Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Pracovní inokula se připraví jedinou pasáží z matečného inokula a ve schválené úrovni pasáží od originálního Sabinova viru. Inokula se připraví ve velkých množstvích a uchovávají se při teplotě nižší než -60 °C.

Pouze virové inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. Každé pracovní inokulum se identifikuje jako poliovirus daného typu za použití specifických protilátek.

Koncentrace viru. Stanoví se dále popsanou metodou. Virová koncentrace je základ pro množství viru použitého ve zkoušce Neurovirulence.

Cizí agens (2.6.16). Jestliže je pracovní inokulum produkováno v lidských diploidních buňkách (5.2.3) nebo v kontinuální buněčné linii, vyhovuje požadavkům na inokulum pro virové vakcíny. Jestliže je pracovní inokulum produkováno v buňkách primárních opičích buněk, vyhovuje požadavkům dále uvedeným v odstavcích Pomnožování a sklizeň viru a Monovalentní spojená sklizeň a zkouškám na dospělých myších, sajících myších a na morčatech uvedeným ve stati Důkaz cizích agens v humánních virových vakcínách (2.6.16).

Neurovirulence (2.6.19). Každé matečné a pracovní inokulum vyhovuje zkoušce neurovirulence pro vakcínu proti poliomyelitidě (perorální). Nad to se zastaví používání pracovního inokula ve výrobě vakcíny, jestliže výskyt nedostatků z něho vyrobených monovalentních spojených sklizní je větší, než je předpovězeno statisticky. Referenční přípravky tří typů polioviru ze Sabinova originálu a dvou pasáží jsou k dosažení pro použití ve Světové zdravotnické organizaci, Ženeva, Švýcarsko.

Tato statistická předpověď se vypočítá po každé zkoušce na základě všech zkoušených monovalentních spojených sklizní; je stejná pravděpodobnost falešného odmítnutí v případě první zkoušky (tj. 1 %), pravděpodobnost falešného odmítnutí v případě nové zkoušky bývá zanedbatelná. Je-li tato zkouška prováděna pouze výrobcem, zkušební skla se poskytnou kontrolní autoritě k ohodnocení.

Genetické markery. Každé pracovní virové inokulum se zkouší na replikační vlastnosti při 36 °C až 40 °C, jak je popsáno v odstavci Monovalentní spojené sklizně.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí v aseptických podmínkách a v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do růstových médií se může použít schválené zvířecí sérum (ale ne lidské), avšak konečné udržovací médium pro buňky v době pomnožování viru neobsahuje zvířecí sérum. Sérum a trypsin použité k přípravě buněčných suspenzí a médií prokazatelně neobsahují živá cizí agens. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je červeň fenolová, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Přednostně se používá při výrobě substrát bez antibiotik. Nejméně 5 % a nejvýše 1000 ml buněčných kultur použitých při výrobě vakcíny se ponechává jako neinfikované buněčné kultury (kontrolní buňky); speciální požadavky, uvedené dále, se vztahují k výrobě vakcíny na primárních opičích buňkách. Virová suspenze se sklidí nejpozději 4 dny po inokulaci viru. Po inokulaci výrobní buněčné kultury pracovním inokulem se inokulované buňky udržují při stanovené teplotě, jež byla prokázána jako vhodná v rozmezí 33 °C až 35 °C. Teplota se udržuje neměnná, s odchylkou ±0,5 °C. Kontrolní buňky se inkubují při 33 °C až 35 °C po přiměřenou dobu inkubace.

Pouze sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě monovalentní spojené sklizně.

Koncentrace viru. Koncentrace viru ve virových sklizních se stanoví, jak je předepsáno v odstavci Stanovení účinnosti, ke sledování pravidelnosti výroby a k výpočtu ředění, které se použije do konečné várky vakcíny.

Cizí agens (2.6.16).

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky produkční buněčné kultury, ze které se sklízí virus, vyhovují ve zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16) nebo, při použití primárních opičích buněk, dále uvedenému.

