Orden de 31 de julio de 1979 por la que se establecen métodos oficiales de análisis de aceites y grasas, productos cárnicos, cereales y derivados fertilizantes, productos fitosanitarios, productos lácteos, piensos, aguas y productos derivados de la uva

m = peso de muestra de la que se ha obtenido el extracto.

V = volumen, en ml tomado del extracto decolorado.

C = concentración en nitrito sódico expresada en μg/ml determinada sobre la curva patrón.

Tomar como resultado la media de los valores obtenidos en dos determinaciones paralelas si las condiciones de reproducibilidad se cumplen.

13.6 Observaciones.

La diferencia entre dos determinaciones paralelas sobre una misma muestra, realizadas simultáneamente por el mismo analista, no debe ser superior al 10 por 100 del contenido calculado en nitritos.

13.7 Referencias.

1. Norma ISO/DIS 2918.

14. NITRATOS

14.1 Principio.

Al reaccionar en medio sulfúrico los nitratos con la brucina se produce una coloración amarilla-marrón, cuya intensidad es proporcional al contenido en nitratos presentes, lo que permite su valoración colorimétrica o espectrofotométrica.

14.2 Material y aparatos.

14.2.1 Matraz aforado de 50 ml de capacidad.

14.2.2 Espectrofotómetro o colorímetro capaces para lecturas a 410 nm.

14.2.3 Cubetas de 1 cm de paso específicas para luz visible.

14.3 Reactivos.

14.3.1 Solución patrón de nitratos.‒Disolver 0,1629 g de nitrato potásico anhidro en agua y enrasar a 1 l. 1 ml de esta solución contiene 0,1 mg de nitrato.

14.3.2 Reactivo brucina-Ácido sulfanílico.‒Disolver 1 g de brucina y 0,1 g de ácido sulfanílico en unos 70 ml de agua destilada caliente, añadir 3 ml de ácido clorhídrico concentrado, dejar enfriar y enrasar a 100 ml con agua. La solución debe guardarse en frasco color topacio.

14.3.3 Solución de ácido sulfúrico.‒Añadir con cuidado 500 ml de ácido sulfúrico concentrado a 75 ml de agua destilada. Debe conservarse herméticamente cerrado.

14.4 Procedimiento.

14.4.1 Preparación del extracto.‒Como en 8.4.1.

14.4.2 Valoración de la muestra.‒Introducir en un matraz aforado de 50 ml de capacidad 10 ml del extracto (14.4.1), 1 ml del reactivo (14.3.2) y 10 ml del reactivo (14.3.3) muy lentamente, mezclar y dejar en reposo durante diez minutos al abrigo de la luz.

Pasado este tiempo, añadir agua destilada, agitando, hasta completar unos 40 ml y dejar reposar durante quince minutos en la oscuridad.

Enfriar el matraz en un baño de hielo hasta que alcance la temperatura ambiente, preferiblemente también en la oscuridad. A continuación, enrasar a 50 ml con agua, homogeneizar el contenido del matraz y leer la absorbancia a 410 nm. El cero se ajusta con 20 ml de agua sometida al proceso anteriormente descrito.

14.4.3 Preparación de la curva patrón. Tomar distintas alícuotas de la solución 14.3.1 y tratar como en 14.4.2.

14.5 Cálculos.

Llevar la absorbancia obtenida a la curva patrón y expresar el correspondiente contenido de nitratos en mg por kg.

14.6 Observaciones.

14.6.1 Periódicamente resulta aconsejable confirmar o rectificar los valores de la curva patrón, lo que es absolutamente necesario cuando se cambia de reactivos.

14.6.2 En las condiciones citadas, se pueden medir concentraciones de nitrato comprendidas entre 50 y 500 μ g/l.

14.6.3 El ácido sulfanílico se añade al reactivo 14.3.2 para evitar la posible interferencia del ion nitrito. Las interferencias de iones ferrosos, férricos y manganosos sólo son apreciables cuando su concentración es superior a 1 mg/l.

15. pH

15.1 Principio.

Medida del potencial eléctrico creado en la membrana de un electrodo de vidrio, función de la actividad de iones hidrógeno a ambos lados de la membrana. Utilizar como referencia un electrodo de calomelanos.

15.2 Material y aparatos.

15.2.1 pH-metro capaz de determinar la segunda cifra decimal.

15.2.2 Electrodos de vidrio de punta fina o convencional (según la dureza de la muestra).

15.2.3 Electrodo de calomelanos.

15.3 Reactivos.

15.3.1 Disolución tampón de pH = 4.

15.3.2 Disolución tampón de pH = 7

15.4 Procedimiento.

Tomar una cantidad de muestra preparada según el método 1 o bien directamente, en el caso de muestras homogéneas, añadir igual cantidad de agua destilada, mezclar y dejar reposar durante diez minutos.

Ajustar el pH-metro a la temperatura de trabajo con las disoluciones 15.3.1 y 15.3.2 e introducir los electrodos de vidrio y de referencia, separados a. menos 2 cm.

Conectar el pH-metro y esperar a que se estabilice.

15.5 Expresión de los resultados.

Anotar el valor de pH indicado por el aparato.

Repetir la operación dos veces al menos.

15.6 Observaciones.

15.6.1 Es necesaria una limpieza escrupulosa de los electrodos entre determinaciones sucesivas, lo que al tratarse de productos con un alto contenido en materia grasa es más laboriosa que en disoluciones desengrasadas, requiriendo a veces ser frotados o sumergidos en alcohol, éter dietílico, éter de petróleo, etcétera; secarlos convenientemente y lavarlos finalmente con agua destilada; secarlos de nuevo, quedando así dispuestos para una nueva lectura.

MÉTODOS BIOLÓGICOS

1. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIE ANIMAL

1.1 Principio.

Las proteínas musculares de las distintas especies animales, aunque muy similares entre sí, tienen en cada grupo zoológico una estructura específica que permite diferenciar carnes de especies distintas por métodos serológicos (técnica de Uhlenhuth).

