Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al

Prueba del negro Sudán

3. Pruebas de aglutinación serológica

La mejor manera de observar la aglutinación de células de R. solanacearum en líquido bacteriano o extractos de tejido sintomático es utilizando anticuerpos validados (véase el apéndice 3) etiquetados con marcadores coloreados apropiados tales como células rojas de Staphylococcus aureus o partículas coloreadas de látex. Si se utiliza un equipo comercializado (véase el apéndice 3), siga las instrucciones del fabricante. En caso contrario, aplique el procedimiento siguiente:

4. Aislamiento selectivo

4.1 Siembra en medio selectivo

Nota: Antes de utilizar este método por primera vez, efectúe pruebas preliminares a fin de garantizar una detección reproducible de 10³ a 10⁴ unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml añadido a extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos.

Utilizar un medio selectivo validado adecuado tal como SMSA (modificado por Elphinstone et al., 1996; véase el apéndice 2).

Es preciso diferenciar R. solanacearum de otras bacterias que pueden desarrollar colonias en el medio. Además, las colonias de R. solanacearum pueden mostrar morfologías atípicas si las placas están superpobladas o si también contienen bacterias antagonistas. Cuando se sospeche la existencia de efectos de la competencia o el antagonismo, deberá volver a analizarse la muestra con otro método.

Para lograr la máxima sensibilidad con este método, utilizar extractos de muestras recién preparados. Sin embargo, este método también puede aplicarse a extractos que se hayan almacenado con glicerol entre –68 y –86°C.

Como controles positivos, preparar diluciones decimales de una suspensión de 10⁶ cfu por ml de una cepa virulenta biovar 2 de R. solanacearum (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar toda posibilidad de contaminación, preparar controles positivos totalmente separados de las muestras que van a analizarse.

Deberá examinarse la adecuación para el crecimiento del patógeno de cada lote recién preparado de un medio selectivo antes de utilizarlo para analizar muestras rutinarias.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

4.1.1 Aplicar una técnica de dilución en placas apropiada a fin de garantizar la dilución de cualquier población saprofita formadora de colonias que pudiera existir. Extender 50-100 µl por placa de extracto de muestra y de cada dilución.

4.1.2 Incubar las placas a 28°C. Leer las placas 48 horas después, y posteriormente a diario hasta un máximo de seis días. Las colonias típicas de R. solanacearum en el medio SMSA son de color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas y, tras tres días de incubación, se vuelven de color rosa a rojo sangre en el centro con rayas o espirales internas (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota: En algunos casos se forman colonias atípicas de R. solanacearum en este medio. Estas pueden ser pequeñas, redondas, completamente rojas y no fluidas, o sólo parcialmente fluidas y, por tanto, difíciles de distinguir de las bacterias saprofitas formadoras de colonias.

4.1.3 Purificar las presuntas colonias de R. solanacearum tras el estriado o la dilución en placas en un medio nutritivo general a fin de obtener colonias aisladas (véase el apéndice 2).

4.1.4 Almacenar los cultivos a corto plazo en agua estéril (pH 6-8, sin cloro) a temperatura ambiente en la oscuridad, o a largo plazo en un medio crioprotector adecuado entre –68 y –86°C o liofilizado.

4.1.5 Identificar los presuntos cultivos (véase la sección VI. B) y efectuar una prueba de patogenicidad (véase la sección VI. C).

Interpretación de los resultados de la siembra en medio selectivo

La siembra en medio selectivo es negativa si no se observan colonias bacterianas al cabo de seis días ni se encuentran presuntas colonias típicas de R. solanacearum, siempre que no haya sospechas de inhibición producida por la competencia o el antagonismo de otras bacterias y que en los controles positivos se encuentren colonias típicas de R. solanacearum.

La siembra en medio selectivo es positiva si se aíslan presuntas colonias de R. solanacearum.

4.2 Procedimiento de enriquecimiento

Utilizar un medio de enriquecimiento validado como el caldo Wilbrink modificado (véase el apéndice 2).

Este procedimiento puede utilizarse para incrementar selectivamente las poblaciones de R. solanacearum en extractos de muestras e incrementar la sensibilidad de la detección. Asimismo, este procedimiento diluye efectivamente los inhibidores de la reacción PCR (1:100). Sin embargo, debe señalarse que el enriquecimiento de R. solanacearum puede fallar debido a la competencia o el antagonismo de organismos saprofitas, que en muchos casos se enriquecen simultáneamente. Por este motivo, el aislamiento de R. solanacearum a partir de cultivos de caldos enriquecidos puede resultar difícil. Además, debido a que pueden incrementarse las poblaciones de saprofitos serológicamente afines, se recomienda la utilización de anticuerpos monoclonales específicos en lugar de anticuerpos policlonales cuando se aplique la prueba ELISA.

4.2.1 Para el enriquecimiento PCR, transferir 100 µl de extracto de muestras a 10 ml de caldo de enriquecimiento (apéndice 2) previamente alicuotados en tubos o matraces sin ADN. Para el enriquecimiento ELISA, pueden utilizarse proporciones más elevadas de extracto de muestras en el caldo (por ejemplo, 100 µl en 1,0 ml de caldo de enriquecimiento).

4.2.2 Incubar durante 72 horas entre 27 y 30°C en un cultivo agitado o un cultivo estático manteniendo el tapón del tubo sin apretar para que haya aireación.

4.2.3 Mezclar adecuadamente antes de utilizar en las pruebas ELISA o PCR.

4.2.4 Tratar el caldo enriquecido de manera idéntica a la muestra o las muestras de las pruebas anteriormente mencionadas.

Nota: Si se prevé una inhibición o un enriquecimiento de R. solanacearum debido a las elevadas poblaciones de determinadas bacterias saprofitas competidoras, pueden conseguirse mejores resultados con el enriquecimiento de extractos de muestras antes de cualquier centrifugación o con otras medidas de concentración.

5. Prueba de inmunofluorescencia (prueba IF)

Principio

Se recomienda utilizar la prueba IF como principal prueba de selección debido a su capacidad demostrada para alcanzar los límites requeridos.

Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de selección y su lectura sea positiva, deberá efectuarse la prueba de aislamiento, PCR o FISH como segunda prueba de selección. Cuando se utilice la prueba IF como segunda prueba de selección y su lectura sea positiva, deberá efectuarse una nueva prueba con arreglo al diagrama de flujo para completar el análisis.

Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. solanacearum (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/ Home/main). Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución más elevada en la que se produce una reacción óptima cuando se analiza una suspensión que contenga de 10⁵ a 10⁶ células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum, utilizando un conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) apropiado, según las recomendaciones del fabricante. Todo el antisuero policlonal validado debe presentar un título IF de al menos 1:2000. Durante el análisis, deberán utilizarse los anticuerpos en diluciones de trabajo cercanas o equivalentes al título.

La prueba debería efectuarse en extractos de muestras recién preparados. En caso necesario, puede realizarse con éxito enextractos almacenados entre –68 y –86°C en glicerol. El glicerol puede eliminarse de la muestra si se añade 1 ml de tampón de precipitado (véase el apéndice 4), se recentrifuga durante 15 minutos a 7.000 g y se resuspende en un volumen equivalente de tampón de precipitado. En muchos casos no es necesario efectuar este procedimiento, especialmente si las muestras se han fijado en los portaobjetos mediante flameado.

Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homóloga o de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 3, punto B, y opcionalmente en tampón.

Cuando sea posible, deberá utilizarse tejido naturalmente infectado (mantenido por liofilización o congelación entre –16 y –24°C) como control similar en el mismo portaobjetos.

Pueden utilizarse como controles negativos alícuotas de extracto de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos de R. solanacearum.

En el apéndice 3 se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.

Utilizar portaobjetos de pocillos múltiples, de preferencia con diez pocillos de 6 mm de diámetro como mínimo.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

5.1 Preparar los portaobjetos según uno de los procedimientos siguientes

Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) de una dilución de 1/100 del precipitado de patata resuspendido en el primer pocillo. A continuación, echar con una pipeta un volumen similar de precipitado sin diluir (1/1) en los pocillos restantes de la fila. La segunda fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1.

ii) Para otros precipitados:

Preparar diluciones decimales (1/10 y 1/100) del precipitado resuspendido en tampón de precipitado. Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada dilución en una fila de pocillos. La segunda fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 2.

5.2 Secar las gotitas a temperatura ambiente o calentándolas entre 40 y 45°C. Fijar las células bacterianas al portaobjetos calentándolo (15 minutos a 60°C), flameándolo con etanol del 95% o con arreglo a las instrucciones específicas de los suministradores de los anticuerpos.

En caso necesario, pueden almacenarse a continuación portaobjetos fijos en un recipiente desecado durante el menor tiempo que resulte necesario (hasta un máximo de 3 meses) antes de efectuar nuevas pruebas.

5.3 Procedimiento IF

Preparar un conjunto de diluciones a 1/2. El primer pocillo deberá contener 1/2 del título (T/2), los otros ¼ del título (T/4), 1/2 del título (T/2), el título (T) y el doble del título (2T).

ii) Si el portaobjetos se ha preparado según el punto 5.1.ii):

Preparar la dilución de trabajo (DT) del anticuerpo en el tampón IF. La dilución de trabajo afecta a la especificidad.

Figura 1. Preparación del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.i) y 5.3.i)

Figura 2. Preparación del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.ii) y 5.3.ii)

5.3.1 Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido. Cubrir cada pocillo completamente con la dilución o diluciones de anticuerpos. El volumen de anticuerpos aplicado en cada pocillo debe ser como mínimo equivalente al volumen de extracto aplicado.

En caso de que no existan instrucciones específicas de los suministradores de los anticuerpos deberá aplicarse el siguiente procedimiento:

5.3.2 Dejar en incubación los portaobjetos en papel húmedo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25°C).

5.3.3 Sacudir las gotitas de cada portaobjetos y enjuagar cuidadosamente con tampón IF. Lavar por inmersión durante cinco minutos en tampón IF-Tween (apéndice 4) y posteriormente en tampón IF. Evitar la transferencia de aerosoles o gotitas que pudiera provocar contaminaciones cruzadas. Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad secándolo suavemente.

5.3.4 Colocar los portaobjetos en papel húmedo. Cubrir los pocillos con la dilución del conjugado FITC utilizado para determinar el título. El volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser idéntico al volumen de anticuerpos aplicado.

5.3.5 Dejar en incubación los portaobjetos en papel húmedo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25°C).

5.3.6 Sacudir las gotitas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (5.3.3).

Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad.

5.3.7 Echar con una pipeta 5 a 10 µl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M (apéndice 4) o un volumen de solución comercial que proteja la fluorescencia (antifading) en cada pocillo y colocar un cubreobjetos.

5.4 Lectura de la prueba IF

5.4.1 Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitación del FITC, con aceite o agua de inmersión y a 500-1 000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que presenten un bajo número de células o ninguna, deben observarse como mínimo 40 campos microscópicos.

En primer lugar, comprobar el control positivo. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas en el título de anticuerpos o la dilución de trabajo determinados. La prueba IF (sección VI.A.5) debe repetirse si la tinción no es correcta.

5.4.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con morfología característica de R. solanacearum en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo en la misma dilución de anticuerpos. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.

Deberá repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contaminación. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren células positivas debido a la contaminación del tampón o si se encuentran células positivas (fuera de los pocillos de los portaobjetos) en la superficie.

5.4.3 Existen varios problemas inherentes a las características específicas de la prueba de inmunofluorescencia. En los precipitados de cuñas basales de patata y los precipitados de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de R. solanacearum.

5.4.4 Tener solamente en cuenta las células fluorescentes con tamaño y morfología típicos en el título o la dilución de trabajo de los anticuerpos, tal como se describe en 5.3.

5.4.5 Interpretación de la lectura de la prueba IF:

La lectura IF es positiva en las muestras con un mínimo de 5 × 10³ células típicas por ml de precipitado resuspendido. Se considera entonces que la muestra puede estar contaminada y deben efectuarse otras pruebas,

ii) la lectura IF es negativa en las muestras con menos de 5 × 10³ células por ml de precipitado resuspendido, y se considera negativa la muestra. No es preciso efectuar más pruebas.

6. Prueba de reacción en cadena de la polimerasa (prueba PCR)

Principios

Cuando se utilice la prueba PCR como principal prueba de selección y dé resultados positivos, deberá efectuarse la prueba de aislamiento o la IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la PCR como segunda prueba de selección y dé resultados positivos, deberán efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico.

La aplicación de este método como principal método de selección sólo se recomienda en el caso de que se hayan adquirido conocimientos especializados del mismo.

Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de 10³ a 10⁴ células de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos. Puede ser necesario llevar a cabo experimentos de optimización para lograr niveles máximos de sensibilidad y especificidad en todos los laboratorios.

Utilizar reactivos y protocolos PCR validados (véase el apéndice 6). Seleccionar preferiblemente un método con control interno.

Tomar las precauciones adecuadas para evitar la contaminación de la muestra con el ADN buscado. La prueba PCR debe ser efectuada por técnicos experimentados, en laboratorios especializados en biología molecular, con el fin de reducir al máximo la posibilidad de contaminación con el ADN buscado.

Como muestras finales del procedimiento siempre deben efectuarse controles negativos (para la extracción de ADN y los procedimientos PCR) que dejen constancia de si se ha producido arrastre de ADN.

En la prueba PCR deben incluirse los siguientes controles negativos:

– extracto de la muestra que previamente haya proporcionado resultados negativos para R. solanacearum,

– controles de los tampones utilizados para extraer la bacteria y el ADN de la muestra,

– mezcla para la reacción PCR.

Deben incluirse los siguientes controles positivos:

– alícuotas de precipitados resuspendidos a los que se ha añadido R. solanacearum (para la preparación véase el apéndice 3, punto B),

– una suspensión de 10⁶ células por ml de R. solanacearum en agua de un aislado virulento (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3, punto B),

– siempre que sea posible, utilizar asimismo ADN extraído de las muestras de control positivas en la prueba PCR.

Para evitar toda posible contaminación, preparar los controles positivos en un entorno distinto al de las muestras que vayan a analizarse.

Los extractos de muestras deben contener la cantidad mínima de tierra posible. En determinados casos puede ser recomendable preparar los extractos a partir de patatas lavadas cuando vayan a utilizarse protocolos PCR.

En el apéndice 3 se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.

6.1 Métodos de purificación del ADN

Utilizar muestras de control positivas y negativas como se indica más arriba (véase el apéndice 3).

