Real Decreto 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al

2.1 Tampón IF [tampón fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2]

Este tampón se utiliza para la dilución de anticuerpos.

Na₂HPO₄.12H₂O: 2,7 g.

NaH₂PO₄.2H₂O: 0,4 g.

NaCl: 8,0 g.

Agua destilada: 1,0 l.

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

2.2 Tampón IF-Tween

Este tampón se utiliza para lavar los portaobjetos.

Añadir 0,1% de Tween 20 al tampón IF.

2.3 Solución de glicerol con tampón de fosfato, pH 7,6

Este tampón se utiliza como fluido de montaje en los pocillos de los portaobjetos de IF para aumentar la fluorescencia.

Na₂HPO₄.12H₂O: 3,2 g.

NaH₂PO₄.2H₂O: 0,15 g.

Glicerol: 50 ml.

Agua destilada: 100 ml.

En el mercado pueden encontrarse soluciones de montaje que protegen la fluorescencia, como, por ejemplo, Vectashield® (Vector Laboratories) o Citifluor® (Leica).

3 Tampones para la prueba ELISA-indirecto

3.1 Tampón fuerza doble para tapizado, pH 9,6

Na₂CO₃: 6,36 g.

NaHCO₃: 11,72 g.

Agua destilada: 1,00 l.

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Puede añadirse como antioxidante sulfito de sodio (0,2%) si es necesario para evitar la acumulación de compuestos aromáticos oxidados.

3.2 Tampón fosfato salino (PBS), 10X pH 7,4

NaCl: 80,0 g.

KH₂PO₄: 2,0 g.

Na₂HPO₄.12H₂O: 29,0 g.

KCl: 2,0 g.

Agua destilada: 1,0 l.

3.3 PBS-Tween

PBS 10X: 100 ml.

Tween 20 al 10%: 5 ml.

Agua destilada: 895 ml.

3.4 Tampón de bloqueo (anticuerpos) (debe prepararse en el momento de su utilización)

PBS 10X: 10,0 ml.

Polivinilpirrolidona-44000: 2,0 g.

(PVP-44).

Tween 20 al 10 %: 0,5 ml.

Leche en polvo: 0,5 g.

Agua destilada completar hasta: 100 ml.

3.5 Solución de sustrato fosfatasa alcalina, pH 9,8

Dietanolamina: 97 ml.

Agua destilada: 800 ml.

Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.

Completar hasta 1 litro con agua destilada.

Añadir 0,2 g de MgCl₂.

Disolver dos pastillas de 5 mg de sustrato fosfatasa (Sigma) por cada 15 ml de solución.

4 Tampones para la prueba ELISA-DASI

4.1 Tampón de tapizado, pH 9,6

Na₂CO₃: 1,59 g.

NaHCO₃: 2,93 g.

Agua destilada: 1000 ml.

Disolver los ingredientes y comprobar el pH.

4.2 Tampón fosfato salino (PBS), 10X pH 7,2-7,4

NaCl: 80,0 g.

NaH₂PO₄.2H₂O: 4,0 g.

Na₂HPO₄.12H₂O: 27,0 g.

Agua destilada: 1000 ml.

4.3 PBS-Tween

10X PBS: 50 ml.

Tween 20 al 10%: 5 ml.

Agua destilada: 950 ml.

4.4 Tampón de sustrato, pH 9,8

Dietanolamina: 100 ml.

Agua destilada: 900 ml.

Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.

Apéndice 5

Determinación del nivel de contaminación en las pruebas IF y FISH

1. Contar el número medio de células fluorescentes típicas por campo de visión (c).

2. Calcular el número de células fluorescentes típicas por pocillo del portaobjetos del microscopio (C):

donde:

S = superficie del pocillo del portaobjetos múltiple.

s = superficie del campo del objetivo.

donde:

i = coeficiente de campo (varía de 8 a 24 dependiendo del tipo ocular).

K = coeficiente del tubo (1 o 1,25).

G = aumentos del objetivo (100x, 40x, etc.).

3. Calcular el número de células fluorescentes típicas por ml de precipitado resuspendido (N):

donde:

y = volumen de precipitado resuspendido en cada pocillo.

F = factor de dilución del precipitado resuspendido.

Apéndice 6

Protocolos y reactivos PCR validados

Nota: Las pruebas preliminares deberán permitir la detección reproducible de al menos 10³ a 10⁴ células de R. solanacearum por ml de extracto de muestra.

Por otra parte, las pruebas preliminares no deben proporcionar resultados positivos falsos con respecto a un conjunto de cepas bacterianas seleccionadas (véase el apéndice 3).

1. Protocolo PCR de Seal et al. (1993)

1.1 Cebadores del oligonucleótido

Cebador directo OLI-1 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'

Cebador reverso Y-2 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 288 pb.

