultáneamente un ensayo en blanco.

19.5 Cálculo.

V = volumen en ml de NaOH empleados en el ensayo en blanco.

V' = volumen en ml de NaOH empleados en el ensayo de la grasa.

N = normalidad en la solución de hidróxido sódico.

P = peso en g de la materia grasa.

19.6 Observaciones.

Es conveniente que el agua empleada sea destilada, recientemente hervida y enfriada.

19.7 Referencias.

20. ÁCIDOS OXIDADOS

20.1 Principio.

Este método determina los ácidos oxidados contenidos en las grasas, expresados en materia grasa insoluble en éter de petróleo.

Teniendo carácter empírico, exige observar estrictamente las condiciones prescritas.

20.2 Material y aparatos.

20.2.1 Matraz de 150 ml, adaptable a refrigerante de reflujo.

20.2.2 Ampollas de decantación de 500 ml.

20.2.3 Estufa estabilizada a 103 °C (± 2 ºC).

20.2.4 Crisol de porcelana de 45 mm de altura y 40 mm de diámetro.

20.3 Reactivos.

20.3.1 Solución atanólica de hidróxido potásico, aproximadamente 2 N. Disolver 112 g de potasa en 500 ml de etanol de 96°, y una vez fría la solución, enrasar a 1.000 ml con etanol de 96°.

20.3.2 Éter de petróleo (p. e. 40°- 60 °C) bidestilado, exento de residuo.

20.3.3 Solución de ácido clorhídrico N.

20.3.4 Éter etílico (C₂H₅)₂O, d = 0,712 - 0,714.

20.3.5 Etanol, 95° exento de acidez.

20.4 Procedimiento.

Tratar 5 g de grasa pesados con una aproximación de 10 miligramos como en 22(b).4, hasta agotamiento de la disolución hidroalcohólica de jabón por el éter y los dos primeros lavados.

Colocar la disolución hidroalcohólica y el agua procedente de los dos primeros lavados del éter en una cápsula de 500 mililitros. Hervir hasta que queden eliminadas las trazas de éter disuelto y el alcohol en su totalidad.

Trasvasar el contenido de la cápsula a una ampolla de decantación de 500 ml, lavando la cápsula con pequeñas cantidades de agua, procurando que el volumen total del líquido en la ampolla sea de 150 ml aproximadamente.

Añadir solución de ácido clorhídrico N en ligero exceso (51 ml aproximadamente). Agitar 2 minutos. Después de agitado no ha de quedar espuma; en caso contrario se añade un poco más de ácido.

Agregar a la ampolla 100 ml de éter de petróleo. Agitar 1 minuto. Dejar reposar 12 horas. Decantar el agua ácida. Filtrar la solución de éter sobre un filtro lento de 90 mm de diámetro.

Los ácidos oxidados se adhieren generalmente a las paredes del tubo y aparecen en forma de una masa roja oscura.

Si los ácidos oxidados son abundantes, hacer salir el éter de petróleo por la parte superior de la ampolla, para evitar que los ácidos obturen la llave de salida. Lavar dos veces la ampolla de decantación con 25 ml de éter de petróleo y filtrar. Lavar también con éter de petróleo el tubo de vaciado de la ampolla y el embudo, el filtrado y el pico del embudo con porciones de 10, 10 y 5 ml respectivamente. Seguidamente desecar el exterior del pico del embudo y el del tubo de vaciado del embudo de decantación.

Disolver en etanol de 95° por 100 v/v caliente, los ácidos oxidados contenidos en la ampolla: Una vez con 25 ml de etanol caliente, y otra con 50 ml de etanol caliente. Pasar sucesivamente cada porción caliente por el filtro. Lavar el tubo de vaciado de la ampolla, el filtro y el cono del embudo con porciones respectivas de 5 ml de etanol caliente, recoger las soluciones alcohólicas en un vaso de 400 ml.

Evaporar el etanol hasta un volumen muy pequeño (algunos ml).

Transvasar cuantitativamente el residuo a un crisol de porcelana tarado, utilizando pequeñas porciones de éter etílico (así se evitan las dificultades presentadas por la evaporación del alcohol, teniendo este disolvente tendencia a subir por las paredes del crisol).