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

Existen diferentes métodos para purificar el ADN buscado a partir de sustratos de muestras complejas, separando de esta manera los inhibidores de PCR y otras reacciones enzimáticas y concentrando el ADN buscado en el extracto de la muestra. Se ha optimizado el método siguiente para su utilización con los métodos PCR validados mostrados en el apéndice 6.

1) verter con una pipeta 220 µl de tampón de lisis [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] en un tubo eppendorf de 1,5 ml;

2) añadir 100 µl de extracto de muestra y colocar en un calentador o al baño maría a 95°C durante diez minutos;

3) colocar el tubo en hielo durante cinco minutos;

4) añadir 80 µl de solución estándar de lisozima (50 mg de lisozima por ml en 10 mM Tris HCl, pH 8,0) e incubar a 37°C durante 30 minutos;

5) añadir 220 µl de solución A Easy DNA® (Invitrogen), mezclar adecuadamente por agitación e incubar a 65°C durante 30 minutos;

6) añadir 100 µl de solución B Easy DNA® (Invitrogen) y agitar vigorosamente hasta que el precipitado se mueva libremente en el tubo y la muestra sea uniformemente viscosa;

7) añadir 500 µl de cloroformo y agitar hasta que disminuya la viscosidad y la mezcla sea homogénea;

8) centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4°C para separar las fases y formar la interfase;

9) transferir la fase superior a un tubo Eppendorf sin utilizar;

10) añadir 1 ml de etanol al 100% (– 20°C), agitar brevemente e incubar en hielo durante diez minutos;

11) centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4°C y retirar el etanol del precipitado;

12) añadir 500 µl de etanol al 80% (– 20°C) y mezclar invirtiendo el tubo;

13) centrifugar a 15.000 g durante diez minutos a 4°C, guardar el precipitado y retirar el etanol;

14) dejar que el precipitado se seque al aire o en un Speed Vac de ADN;

15) resuspender el precipitado en 100 µl de agua ultrapura estéril y dejar a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos;

16) almacenar a –20°C hasta que se necesite para la prueba PCR;

17) centrifugar todo precipitado blanco y utilizar 5 µl del sobrenadante que contenga ADN para la prueba PCR.

Pueden aplicarse otros métodos de extracción del ADN, como por ejemplo Qiagen DNeasy Plant Kit, siempre que se haya demostrado que son igual de eficaces en la purificación del ADN a partir de muestras de control que contengan de 10³ a 10⁴ células patógenas por ml.

6.2 PCR

6.2.1 Preparar plantillas de ensayo y de control para la prueba PCR con arreglo a los protocolos validados (sección VI.A.6). Preparar una dilución decimal de extracto de ADN de la muestra (1:10 en agua ultrapura).

6.2.2 Preparar la mezcla de reacción PCR apropiada en un entorno sin contaminación de acuerdo con los protocolos publicados (apéndice 6). Cuando sea posible, se recomienda utilizar un protocolo PCR multiplex que incorpore asimismo un control interno de la prueba PCR.

6.2.3 Añadir de 2 a 5 µl de extracto de ADN por 25 µl de reacción PCR en tubos PCR estériles con arreglo a los protocolos PCR (véase el apéndice 6).

6.2.4 Incorporar una muestra de control negativo que contenga sólo mezcla de reacción PCR y añadir la misma fuente de agua ultrapura utilizada en la mezcla PCR en lugar de la muestra.

6.2.5 Colocar los tubos en el mismo termociclador utilizado en las pruebas preliminares y aplicar el programa PCR optimizado adecuado (apéndice 6).

6.3 Análisis del producto de la PCR

6.3.1 Resolver los amplicones PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Aplicar como mínimo 12 µl de mezcla de reacción de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 µl de tampón de carga (apéndice 6) en 2,0% (w/v) de geles de agarosa en un tampón de tris-acetatoEDTA (TAE) (apéndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar un marcador de ADN adecuado, por ejemplo, 100 pb ladder.

6.3.2 Revelar las bandas de ADN tiñéndolas con bromuro de etidio (0,5 mg/l) durante 30 a 60 minutos, tomando las precauciones adecuadas para el manejo de este mutágeno.

6.3.3 Observar el gel teñido mediante transiluminación en UV de onda corta (λ = 302 nm) para productos de la PCR amplificados del tamaño esperado (apéndice 6) y anotar los resultados.

6.3.4 En relación con todos los nuevos descubrimientos o casos, para verificar la autenticidad del amplicón PCR efectuar un análisis de la enzima de restricción en una muestra del ADN restante amplificado incubando a la temperatura óptima y durante el tiempo necesario con una enzima y un tampón apropiados (véase el apéndice 6). Resolver los fragmentos digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa, al igual que antes, y observar el patrón característico del fragmento de restricción con transiluminación UV una vez teñido con bromuro de etidio y comparar con el control positivo no digerido y digerido.

Interpretación de los resultados de la prueba PCR

La prueba PCR es negativa si el amplicón PCR específico de R. solanacearum del tamaño esperado no se detecta en la muestra en cuestión pero sí se detecta en todas las muestras de controles positivos (en caso de PCR multiplex con cebadores de control interno específicos de la planta, se debe amplificar con la muestra en cuestión un segundo producto PCR del tamaño esperado).

La prueba PCR es positiva si se detecta el amplicón PCR específico de R. solanacearum del tamaño y patrón de restricción esperado (cuando se exija), siempre que no se amplifique a partir de ninguna de las muestras de control negativo. La confirmación fiable de un resultado positivo puede obtenerse también repitiendo la prueba con un segundo conjunto de cebadores de la PCR (apéndice 6).

Nota: Puede sospecharse la inhibición de la PCR si el amplicón esperado se obtiene a partir de la muestra de control positivo que contiene R. solanacearum en agua, pero se obtienen resultados negativos de los controles positivos con R. solanacearum en extracto de patata. En protocolos PCR multiplex con controles PCR internos, la inhibición de la reacción se indica cuando no se obtiene ninguno de los dos amplicones.

Puede sospecharse la existencia de contaminación si el amplicón esperado se obtiene a partir de uno o varios de los controles negativos.

7. Prueba de hibridación fluorescente in situ (prueba FISH)

Principio

Cuando se utilice la prueba FISH como primera prueba de selección y esta proporcione resultados positivos, deberá efectuarse la prueba de aislamiento o la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la prueba FISH como segunda prueba de selección y dé resultados positivos, deberán efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico.

Nota: Utilizar oligosondas específicas para R. solanacearum validadas (véase el apéndice 7). Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de al menos 10³ a ¹⁰⁴ células de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos.

El procedimiento siguiente debería efectuarse, a ser posible, con extracto de muestra recién preparado, pero también puede realizarse con éxito con extracto de muestra que se haya almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre –16 y –24°C o entre –68 y –86°C.

Utilizar como controles negativos alícuotas de extracto de muestras que hayan dado previamente resultados negativos para R. solanacearum.

Como controles positivos, preparar suspensiones que contengan de 10⁵ a 10⁶ células por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo la cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3) en tampón de fosfato de 0,01 M de un cultivo de tres a cinco días. Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homóloga o de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 3, punto B.

El uso de una oligosonda eubacteriana con etiqueta FITC ofrece un control para el proceso de hibridación, ya que teñirá todas las eubacterias presentes en la muestra.