1.2 Mezcla para la reacción PCR

Reactivo	Cantidad por reacción	Concentración final
Agua ultrapura estéril	17,65 µl
10x tampón PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
Mezcla dNTP (20 mM)	0,25 µl	0,2 mM
Cebador OLI-1 (20 µM)	1,25 µl	1µM
Cebador Y-2 (20 µM)	1,25 µl	1µM
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1)	0,1 µl	0,5 U
Volumen de muestra	2,0 µl
Volumen total	25 µl

(1) El método se validó utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.

1.3 Condiciones de reacción PCR

Aplicar el siguiente programa:

1 ciclo de:

35 ciclos de:

ii) 20 segundos a 94°C (desnaturalización del molde de ADN)

iii) 20 segundos a 68°C (hibridación de los cebadores)

iv) 30 segundos a 72°C (extensión de la copia)

1 ciclo de:

vi) mantener a 4°C

Nota: Este programa se optimizó para utilizarlo con un termociclador Perkin Elmer 9600. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.

1.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Ava II tras la incubación a 37°C.

2 Protocolo PCR de Pastrik y Maiss (2000)

2.1 Cebadores del oligonucleótido

Cebador directo Ps-1 5'- agt cga acg gca gcg ggg g -3'

Cebador reverso Ps-2 5'- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3'

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 553 pb.

2.2 Mezcla para la reacción PCR.

Reactivo	Cantidad por reacción	Concentración final
Agua ultrapura estéril	16,025 µl
10x tampón PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (fracción V) (10%)	0,25 µl	0,1%
Mezcla d-nTP (20 mM)	0,125 µl	0,1 mM
Cebador Ps-1 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Cebador Ps-2 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1)	0,1 µl	0,5 U
Volumen de muestra	5,0 µl
Volumen total	25,0 µl

(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.

Nota: Originalmente optimizado para termociclador MJ Research PTC 200 con polimerasa Gibco Taq.

También pueden utilizarse Perkin Elmer AmpliTaq y tampón con las mismas concentraciones.

2.3 Condiciones de reacción PCR

Aplicar el siguiente programa:

1 ciclo de:

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)

iii) 30 segundos a 68°C (hibridación de los cebadores)

iv) 45 segundos a 72°C (extensión de la copia)

1 ciclo de:

vi) mantener a 4°C.

Nota: Este programa está optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.

2.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Taq I tras la incubación a 65°C durante 30 minutos. Los fragmentos de restricción obtenidos a partir del fragmento específico de R. solanacearum tienen un tamaño de 457 pb y 96 pb.

3. Protocolo PCR multiplex con control PCR interno (Pastrik et al., 2002)

3.1 Cebadores del oligonucleótido

Cebador directo RS-1-F 5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3'

Cebador reverso RS-1-R 5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3'

Cebador directo NS-5-F 5'- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3'

Cebador reverso NS-6-R 5'- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3'

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 718 pb (conjunto de cebadores RS).

Tamaño esperado del amplicón de control PCR interno 18S rARN = 310 pb (conjunto de cebadores NS).

3.2 Mezcla para la reacción PCR

Reactivo	Cantidad por reacción	Concentración final
Agua ultrapura estéril	12,625 µl
10x tampón PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (fracción V) (10 %)	0,25 µl	0,1%
Mezcla d-nTP (20 mM)	0,125 µl	0,1 mM
Cebador RS-1-F (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Cebador RS-1-R (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Cebador NS-5-F (10 µM) (2)	0,15 µl	0,06 µM
Cebador NS-6-R (10 µM) (2)	0,15 µl	0,06 µM
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1)	0,2 µl	1,0 U
Volumen de muestra	5,0 µl
Volumen total	25,0 µl

(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.

(2) La concentración de los cebadores NS-5-F y NS-6-R se optimizó para la extracción de cuñas basales de patata utilizando el método de homogeneización y purificación del ADN de acuerdo con Pastrik (2000) (véase la sección VI.A.6.1.a). Será necesario proceder a la reoptimización de las concentraciones de reactivos si se utilizan la extracción por agitación u otros métodos de aislamientodel ADN.

3.3 Condiciones de reacción PCR

Aplicar el siguiente programa:

1 ciclo de:

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)

iii) 30 segundos a 58°C (hibridación de los cebadores)

iv) 45 segundos a 72°C (extensión de la copia)

1 ciclo de:

vi) mantener a 4°C.

Nota: Este programa está optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.

3.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Bsm I o un Isoschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubación a 65°C durante 30 minutos.

4. Protocolo PCR específico del biovar de R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)

4.1 Cebadores del oligonucleótido

Cebador directo Rs-1-F 5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3'

Cebador reverso Rs-1-R 5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3'

Cebador reverso Rs-3-R 5'- TTC ACG GCA AGA TCG CTC -3'

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum:

con Rs-1-F/Rs-1-R = 718 pb

con Rs-1-F/Rs-3-R = 716 pb.