Primární opičí buňky. Následující speciální požadavky se vztahují k pomnožování viru v primárních opičích buňkách a k jeho sklizni.

Buněčné kultury. V den inokulace virovým inokulem se buněčné kultury vyšetří na degeneraci způsobenou infekčním agens. Jestliže se při prohlížení zjistí přítomnost cizího agens v některé buněčné kultuře, vyřadí se celá skupina kultur.

V den inokulace virovým pracovním inokulem se odebere vzorek nejméně 30 ml směsné tekutiny z buněčných kultur z ledvin z každé jednotlivé opice nebo ze skupiny nejvýše deseti opičích plodů. Vzorek se rozdělí na dvě části. Jedna část směsných tekutin se zkouší na kulturách buněk opičích ledvin připravených z téhož druhu, jaký se použil pro přípravu vakcíny, ale z jiného zvířete. Druhá část vzorku směsných tekutin se v případě nutnosti zkouší na kulturách buněk opičích ledvin z jiného druhu tak, aby alespoň jeden ze zkoušených vzorků byl zkoušen na kulturách buněk z opi c citlivých k viru SV40. Směsný vzorek se inokuluje do lahví s těmito buněčnými kulturami tak, aby ředění směsné tekutiny živným médiem nebylo vyšší než 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm^2 na mililitr směsné tekutiny. Nejméně jedna láhev každého druhu buněčné kultury zůstává bez inokulace a slouží jako kontrola. Jestliže je pro výrobu vakcíny použit druh opice, která je citlivá na SV40, zkouška na jiném druhu opice se nepožaduje. Pro pomnožování buněk se může použít zvířecí sérum za předpokladu, že neobsahuje protilátky proti SV40. Udržovací médium používané po inokulaci zkoušeného materiálu neobsáhuje sérum, s výjimkou dále uvedenou.

Buněčné kultury se inkubují při teplotě mezi 35 °C a 37 °C a pozorují se po celou dobu nejméně 4 týdnů. Během doby sledování a po nejméně 2 týdnech inkubace se z roztoku založí další subkultura na témže buněčném systému. Tyto subkultury se také pozorují nejméně 2 týdny.

Při pasážování subkultur se na původní kultury může přidat sérum, pokud toto sérum neobsahuj e protilátky proti SV40.

Pro detekci viru SV40 a ostatních virů v buňkách mohou být užitečné techniky využívající fluorescenční protilátky.

Další vzorek nejméně 10 ml směsné tekutiny se zkouší na přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus) a na přítomnost ostatních virů v kulturách buněk králičích ledvin. Sérum používané v růstovém médiu pro tyto kultury má být prokazatelně prosté inhibitorů viru B. Jako indikátor nepřítomnosti inhibitorů viru B se používá lidský herpesvirus pro nebezpečí při zacházení s cerkopitecidním herpesvirem 1 (B virem). Vzorek se inokuluje do láhví s těmito buněčnými kulturami tak, aby ředění směsné tekutiny růstovým médiem nebylo vyšší než 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm^2 na mililitr směsné tekutiny. Nejméně jedna láhev buněčné kultury zůstává bez inokulace a slouží jako kontrola.

Kultury se inkubují při 35 °C až 37 °C a pozorují se nejméně 2 týdny.

Další vzorek 10 ml směsné tekutiny se z buněčné kultury přemístí v den inokulace virovým inokulem a zkouší se na přítomnost cizích agens inokulaci na lidské buněčné kultury citlivé na virus spalniček.

Tyto zkoušky lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejvýše 20 % lahví s kulturami bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody do konce vlastní zkušební doby.

Jestliže se při těchto zkouškách najde důkaz přítomnosti nějakého cizího agens, je jednotlivá sklizeň ze skupiny buněčných kultur vyřazena.