En el apéndice 3, punto A, se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

7.1 Fijación del extracto de patata

El protocolo siguiente se basa en Wullings et al. (1998).

7.1.1 Preparar la solución de fijación (véase el apéndice 7).

7.1.2 Verter 100 µl de cada extracto de muestra en un tubo eppendorf y centrifugar durante siete minutos a 7 000 g.

7.1.3 Separar el sobrenadante y disolver el precipitado en 200 µl de solución fijadora preparada con menos de 24 horas de antelación. Agitar e incubar durante una hora en el refrigerador.

7.1.4 Centrifugar durante siete minutos a 7 000 g, separar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 µl de tampón de fosfato de concentración 0,01 M (véase el apéndice 7).

7.1.5 Colocar 16 µl de las suspensiones fijadas en un portaobjetos múltiple limpio, tal como muestra la figura 7.1. Aplicar dos muestras diferentes por portaobjetos sin diluir y utilizar 10 µl para realizar una dilución a 1:100 (en tampón de fosfato de concentración 0,01 M). La solución de la muestra restante (49 µl) puede almacenarse a –20°C tras la adición de 1 volumen de etanol al 96 %. En caso de que sea necesario repetir la prueba FISH, separar el etanol mediante centrifugación y añadir un volumen equivalente de tampón de fosfato de concentración 0,01 M (mezclar mediante agitación).

Figura 7.1. Distribución del portaobjetos para la prueba FISH.

7.1.6 Secar los portaobjetos al aire (o con secador de portaobjetos a 37°C) y fijarlos flameándolos.

El procedimiento puede interrumpirse en esta fase, pudiéndose proseguir con la hibridación al día siguiente. Los portaobjetos deben almacenarse secos y sin polvo a temperatura ambiente.

7.2 Hibridación

7.2.1 Deshidratar las células en series de etanol escalonadas al 50%, 80% y 96% durante un minuto cada una. Secar las preparaciones en un portaobjetos.

7.2.2 Preparar una cámara de incubación húmeda recubriendo el fondo de una caja hermética con papel de seda o de filtro empapado en 1x hybmix (apéndice 7). Preincubar la caja en el horno de hibridación a 45°C durante un mínimo de diez minutos.

7.2.3 Aplicar 10 µl de solución de hibridación (apéndice 7) a ocho pocillos (pocillos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 y 10; véase la figura 7.1) de cada portaobjetos dejando vacíos los dos pocillos centrales (3 y 8).

7.2.4 Aplicar cubreobjetos (24 × 24 mm) al primer y a los cuatro últimos pocillos evitando la entrada de aire. Colocar los portaobjetos en la cámara húmeda precalentada y dejar que se produzca la hibridación durante cinco horas a 45°C en la oscuridad.

7.2.5 Preparar tres vasos de precipitado que contengan 1 l de agua Milli Q (grado molecular), 1 l de 1x hybmix (334 ml 3x hybmix y 666 ml agua Milli Q) y 1 l de 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix y 958 ml agua Milli Q). Preincubarlos al baño maría a 45°C.

7.2.6 Quitar los cubreobjetos de las preparaciones y colocar estas en un portaobjetos.

7.2.7 Lavar el exceso de sonda mediante incubación durante 15 minutos en el vaso de precipitado con 1x hybmix a 45°C.

7.2.8 Transferir el portaobjetos a una solución de lavado de hybmix a 1/8 e incubar durante otros 15 minutos.

7.2.9 Sumergir las preparaciones brevemente en agua Milli Q y colocarlas en papel de filtro. Eliminar el exceso de humedad cubriendo la superficie con cuidado con papel de filtro. Verter de 5 a 10 µl de solución de montaje protectora de la fluorescencia (por ejemplo Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, o equivalente) en cada pocillo y aplicar un cubreobjetos grande (24 × 60 mm) sobre la totalidad de la preparación.

7.3 Lectura de la prueba FISH

7.3.1 Los portaobjetos deben examinarse inmediatamente utilizando un microscopio epifluorescente a 630 o 1.000 aumentos con aceite de inmersión. Con un filtro adecuado para isotiocianato de fluoresceína (FITC), las células eubacterianas (incluida la mayoría de las células gramnegativas) de la muestra aparecen teñidas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina-5-isotiocianato, las células de R. solanacearum marcadas con Cy3 aparecen teñidas de rojo fluorescente. Comparar la morfología de las células con la de los controles positivos. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas. La prueba FISH (sección VI.A.7) debe repetirse si la tinción es aberrante. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que presenten un bajo número de células o ninguna, deben observarse como mínimo 40 campos microscópicos.

7.3.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con la morfología característica de R. solanacearum en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente o mejor que la de la cepa de control positivo. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.

7.3.3 Deberá repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contaminación. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren células positivas debido a la contaminación del tampón o si se encuentran células positivas (fuera de los pocillos de los portaobjetos) en la superficie.

7.3.4 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba FISH. En los precipitados de cuñas basales de patata y de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de R. solanacearum, aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF.

7.3.5 Ténganse en cuenta únicamente las células fluorescentes de tamaño y morfología típicos.

7.3.6 Interpretación de los resultados de la prueba FISH.

ii) Los resultados de la prueba FISH serán negativos cuando no se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante con un tamaño y morfología típicos de R. solanacearum utilizando el filtro de rodamina, siempre que se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante típicas en las preparaciones de control positivo cuando se utilice el filtro de rodamina.

8. Pruebas de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)

Principio

Las pruebas ELISA solamente pueden utilizarse como prueba opcional además de las pruebas IF, PCR o FISH, debido a la sensibilidad relativamente baja de esta prueba. Cuando se utilice ELISA-DASI, es obligatorio efectuar un enriquecimiento y utilizar anticuerpos monoclonales (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Puede resultar de utilidad efectuar un enriquecimiento de las muestras antes de utilizar la prueba ELISA, a fin de incrementar la sensibilidad de la prueba, pero puede fracasar debido a la competencia de otros organismos en la muestra.

Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. solanacearum (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución más elevada en la que se produce una re-acción óptima cuando se analiza una suspensión que contenga de 10⁵ a 10⁶ células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum, utilizando conjugados de anticuerpos secundarios apropiados, según las recomendaciones del fabricante. Durante el análisis, deben utilizarse los anticuerpos en diluciones de trabajo cercanas o equivalentes a la formulación comercial.

Determinar el título de los anticuerpos en una suspensión de 10⁵ a 10⁶ células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum.

Incluir una muestra de extracto que haya dado previamente resultados negativos para R. solanacearum y una suspensión de una bacteria que no tenga reacción cruzada en tampón fosfato salino (PBS) como controles negativos.

Como control positivo utilizar alícuotas de extracto de muestra que haya dado previamente resultados negativos, mezcladas con 10³ a 10⁴ células por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3, puntos A y B). Para la comparación de los resultados de cada placa utilizar una suspensión normalizada de 10⁵ a 10⁶ células por ml en PBS de R. solanacearum. Debe asegurarse que los controles positivos estén bien separados en la placa de microtitulación de la muestra o las muestras analizadas.