4.2 Mezcla para la reacción PCR

Reactivo	Cantidad por reacción	Concentración final
Agua ultrapura estéril	12,925 µl
10X tampón PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (fracción V) (10%)	0,25 µl	0,1%
Mezcla d-NTP (20 mM)	0,125 µl	0,1 mM
Cebador Rs-1-F (10 µM)	2 µl	0,8 µM
Cebador Rs-1-R (10 µM)	2 µl	0,8 µM
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1)	0,2 µl	1 U
Volumen de muestra	5,0 µl
Volumen total	25,0 µl

(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.

Reactivo	Cantidad por reacción	Concentración final
Agua ultrapura estéril	14,925 µl
10X tampón PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (fracción V) (10%)	0,25 µl	0,1%
Mezcla dNTP (20 mM)	0,125 µl	0,1 mM
Cebador Rs-1-F (10 µM)	1 µl	0,4 µM
Cebador Rs-3-R (10 µM)	1 µl	0,4 µM
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1)	0,2 µl	1 U
Volumen de muestra	5,0 µl
Volumen total	25,0 µl

(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.

4.3 Condiciones de reacción PCR

Aplicar el siguiente programa a las reacciones específicas de biovar 1/2 y biovar 3/4/5:

1 ciclo de:

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)

iii) 30 segundos a 58°C (hibridación de los cebadores)

iv) 45 segundos a 72°C (extensión de la copia)

1 ciclo de:

vi) mantener a 4°C.

Nota: Este programa se optimizó para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.

4.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando cebadores Rs-1-F y Rs-1-R producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Bsm I o un Isoschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubación a 65°C durante 30 minutos. Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando los cebadores Rs-1-F y Rs-3R no poseen sitios de restricción.

5. Preparación del tampón de carga

5.1 Azul de bromofenol (solución estándar al 10%)

Azul de bromofenol: 5 g.

Agua bidestilada: 50 ml.

5.2 Tampón de carga

Glicerol (86 %): 3,5 ml.

Azul de bromofenol (5,1) : 300 µl.

Agua bidestilada: 6,2 ml.

6. 10X tampón de tris acetato EDTA (TAE), pH 8,0

Tampón tris: 48,40 g.

Ácido acético glacial: 11,42 ml.

EDTA (sal disódica) : 3,72 g.

Agua destilada: 1,00 l.

Diluir a 1X antes de utilizarlo.

Se encuentra también disponible en el mercado (por ejemplo, Invitrogen o equivalente).

Apéndice 7

Reactivos validados para la prueba FISH

1. Oligosondas

Sonda específica para R. solanacearum OLI-1-CY3:

5'- GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3'

Sonda eubacteriana no específica EUB-338-FITC:

5'- GCT GCC TCC CGT AGG AGT -3'

2. Solución fijadora

¡ADVERTENCIA! LA SOLUCIÓN FIJADORA CONTIENE PARAFORMALDEHÍDO QUE ES TÓXICO. UTILIZAR GUANTES Y NO INHALAR. SE RECOMIENDA TRABAJAR EN UNA CAMPANA EXTRACTORA DE GASES.

ii) Ajustar el pH a 7,0 mediante la adición de 1 ml de tampón de fosfato de concentración 0,01 M y 5 gotas de 1N HCl. Verificar el pH con bandas indicadoras y ajustar si fuese necesario con HCl o NaOH. ¡ADVERTENCIA! NO UTILIZAR UN MEDIDOR DE PH EN SOLUCIONES QUE CONTENGAN PARAFORMALDEHÍDO.

iii) Filtrar la solución con un filtro de membrana de 0,22µm y mantener libre de polvo a 4°C hasta nueva utilización.

3. 3X Hybmix

NaCl: 2,7 M.

Tris-HCl: 60 mM (pH 7,4).

EDTA (filtro esterilizado con autoclave): 15 mM.

Diluir a 1X como se precisa.

4. Solución de hibridación

1X Hybmix.

Dodecilsulfato sódico (SDS): 0,01%.

Formamida: 30%.

Sonda EUB 338: 5 ng/µl.

Sonda OLI-1 o OLI-2: 5 ng/µl.

Preparar las cantidades de solución de hibridación de acuerdo con los cálculos de la tabla 1. Para cada portaobjetos (que contenga dos muestras distintas por duplicado) se precisan 90 µl de solución de hibridación. IMPORTANTE: DEBE TENERSE EN CUENTA QUE LA FORMAMIDA ES MUY TÓXICA, POR LO QUE DEBEN UTILIZARSE GUANTES Y TOMARSE LAS PRECAUCIONES DE SEGURIDAD NECESARIAS.