Sólo es aplicable a productos crudos.

1.2 Material y aparatos.

1.2.1 Tubos de precipitación de 20 x 4 mm.

1.2.2 Gradillas metálicas para los tubos anteriores.

1.2.3 Precipitoscopio (cámara oscura con luz indirecta).

1.2.4 Pipetas capilares muy finas.

1.2.5 Pinzas.

1.2.6 Bisturí.

1.2.7 Tijeras.

1.2.8 Gasa.

1.2.9 Papel de filtro.

1.2.10 Tubos de ensayo.

1.2.11 Erlenmeyer de 250 ml de capacidad.

1.3 Reactivos.

1.3.1 Suero fisiológico estéril.

1.3.2 Antisueros específicos (su especificidad debe ser contrastada en el momento de su utilización).

1.4 Procedimiento.

Separar del producto cárnico entre 5 y 10 g de carne magra lo más exenta posible de grasa. Picar en trozos muy pequeños, poniéndose a macerar en suero fisiológico estéril en la proporción de 1/10 Mantener el macerado puesto en un Erlenmeyer de 250 ml en frigorífico durante 24 horas, al objeto de evitar la proliferación bacteriana.

Transcurridas las 24 horas, filtrar el macerado a través de gasa y papel de filtro cuantas veces sea necesario, hasta obtener un líquido transparente, sin importar que tenga coloración propia. Diluir el filtrado, que estaba a 1/10, hasta 1/25 y 1/50.

Poner en una gradilla metálica tres tubos de precipitación para las tres diluciones preparadas. Tomar con pipeta capilar una para cada dilución, partes de las disoluciones (antígeno problema), llevándolo hasta el fondo de los tubos. Colocar seguidamente el antisuero que se ensaya (anticuerpo específico conocido) en los tres tubos mediante pipeta capilar muy fina de la manera siguiente: Poner el tubo conteniendo el antígeno problema en posición horizontal, llevando en este momento la pipeta con el antisuero hasta el fondo del tubo, momento en que se vuelve a poner el tubo en posición vertical, con le que saldrá una pequeña cantidad de antisuero que desplazará hacia arriba el antígeno, pero sin mezclarse con él; volver a poner de nuevo en posición horizontal el tubo, sacando rápidamente la pipeta que contiene el antisuero. El tubo debe estar siempre en posición horizontal a la entrada o la salida de la pipeta con el antisuero, evitando de esta forma que los dos líquidos reaccionantes se mezclen. Utilizar una sola pipeta para cada antisuero. Es conveniente poner dos tubos testigos, uno para el suero y otro para el antígeno, testigos que necesariamente deben dar siempre reacción negativa.

1.5 Interpretación de resultados.

La reacción positiva se produce con la aparición de un anillo blanquecino, opalescente, en la zona de separación de ambos líquidos reaccionantes antes de 15 minutos. Reacciones positivas posteriores a este tiempo deben considerarse inespecíficas. La reacción tiene lugar, para un mismo antígeno, a distintos tiempos, según sea el título del antisuero empleado.

1.6 Observaciones.

1.6.1 La lectura de los resultados debe hacerse con luz intensa indirecta y sobre fondo oscuro, preferiblemente en un precipitoscopio.

1.7 Referencias.

1. Normalización de Técnicas en Bromatología Sanitaria. F. Pérez Flórez. 1970.

ANEJO III. Métodos de análisis de cereales y derivados

16. ÁCIDO ASCÓRBICO (VITAMINA C)

(Método cualitativo)

16.1 Principio.

Este método sirve para determinar la presencia de vitamina C en harina y consiste en la aparición de puntos blancos sobre fondo rosa del reactivo sal sódica del 2,6 diclorofenol indofenol en medio ácido.

16.2 Material y aparatos.

16.2.1 Placa Petri de 65 cm².

16.3 Reactivos.

16.3.1 Disolución acuosa al 0,05 por 100 de la sal sódica del 2,6 diclorofenol indofenol.

16.3.2 Disolución acuosa al 5 por 100 de ácido metafosfórico.

16.4 Procedimiento.

Extender 10 g de la muestra sobre una placa de vidrio compactándola de forma que quede bien uniforme. Rociar por completo con la disolución del ácido metafosfórico y a continuación hacer lo mismo con la disolución de la sal sódica del 2,6 diclorofenol indofenol. Al cabo de unos minutos aparecen unos puntos blancos más o menos grandes sobre el fondo rosa.

18. FÓSFORO

18.1 Principio.

Transformación de los compuestos fosforados en ortofosfatos y posterior valoración colorimétrica con fosfomolibdovanadato.

18.2 Material y aparatos.

18.2.1 Espectrofotómetro o colorímetro que permita lecturas a 430 nm.

18.2.2 Crisoles de porcelana, de 35 mm de diámetro y 45 milímetros de altura, sin tapadera.

18.2.3 Matraces aforados de 100 y 500 ml de capacidad.

18.2.4 Baño de agua.

18.2.5 Estufa de desecación con sensibilidad de ± 1 ºC.

18.3 Reactivos.

18.3.1 Amoníaco concentrado de densidad ρ = 0,910 g/ml.

18.3.2 Disolución de molibdato amónico al 10 por 100 (p/v). Disolver 100 g de molibdato amónico en agua caliente; añadir 10 ml de amoníaco concentrado de ρ = 0,910 g/cm³ para asegurar su conservación y completar hasta 1.000 ml con agua destilada.

18.3.3 Ácido nítrico de densidad ρ = 1,38 g/ml.

18.3.4 Ácido nítrico al 10 por 100 (p/v).‒Disolver 16 ml de ácido nítrico ρ = 1,38 g/cm³, hasta 100 ml con agua destilada.

18.3.5 Disolución de metavanadato de amonio.‒Disolver 2,35 gramos de metavanadato de amonio en 400 ml de agua destilada y caliente. Añadir lentamente y agitando 20 ml de la disolución que contiene 7 ml de ácido nítrico ρ = 1,381 g/ml y 13 ml de agua destilada.