En el apéndice 3, punto A, se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

Se han validado dos protocolos ELISA:

1) utilizar de 100 a 200 µl de alícuotas de extracto de muestra. (Si se calienta a 100°C durante cuatro minutos al baño maría o un calentador pueden reducirse en algunos casos los resultados no específicos.);

2) añadir un volumen igual de tampón de tapizado de doble concentración (apéndice 4) y agitar;

3) aplicar 100 µl de alícuotas en al menos dos pocillos de una placa de microtitulación (por ejemplo, Nunc-Polysorp o equivalente) e incubar durante una hora a 37°C o durante una noche a 4°C;

4) quitar los extractos de los pocillos. Lavar estos tres veces con PBS-Tween (apéndice 4), dejando en ellos la última solución de lavado durante al menos cinco minutos;

5) preparar la dilución adecuada de anticuerpos contra R. solanacearum en tampón de bloqueo (apéndice 4). Para anticuerpos comerciales validados, utilizar las diluciones recomendadas (normalmente una concentración que duplique el título);

6) añadir 100 µl a cada pocillo e incubar durante una hora a 37°C;

7) quitar la solución de anticuerpos de los pocillos y lavar como se describe en el punto 4;

8) preparar la dilución adecuada de conjugado de fosfatasa alcalina de anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo. Añadir 100 µl a cada pocillo e incubar durante una hora a 37°C;

9) quitar los anticuerpos conjugados de los pocillos y lavar como se describe en el punto 4;

10) añadir 100 µl de solución de sustrato de fosfatasa alcalina (apéndice 4) a cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente y leer la absorbencia a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

1) preparar la dilución adecuada de inmunoglobulinas policlonales contra R. solanacearum en tampón de bloqueo de pH 9,6 (apéndice 4). Añadir 200 µl a cada pocillo. Incubar a 37°C de cuatro a cinco horas o a 4°C durante 16 horas;

2) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apéndice 4).

Añadir 190 µl de extracto de muestra en al menos dos pocillos. Añadir asimismo controles positivos y negativos en dos pocillos de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4°C;

3) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apéndice 4);

4) preparar una dilución apropiada de anticuerpos monoclonales específicos de R. solanacearum en PBS (apéndice 4) que contenga asimismo 0,5% de seroalbúmina bovina (BSA) y añadir 190 µl a cada pocillo. Incubar a 37°C durante dos horas;

5) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apéndice 4);

6) preparar una dilución apropiada de inmunoglobulinas anti-ratón conjugadas con fosfatasa alcalina en PBS. Añadir 190 µl a cada pocillo. Incubar a 37°C durante dos horas;

7) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apéndice 4);

8) preparar una solución de sustrato de fosfatasa alcalina que contenga 1 mg de p-nitrofenil fosfato por ml de tampón de substrato (apéndice 4). Añadir 200 µl a cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente y leer la absorbencia a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

Interpretación de los resultados de la prueba ELISA

La prueba ELISA es negativa si la lectura media de la densidad óptica (DO) de los pocillos de cada muestra duplicada es < 2 veces la DO del pocillo de control del extracto de muestra negativa, siempre y cuando todas las DO de los controles positivos sean superiores a 1,0 (tras 90 minutos de incubación con el substrato) y sean más de dos veces superiores a la DO obtenida a partir de extractos de muestra negativa.

La prueba ELISA es positiva si las lecturas medias de la DO de los pocillos de cada muestra duplicada es > 2 veces la DO en el pocillo del extracto de muestra negativa, siempre y cuando las lecturas de DO en todos los pocillos de control negativo sean < 2 veces las de los pocillos de control positivo.

Las lecturas ELISA negativas en pocillos de control positivo indican que no se ha efectuado correctamente la prueba o que ha estado inhibida. Las lecturas ELISA positivas en pocillos de control negativo indican que se ha producido contaminación cruzada o unión de anticuerpos no específicos.

9. Prueba de bioensayo

Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de 10³ a 10⁴ unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos (para la preparación véase el apéndice 3).

Se puede alcanzar la máxima sensibilidad de detección cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cultivo sean las óptimas. No obstante, este método puede aplicarse también con éxito a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre –68 y –86°C.

El protocolo siguiente se basa en Janse (1988):

9.1 Utilizar diez plantas de prueba de un cultivar de tomate sensible (por ejemplo, Moneymaker o cultivar con sensibilidad equivalente determinado por el laboratorio de análisis) en la fase de la tercera hoja verdadera para cada muestra. Para más detalles de cultivo, véase el apéndice 8. Otra alternativa es utilizar berenjenas (por ejemplo, cultivar Black Beauty o cultivares con sensibilidad equivalente), únicamente plantas en fase de hoja 23 hasta la plena expansión de la tercera hoja verdadera. Se ha observado que los síntomas son menos graves y que se desarrollan más lentamente en la berenjena. Por tanto, cuando sea posible se recomienda utilizar plántulas de tomate.

9.2 Distribuir 100 µl de extracto de muestra entre las plantas analizadas.

9.2.1 Inoculación con jeringa.

Inocular los tallos de las patatas justo por encima de los cotiledones con una jeringa provista de una aguja hipodérmica (no menos de 23G). Distribuir la muestra entre las plantas analizadas.

9.2.2 Inoculación en estrías.

Sosteniendo la planta entre dos dedos, aplíquese con una pipeta una gota (de unos 5-10 µl) del precipitado en suspensión en el tallo situado entre los cotiledones y la primera hoja.

Con un bisturí estéril practicar una incisión diagonal de aproximadamente 1,0 cm de largo y una profundidad de aproximadamente 2/3 del grosor del tallo, comenzando el corte a partir de la gota del precipitado.

Sellar el corte con vaselina estéril utilizando una jeringa.

9.3 Inocular con la misma técnica cinco plantones con una suspensión acuosa de 10⁵ a 10⁶ células por ml preparada a partir de un cultivo de 48 horas de una cepa biovar 2 virulenta de R. solanacearum como control positivo y con tampón de precipitado (apéndice 4) como control negativo. Separar las plantas de control positivo y negativo de las otras para evitar la contaminación cruzada.

9.4 Cultivar las plantas de prueba en instalaciones de cuarentena hasta un máximo de cuatro semanas entre 25 y 30°C con elevada humedad relativa, regándolas adecuadamente para evitar que se aneguen o se marchiten por deficiencia hídrica. Para evitar la contaminación se deben incubar las plantas de control positivo y negativo en bancos claramente separados en un invernadero o cámara de cultivo; en el caso de que se disponga de un espacio reducido, garantizar la estricta separación entre tratamientos. En el caso de que deban incubarse juntas plantas para distintas muestras, deben separarse con las pantallas adecuadas. Durante la fertilización, el riego, la inspección y cualquier otra manipulación deben extremarse las precauciones para evitar la contaminación cruzada. Es esencial mantener los invernaderos y las cámaras libres de toda plaga de insectos, ya que estos pueden transmitir la bacteria de una muestra a otra.

Comprobar si se aprecian síntomas de marchitamiento, epinastia, clorosis y/o crecimiento reducido.

9.5 Aislarlas de las plantas infectadas (sección II.3) e identificar cultivos purificados de presunta R. solanacearum (sección VI. B).

9.6 Si no se observan síntomas después de tres semanas, efectuar una prueba IF/PCR/Aislamiento en una muestra mixta de secciones de 1 cm del tallo de cada planta analizada, tomadas por encima del punto de inoculación. Si la prueba es positiva, efectuar una dilución en placas (sección 4.1).