Tabla 1: Cantidades sugeridas para la preparación de la mezcla de hibridación

Número de portaobjetos	1	4	6	8	10
Agua ultrapura estéril	23,1	92,4	138,6	184,8	231,0
3X hybmix	30,0	120,0	180,0	240,0	300,0
SDS al 1%	0,9	3,6	5,4	7,2	9,0
Formamida	27,0	108,0	162,0	216,0	270,0
Sonda EUB 338 (100 ng/µl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Sonda OLI-1 u OLI-2 (100 ng/µl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Volumen total (µl)	90,0	360,0	540,0	720,0	900,0

Nota: Almacenar todas las soluciones que contengan oligosondas fotosensibles en la oscuridad a –20°C.

Proteger de la luz del sol o eléctrica directa durante su utilización.

5. Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0

Na₂HPO₄: 8,52 g.

KH₂PO₄: 5,44 g.

Agua destilada: 1,00 l.

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Apéndice 8

Condiciones de cultivo para el tomate y la berenjena

Sembrar semillas de tomate (Lycopersicon esculentum) o berenjena (Solanum melongena) en compost pasteurizado de semillas. Trasplantar las plántulas con los cotiledones completamente abiertos (10 a 14 días) en compost pasteurizado de tiesto.

Las berenjenas o tomates deben cultivarse en un invernadero que cumpla las siguientes condiciones medioambientales antes de la inoculación:

Duración diurna: 14 horas o día natural si es de mayor duración

Temperatura:

diurna: 21 a 24°C.

nocturna:14 a 18°C.

Variedad de tomate sensible: ‘Moneymaker’.

Variedad de berenjena sensible:‘Black Beauty’.

Proveedores: véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main.

REFERENCIAS

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26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 4449.

29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

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ANEXO III. Conservación de las pruebas analíticas en caso de aparición de un brote sospechoso

1. En cada caso de foco sospechoso para el que se haya realizado una o varias pruebas de selección con resultados positivos de acuerdo con los métodos establecidos en el anexo II para el material vegetal enumerado y para todos los otros casos, y se espere recibir confirmación o refutación por aplicación de los citados métodos, se deberá proceder a la retención y adecuada conservación, hasta completar los métodos mencionados, de:

– todos los tubérculos de los que se hayan obtenido muestras y, siempre que sea posible, todas las plantas de las que se hayan obtenido muestras,

– cualquier extracto sobrante y cualquier material adicional que se haya preparado para la prueba o pruebas de selección, como por ejemplo placas de inmunofluorescencia, y

– toda la documentación pertinente.

La retención de los tubérculos permitirá que se puedan llevar a cabo pruebas de variedades cuando se estime oportuno.

2. En el caso de confirmación de la presencia del organismo, se procederá a la retención y adecuada conservación hasta un mes después, como mínimo, en virtud del procedimiento establecido en el artículo 6, apartado 2:

– del material especificado en el punto 1, y

– de una muestra de las berenjenas o los tomates infectados inoculados con extracto de tubérculo o de planta, cuando sea adecuado, y

– del cultivo aislado del organismo.

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ANEXO IV. Elementos que deben tenerse en cuenta para la determinación de la probable contaminación

Los elementos de la investigación que dispone el artículo 6, apartado 1, letra a), inciso i), serán, cuando proceda, los siguientes:

– en los que se estén cultivando o se hayan cultivado patatas que estén relacionadas clónicamente con aquellas en las que se haya comprobado la infección por el organismo,

– en los que se estén cultivando o se hayan cultivado tomates que procedan de las mismas fuentes que aquellos en los que se haya comprobado la infección por el organismo,

– en los que se estén cultivando o se hayan cultivado patatas o tomates que se hayan puesto bajo control oficial por sospecharse la presencia del organismo,

– en los que se estén cultivando o se hayan cultivado patatas que estén relacionadas clónicamente con las que hayan sido cultivadas en lugares de producción de los que se sospeche la infección por el organismo,

– en los que se cultiven patatas o tomates y que estén localizados en las proximidades de los lugares de producción infectados, incluidos aquellos en los que se compartan equipos e instalaciones de producción directamente o por intervención de un contratista común,

– en los que se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas de superficie de cualquier fuente en la que se haya confirmado o de la que se sospeche la infección por el organismo,

– en los que se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas de superficie de una fuente explotada en común con lugares de producción en los que se haya confirmado o de los que se sospeche la infección por el organismo,

– que estén o hayan sido anegados con aguas de superficie en las que se haya confirmado o de las que se sospeche la infección por el organismo, y

ii) las aguas de superficie que se utilicen para el riego o rociamiento, o para la anegación, de un campo o campos o de un lugar o lugares de producción en los que se haya confirmado la infección

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ANEXO V. Medidas bajo control oficial

1. Al determinar, con arreglo al artículo 6, apartado 1, letra a), inciso iii), y al artículo 6, apartado 1, letra c), inciso iii), el alcance de la contaminación probable, se incluirán los elementos siguientes:

– el material vegetal indicado obtenido en un lugar de producción que haya sido declarado contaminado en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso ii),