Comenzar la evaporación al aire libre. Terminarla en baño de agua hirviente, hasta la desaparición de los olores de éter y alcohol y la aparición de un olor acre.

Colocar el crisol en estufa a 103 °C (± 2 ºC), durante media hora. Pasar a desecador con ácido sulfúrico durante 15 minutos y pesar. Repetir sucesivamente estas operaciones hasta pesada constante con una precisión de 1 mg. La última pesada representa el peso de los ácidos oxidados más el de las sales minerales arrastradas con los ácidos oxidados.

Calcinar el residuo, dejar enfriar el crisol y pesar.

20.5 Cálculo.

P' = peso en g de los ácidos oxidados, más las sales minerales.

P" = peso en g de las sales minerales.

P = peso en g de la muestra tomada para análisis.

20.6 Referencias.

21. ÍNDICE DE PERÓXIDOS

21.1 Principio.

Se denomina «índice de peróxidos» a los miliequivalentes de oxígeno activo contenidos en un kilogramo de la materia ensayada, calculados a partir del yodo liberado del yoduro potásico, operando en las condiciones que se indican en la metódica.

Las sustancias que oxidan el yoduro potásico en las condiciones descritas se supone son peróxidos u otros productos similares de oxidación de la grasa, por lo que el índice obtenido puede tomarse, en una primera aproximación, como una expresión cuantitativa de los peróxidos de la grasa.

21.2 Material y aparatos.

21.2.1 Navecillas de vidrio de aproximadamente 3 ml para pesada de la grasa.

21.2.2 Matraces con tapón esmerilado, de aproximadamente 250 ml, previamente secados y llenos de gas inerte (anhídrido carbónico o nitrógeno).

21.3 Reactivos.

21.3.1 Cloroformo, para análisis, exento de oxígeno por barboteo de una corriente de gas inerte puro y seco.

21.3.2 Ácido acético glacial puro exento de oxígeno como en 2.3.1.

21.3.3 Solución acuosa saturada de yoduro potásico, exento de yodo y yodatos.

21.3.4 Soluciones acuosas de tiosulfato sódico 0,01 N y 0,002 N exactamente valoradas.

21.3.5 Solución indicadora de almidón al 1 por 100 en agua destilada.

21.4 Procedimiento.

Tomar un matraz con cierre esmerilado, de unos 250 ml, previamente seco, y llenar con un gas inerte, puro y seco (anhídrido carbónico o nitrógeno). Introducir tan rápidamente como se pueda la muestra del aceite que se desea ensayar, definida en función de los índices presumidos (ver 21.6.1).

Agregar 10 ml de cloroformo, en el cual se disuelve rápidamente la grasa por agitación, 150 ml de ácido acético glacial y 1 ml de una disolución acuosa de yoduro potásico.

Cerrar el matraz y mantener en agitación durante un minuto, imprimiéndole un suave movimiento de rotación, conservándolo después en la oscuridad durante 5 minutos; transcurrido este tiempo, agregar 75 ml de agua, agitar vigorosamente y valorar el yodo liberado con una disolución de tiosulfato 0,002 N, para los aceites de índices inferiores o iguales a 20 y 0,01 N para los índices más elevados.

Paralelamente, se efectúa un ensayo testigo, sin aceite, que debe dar un índice nulo.

21.5 Cálculos.

El índice de peróxidos se expresa en miliequivalentes de oxígeno por kilogramo de muestra, y se calculará aplicando la fórmula siguiente:

V = tiosulfato, en ml, consumido en la valoración.

N = normalidad de la solución de tiosulfato.

P = peso, en gramos, de la muestra de grasa tomada para la determinación.

21.6 Observaciones.

21.6.1 Peso de la muestra. La toma de las muestras para el ensayo se efectuará tomando una cantidad de grasa de acuerdo con el índice de peróxidos que se presupone y que se indica en el cuadro siguiente:

Índice que se presupone	Peso de la muestra en g
De 0 a 20	De 2,0 a 1,2
De 20 a 30	De 1,2 a 0,8
De 30 a 50	De 0,8 a 0,5
De 50a 100	De 0,5 a 0,3

21.6.2 Para la expresión del índice de peróxidos se han propuesto otras unidades distintas a la adoptada en esta norma y que suelen ser utilizadas, en algunos casos, presentándose a confusiones en la interpretación de resultados. Para evitar estos errores y los inconvenientes que pudieran derivarse de los mismos, en los informes analíticos deberá indicarse siempre la unidad en la que se expresa el índice.