9.7 Identificar cualquier cultivo purificado de presunta R. solanacearum (sección VI. B).

Interpretación de los resultados de la prueba del bioensayo

Se obtienen resultados válidos de la prueba del bioensayo cuando las plantas del control positivo muestran síntomas típicos, pueden reaislarse las bacterias de estas plantas y no se encuentran síntomas en los controles negativos.

La prueba del bioensayo es negativa si las plantas analizadas no están infectadas por R. solanacearum, siempre que se detecte R. solanacearum en los controles positivos.

La prueba del bioensayo es positiva si las plantas analizadas están infectadas por R. solanacearum.

B. PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

Identificar cultivos puros de aislados de presunta R. solanacearum utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios biológicos diferentes.

Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada (véase el apéndice 3).

1. Pruebas de identificación nutricional y enzimática

Determinar las propiedades fenotípicas siguientes que estén universalmente presentes o ausentes en R. solanacearum, de acuerdo con los métodos de Lelliott y Stead (1987), Klement et al. (1990) y Schaad (2001).

Pruebas	Resultado esperado
Producción de pigmento fluorescente	–
Inclusiones de poli-β-hidroxibutirato	+
Prueba de la oxidación/fermentación	O+/F–
(O/F)
Actividad catalasa	+
Prueba de oxidasa de Kovac	+
Reducción de nitratos	+
Utilización de citratos	+
Crecimiento a 40°C	–
Crecimiento en NaCl al 1%	+
Crecimiento en NaCl al 2%	–
Actividad de dihidrolasa de arginina	–
Licuefacción de la gelatina	–
Hidrólisis del almidón	–
Hidrólisis de la esculina	–
Producción de levano	–

2. Prueba IF

2.1 Preparar una suspensión de aproximadamente 10⁶ células por ml en tampón IF (apéndice 4).

2.2 Preparar una serie de diluciones a 1/2 de un antisuero adecuado (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3 Aplicar el procedimiento IF (sección VI.A.5).

2.4 La prueba IF será positiva si el título IF del cultivo es equivalente al del control positivo.

3. Prueba ELISA

Nota: Si solamente se efectúan dos pruebas de identificación, no debe utilizarse ninguna otra prueba serológica además de este método.

3.1 Preparar una suspensión de aproximadamente 10⁸ células por ml en 1X PBS (apéndice 4).

3.2 Llevar a cabo un procedimiento ELISA adecuado con un anticuerpo monoclonal específico de R. solanacearum.

3.3 La prueba ELISA será positiva si la lectura ELISA obtenida del cultivo es como mínimo la mitad de la obtenida para el control positivo.

4. Prueba PCR

4.1 Preparar una suspensión de aproximadamente 10⁶ células por ml en agua estéril de grado molecular.

4.2 Calentar 100 µl de la suspensión celular en tubos cerrados en un calentador o al baño maría a 100°C durante cuatro minutos. Las muestras pueden almacenarse entonces a una temperatura de –16 a –24°C hasta que sea necesario.

4.3 Aplicar los procedimientos PCR adecuados para amplificar los amplicones específicos de R. solanacearum [por ejemplo, Seal et al. (1993); Pastrik y Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997); Weller et al. (1999)].

4.4 Se logrará la identificación positiva de R. solanacearum si los amplicones de la PCR son del mismo tamaño y tienen los mismos polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción que los de la cepa de control positivo.

5. Prueba FISH

5.1 Preparar una suspensión de aproximadamente 10⁶ células por ml en agua ultrapura.

5.2 Aplicar el procedimiento FISH (sección VI.A.7) con al menos dos oligosondas específicas para R. solanacearum(apéndice 7).

5.3 La prueba FISH será positiva si se obtienen las mismas reacciones del cultivo y el control positivo.

6. Perfiles de ácidos grasos (Fatty acid profiling o FAP)

6.1 Mantener el cultivo en agar de tripticasa de soja (Oxoide) durante 48 horas a 28°C.

6.2 Aplicar un procedimiento FAP adecuado (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3 La prueba FAP será positiva si el perfil del presunto cultivo es idéntico al del control positivo. Los ácidos grasos cuya presencia es característica son 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH y 18:1 2OH, y la ausencia de 16:0 3OH es altamente indicativa de Ralstonia sp.

7. Métodos de caracterización de las cepas

Se recomienda efectuar la caracterización de las cepas con uno de los métodos siguientes para cada nuevo caso de aislamiento de R. solanacearum.

Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada (véase el apéndice 3).

7.1 Determinación de los biovares

R. solanacearum se separa en biovares en función de la capacidad para utilizar y/o oxidar tres disacáridos y tres hexosas alcohólicas (Hayward, 1964 y Hayward et al., 1990). Los medios nutritivos para la prueba del biovar se describen en el apéndice 2. Esta prueba puede efectuarse con éxito inoculando los medios por perforación con cultivos puros de aislados de R. solanacearum e incubando a 28°C. Si los medios se distribuyen en placas estériles de cultivo de células de 96 pocillos (200 µl por pocillo) puede observarse en un plazo de 72 horas un cambio de color, del verde oliva al amarillo, lo que indica un resultado positivo de la prueba.

	1	2	3	4	5
	Biovar	Biovar	Biovar	Biovar	Biovar
Utilización de:
Maltosa	-	+	+	-	+
Lactosa	-	+	+	-	+
D (+) Celobiosa	-	+	+	-	+
Manitol	-	-	+	+	+
Sorbitol	-	-	+	+	-
Dulcitol	-	-	+	+	-

El biovar 2 se diferencia en subfenotipos mediante pruebas adicionales

	Biovar 2A (distribución mundial)	Biovar 2A (en Chile y Colombia)	Biovar 2T (en áreas tropicales)
Utilización de trehalosa	-	+	+
Utilización de meso-inositol	+	-	+
Utilización de D (-) ribosa	-	-	+
Actividad pectolítica	baja	baja	alta

(1) Véase Lelliott y Stead (1987).

7.2 Obtención de la huella dactilar genómica

La diferenciación molecular de las cepas en el complejo de R. solanacearum puede conseguirse mediante diferentes técnicas, entre las que se incluyen:

7.2.1 Análisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2 PCR de secuencia repetitiva utilizando cebadores REP, BOX y ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3 Análisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento amplificado (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3 Métodos PCR

Pueden utilizarse cebadores específicos de PCR (Pastrik et al, 2002; véase el apéndice 6) para diferenciar cepas que pertenezcan a la división 1 (biovares 3, 4 y 5) y la división 2 (biovares 1, 2A y 2T) de R. solanacearum, tal como se define originalmente con el análisis RFLP (Cook et al., 1989) y la secuenciación de 16S rADN (Taghavi et al., 1996).