– el lugar o lugares de producción que tengan una relación de producción con el material vegetal indicado que haya sido declarado contaminado en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), incluidos aquellos lugares que compartan equipos e instalaciones de producción directamente o por intervención de un contratista común,

– el material vegetal indicado que se haya producido en el lugar o lugares de producción contemplados en el guión anterior o que estuviera presente en tales lugares durante el tiempo en que el material vegetal indicado declarado contaminado en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), se hallara presente en el lugar de producción mencionado en el primer guión,

– las instalaciones que hayan manipulado el material vegetal indicado procedente de los lugares de producción a los que se refieren los guiones anteriores,

– cualquier maquinaria, vehículo, buque, almacén o unidades de estos y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que puedan haber estado en contacto con el material vegetal indicado declarado contaminado en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso ii),

– cualquier material vegetal indicado que haya sido almacenado o haya estado en contacto con cualquiera de las estructuras y los objetos mencionados en el guión anterior antes de la limpieza y desinfección de estos,

– como resultado de la investigación y de los análisis contemplados en el artículo 6, apartado 1, letra a), inciso i), en el caso de las patatas, aquellos tubérculos o plantas que tengan una relación clonal fraterna o parental y, en el caso del tomate, aquellas plantas que procedan de las mismas fuentes que el material vegetal indicado declarado contaminado en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), y para las cuales, aunque las pruebas de detección del organismo hayan sido negativas, parezca probable la contaminación a través de un vínculo clonal. Puede efectuarse una prueba de variedades para verificar la identidad de los tubérculos o plantas contaminados que estén relacionados clónicamente,

– el lugar o lugares de producción del material vegetal indicado a que se refiere el guión anterior,

– el lugar o lugares de producción del material vegetal indicado en los que se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas que hayan sido declaradas contaminadas en virtud del artículo 6, apartado 1, letra c), inciso ii),

– el material vegetal indicado producido en campos anegados con aguas de superficie en las que se haya confirmado la contaminación.

2. Para la determinación de la posible propagación a la que se refieren el artículo 6, apartado 1, letra a), inciso iv), y el artículo 6, apartado 1, letra c), inciso iii), deberán tenerse en cuenta los elementos siguientes:

– la proximidad de otros lugares de producción en los que se cultive el material vegetal indicado,

– la producción y utilización comunes de existencias de patatas de siembra,

– los lugares de producción en los que se utilicen aguas de superficie para el riego o rociamiento del material vegetal indicado cuando exista o haya existido el riesgo de escorrentía, o de anegamiento, de aguas superficiales procedentes de un lugar o lugares de producción que hayan sido declarados contaminados en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso ii),

ii) en los casos en que se hayan declarado contaminadas aguas de superficie en virtud del artículo 6, apartado 1, letra c), inciso ii):

– el lugar o lugares productores del material vegetal indicado contiguos a las aguas superficiales declaradas contaminadas, o que corran el riesgo de ser anegados por estas aguas,

– cualquier fuente de riego separada que se comunique de alguna forma con las aguas superficiales declaradas contaminadas,

– masas de agua conectadas con el agua superficial declarada contaminada, teniendo en cuenta:

• la dirección y el nivel de flujo del agua declarada contaminada,

• la presencia de solanáceas silvestres huésped.

3. La notificación a la que se refiere el artículo 6, apartado 2, deberá:

– efectuarse de manera inmediata una vez que la presencia del organismo haya sido confirmada por las pruebas de laboratorio con arreglo a los métodos expuestos en el anexo II, y deberá recoger, como mínimo:

• para las patatas:

• para las tomateras: el nombre de la variedad del lote y, en su caso, la categoría,

– sin perjuicio de los requisitos de notificación de la sospecha de la presencia del organismo previstos en el artículo 5, apartado 3:

• la Comunidad Autónoma en la que se haya confirmado la presencia del organismo, cuando exista un riesgo de contaminación del material vegetal indicado hacia otra u otras Comunidades Autónomas, transmitirá inmediatamente a las Comunidades Autónomas afectadas la información necesaria para cumplir el artículo 6, apartado 3, que incluye:

Cuando se suministre dicha información, la Comunidad Autónoma informará de ello inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.

• la Comunidad Autónoma en la que se haya confirmado la presencia del organismo, cuando exista el riesgo de contaminación del material vegetal indicado hacia otro u otros Estados Miembros, transmitirá inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente a los Estados Miembros afectados la información necesaria para, cumplir el artículo 6, apartado 3, que incluye:

Cuando se suministre dicha información, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación informará de ello inmediatamente a la Comisión.

• cuando exista el riesgo de contaminación del material vegetal indicado procedentes de otro u otros Estados Miembros a raíz de la correspondiente notificación o notificaciones de los mismos, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación comunicará la información recibida a las Comunidades Autónomas interesadas para, cumplir el artículo 6, apartado 3.