18.3.6 Reactivo nitromolibdovanadato.‒Mezclar 200 ml de la disolución de molibdato amónico al 10 por 100 y 200 ml de la disolución de metavanadato de amonio, con 134 ml de ácido nítrico ρ = 1,381 g/cm3 o en su lugar 192 ml de ácido nítrico ρ = 1,331 g/ml.

18.3.7 Ácido clorhídrico concentrado de densidad ρ = 1,19 g/ml.

18.3.8 Disolución patrón de fósforo.‒Pesar 4,394 g de fosfato monopotásico, previamente desecado en estufa a 100 °C durante unas doce horas. Disolver en agua destilada y llevar a un volumen de 1.000 ml en un matraz aforado, 1 ml corresponde a 1.000 gammas de fósforo

18.3.9 Disoluciones patrones.‒Tomar 10 ml de la disolución anterior y diluir con agua destilada hasta el enrase en un matraz aforado de 100 ml, obteniéndose una concentración de 100 gammas de fósforo por mililitro. Tomar partes alícuotas de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 y 2,5 ml y llevar a un volumen de 10 ml con agua destilada. Su concentración será de 5, 10, 15, 20 y 25 gammas /ml. Añadir 10 ml del reactivo nitromolibdovanadato y proceder como se describe en el método.

18.4 Procedimiento.

Pesar, con una aproximación de ± 0,1 mg, de 0,3 a 1,5 g de muestra en un crisol previamente calcinado y tarado. Introducir el crisol en la mufla a una temperatura inferior a 100 °C. Aumentar la temperatura paulatinamente hasta alcanzar los 550 °C; mantener esta temperatura durante 2 horas. No se debe pasar de 550 °C, para evitar decrepitaciones y volatilizaciones, ya que cuando existen cloruros en el producto a analizar, puedan afectar a los resultados. El tiempo que debe permanecer el crisol con la muestra en la mufla es variable y estará de acuerdo con la naturaleza y con la cantidad de la muestra. Suelen ser suficientes 2 horas, pero si transcurrido este tiempo las cenizas del crisol no presentan el color blanco grisáceo deseado, sacar el crisol de la muña y dejar enfriar dentro de un desecador, añadiendo posteriormente unas gotas de agua o, mejor, unas gotas de agua oxigenada de 50 volúmenes, introducir el crisol en la estufa de desecación a 100 °C para eliminar el agua o el agua oxigenada. Eliminada la humedad, introducir nuevamente el crisol en la mufla a 550 °C. Dejar transcurrir el tiempo necesario hasta que las cenizas contenidas en el crisol alcancen el color deseado. Sacar el crisol de la mufla y llevar a un desecador con sustancias desecadoras. Dejar enfriar hasta la temperatura ambiente.

Obtenidas las cenizas, añadir en el crisol una cantidad de ácido clorhídrico concentrado (18.3.7) hasta que las cenizas queden cubiertas Evaporar el ácido clorhídrico en el baño de agua a ebullición, hasta sequedad, en un dispositivo adecuado para la eliminación de vapores ácidos. Disolver el residuo en 3 ml de ácido nítrico al 10 por 100 y hervir en el baño de agua durante 5 minutos, utilizando el dispositivo adecuado para la eliminación de los vapores ácidos. No se debe dejar secar el contenido para evitar la hidrólisis de los ortofosfatos que produciría reacciones coloreadas Filtrar a través de papel, sobre un matraz aforado de 500 ml, lavando con agua destilada los crisoles donde estaban contenidas las cenizas y diluir hasta el enrase.

Para desarrollar la reacción de color, colocar, en una cubeta o tubo de espectrofotómetro o fotocolorímetro, 10 ml de la disolución problema y añadir 10 ml del reactivo nitromolibdovanadato. Agitar, dejar reposar durante diez minutos. Efectuar la lectura espectrofotométrica o fotocolorimétrica a 430 nm, utilizando como blanco la mezcla de 10 ml de agua destilada y 10 ml de reactivo nitromolibdovanadato. La coloración amarilla desarrollada es estable durante varios días.

18.5 Cálculos.

Leer en el espectrofotómetro o fotocolorímetro y buscar su correspondencia en fósforo en la curva patrón.

Siendo:

F = concentración de fósforo, en gammas, encontrada en la curva patrón/10 ml disolución.

P = peso, en gramos, de la muestra empleada.

18.6 Referencias.

1. Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española UNE 64017.

19. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE HARINAS DE TRIGOCOMÚN (TRITICUM VULGARE) EN SÉMOLAS Y PASTAS ALIMENTICIAS

19.1 Principio.

El método se basa en la detección y cuantificación de un componente designado CM₂, del extracto cloroformo-metanol del endospermo de trigo o de productos derivados de él, cuyo control genético radica en el cromosoma 1D de «Triticum Vulgare» y que por tanto no se encuentra en «T. durum».

El mencionado extracto, al que se designa proteína CM, se fracciona por electroforesis sobre gel de almidón, y el componente CM₁ se estima visualmente o se cuantifica densitométricamente.

19.2 Material y aparatos.

19.2.1 Balanza analítica.

19.2.2 Equipo de electroforesis.‒Fuente de tensión, corriente continua 0-500 V, ‒100 mA. Placas de vidrio de 20 x 20 cm marcos de plástico de 20 x 20 cm exterior, de 18 x 18 cm interior y de 3 mm de espesor. Depósitos de electrodos de 20 x 10 x 10 centímetros.