Jestliže se prokáže přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus), výroba perorální vakcíny proti poliomyelitidě se přeruší a informuje se oprávněná autorita. Výroba se neobnoví, dokud se neuzavře vyšetřování a nepřijmou se opatření proti jakémukoliv znovuobjevení infekce. Obnovení výroby schválí oprávněná autorita.

Jestliže tyto zkoušky nejsou prováděny bezprostředně, vzorky směsné tekutiny z kultur se uchovávají při teplotách 60 °C nebo nižších teplotách, s výjimkou vzorku pro zkoušku na B virus, který se uchovává při 4 °C po dobu nejvýše 7 dní po odběru.

Kontrolní buněčné kultury. V den inokulace virovým pracovním inokulem se 25 % (ale nejvýše 2,5 l) buněčné suspenze pocházející z ledvin jednotlivých opic nebo z nejvýše deseti plodů opic ponechá jako neinokulované kontrolní buněčné kultury. Tyto kontrolní buněčné kultury se kultivují nejméně 2 týdny za stejných podmínek jako kultury inokulované a během této doby se vyšetřuj í na výskyt cytopatických změn. Zkoušky lze hodnotit, jestliže nejvýše 20 % kontrolních buněčných kultur bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody.

Na konci doby sledování se kontrolní buňky vyšetří na degeneraci způsobenou nějakým infekčním agens. Jestliže toto vyšetření nebo některá ze zkoušek požadovaných v tomto odstavci prokáže v kontrolní kultuře známky přítomnosti nějakého cizího agens, vyřadí se poliovirus rostoucí na inokulovaných kulturách z této skupiny.

Zkoušky na hemadsorbující viry. V době sklizně viru nebo 4 dny po inokulaci výrobních kultur virovým pracovním inokulem se odebere vzorek o velikosti 4 % kontrolních buněčných kultur a zkouší se na hemadsorbující viry. Na konci sledovaného období se podobně zkoušejí zbývající buněčné kultury. Tyto zkoušky se provádějí, jak je popsáno ve stati Důkaz cizích agens v lidských virových vakcínách (2.6.16).

Zkoušky na ostatní cizí agens. V době sklizně nebo 7 dní po inokulaci výrobních kultur virovým pracovním inokulem se odebere vzorek nejméně 20 ml směsné tekutiny z každé skupiny kontrolních kultur a zkouší se na dvou druzích buněčných kultur opičích ledvin, jak je popsáno výše.

Na konci doby pozorování původních kontrolních buněčných kultur se odeberou obdobné vzorky směsných tekutin a opakují se zkoušky vztahující se k této skupině na dvou druzích buněk opičích ledvin a na kulturách králičích buněk, jak je výše popsáno v odstavci Buněčné kultury.

Jestliže se prokáže přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (virus B), výrobní buněčná kultura se nepoužije a provedou se výše popsaná opatření týkající se výroby vakcíny.

Tekutiny odebrané z kontrolních buněčných kultur v době sklizně viru a na konci doby pozorování se před zkouškou na cizí agens mohou smísit. Vzorek 2 % směsné tekutiny se zkouší v každém specifikovaném systému buněčných kultur.

Jednotlivé sklizně.

Zkoušky neutralizovaných jednotlivých sklizní na buněčných kulturách opičích ledvin. Vzorek nejméně o velikosti 10 ml z každé jednotlivé sklizně se neutralizuje typově specifickým antisérem proti poliomyelitidě připraveným z jiných zvířat, než jsou opice. Při přípravě antiséra pro tento účel se imunizační antigeny připraví v jiných buňkách než opičích.

Polovina neutralizované suspenze (odpovídající nejméně 5 ml jednotlivé sklizně) se zkouší na kulturách buněk opičích ledvin připravených z téhož druhu, ale ne ze stejného zvířete, jaký se použil pro výrobu vakcíny. Druhá polovina neutralizované suspenze se zkouší, je-li třeba na buněčných kulturách opičích ledvin jiného druhu tak, že se provedou zkoušky neutralizované suspenze na buněčných kulturách z nejméně jednoho druhu, o němž je známo, že je citlivý na SV40.