C. PRUEBA DE CONFIRMACIÓN DE PATOGENICIDAD

Como confirmación final del diagnóstico de R. solanacearum y para la evaluación de la virulencia de cultivos identificados como R. solanacearum debe realizarse la prueba de patogenicidad:

1) preparar un inóculo de aproximadamente 10⁶ células por ml de cultivos de 24 a 48 horas a partir del aislado que se vaya a someter a prueba y una cepa de control positivo adecuada de R. solanacearum (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3);

2) inocular entre cinco y diez tallos de plántulas de tomate o berenjena sensibles en la fase de la tercera hoja verdadera (véase la sección VI.A.9);

3) incubar durante un máximo de dos semanas a una temperatura de 25 a 28°C, con humedad relativa alta y riego adecuado, evitando tanto el estancamiento del agua como el estrés provocado por la sequía. Con los cultivos puros deberá obtenerse el marchitamiento típico en el plazo de 15 días. Si después de este período no se presentan los síntomas, no podrá confirmarse que el cultivo es una forma patógena de R. solanacearum;

4) comprobar si se aprecian síntomas de marchitamiento y/o epinastia, clorosis y crecimiento reducido;

5) aislar las plantas sintomáticas separando una sección de tallo que esté 2 cm por encima del punto de inoculación. Dilacerar y suspender en un pequeño volumen de agua destilada estéril o en tampón fosfato 50 mM (apéndice 4). Aislar de la suspensión mediante dilución, extendiendo o haciendo estrías en un medio adecuado, preferentemente en un medio selectivo (apéndice 2), incubar entre 48 y 72 horas a 28°C y examinar la formación de colonias típicas de R. solanacearum.

Apéndice 1

Laboratorios que han participado en la optimización y la validación de los protocolos

Laboratorio (1)	Ciudad	País
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit	Viena y Linz	Austria
Departement Gewasbescherming	Merelbeke	Bélgica
Plantedirektoratet	Lyngby	Dinamarca
Central Science Laboratory	York	Inglaterra
Scottish Agricultural Science Agency	Edimburgo	Escocia
Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité Bactériologie	Angers	Francia
Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre	Le Rheu	Francia
Biologische Bundesanstalt	Kleinmachnow	Alemania
Pflanzenschutzamt Hannover	Hannover	Alemania
State Laboratory	Dublín	Irlanda
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali	Bolonia	Italia
Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari	Verona	Italia
Nederlandse Algemene Keuringsdienst	Emmeloord	Países Bajos
Plantenziektenkundige Dienst	Wageningen	Países Bajos
Direcção-Geral de Protecção das Culturas	Lisboa	Portugal
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia	Salamanca	España
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias	Valencia	España
Swedish University of Agricultural Sciences	Uppsala	Suecia

(1) Científicos de contacto: véase el sitio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Apéndice 2

Medios para el aislamiento y el cultivo de R. solanacearum

Agar nutritivo (NA)

Agar nutritivo (Difco): 23,0 g.

Agua destilada: 1,0 l.

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Agar de levadura, glucosa, peptona (YPGA)

Extracto de levadura (Difco): 5,0 g.

Bacto-peptona (Difco): 5,0 g.

D(+)-glucosa (monohidrato): 10,0 g.

Bacto-agar (Difco): 15,0 g.

Agua destilada: 1,0 l.

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Agar de sacarosa y peptona (SPA)

Sacarosa: 20,0 g.

Bacto-peptona (Difco): 5,0 g.

K₂HPO₄: 0,5 g.

MgSO₄.7H₂O: 0,25 g.

Bacto-agar (Difco) 15,0 g.

Agua destilada: 1,0 l.

pH 7,2-7,4

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Medio de tetrazolio de Kelman

Casaminoácidos (Difco): 1,0 g.

Bacto-peptona (Difco): 10,0 g.

Dextrosa: 5,0 g.

Bacto-agar (Difco): 15,0 g.

Agua destilada: 1,0 l.

Cristal violeta (Sigma): 5 mg por l.

Polimixina-B-Sulfato: (Sigma P-1004) 600.000 U (aproximadamente 100 mg) por l.

Bacitracina (Sigma B-0125): 1 250 U (aproxim. 25 mg) por l.

Cloranfenicol (Sigma C-3175): 5 mg por l.

Penicilina-G (Sigma P-3032): 825 U (aproximadamente 0,5 mg) por l.

Cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (Sigma) 50 mg por l.

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Enfriar a 50°C y añadir una solución de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (Sigma), esterilizada por filtración, para conseguir una concentración final de 50 mg/l.

Medio SMSA (Englebrecht, 1994, modificado por Elphinstone et al., 1996).

Medio de base

Casaminoácidos (Difco): 1,0 g.

Bacto-peptona (Difco): 10,0 g.

Glicerol: 5,0 ml.

Bacto-agar (Difco) (véase la nota 2): 15,0 g.

Agua destilada: 1,0 l.

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Enfriar a 50°C y añadir soluciones estándar acuosas, esterilizadas por filtración, de los siguientes ingredientes, a fin de obtener las concentraciones finales especificadas.

Nota:

1. La utilización de reactivos diferentes de los especificados arriba puede afectar al crecimiento de R. solanacearum.

2. Puede utilizarse Agar oxoide #1 en lugar de Bactoagar (Difco). En este caso, el crecimiento de R. solanacearum será más lento, aunque también puede reducirse el crecimiento de saprofitas competidoras. Las colonias típicas de R. solanacearum pueden necesitar de uno a dos días más para formarse y la coloración rojiza puede ser más ligera y difusa que en Bacto-agar.

3. Si se incrementa la concentración de bacitracina a 2 500 U por l pueden reducirse las poblaciones de bacterias competidoras sin que se vea afectado el crecimiento de R. solanacearum.

Almacenar los medios y las soluciones estándar de antibióticos a 4°C en la oscuridad y utilizar en el plazo de un mes.

Las placas deberán carecer de condensación de superficie antes de su utilización.

Evitar un secado excesivo de las placas.

Deberá efectuarse un control de calidad tras la preparación de cada nuevo lote de medio mediante siembra de una suspensión de un cultivo de referencia de R. solanacearum (véase el apéndice 3) y observación de la formación de colonias típicas después de incubación a 28°C de dos a cinco días.

Caldo SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Preparar como para medio de agar selectivo SMSA pero omitir Bacto-agar y cloruro de 2,3,5-tetrazolio.

Caldo Wilbrink modificado (Caruso et al., 2002).

Sacarosa: 10 g.

Peptona proteosa: 5 g.

K₂HPO₄: 0,5 g.

MgSO₄: 0,25 g.

NaNO₃: 0,25 g.

Agua destilada: 1 l.

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos y enfriar a 50°C.

Añadir soluciones estándar de antibióticos como para el caldo SMSA.

Apéndice 3

A. Material de control normalizado comercialmente disponible

Se recomiendan los siguientes aislados bacterianos para su utilización como material normalizado de referencia, bien como controles positivos (cuadro 1) o durante la optimización de las pruebas para evitar reacciones cruzadas (cuadro 2). Todas las cepas están comercializadas por:

1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Reino Unido.

2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Países Bajos.

3. Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP) — INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francia.