19.2.3 Densitómetro de reflexión en el caso de que se quiera cuantificar.

19.2.4 Tubos de 8 x 50 mm o similar, con tapones de corcho.

19.2.5 Gradilla.

19.2.6 Dos placas de acero inoxidable de 5 x 7 x 1 cm o dimensiones similares.

19.2.7 Jeringa de vidrio de 1 ml de capacidad.

19.2.8 Capilares de 10 cm de largo.

19.2.9 Placa de porcelana con pocillos.

19.2.10 Probetas de 100 ml y 1.000 ml.

19.2.11 Vasos de 500 ml y de 1.000 ml.

19.2.12 Baño de agua con termómetro.

19.2.13 Cubeta de plástico de al menos 25 x 25 x 5 cm.

19.3 Reactivos.

19.3.1 Cloroformo.

19.3.2 Metanol.

19.3.3 Éter dietílico libre de peróxidos.

19.3.4 Etanol del 70 por 100.

19.3.5 Papel Albet número 502, o similar, y papel de filtro.

19.3.6 Almidón hidrolizado para electroforesis Connauglit o similar.

19.3.7 Tampón lactato de aluminio-ácido láctico, 0,1 N, pH 3,2 en urea 3 M.‒Diluir 4,9 g de lactato de aluminio en agua destilada, añadir 10,6 ml de ácido láctico purísimo y 180 g de urea, completando hasta 1 litro con agua destilada. Este tampón sirve tanto para el gel de almidón como para los compartimentos de los electrodos.

19.3.8 Solución de nigrosina soluble en agua al 0,5 por 100 en acético-agua (1/1) (v/v).

19.3.9 Gel de almidón.‒Mezclar 24,5 g de almidón y 180 ml de tampón en un vaso de 500 ml, agitar suavemente con una varilla en baño de agua a 80 ± 3 ºC hasta que gelifique (2-3 minutos). El gel caliente se vierte sobre una placa de vidrio a la que se ha superpuesto un marco de plástico de las mismas dimensiones externas que la placa y de 3 mm de espesor, extender uniformemente con la varilla y, finalmente, prensar suavemente con una placa de vidrio de las mismas dimensiones sin dejar burbujas. Dejar reposar durante al menos 3 horas.

19.4 Procedimiento.

19.4.1 Extracción y preparación para electroforesis de la proteína CM.‒Pesar 50 mg de harina, sémola, grano o pasta alimenticia y transferirlos o un tubo de 8 x 50 mm o similar. El grano y la pasta se aplastan por presión entre dos placas de acero inoxidable antes de ser transferidas al tubo. Añadir aproximadamente 0,5 ml de éter dietílico en cada tubo y dejar reposar durante no menos de 30 minutos, agitando ocasionalmente. Después de la última agitación se deja sedimentar por gravedad y el sobrenadante se elimina con la ayuda de una jeringa. El disolvente residual se deja evaporar a la temperatura ambiente o en una estufa a 35 °C durante 10 minutos. Agregar aproximadamente 0,25 ml de cloroformo-metanol (2/1) (v/v) a cada tubo, tapar y dejar reposar durante 2 horas, agitando ocasionalmente.

Después de la última agitación, dejar sedimentar por gravedad y transferir el extracto sobrenadante con un capilar a una pieza de papel Albet número 502 o similar, de dimensiones 3 x 10 mm. Con el capilar se satura el papel, que se deja evaporar antes de una nueva adición (ver 19.6.4), repitiendo la operación hasta agotar el sobrenadante. Para esta operación, las piezas de papel a las que se van a transferir las distintas muestras se depositan en distintos pocillos de una placa de porcelana o similar Se recomienda realizar la transferencia entre 10 y 20 muestras simultáneamente.

19.4.2 Electroforesis sobre gel de almidón de la proteína CM.‒Separar cuidadosamente una de las placas de vidrio con la ayuda de una espátula y recubrir la superficie expuesta del gel con un plástico fino. Marcar en dicha superficie una fila de ranuras (1 cm de largo cada una) a 3 cm de uno de los bordes del gel. Alojar en dicha ranura las piezas de papel Albet número 502 o similar que portan las muestras, previamente impregnadas con tampón. Disponer el gel horizontalmente apoyado sobre las cubetas de electrodos y establecer la conexión eléctrica mediante puentes de papel de filtro (20 papeles de dimensiones apropiadas superpuestos).

19.5 Interpretación de resultados.

19.5.1 Detección de trigo exaploide.‒La electroforesis del extracto CM de trigo exaploide («T. Vulgare») muestra tres bandas designadas CM₁, CM₂ y CM₃, mientras que la de trigo tetraploide («T. durum») sólo presenta dos CM₂ y CM₃.

El trigo exaploide se detecta en una mezcla por la aparición de CM₁ en el perfil electroforético. Para el tamaño de muestra anteriormente propuesto, CM₁ se detecta en mezcla de 10-15 por 100. Usando muestras de tamaño doble, el umbral de detección se reduce proporcionalmente.

19.5.2 Cuantificación de trigo exaploide en mezclas.‒La acotación del porcentaje de «T. Vulgare» en una mezcla se basa en la cuantificación de la relación CM₁, CM₂ y en la estimación de la variabilidad intraespecífica de CM₁ y CM₂.

En la figura 1-A se presenta la forma de acotar gráficamente el porcentaje de trigo exaploide en mezclas basándose en la medida de la relación CM₁, CM₂ mediante densitometría de reflectancia con luz de 620 mm. En la figura 1-B se representa la variación de la amplitud de la acotación según el valor obtenido.

Una estimación semicuantitativa, más imprecisa que la anterior, puede obtenerse por comparación visual del problema con una serie de mezclas conocidas que pueden incorporarse al mismo gel.

19.6 Observaciones.

19.6.1 Las condiciones de electroforesis son 10 V/cm durante seis horas.

19.6.2 La tinción se realiza con nigrosina al 0,05 por 100 en acético.‒Agua (1/1) (v/v) durante 14-16 horas en una cubeta de plástico de dimensiones apropiadas, dejando el gel con la cara opuesta a la de inserción hacia arriba.

19.6.3 La decoloración del fondo se realiza en pocos minutos con etanol al 70 por ICO.

19.6.4 Cuando se manejan 10-20 muestras, después de una transferencia se devuelve el capilar al tubo y se pasa a la muestra siguiente. Cuando se llega a la muestra final, ya se ha evaporado la primera y está en condiciones de una nueva transferencia.