Neutralizované suspenze se inokulují do lahví s těmito buněčnými kulturami takovým způsobem, aby ředění suspenze v růstovém médiu nepřesáhlo poměr 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm^2 na mililitr neutralizované suspenze. Nejméně jedna láhev každého typu buněčné kultury zůstane neinokulovaná a slouží jako kontrola a je udržována růstovým médiem obsahujícím stejnou koncentraci specifického antiséra použitého k neutralizaci.

Pro růst buněk se může použít zvířecí sérum, pokud toto sérum neobsahuje protilátky proti SV40. Udržovací médium, používané po inokulaci zkoušeného materiálu, neobsahuje žádné sérum kromě antiséra neutralizujícího poliovirus, s výjimkou dále popsanou.

Kultury se inkubují při teplotě 35 °C až 37 °C a pozorují se po celou dobu nejméně 4 týdnů. Během doby pozorování a po nejméně 2 týdnech inkubace se založí nejméně jedna subkultura z tekutiny z každé kultury na témže systému buněčné kultury. Subkultury se také pozorují nejméně 2 týdny. Sérum se může přidat k původním kulturám v době založení subkultury, pokud neobsahuj e protilátky proti SV40.

Na dalším vzorku z neutralizovaných jednotlivých sklizní se provedou další zkoušky na cizí viry inokulací 10 ml na kultury lidských buněk citlivých na virus spalniček.

Pro detekci viru SV40 a ostatních virů v buňkách mohou být užitečné techniky využívající fluorescenčních protilátek.

Tyto zkoušky lze hodnotit, jestliže nejvýše 20 % nádob s kulturami bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody do konce vlastní zkušební doby.

Když se objeví cytopatické změny v některé z kultur, příčiny těchto změn se vyšetří. Jestliže se prokáže, že cytopatické změny způsobil nezneutralizovaný poliovirus, zkouška se opakuje.

Projeví-li se známky přítomnosti SV40 nebo jiného cizího agens v jednotlivé sklizni, tato sklizeň se vyřadí.

Monovalentní spojená sklizeň

Monovalentní spojená sklizeň se připraví smícháním počtu vyhovujících jednotlivých sklizní téhož typu viru. Monovalentní spojené sklizně z kontinuálních buněčných linií se mohou purifíkovat. Každá monovalentní spojená sklizeň se filtruje filtrem zadržujícím bakterie.

Pouze monovalentní spojená sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Každá monovalentní spojená sklizeň se za použití specifických protilátek prokáže jako poliovirus daného typu.

Koncentrace viru. Koncentrace viru se stanoví dále popsanou metodou a slouží jako základ pro výpočet ředění přípravku v konečné várce, pro množství viru použitého ve zkoušce neurovirulence a ke sledování pravidelnosti výroby.

Neurovirulence (2.6.19). Každá monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce neurovirulence pro vakcínu proti poliomyelitidě (perorální). Je-li tato zkouška prováděna pouze výrobcem, poskytnou se zkušební skla také oprávněné autoritě k hodnocení.

Genetické markery. Poměr replikačních kapacit viru v monovalentní spojené sklizni se získá při teplotě v rozmezí mezi 36 °C a 40 °C ve srovnání s inokulem nebo referenčním přípravkem pro markerové zkoušky a s vhodnými rct/40- a rct/40+ kmeny polioviru téhož typu. Inkubační teploty užívané v této zkoušce se řídí v rozmezí ±0,1 °C. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje této zkoušce, jestliže titr viru ze sklizně a vhodného referenčního materiálu je při 36 °C nejméně o 5,0 log vyšší než titr stanovený při 40 °C. Je-li růst při 40 °C tak nízký, že validní srovnání nelze provést, použije se teplota v rozmezí 39,0 °C až 39,5 °C. Při této teplotě je snížení titru referenčního materiálu v rozmezí od 3,0 log do 5,0 log proti hodnotě při 36 °C. Přijatelná minimální redukce se pro každý kmen viru stanoví při dané teplotě. Jestliže titry získané pro jeden nebo více referenčních virů nejsou ve shodě s očekávanými hodnotami, zkouška se opakuje.