4. Cuando hayan finalizado todas las investigaciones, y al objeto de posibilitar la notificación adicional (complementaria), las comunidades autónomas facilitarán, para cada caso:

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ANEXO VI. Métodos oficialmente autorizados para la eliminación de residuos

1. Las disposiciones mencionadas en el artículo 7, apartado 1, serán las siguientes:

– la utilización como piensos, previo tratamiento térmico adecuado, de forma que no haya riesgo alguno de supervivencia del organismo,

o

– la eliminación en un vertedero de eliminación de residuos autorizado oficialmente en donde no exista ningún riesgo identificable de escape del organismo al medio ambiente, por ejemplo, a través de filtración a tierras agrícolas ni de contacto con fuentes de agua que puedan utilizarse para el riego de dichas tierras,

o

– la incineración,

o

– la transformación industrial mediante entrega directa e inmediata a una planta de transformación dotada de instalaciones de eliminación de residuos autorizadas oficialmente, para las que se establezca la ausencia de riesgos detectables de propagación del organismo, y de un sistema de limpieza y desinfección de los vehículos de transporte, al menos,

u

– otras medidas, siempre que se descarte el posible riesgo de propagación del organismo; dichas medidas y su justificación se notificarán inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a la Comisión y a los demás Estados miembros.

Cualquier residuo restante asociado con las opciones anteriores y derivado de ellas se eliminará con métodos autorizados oficialmente de conformidad con el anexo VII de este real decreto.

2. El uso adecuado o la eliminación del material vegetal indicado dispuestos en el artículo 7, apartado 2, deberán efectuarse bajo el control de los organismos oficiales responsables interesados, así como con la oportuna comunicación entre estos organismos para garantizar en todo momento dicho control, y con la aprobación del organismo oficial responsable de la Comunidad Autónoma donde vayan a envasarse o transformarse las patatas, en lo que se refiere a los vertederos citados en los guiones primero y segundo, y consistirán en lo siguiente:

– la utilización como patatas de consumo destinadas al consumo, envasadas para su distribución y venta directa sin cambio de envase, en un lugar dotado de instalaciones de eliminación de residuos adecuadas. Las patatas destinadas a la siembra sólo pueden manipularse en el mismo lugar si esto se realiza separadamente o tras la limpieza y desinfección,

o

– su uso como patatas de consumo para la transformación industrial y destinadas a la entrega directa e inmediata a una planta de transformación dotada de instalaciones de eliminación de residuos adecuadas y de un sistema de limpieza y desinfección de los vehículos de transporte, al menos,

o

– algún otro tipo de uso o eliminación, siempre que se establezca que no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo, y previa aprobación de los citados organismos oficiales responsables,

ii) en el caso de las otras partes de las plantas, incluidos los detritos del tallo y de las hojas,

– la destrucción,

o

– cualquier otro uso o eliminación, a condición de que se garantice que no existe riesgo identificable de dispersar el organismo, y previa aprobación de los citados organismos oficiales responsables.

3. Los métodos adecuados para la descontaminación de los objetos a los que se refiere el artículo 7, apartado 3, consistirán en una limpieza y, en su caso, una desinfección que permitan descartar todo riesgo identificable de propagación del organismo; estas operaciones se efectuarán bajo la supervisión de los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas.

4. La serie de medidas mencionadas en el artículo 7, apartado 4, que deberán aplicar las Comunidades Autónomas dentro de la zona o zonas delimitadas que se hayan establecido en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso iv), y del artículo 6, apartado 1, letra c), inciso iii), serán las siguientes:

4.1 En los casos en que, en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), se hayan declarado contaminados lugares de producción, las medidas consistirán en lo siguiente:

– se adoptarán medidas para eliminar las patatas y tomateras espontáneas así como otras plantas que puedan ser huésped del organismo, incluidas las malas hierbas solanáceas,

y

– no se plantarán:

• tubérculos, plantas ni semillas propiamente dichas de patata,

• tomateras y semillas de tomateras,

• teniendo en cuenta la biología del organismo.

• otras plantas huésped,

• plantas de especies de Brassica para las que exista un riesgo identificado de supervivencia del organismo,

• otros cultivos para los que exista un riesgo identificado de propagación del organismo,

– en la primera temporada de cultivo de patatas o tomates siguiente al período indicado en el guión anterior, y siempre que se haya comprobado que, durante al menos los dos años de vegetación inmediatamente, anteriores a la plantación, el campo estuvo libre de patatas y tomateras espontáneas y de otras plantas huésped del organismo, incluidas las malas hierbas solanáceas:

• en el caso de las patatas, solamente se autorizará la producción de patatas de consumo,

• en el caso de las patatas y los tomates, los tubérculos de patata cosechados, o las tomateras, según corresponda, serán analizados de conformidad con el procedimiento detallado en el anexo II,