19.7 Referencias.

1. R. García Faure y F. García Olmedo: «A new Method for the Estimation of Common Wheat in Pasta Products». Lebensm. Wis. U. Technol. Vol. 2. 1969.

20. DETECCIÓN DE HARINAS DEGRADADAS POR EL ATAQUE DE PENTATÓMIDOS

20.1 Principio.

Se detecta la degradación de la calidad panadera de la masa de harina mediante la determinación del exceso de actividad proteolítica.

20.2 Material y aparatos.

Como en 14.2.

20.3 Reactivos.

Como en 14.3.

20.4 Procedimiento.

Como el 14.4 con las siguientes modificaciones:

20.4.1 El número de piezas de masa serán seis.

20.4.2 Transcurrido el tiempo normal de 26 minutos del comienzo de amasado, extraer tres piezas de la cámara del alveógrafo y analizarlas obteniendo sus correspondientes curvas. El resto de las piezas se analizan sobre el mismo papel después de un periodo de reposo de tres horas.

Si alguno de los alveolos o curvas fuera claramente anormal debe desecharse la curva.

20.5 Expresión de los resultados.

Si existe una actividad proteolítica excesiva, la segunda serie de curvas presentará menor extensibilidad y tenacidad, siendo mayor la diferencia entre ellas, a mayor actividad.

Cuantificar esta actividad calculando la degradación de W y G en la forma siguiente:

Calcular los valores de estos índices por separado para la primera serie de curvas (con tiempo de reposo normal) Wo y Go y para la segunda (con tiempo de reposo de 3 horas) W₁ y G₁.

20.6 Referencias.

1. Harinas. Actividad proteolítica. H-80277-A. Ministerio del Aire.

ANEJO IV. Métodos de análisis de fertilizantes

Téngase en cuenta que el Real Decreto 506/2013, de 28 de junio, sobre productos fertilizantes, Ref. BOE-A-2013-7540#anvi, regula en su Anexo VI los métodos de análisis de los productos fertilizantes.

16(b). FÓSFORO SOLUBLE EN AGUA

(Derogado).

17(b). FÓSFORO SOLUBLE EN AGUA Y EN CITRATOAMÓNICO NEUTRO

(Derogado).

22. BORO SOLUBLE EN ÁCIDO

22.1 Principio.

Consiste en pasar el boro a BO₃H₃, el cual puede ser valorado con un álcali fuerte, previa exaltación de su acidez por formación de un ion complejo con una sustancia polihidroxilada (manitol o sorbitol).

22.2 Material y aparatos.

22.2.1 Balanza analítica.

22.2.2 pH-metro o similar.

22.2.3 Vaso de 250 ml.

22.3 Reactivos.

22.3.1 Solución patrón de ácido bórico.

Disolver 1 g de BO₃H₃ en H₂O y llevar a 1 litro.

1 ml contendrá 0,1748 mg de B.

22.3.2 Solución patrón de NaOH.

Preparar una solución de concentración 0,025 N libre de CO₂ y a continuación se titula de la siguiente manera: Pipetear 25 ml de la solución patrón de BO₃H₃ depositándolos en un Erlenmeyer de 250 ml. Añadir 3 g de ClNa e indicador rojo de metilo, diluyéndose con agua destilada hasta 150 ml; calentar hasta ebullición para expulsar el CO₂, enfriar y titular potenciométricamente como en 22.4. Realizar un blanco repitiendo la titulación cambiando los 25 ml de la solución patrón de BO₃H₃ por 25 ml de agua. Para determinar la equivalencia en B se efectúan los siguientes cálculos:

mg B/ml = 4,369/ml de la solución de NaOH ‒ ml gastados en el blanco.

Esta solución se debe preservar del CO₂ atmosférico.

22.3.3 Solución del indicador rojo de metilo.

Disolver 0,1 mg de rojo de metilo en 50 ml de alcohol, diluir hasta 100 ml con agua y filtrar si es necesario.

22.3.4 ClH.

22.3.5 ClH 0,5 N.

22.3.6 ClH 0,02 N.

22.3.7 Solución de (NO₃)₂ Pb al 10 por 100.

22.3.8 NaOH 0,5 N.

22.3.9 NaOH 0,025 N.

22.3.10 CINa.

22.3.11 Manitol o sorbitol.

22.4 Procedimiento.

Pesar la muestra con exactitud de 1 mg (22.6.1), depositando la cantidad de sustancia pesada en un vaso de 250 ml. Añadir, aproximadamente, 50 ml de H₂O y 3 ml de ClH. Calentar a ebullición y mantener ésta durante un tiempo suficiente como para descomponer los carbonatos. Mantener a continuación la solución caliente sin llegar a ebullición durante el procedimiento de eliminación de posibles fosfatos. Añadir unos 10 ml de solución de (NO₃)₂ Pb al 10 por 100 o 1 ml por cada 1,2 por 100 de P₂O₅ si el contenido de éste se conoce y es superior al 12 por 100. Añadir CO₃H Na hasta neutralizar. Seguidamente añadir unas cuantas gotas de rojo de metilo y continuar añadiendo CO₃H Na hasta conseguir un viraje alcalino del rojo de metilo (amarillo o ligeramente anaranjado). A continuación calentar la mezcla al baño de María durante treinta minutos, añadiendo pequeñas cantidades de CO₃H Na si fuera necesario para mantener el color (22.6.2). Después de la neutralización y el período de calentamiento, tendremos de 40-50 ml de solución. Filtrar la solución en caliente, recogiéndola sobre un Erlenmeyer de 250 ml, lavando el filtro con agua caliente. Se acidifica con unas cuantas gotas de ClH y calentar brevemente para expulsar el CO₂. Neutralizar la solución en caliente con NaOH 0,5 N y acidificar de nuevo con ClH 0,5 N, añadiendo de 0,3-0,5 ml de exceso. Diluir a 150 ml, aproximadamente, y calentar de nuevo a ebullición durante unos minutos para expulsar el CO₂ que pueda quedar. Enfriar a temperatura ambiente con agua fría. Neutralizar la mezcla con NaOH 0,5 N y colocar dentro del vaso los electrodos y agitador magnético.