Para facilitar el paso de una unidad a otra, se indican a continuación, los factores de conversión por los que deberá multiplicarse, en cada caso, la cifra del índice, expresado en una determinada unidad, para obtener la cifra equivalente en la unidad que se define en 21.1.

Índice de peróxidos expresado en	Factor de con versión para calcular el índice expresado en miliequivalentes de oxígeno activo por kilogramo de grasa
a) Microgramos de oxígeno activo por gramo de grasa .	0,125
b) Gramos de oxígeno activo por kilogramo de grasa.	125
c) Mililitros de solución de tiosulfato sódico 0,01 N por kilogramo de grasa.	0,01
d) Mililitros de solución de tiosulfato sódico 0,01 N por gramo de grasa.	10
e) Mililitros de solución de tiosulfato sódico 0,002 N por gramo de grasa.	2
f) Milimoles de oxígeno activo por kilogramo de grasa.	2

21.7 Referencias.

2 International Union of Pure and Applied Chemistry. Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Soaps 1964. II. D.13.

22(a). INSAPONIFICABLE

(Método éter de petróleo)

22(a).1 Principio.

Se entiende por insaponificable el peso en g de sustancias no saponificables, insolubles en agua y solubles en el disolvente utilizado en la determinación, contenidas en 100 g de grasa.

El método es aplicable a todas las materias grasas. Su exactitud es sólo aproximada para aquellas grasas con un contenido de insaponificable muy elevado.

22(a).2 Material y aparatos.

22(a).2.1 Matraz de fondo plano, de 200 ml, adaptable a refrigerante de reflujo.

22(a).2.2 Refrigerante de reflujo.

22(a).2.3 Embudos de separación de 500 ml.

22(a).2.4 Estufa graduable a 103° 1± 2 °C).

22(a).3 Reactivos.

22(a).3.1 Solución de hidróxido potásico, alcohólica, 2 N, en etanol, de 95 por 100 v/v.

22(a).3.2 Éter de petróleo (p. e. 40° - 60°; índice de bromo, 1), redestilado y exento de residuo.

22(a).3.3 Etanol al 50 por 100 en volumen.

22(a).3.4 Agua destilada.

22(a).3.5 Solución de heliantina al 1 por 100.

22(a).3.6 Solución de ácido clorhídrico 0,1 N.

22(a).4 Procedimiento.

Eliminar el agua de la muestra por decantación y filtración sobre papel, efectuadas a una temperatura ligeramente superior al punto de fusión de determinados componentes sólidos que hubieran podido separarse de la materia grasa fluida.

Pesar en el matraz 5 g de materia grasa, con una aproximación de 0,01 g.

Añadir 50 ml de solución alcohólica de potasa 2 N. Adaptar refrigerante de reflujo. Calentar una hora con ligera ebullición. Separar la fuente de calor. Agregar por la parte superior del refrigerante 50 ml de agua destilada y agitar. Dejar enfriar.

Transvasar el contenido del matraz a un embudo de decantación, aclarar y arrastrar las últimas porciones lavando el matraz varias veces con 50 ml de éter de petróleo en total.

Agitar enérgicamente durante un minuto. Dejar en reposo hasta la completa separación de las dos fases. Pasar a un segundo embudo de decantación la fase jabonosa. Extraer ésta con otros 50 ml de éter de petróleo; decantarla de nuevo y volver a extraer con 50 ml de éter de petróleo.

Reunir las tres fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y lavarlas tres veces seguidas, utilizando cada vez 50 ml de etanol al 50 por 100 v/v. Transvasar la solución de éter de petróleo a un pequeño matraz de cuello corto, previamente tarado y eliminar el disolvente por destilación en baño de agua hirviendo.

Secar colocando el matraz en posición horizontal en una estufa regulada a 103° durante 15 minutos. Dejar enfriar en desecador y pesar. Repetir la operación hasta que las pérdidas entre dos pesadas consecutivas sean inferiores a 0,10 por 100.