Primární opičí buňky. Následující speciální požadavky platí pro monovalentní spojené sklizně odvozené z primárních opičích buněk.

Zkoušky na králících. Vzorek monovalentní spojené sklizně se zkouší na přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus) a ostatní viry vstříknutím nejméně 100 ml nejméně deseti zdravým králíkům hmotnosti 1,5 kg až 2,5 kg. Každý králík dostane nejméně 10 ml a nejvýše 20 ml, přičemž 1 ml je podán intradermálně na několik míst a zbytek subkutánně. Králíci se pozorují nejméně 3 týdny, sleduje se úhyn a známky onemocnění.

Všichni králíci, kteří uhynuli po prvních 24 h zkoušky a vykazují známky onemocnění, se pitvají a vyjme se jim mozek a orgány k podrobnému vyšetření pro zjištění příčiny úhynu.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejvýše 20 % inokulovaných králíků vykazuje známky interkurentní infekce během doby pozorování. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce, jestliže žádný z králíků nemá známky infekce virem B nebo ostatními cizími agens nebo léze jakéhokoliv druhu, jež lze přisoudit suspenzi várky.

Při průkazu přítomnosti viru B se provedou opatření týkající se výroby vakcíny uvedená výše v odstavci Buněčné kultury.

Zkouška na morčatech. Nejméně pěti morčatům, každému o hmotnosti 350 g až 450 g, se podá 0,1 ml monovalentní spojené sklizně intracerebrálně a 0,5 ml intraperitoneálně. Po 6 týdnů se každý pracovní den měří rektálně teplota každému zvířeti. Na konci doby pozorování se provede pitva každého zvířete.

Kromě toho se nejméně pěti morčatům intraperitoneálně podá 0,5 ml a 2 až 3 týdny se pozorují, jak je popsáno výše. Na konci doby pozorování se provede pasáž krve a suspenze jaterní nebo slezinné tkáně nejméně dalším pěti morčatům. Těmto morčatům se po dobu 2 až 3 týdnů měří rektálně teplota. Jestliže dojde po prvním dni k úhynu nebo jsou zvířata utracena pro příznaky onemocnění, provede se pitva. Pitva se provede také v případě, že vykazují po tři za sebou následující dny teplotu vyšší než 39 °C; provede se histologické vyšetření k detekci viru Marburg; navíc se intraperitoneálně podá suspenze jaterní nebo slezinné tkáně nebo krve nejméně třem dalším morčatům. Jestliže se zjistí jakékoliv příznaky infekce virem Marburg, provede se konfirmační sérologický test z krve postižených zvířat. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce, jestliže nejméně 80 % morčat přežívá do konce doby pozorování v dobrém zdravotním stavu a žádné zvíře nemá příznaky infekce virem Marburg.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více vyhovujících monovalentních spojených sklizní a může obsahovat více než jeden typ viru. Mohou se přidat vhodné ochucující látky a stabilizátory.

Pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1); na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje následujícímu požadavku na teplotní stabilitu a vyhovuje všem požadavkům uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkouška na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití.

Teplotní stabilita. Vzorky z šarže se 48 h uchovávají při 37 °C. Stanoví se celková koncentrace viru, jak je popsáno v odstavci Stanovení účinnosti, současně ve vzorkách vystavených vyšší teplotě a ve vzorkách nezahřáté vakcíny. Stanovený rozdíl mezi celkovou virovou koncentrací zahřáté a nezahřáté vakcíny není vyšší než 0,5 log10 infekční virové jednotky (CCID50) na jednu lidskou dávku.

Zkouška totožnosti

Použitím specifických protilátek se prokáže, že vakcína obsahuje poliovirus každého typu uvedeného v označení na obalu.