Comenzar a agitar y ajustar a pH = 6,30 mediante la adición de NaOH 0,25 N o ClH 0,02 N y según se requiera (22.6.3). Una vez que el pH se mantenga a 6,30, se procede a efectuar la lectura en la bureta de NaOH 0,25 N; añadir 20 g de manitol o de cristales de D-sorbitol y efectuar la valoración con sosa 0,25 N hasta obtener nuevamente el pH 6,30 (desconectar el pH-metro dejando la lectura a 6,30 cuando se añade el manitol, conectándolo de nuevo cuando el indicador se acerca a su punto final, continuando añadiéndole cuidadosamente solución patrón de NaOH hasta que la aguja del galvanómetro vuelva a cero). De esta manera, con práctica, se trabaja sin sobrepasar el punto final de la titulación. Cuando se alcanza el punto final, se efectúa de nuevo la lectura de la cantidad de NaOH gastado. Efectuar un blanco con todos los reactivos a excepción de la muestra a analizar.

22.5 Cálculos.

Calcular el contenido en B aplicando la siguiente fórmula:

% B = (ml de NaOH gastados en la determinación ‒ ml blanco) ⋅ (mg B/ml de solución de NaOH)/10 g muestra.

22.6 Observaciones.

22.6.1 Para muestras de hasta 0,45 por 100 de contenido en B, pesar 1 g. Para contenidos más altos, pesar menos, pero guardando, aproximadamente, esta proporción.

22.6.2 Si el color de la solución palidece debido a la presencia de nitratos, añadir más rojo de metilo. Por el contrario, si dicho color se oscurece debido a la materia orgánica, se aconseja seguir la neutralización por medio de la técnica del indicador externo.

22.6.3 El pH se debe mantener; de no ocurrir así, sería debido a una expulsión incompleta del CO₂.

22.7 Referencias.

1. A. O. A. C.: «Official Methods of Analysis». Ed. 1970, página 24/2.103.

23. BORO SOLUBLE EN AGUA

(Derogado).

24. DETERMINACIÓN DEL MAGNESIO

(Derogado).

25. AZUFRE LIBRE

(Derogado).

26. AZUFRE TOTAL

(Derogado).

27. AZUFRE DE SULFATOS

(Derogado).

28. CLORUROS

(Derogado).

29. CINC

(Derogado).

30. COBRE

(Derogado).

31. SODIO

(Derogado).

32. HIERRO

(Derogado).

33. MANGANESO

(Derogado).

34(a). CALCIO SOLUBLE EN ÁCIDO

(Derogado).

34(b). CALCIO SOLUBLE EN ÁCIDO

(Derogado).

Se derogan los métodos 23, 29, 30, 32 y 33 por la disposición derogatoria única del Real Decreto 2490/1994, de 23 de diciembre. Ref. BOE-A-1995-3393

Se derogan los métodos 25, 26, 27, 31, 34(a) y 34(b) por la disposición derogatoria del Real Decreto 1163/1991, de 22 de julio. Ref. BOE-A-1991-19200

Se derogan los métodos 1, 2, 6(a), 6(b), 6(c), 7(a), 7(b), 8, 10(a), 11, 12, 15, 16, 16(b), 17, 17(b), 18, 19, 20(a), 20(b), 20(c), 24 y 28, por la disposición derogatoria de la Orden de 18 de julio de 1989. Ref. BOE-A-1989-17510

ANEJO V. Métodos de análisis de productos fitosanitarios

(Derogado).

Se deroga por la disposición derogatoria única del Real Decreto 971/2014, de 21 de noviembre. Ref. BOE-A-2014-12561#ddunica

ANEJO VI. Métodos de análisis de productos lácteos

Téngase en cuenta que la Orden de 26 de enero de 1989 Ref. BOE-A-1989-2695, por la que se aprueban los métodos oficiales de análisis de determinados tipos de leche parcial o totalmente deshidratada destinados a la alimentación humana, deroga los métodos coincidentes que figuran en la presente Orden.

MANTEQUILLA

9. ÁCIDOS GRASOS DE CADENA CORTA

9.1 Principio.

Obtención de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante reacción con una solución de hidróxido potásico en metanol y subsiguiente inyección directamente de la disolución de ésteres metílicos en el cromatógrafo.

El método es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que contengan ácidos grasos de longitud de cadena inferior al C₁₄ y siempre que el contenido de ácidos libres no exceda del 1 por 100 expresados en ácido oleico.

9.2 Material y aparatos.

9.2.1 Matraces con boca esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml de capacidad.

9.2.2 Pipetas aforadas de 1, 2 y 10 ml.

9.2.3 Matraces aforados de 50 y 100 ml de capacidad.

9.2.4 Probeta graduada de 10 ml.

9.2.5 Jeringa de características adecuadas para la inyección de la muestra, graduada en décimas de ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml.

9.2.6 Cromatógrafo apto para trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser calentado hasta 250-300 °C y sistema de regulación que permita controlar la temperatura con un error de ± 1,0 °C. Equipado con programador de temperatura capaz de llevar la temperatura del horno de 60 °C a 180 °C a una velocidad de 4 °C/min. Provisto de regulación independiente de la temperatura del inyector, que podrá ser calentado a una temperatura superior por lo menos en 50° a la máxima alcanzable por el horno provisto de un sistema de detección sensible, de ionización de llama de hidrógeno, que pueda ser mantenido a la temperatura de la columna, a unos 50 °C por encima de la del horno.

9.2.7 Registrador con una tensión de entrada adecuada a la salida del amplificador del cromatógrafo, con una velocidad de respuesta mínima capaz de producir la deflexión completa de la escala en un segundo; y una velocidad de desplazamiento del papel de 5 mm/min, que permita la posibilidad de variar esta velocidad, acelerando o retardando el desplazamiento.