Cuadro 1. Panel de referencia SMT de aislados de R. solanacearum

Código NCPPB	SMT#	Otros códigos	País de origen	Biovar
NCPPB 4153	6	CFBP 4582, Pr 3020, EURS11	Egipto	2
NCPPB 4154	10	CFBP 4585, 550, EURS21	Turquía	2
NCPPB 3857	12	CFBP 4587, Pr 1140, EURS26	Inglaterra	2
NCPPB 1584	23	CFBP 4598, EURS49	Chipre	2
NCPPB 2505	24	CFBP 4599, EURS50	Suecia	2
NCPPB 4155	26	CFBP 4601, 502, EURS55	Bélgica	2
NCPPB 4156 (*)	71(*)	PD 2762, CFBP 3857	Países Bajos	2
NCPPB 4157	66	LNPV 15.59	Francia	2
NCPPB 4158	39	CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066	Portugal	2
NCPPB 4160	69	IVIA-1632-2	España	2
NCPPB 4161	76	B3B	Alemania	2
NCPPB 325	41	CFBP 2047, KEL60-1, R842	Estados Unidos	1
NCPPB 3967	42	CFBP 4610, R285, GONg7	Costa Rica	1
NCPPB 4028	43	CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205	Colombia	2
NCPPB 3985	44	CFBP 4612, R578, CIP312	Perú	2T
NCPPB 3989	45	CFBP 4613, R568, CIP226	Brasil	2T
NCPPB 3996	46	CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225	Perú	3
NCPPB 3997	47	CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a	Australia	3
NCPPB 4029	48	CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861	Sri Lanka	4
NCPPB 4005	49	CFBP 4616, R470	Filipinas	4
NCPPB 4011	50	CFBP 4617, R288, HEmps2	China	5

(*) Utilizar como cepa normalizada de referencia de R. solanacearum biovar 2 (raza 3).

Nota: La autenticidad de las cepas mencionadas solamente puede garantizarse.

Cuadro 2. Panel de referencia SMT de bacterias serológica o genéticamente relacionadas para su utilización en la optimización de las pruebas de detección

Código NCPPB	SMT #	Otro código	Identificación
NCPPB 4162	51	CFBP 1954	Bacillus polymyxa (1)
NCPPB 4163	52	CFBP 1538	Pseudomonas marginalis pv. Marginalis (1)
NCPPB 4164	–	CFBP 2227	Burkholderia cepacia (2)
NCPPB 4165	–	CFBP 2459	Ralstonia pickettii (2)
NCPPB 4166	58	CFBP 3567 CSL Pr1150	Ralstonia pickettii (1)
NCPPB 4167	60	CFBP 4618 PD 2778	Ralstonia sp. (1)
NCPPB 1127	53	CFBP 3575	Burkholderia andropogonis (1)
NCPPB 353	54	CFBP 3572	Burkholderia caryophylli (1)
NCPPB 945	55	CFBP 3569	Burkholderia cepacia (1)
NCPPB 3708	56	CFBP 3574	Burkholderia glumae (1)
NCPPB 3590	57	CFBP 3573	Burkholderia plantarii (1)
NCPPB 3726	59	CFBP 3568	Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3)
NCPPB 4168	61	CFBP 4619 IPO S339	Enterobacter sp. (1)
NCPPB 4169	62	IPO 1695	Enterobacter sp. (1)
NCPPB 4170	63	CFBP 4621 IPO S306	Ochrobactrum anthropi (1) (2)
NCPPB 4171	64	CFBP 4622 IPO 1693	Curtobacterium sp. (1) (2)
NCPPB 4172	65	IPO 1 696.ª	Pseudomonas sp. (1)
NCPPB 4173	–	PD 2318	Aureobacterium sp. (2)
NCPPB 4174	81	IVIA 1844.06	Flavobacterium sp. (1) (2)

(1) Cepa que puede presentar reacción cruzada en pruebas serológicas (IF y/o ELISA) con antisueros policlonales.

(2) Cepa de la que puede amplificarse el producto de la PCR en algunos laboratorios de un tamaño similar al esperado utilizando cebadores específicos OLI1 y Y-2 (véase el apéndice 6).

(3) Probablemente tendrá reacciones cruzadas en la mayor parte de las pruebas, pero solamente se conoce su aparición en bananas en Indonesia.

El siguiente material de control normalizado puede obtenerse a partir de un cultivo NCPPB:

Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tubérculos de patata sanos como control negativo para todas las pruebas.

Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tubérculos de patata sanos que contengan de 10³ a 10⁴ y 10⁴ a 10⁶ células de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como controles positivos para pruebas serológicas y PCR. Teniendo en cuenta que la viabilidad de las células se ve afectada durante la criodesecación, no son adecuados como controles normalizados para pruebas de aislamiento o de bioensayo.

Utilizar suspensiones fijadas con formalina de R. solanacearum biovar 2 (cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de 10⁶ células por ml como controles positivos para pruebas serológicas.

B. Preparación de controles positivos y negativos

Preparar un cultivo de 48 horas de una cepa virulenta de R. solanacearum raza 3/biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) en medio base SMSA y suspender en tampón fosfato 10 mM para obtener una densidad celular de aproximadamente 2 × 10⁸ cfu por ml. Esto se obtiene normalmente mediante una suspensión ligeramente turbia equivalente a una densidad óptica de 0,15 a 600 nm.

Separar las cuñas basales de 200 tubérculos de una variedad de piel blanca conocida por estar exenta de R. solanacearum.

Procesar las cuñas basales como es habitual y resuspender el precipitado en 10 ml.

Preparar diez microviales estériles de 1,5 ml con 900 µl del precipitado resuspendido.

Transferir 100 µl de la suspensión de R. solanacearum al primer microvial. Homogeneizar por agitación.

Establecer niveles decimales de contaminación realizando nuevas diluciones en los cinco microviales siguientes.

Los seis microviales contaminados se utilizarán como controles positivos. Los cuatro microviales no contaminados se utilizarán como controles negativos. Etiquetar los microviales como corresponda.

Preparar alícuotas de 100 µl en microviales estériles de 1,5 ml para obtener de este modo nueve réplicas de cada muestra de control. Almacenar a una temperatura de –16 a –24°C hasta que se vayan a utilizar.

La presencia y la cuantificación de R. solanacearum en las muestras de control deberá confirmarse en primer lugar mediante una prueba IF.

Para la prueba PCR, extraer ADN de las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensayo.

Para las pruebas IF y FISH, realizar ensayos con las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensayo.

En las pruebas IF, FISH y PCR, debe detectarse R. solanacearum en al menos 10⁶ y 10⁴ células/ml de los controles positivos y en ninguno de los controles negativos.

Apéndice 4

Tampones para procedimientos de ensayo

GENERAL: Los tampones esterilizados que no se hayan abierto pueden almacenarse hasta un año.

1. Tampones para el procedimiento de extracción

1.1 Tampón de extracción (tampón fosfato 50 mM, pH 7,0)

Este tampón se utiliza para la extracción de la bacteria del tejido de las plantas mediante la homogeneización o la agitación.

Na₂HPO₄ (anhidro): 4,26 g.

KH₂PO₄: 2,72 g.

Agua destilada: 1,00 l.

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Los siguientes componentes adicionales pueden resultar útiles:

	Finalidad	Cantidad (por l)
Copos de Lubrol	Defloculante (*)	0,5 g
Compuesto DC silicona antiespumante	Antiespumante (*)	1,0 ml
Pirofosfato tetrasódico	Antioxidante	1,0 g
Polivinilpirrolidona-40000 (PVP-40)	Unir los inhibidores PCR	50 g

(*) Para su utilización en el método de extracción por homogeneización.

1.2 Tampón de precipitado (tampón fosfato 10 mM, pH 7,2)

Este tampón se utiliza para la resuspensión y la dilución de extractos de cuñas basales de tubérculos de patata tras la concentración en un precipitado mediante centrifugación.

Na₂HPO₄.12H₂O: 2,7 g.

NaH₂PO₄.2H₂O: 0,4 g.

Agua destilada: 1,0 l.

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

2. Tampones para la prueba IF