Zkouška na čistotu

Bakterie a houby. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Stanovení účinnosti

Titrace infekčního viru se provádí nejméně trojmo za použití metody dále popsané. K validaci každého stanovení se používá vhodný referenční virus. Jestliže vakcína obsahuje více než jeden typ polioviru, titruje se každý typ odděleně za neutralizace ostatních přítomných typů vhodnými specifickými antiséry (nebo přednostně monoklonálními protilátkami).

Pro trivalentní vakcínu jsou stanoveny tyto dolní titry virů: nejméně 1 . 10^6,0 infekčních virových jednotek (CCID50) v jednotlivé lidské dávce pro typ 1; nejméně 1 . 105,0 infekčních virových jednotek (CCID50) pro typ 2; nejméně 1 . 10^5,5 infekčních virových jednotek (CCID50) pro typ 3.

Pro monovalentní a divalentní vakcínu rozhodne o výši minimálního titru oprávněná autorita.

Metoda. Skupiny osmi až dvanácti jamek s plochým dnem na mikrotitrační destičce se inokulují 0,1 ml každého vybraného ředění viru a následně se přidá vhodná suspenze buněk linie Hep-2 (Cincinnati). Destičky se inkubují ve vhodné teplotě. Kultury se vyšetřují v 7. až 9. dnu. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95 ) logaritmu virové koncentrace je nejvýše ±0,3.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

• typy polioviru obsažené ve vakcíně,

• minimální množství viru každého typu obsažené v jedné lidské dávce,

• buněčný substrát použitý pro výrobu vakcíny,

• že se vakcína nevstřikuje.

Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti pseudomoru ptáků

Synonymum. Inaktivovaná vakcína proti Newcastleské chorobě

Je to emulze nebo suspenze vhodného kmene viru pseudomoru ptáků inaktivovaného takovým způsobem, který zachová jeho imunogenní účinnost. Vakcína může obsahovat olejové nebo jiné vhodné adjuvans.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží v kuřecích embryích pocházejících ze zdravých chovů nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4).

Zkouška na pomnožení reziduálních živých virů se provádí při sklizni meziproduktu těsně před přidáním adjuvans, aby potvrdila inaktivaci viru. Zkouška se provádí na kuřecích embryích nebo ve vhodné buněčné kultuře a použité množství inaktivovaného viru odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Nezjistí se žádný živý virus.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti a imunogenity pro všechny druhy a kategorie ptáků, pro které je určena. K průkazu účinnosti (5.2.7) se může použít následující zkouška.

Imunogenita. Pro domácí drůbež je k prokázání imunogenity vhodná zkouška s virulentní čelenží (zkouška B) popsaná v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkouška totožnosti

Podána vnímavým zvířatům podporuje vakcína tvorbu protilátek proti viru pseudomoru ptáků (ptačí paramyxovirus typ I).

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Pokud je vakcína určena pro domácí drůbež, podá se deseti kuřatům z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Pokud vakcína není určena pro domácí drůbež, podává se deseti zdravým ptákům toho druhu, pro který je určena. Podají se dvě dávky vakcíny jedním z doporučených způsobů podání každému z deseti ptáků starých 14 dní až 28 dní. Doba pozorování je 21 dnů. Neobjeví se žádné abnormální místní ani systémové reakce.

Inaktivace. Deseti kuřecím embryím z chovu prostého specifikovaných patogenů (SPF vejce) (5.2.2) a starých 9 dní až 11 dní se do alantoidní dutiny vstříkne po dvou pětinách dávky a nechají se inkubovat. Pozorují se 6 dnů, pak se odděleně shromáždí alantoidní tekutina z vajec obsahujících živá embrya a z vajec obsahujících mrtvá embrya, z nichž se vyřadí ta, která uhynula do 24 h po injekci. Embrya, která uhynula do 24 h po injekci, se zkouší na přítomnost viru pseudomoru ptáků. Vakcína nevyhovuje, pokud je tento virus zjištěn.