– en la temporada de cultivo de patatas o tomates siguiente a la indicada en el guión anterior y tras un ciclo de rotación adecuado, que será de un mínimo de dos años si se cultivan patatas de siembra, se efectuará un examen oficial tal como se dispone el artículo 3, apartado 1,

o

ii) durante los cinco años de cultivo siguientes al de la declaración de la contaminación:

– se adoptarán medidas para eliminar las patatas y tomateras espontáneas así como otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, incluidas las malas hierbas solanáceas,

y

– durante los tres primeros años, se dejará y mantendrá el campo, bien en barbecho completo, bien para el cultivo de cereales, con arreglo al riesgo que se haya determinado, bien como pasto permanente, con siega intensa y frecuente o pastoreo intensivo, o bien como pastizal para la producción de semillas y, a continuación, en los dos años subsiguientes, se plantarán plantas que no sean huésped del organismo para las que no exista ningún riesgo identificado de supervivencia o propagación de este,

– en la primera temporada de cultivo de patatas o tomates siguiente al período indicado en el guión anterior y, siempre que se haya comprobado que, durante al menos los dos años de vegetación inmediatamente anteriores a la plantación, el campo estuvo libre de patatas y tomateras espontáneas y de otras plantas huésped del organismo, incluidas las malas hierbas solanáceas:

• en el caso de las patatas, se autorizará la producción de patatas de siembra y de consumo,

• los tubérculos de patata cosechados, o las tomateras, según corresponda, serán analizados de conformidad con el procedimiento detallado en el anexo II;

– durante el año de cultivo siguiente al de declaración de contaminación.

– o bien no se plantarán tubérculos, plantas ni semillas propiamente dichas de patata, ni cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo,

o

– en el caso de los tubérculos de patata, se podrá plantar patata de siembra oficialmente certificada, pero sólo para la producción de patata de consumo,

– en el caso de las tomateras, solamente se plantarán tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE del Consejo, de 8 de mayo de 2000, relativa a las medidas de protección contra la introducción en la Comunidad de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales y contra su propagación en el interior de la Comunidad, para la producción de fruto,

– durante el segundo año de cultivo siguiente al de declaración de contaminación.

– en el caso de las patatas, solamente se plantarán, para la producción de patatas de siembra o de consumo, patatas de siembra certificadas o patatas de siembra analizadas para determinar la inexistencia de podredumbre parda y cultivadas bajo control oficial en lugares de producción diferentes de los mencionados en el punto 4.1,

– en el caso de los tomates, solamente se plantarán tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE o, si se han propagado vegetativamente, de tomateras producidas a partir de esas semillas y cultivadas bajo control oficial en lugares de producción diferentes de los mencionados en el punto 4.1, para la producción de plantas o de fruto,

– durante al menos los tres años de cultivo siguientes a la declaración de la contaminación.

– en el caso de las patatas, se plantarán para la producción de patatas de siembra o de consumo exclusivamente patatas de siembra certificadas o patatas de siembra que se hayan cultivado bajo control oficial a partir de patatas de siembra certificadas,

– en el caso de los tomates, solamente se plantarán tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE o tomateras cultivadas bajo control oficial a partir de estas plantas, para la producción de plantas o de fruto,

– en cada uno de los años de cultivo mencionados en los guiones anteriores, se tomarán medidas para eliminar las plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, si existen, y se efectuará una inspección oficial del cultivo en crecimiento en los momentos pertinentes y, en cada campo de patatas, se efectuarán pruebas oficiales de las patatas cosechadas con arreglo al procedimiento detallado en el anexo II;

– toda la maquinaria e instalaciones de almacenamiento del lugar de producción que se utilicen en la producción de patatas o tomates se limpiarán y, en su caso, desinfectarán utilizando métodos adecuados de la forma que se dispone en el punto 3,

– con el fin de impedir la propagación del organismo, se efectuarán controles oficiales de los planes de riego y rociamiento y, en caso necesario, se prohibirán los mismos;

– no se plantarán tubérculos, plantas ni semillas propiamente dichas de patata, ni otras plantas que puedan ser huésped del organismo, incluidas tomateras y semillas de tomateras, a menos que, por una parte, la unidad de producción se haya sometido a medidas oficialmente supervisadas que, teniendo por objeto la eliminación del organismo y la retirada de todo el material vegetal huésped, incluyan, como mínimo, un cambio completo de los medios de cultivo y una limpieza y, en su caso, una desinfección de tales unidades y de todo el equipo y que, por otra parte, los organismos oficiales responsables hayan dado subsiguientemente su autorización para la producción de patatas o tomates,

y

– además, la producción procederá, en el caso de la patata, de patatas de siembra certificadas o de minitubérculos o microplantas obtenidos de fuentes analizadas,

– en cuanto a la producción de tomates, la producción deberá proceder de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE o, si se han propagado vegetativamente, de tomateras producidas a partir de estas semillas y cultivadas bajo control oficial,

– con el fin de impedir la propagación del organismo, se efectuarán controles oficiales de los planes de riego y rociamiento y, en caso necesario, se prohibirán los mismos.