9.2.8 Tubo de nitrógeno a presión, utilizable como gas portador, debiendo tener una riqueza mínima del 99,8 por 100.

9.2.9 Tubos de hidrógeno y aire a presión necesarios para el caso en que se utilice detector de llama de hidrógeno. El hidrógeno deberá tener una riqueza mínima del 99,8 por 100, debiendo estar seco. Como medida de seguridad, es muy conveniente colocar a la entrada de los gases en el cromatógrafo, sendos tubos de desecación, provistos de tamiz molecular 13X.

9.2.10 Columna cromatográfica.

9.2.10.1 Columna que satisfaga las condiciones que se indican en 9.6.1.

9.2.10.2 Columna de vidrio con diámetro interior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm. Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100 mallas), conteniendo de 2,5 a 5 por 100 de un poliéster, recomendándose cualquiera de los tres siguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS); etilenglicolsuccinato o adipato (EGS o EGA): polietilenglicoladipato (PEGA).

Antes de emplear una columna nueva en la resolución de problemas analíticos, debe ser acondicionada, eliminando todos aquellos productos volátiles que perturbarían la marcha de la cromatografía. Para ello, se monta en el cromatógrafo, sin conectarla al detector, y se calienta el horno a unos 10 °C por encima de la temperatura máxima a que vaya a ser utilizada la columna en trabajos posteriores; haciendo pasar, al mismo tiempo, una corriente de nitrógeno de 30 a 40 ml/minuto, que se mantiene durante veinticuatro horas como mínimo. La columna será apta para su utilización si, una vez conectada al detector y en funcionamiento normal, la línea base dibujada por el registrador acusa la estabilidad del sistema.

9.3 Reactivos.

9.3.1 Metanol absoluto (99,8 por 100).

9.3.2 Hidróxido potásico, en lentejas.

9.3.3 Éter de petróleo o hexano. Éter de petróleo (p. e.: 40-60 °C), cuyo contenido en benceno no sea superior a 0,1 por 100. Hexano normal, que cumpla las mismas especificaciones del éter de petróleo.

9.3.4 Heptano normal, con una riqueza mínima del 99 por 100.

9.3.5 Disolución 2 N de hidróxido potásico en metanol. Disolver 11,2 g de hidróxido potásico en 100 ml de metanol.

9.3.6 Ésteres metílicos de pureza adecuada para su utilización como patrones de cromatografía gaseosa.‒Se dispondrá de los ésteres metílicos de los ácidos mencionados a continuación, debiendo tener una pureza mínima de 99 por 100, determinada por cromatografía gaseosa:

Ácido butanoico (butírico).

Ácido pentanoico (valeriánico).

Ácido hexanoico (caproico).

Ácido octanoico (caprílico).

Ácido decanoico (cáprico).

Ácido dodecanoico (láurico).

Ácido tetradecanoico (mirístico).

Ácido hexadecanoico (palmítico).

Ácido octadecanoico (esteárico).

Ácido 9-octadecanoico (oleico).

Ácido 9,12 octadecadienoico (linoléico).

Ácido sicosanoico (aráquico).

9.3.7 Solución de referencia I.‒En un matraz aforado de 50 ml se pesa, con exactitud de ± 0,1 mg, 1 g de pentanoato de metilo, disolviéndolo en heptano normal y completando hasta el enrase.

9.3.8 Solución de referencia II.‒En un matraz aforado de 100 ml se pesa, con exactitud de ± 0,1 mg, 200 g de pentanoato de metilo, disolviéndolo en heptano normal y completando hasta el enrase.

9.4 Procedimiento.

9.4.1 Preparación de los ésteres metílicos.

En un matraz de fondo redondo de 50 ml, pesar con exactitud de ± 0,1 mg, 1 g de grasa. Añadir 10 ml de éter de petróleo o hexano y agitar suavemente hasta disolución de la grasa.

En el caso de que se quiera efectuar una determinación cuantitativa de los ácidos butírico y caproico en la muestra, agregar a la disolución en éter de petróleo de la grasa 1 ml, exactamente medido, de la solución de referencia más adecuada; para muestras conteniendo de 1-4 por 100 de ácido butírico se utilizará la solución de referencia I; para muestras conteniendo menos de 1 por 100 de ácido butírico se utilizará la solución de referencia II.

Si se desea efectuar solamente un análisis completo de la fracción de ácidos grasos, para lo que se aplica el método de normalización interna, no será necesario el empleo de solución de referencia.

A la solución en éter de petróleo de la muestra, adicionada o no de solución de referencia, agregar 0,5 ml de disolución 2 N de hidróxido potásico. Agitar suavemente la mezcla hasta que se ponga transparente, para lo cual son suficientes unos veinte a treinta segundos. Casi inmediatamente después de observar la clarificación de la solución suele apreciarse un enturbiamiento debido a la separación de glicerol, que se sedimenta rápidamente.

Inmediatamente después de terminada la reacción y observada la sedimentación, tomar la cantidad necesaria con la jeringa e inyectar en el cromatógrafo; una demora en la inyección de los ésteres metílicos daría lugar a la formación de jabones, con error en la determinación.

9.4.2 Determinación cromatográfica.

9.4.2.1 Condiciones de trabajo.

Temperatura de la columna: Temperatura programada de 60 °C a 160 °C, con una velocidad de 4 ºC/minuto.

Temperatura del inyector: 200 °C.

Temperatura del detector: 200 °C.

Gas portador: Nitrógeno (o helio) con un flujo de 60 ml/min.

Flujo de hidrógeno y aire para la alimentación del detector: Los flujos dependerán del tipo de detector utilizado, debiendo determinarse previamente para optimizar la respuesta.

El registro obtenido del cromatograma debe satisfacer las condiciones que se indican a continuación; caso contrario, se repite la inyección modificando la cantidad inyectada o la sensibilidad de trabajo hasta obtener un cromatograma satisfactorio.