Do alantoidní dutiny každého z deseti 9 dnů až 11 dnů starých SPF vajec se vstříkne po 0,2 ml spojené alantoidní tekutiny z vajec se živými embryi a do každého z dalších deseti SPF vajec 0,2 ml spojené tekutiny z vajec s uhynulými embryi, inkubuje se 5 až 6 dnů. Alantoidní tekutina z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutininů za použití kuřecích erytrocytů.

Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže nejsou přítomny známky hemaglutinační aktivity a jestliže neuhyne více než 20 % embryí v jedné ze skupin. Pokud v jedné ze skupin uhyne více než 20 % embryí, opakuje se zkouška v této skupině. Nezjistí se hemaglutinační aktivita a nejvýše 20 % embryí ve skupině smí uhynout.

K vyloučení bakteriální infekce se mohou v této zkoušce použít antibiotika.

Cizí agens. Každému z deseti kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů a 14 až 28 dnů starých se jedním z doporučených způsobů podají dvě dávky. Po třech týdnech se každému kuřeti doporučeným způsobem podá jedna dávka. Po dvou týdnech se získají vzorky sér od každého kuřete a provedou se zkoušky na přítomnost protilátek proti sledovaným agens metodami předepsanými pro chovy prosté specifikovaných patogenů, které se používají pro výrobu a kontrolu kvality vakcín (5.2.2): virus ptačí encefalomyelitidy, virus ptačí infekční bronchitidy, virus ptačí leukózy, hemaglutinační ptačí adenovirus, virus infekční burzitidy, virus infekční laryngotracheitidy, virus chřipky A, virus Markovy choroby. Vakcína nevyvolá tvorbu protilátek proti těmto virům.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

A. Každému z nejméně deseti kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů a 21 až 28 dnů starých se vstříkne intramuskulárně objem vakcíny odpovídající 1/50 dávky. Za 17 až 21 dnů se odeberou vzorky séra od každého vakcinovaného kuřete a od každého z deseti kontrolních kuřat stejného věku a stejného původu. Hladina protilátek v jednotlivých sérech se měří dále popsanou hemaglutinačně-inhibiční zkouškou (HI) nebo rovnocennou metodou se stejným počtem hemaglutinačních jednotek a množstvím erytrocytů a s pozitivním kontrolním sérem kalibrovaným podle mezinárodního referenčního přípravku séra proti pseudomoru ptáků. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže průměrný HI titr vakcinované skupiny je stejný nebo větší než 4 log2 a titr u nevakcinované skupiny je 2 log nebo méně. Jestliže HI titry nejsou uspokojivé, provede se zkouška B.

Hemaglutinačně-inhibični zkouška. Zkoušená séra se 30 min inaktivují zahřátím na 56 °C. Do první řady jamek mikrotitrační destičky se odpipetuje po 0,05 ml inaktivovaných sér a do ostatních jamek se odpipetuje 0,50 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l) o pH 7,2 až 7,4. Připraví se dvojnásobné ředění séra po celé destičce. Do každé jamky se přidá 0,05 ml suspenze obsahující 4 hemaglutinační jednotky inaktivovaného viru pseudomoru ptáků. Destičky se 1 h inkubují při 4 °C, přidá se 0,05 ml 1% suspenze červených krvinek získaných ze 3- až 4týdenních kuřat vnímavých k pseudomoru ptáků. Destičky se 1 h inkubují při 4 °C. Ve zkoušce se použijí jak pozitivní, tak negativní séra. Pozitivní kontrolní sérum má titr 300 m.j. až 400 m.j. stanovených kalibrací na mezinárodní referenční přípravek a HI titr 5 log2 až 6 log2 stanovený v použitém zkušebním systému.