4.2 Dentro de la zona delimitada, y sin perjuicio de las medidas dispuestas en el punto 4.1, las Comunidades Autónomas:

ba) en los casos en que la delimitación de la zona se haya efectuado en virtud del artículo 6, apartado 1, letra a), inciso iv):

– garantizarán que sus organismos oficiales responsables supervisen las instalaciones que cultiven, almacenen o manipulen tubérculos de patata o tomates, así como aquellas otras instalaciones que utilicen en el marco de un contrato maquinaria para la producción de patatas o tomates,

– requerirán que, para todos los cultivos de patata dentro de la zona delimitada, se planten exclusivamente semillas certificadas o semillas cultivadas bajo control oficial, y se efectúe un análisis después de cosechar los cultivos de patatas de siembra en lugares de producción determinados como probablemente contaminados según el artículo 6, apartado 1, letra a), inciso iii),

– exigirán que se manipulen por separado las existencias de patatas de siembra y de patatas de consumo recolectadas en todas las explotaciones de la zona o, cuando sea adecuado, que se efectúe una desinfección entre la manipulación de las existencias de patatas de siembra y de patatas de consumo,

– exigirán que, para todos los cultivos de tomate de la zona, solamente se planten tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE o, si se han propagado vegetativamente, de tomateras producidas a partir de estas semillas y cultivadas bajo control oficial,

– efectuarán el examen oficial que dispone el artículo 3, apartado 1;

bb) en los casos en que, en virtud del artículo 6, apartado 1, letra c), inciso ii), se hayan declarado contaminadas aguas de superficie o en que, de conformidad con el anexo V, punto 2, se hayan incluido dichas aguas entre los factores de la posible propagación del organismo:

– realizarán un examen anual, en los momentos oportunos, con una toma de muestras de las aguas de superficie y, cuando sea oportuno, de las plantas huésped solanáceas en las fuentes hídricas pertinentes, así como análisis con arreglo a los métodos pertinentes establecidos en el anexo II para el material vegetal indicado y para otros casos,

– con el fin de impedir la propagación del organismo, establecerán controles oficiales de los planes de riego y rociamiento, así como una prohibición del uso de las aguas declaradas contaminadas para el riego y rociamiento del material vegetal indicado y, en su caso, de otras plantas huésped. Esta prohibición podrá reexaminarse en función de los resultados obtenidos en el examen anual mencionado, y podrán revocarse las declaraciones cuando los organismos oficiales responsables tengan la certeza de que las aguas superficiales ya no están contaminadas. Podrá autorizarse el uso del agua sometida a prohibición, bajo control oficial, para el riego y el rociamiento de las plantas huésped, cuando se utilicen técnicas aprobadas oficialmente que eliminen el organismo y eviten su propagación,

– en los casos en que se hayan contaminado vertidos de residuos líquidos, establecerán controles oficiales de la eliminación de los residuos sólidos o líquidos procedentes de las instalaciones industriales de transformación o envasado que manipulen el material vegetal indicado;

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ANEXO VII. Disposiciones que se deben cumplir para la eliminación de los residuos

Los métodos de eliminación de residuos autorizados oficialmente mencionados en el anexo VI, punto 1, deberán cumplir las disposiciones que se indican a continuación con el fin de evitar todo riesgo identificable de propagación del organismo:

– en un vertedero de eliminación de residuos autorizado oficialmente en donde no exista ningún riesgo identificable de escape del organismo al medio ambiente, por ejemplo, a través de filtración a tierras agrícolas ni de contacto con fuentes de agua que puedan utilizarse para el riego de dichas tierras. Los residuos se conducirán directamente al vertedero en unas condiciones de confinamiento que impidan todo riesgo de pérdida de los mismos,

o

– mediante incineración,

o

– a través de otras medidas, siempre que se descarte el posible riesgo de propagación del organismo. Dichas medidas se notificarán inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a la Comisión y a los demás Estados miembros,

ii) residuos líquidos: antes de la eliminación, los residuos líquidos que contengan sólidos en suspensión se someterán a procesos de filtración o sedimentación para eliminar dichos sólidos. Estos sólidos se eliminarán tal como se establece en el inciso i).

A continuación, los residuos líquidos:

– se calentarán a un mínimo de 60°C en todo su volumen durante un mínimo de 30 minutos antes de la eliminación,

o

– se eliminarán, previa autorización oficial y bajo control oficial, de manera que no exista ningún riesgo identificable de que los residuos puedan entrar en contacto con tierras agrícolas ni fuentes de agua que pudieran utilizarse para la irrigación de tierras agrícolas. Los detalles de estas medidas se notificarán al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a los demás Estados miembros y a la Comisión.

Las opciones descritas en el presente anexo se aplican asimismo a los residuos asociados a la manipulación, la eliminación y el tratamiento de lotes contaminados.

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