Incinerar las sustancias insaponificables obtenidas, y si dejan cenizas, dosificar su alcalinidad en presencia de heliantina con una solución de ácido clorhídrico 0,1 N (1 ml de esta solución representa 0,032 g de jabón de potasa, que hay que deducir).

22(a).5 Cálculo.

Calcular el insaponificable expresado en porcentaje.

22(a).5.1 Insaponificable

22(a).5.2 En el caso de haber incinerado el residuo y valorado con KOH alcohólica 0,1 N.

P' = peso en g del residuo.

P = peso en g de la muestra.

N = normalidad exacta de la solución acuosa de ClH 0,1 N.

V = volumen en ml de ClH 0,1 N utilizados.

22(a).6 Observaciones.

22(a).6.1 En los certificados de análisis, indicar: Método del éter de petróleo.

22(a).7 Referencias.

22(b). INSAPONIFICABLE

(Método éter etílico)

22(b).1 Principio.

Como 22(a).1

22(b).2 Material y aparatos.

Como 22(a).2.

22(b).3 Reactivos.

22(b).3.1 Solución etanólica de hidróxido potásico, aproximadamente 2 N, en etanol de 95° v/v.

22(b).3.2 Solución acuosa de hidróxido potásico, aproximadamente 0,5 N.

22(b).3.3 Éter etílico neutro, recién destilado y exento de residuo.

22(b).4 Procedimiento.

Eliminar el agua de la muestra por decantación y filtración sobre papel, efectuadas a una temperatura ligeramente superior al punto de fusión de determinados componentes sólidos que hubieran podido separarse de la materia grasa fluida.

Pesar en el matraz, con una precisión de 0,01 g, aproximadamente, 5 g de materia grasa. Saponificar como en 22(a).4.

Separar la fuente de calor. Desconectar el refrigerante. Transvasar el contenido del matraz a una ampolla de decantación. Lavar con 100 ml de agua destilada.

Enjuagar el matraz y el refrigerante con 100 ml de éter etílico, y pasarlos a la ampolla; tapar y agitar vigorosamente, mientras el contenido esté ligeramente caliente. Dejar en reposo hasta separación nítida de las dos capas. Si aparece una emulsión persistente causada por una alcalinidad fuerte del medio, añadir unas gotas de ácido clorhídrico N.

Separar la capa alcohólico-acuosa y verterla en el matraz empleado en la saponificación.

Pasar la capa etérea a una segunda ampolla de decantación conteniendo 40 ml de agua.

Tratar la solución alcohólico-acuosa de jabón dos veces más, con porciones de 100 ml de éter etílico. Reunir las tres fracciones etéreas en la segunda ampolla de decantación. Si las fracciones etéreas reunidas contuviesen materias sólidas en suspensión, filtrar y lavar cuantitativamente el filtro con un poco de éter.

Girar, sobre sí mismo, sin sacudidas violentas, la ampolla que contiene el éter y los 40 ml de agua. Una vez separadas las dos capas, eliminar la capa acuosa. Lavar la capa etérea dos veces, con 40 ml de agua cada vez, agitando enérgicamente. Después, lavar sucesivamente con 40 ml de solución de potasa acuosa 0,5 N, con 40 ml de agua, y de nuevo con 40 ml de solución acuosa de potasa 0,5 N, y, por lo menos, dos veces con 40 ml de agua. Continuar los lavados con agua hasta que las aguas de lavado no den coloración rosa a la fenolftaleína.

Transvasar cuantitativamente la solución etérea a un matraz tarado de 200 ml, después de reducirla a pequeño volumen por evaporación. Agregar 6 ml de acetona y eliminar completamente el solvente volátil, por medio de una ligera corriente de aire, estando el matraz casi sumergido en un baño de agua hirviendo, en posición oblicua y haciéndole girar. Terminar el secado en estufa a 103 °C, como en 22(a).4.

Después de pesar el residuo, disolverlo en 20 ml de etanol de 95 por 100, v/v, recién destilado y neutralizado; valorar con solución alcohólica de hidróxido potásico 0,1 N en presencia de fenolftaleína; si el volumen utilizado de solución alcalina de superior a 0,2 ml, repetir todo el procedimiento.

22(b).5 Cálculo.

Calcular el insaponificable expresado en porcentaje.