Los requisitos exigidos son los siguientes:

Una vez conseguido un registro satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la pluma la línea base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el papel con el registro para la identificación de los picos y/o cálculos cuantitativos.

9.4.2.2 Identificación de los picos.‒Se seguirán los criterios establecidos en el apartado 9.6.2.

9.4.2.3 Determinaciones cuantitativas.‒La determinación cuantitativa se basa en el principio de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la mezcla son proporcionales a las áreas comprendidas dentro de los triángulos dibujados debajo de cada pico. El área de cada triángulo se obtiene trazando rectas tangentes a las líneas dibujadas en el registro, prolongándolas hasta su intersección con la línea base y multiplicando la altura del triángulo por la mitad de la base. En el caso de haber trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico, se referirán todas las medidas a una misma sensibilidad del registrador, multiplicando la altura por el factor de atenuación correspondiente en cada caso, y el valor de la altura así corregida por la mitad de la base.

9.4.3 Determinación del contenido de los ácidos butírico y caproico en la materia grasa.‒Esta determinación se realiza por el método del patrón interno, siendo el patrón elegido el pentanoato de metilo.

9.4.3.1 Preparación de la mezcla de calibración.‒Con una exactitud de ± 0,1 mg y en un matraz aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg de cada uno de los siguientes patrones: butanoato de metilo, pentanoato de metilo y caproato de metilo. Se disuelve la mezcla de heptano normal y se diluye completando hasta el enrase.

Inyectar la cantidad necesaria de la solución anterior, normalmente 0,2-0,4 μl, para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar los máximos de los picos en una posición del 70-80 por 100 del recorrido total de la pluma del registrador. Los tres picos deberán registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluirá la solución anterior con heptano normal en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí más del 1 por 100.

9.4.4 Análisis cuantitativo de la totalidad de los componentes de la fracción de ácidos grasos, comprendiendo del C₄ al C₂₀ y C_18:3.

9.4.4.1 Preparación de la mezcla de calibración.‒Determinar previamente el factor de corrección para cada ácido componente de la mezcla, referido a uno cualquiera de ellos que se toma como patrón, eligiéndose normalmente para este fin el ácido palmítico, y debiendo tener la mezcla de calibración una composición análoga a la de la mezcla problema.

Para ello, si no se conoce previamente el orden de composición del problema, se realizará una determinación cromatográfica de orientación, realizándose en el registro la cuantificación de los componentes suponiendo el mismo factor de respuesta para todos ellos, efectuando un reparto proporcional entre las áreas medidas.

En un matraz aforado de 50 ml, pesar, con una exactitud de ± 0,1 mg, cantidades de los ésteres metílicos patrones que se indican a continuación proporcionales a las cifras de composición encontradas en el análisis de orientación anteriormente aludido, o previstas con anterioridad para la muestra. Los patrones que deben pesarse son los siguientes: butanoato de metilo; hexanoato de metilo, octanoato de metilo, decanoato de metilo, dodecanoato de metilo, tetradecanoato de metilo; hexadecanoato de metilo, octadecanoato de metilo, oleato de metilo, linoleato de metilo y eicosanoato de metilo. Se disuelve la mezcla de heptano normal agregando la cantidad adecuada de disolvente en relación al peso total de ésteres metílicos que se hayan pesado; para unos 500 mg en total, se deben emplear, como orientación, unos 50 ml de heptano. A continuación, inyectar 0,2-0,4 μl para que trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar el máximo del pico correspondiente al componente mayoritario, en una posición del 70-80 por 100 del recorrido total de la pluma del registrador. Todos los picos deben registrarse a la misma sensibilidad, lo cual suele ser perfectamente factible en la grasa de leche; en aquellos casos en que la relación entre el pico mayoritario y el pico minoritario no permita registrar este último con las dimensiones adecuadas para efectuar una cuantificación correcta de su área, se podrá efectuar el cambio necesario en la atenuación del registro, procurando que ésta no sobrepase la relación de 4:1. Si fuese necesario, se diluirá la solución con heptano normal en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí más del 1 por 100.

9.5 Cálculos.

9.5.1 Cálculo de los factores de corrección para los ácidos butírico y caproico.‒Se determinan las áreas de los tres picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado 5.4, y se calculan los dos factores correspondientes al C₄ y C₆, con la fórmula siguiente:

Siendo:

f_x = factor de corrección del ácido x.

x = cantidad pesada del ácido x.

A_p = área medida en el registro para el patrón de pentanoato.

A_x = área medida en el registro para el ácido x.

P = peso del patrón pentanoato.

9.5.2 Cálculo del contenido de ácidos.‒Los contenidos de ácido butírico y ácido caproico en la muestra de grasa se calculan por la fórmula siguiente:

f_x = factor de corrección determinado para cada ácido, según se indica en el párrafo anterior.

A_x = área medida en el registro para el ácido.

P = peso del patrón interno (pentanoato).

A_p = Área medida en registro para el patrón interno.

M = peso de la muestra de grasa.

9.5.3 Cálculo de los factores de corrección.‒Una vez determinadas las áreas de todos los picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado 9.4.2.2, se calcula el factor de cada Ácido, referido al ácido palmítico tomado como unidad, utilizando la fórmula que se incluye en el apartado 9.5.1, sustituyendo el área A_p y el peso P del compuesto patrón por los valores correspondientes al palmitato de metilo.

9.5.4 Cálculo de composición de la fracción de ácidos grasos.‒Se calcularán las áreas corregidas de cada uno de los componentes de la fracción multiplicando el área medida en el registro por el factor de corrección determinado según se indica en el apartado anterior. El contenido de cada componente vendrá dado por la expresión:

Siendo:

fx = factor de corrección del componente x.

Ax = área medida en el registro para el componente x.

Σ (fx • Ax) = suma de todas las áreas corregidas correspondientes a los componentes de la fracción.

9.6 Observaciones.