B. Použijí se kuřata z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) a stará 21 až 28 dnů. Pro vakcinaci se použijí nejméně tři skupiny, v každé nejméně dvacet kuřat; deset kuřat se ponechá jako kontrolní skupina. Vybere se takový počet různých objemů vakcíny, jaký je počet skupin: například objemy odpovídající 1/25, 1/50,1/100 dávky. Každé skupině se podá odlišný objem. Každému kuřeti se intramuskulárně podá objem zvolený pro danou skupinu. Za 17 až 21 dnů se všem kuřatům podá intramuskulární injekce o obsahu 6 log10 embryonální LD50 viru pseudomoru ptáků kmene - Herts (Weybridge 33/56). (Embryonální LD50 aplikovaného kmene se stanoví sledováním embryí po dobu 6 dnů.) Kuřata se sledují 21 dnů. Z počtu kuřat, které přežijí 21 dní v každé vakcinační skupině bez klinických známek onemocnění Newcastleskou chorobou, se vypočítá PD50 standardními statistickými metodami. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže nejmenší dávka uvedená na označení vakcíny odpovídá nejméně 50 PD50 a spodní hranice spolehlivosti je nejméně 35 PD50 na dávku. Je-li tento limit méně než 35 PD50na dávku, zkouška se opakuje. Vakcína v opakované zkoušce obsahuje nejméně 50 PD50. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, pokud všechna kuřata v kontrolní skupině uhynou během 6 dnů po čelenži.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

• druh a třída ptáků, pro které je vakcína určena,

• kmen viru, který byl použit pro výrobu.

Vaccinum pseudopestis aviariae vivum cryodesiccatum [image omitted]

Živá vakcína proti pseudomoru ptáků lyofilizovaná

Synonymum. Živá vakcína proti Newcastleské chorobě

Je to přípravek lentogenního kmene viru pseudomoru.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží v alantoidní dutině kuřecích embryí z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Jsou-li buněčné kultury ptačího původu, jsou získány z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2). Virové suspenze se shromáždí, smíchají s vhodnou stabilizující tekutinou a lyofilizují.

Výběr vakcinačního kmene

Pro přípravu vakcíny se může použít pouze kmen, který je prokazatelně imunogenní a jehož index neurovirulence není vyšší než 0,5. Při průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Index neurovirulence. Vzorek inokula, je-li třeba rekonstituovaný, se vstříkne do alantoidní dutiny kuřecích embryí 9 až 11 dní starých pocházejících z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Vejce se inkubuje 2 dny, potom se sklidí alantoidní tekutiny. Každému z nejméně deseti jednodenních (to je více než 24 h, ale méně než 40 h po vylíhnutí) vnímavých kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů se intracerebrálně vstříkne 0,05 ml alantoidní tekutiny obsahující množství viru odpovídající nejméně 10^8EID50. Kuřata se pozorují 8 dnů a každý den se zaznamenává počet zdravých, počet vykazujících příznaky onemocnění a počet uhynulých. Všechny tři soubory se sečtou. Celkový součet zdravých se násobí nulou, celkový počet vykazujících příznaky onemocnění se násobí 1 a celkový počet úhynů se násobí 2. Index neurovirulence se získá, když se součet tří předchozích součinů dělí součtem počtu zdravých, nemocných a uhynulých zvířat.

Imunogenita. K prokázání imunogenity je vhodná zkouška, která je popsána v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušení šarže

Pokud byly zkouška na viry ptačí leukózy a zkoušky na cizí viry na buněčných kulturách a kuřecích embryích provedeny na reprezentativní šarži vakcíny s vyhovujícími výsledky, mohou být tyto zkoušky při rutinních kontrolách jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěny, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno s vyhovujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených ze stejného inokula vypuštěna, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Rekonstituovaná vakcína smísená s monospecifickým antisérem již nevyvolá hemaglutinaci vhodné koncentrace kuřecích erytrocytů nebo již neinfikuje vnímavá kuřecí embrya, ve stáří 9 až 11 dnů, nebo vnímavé buněčné kultury, do nichž je inokulována.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) a nejnižšího stáří, které je pro vakcinaci uvedeno v označení. Každému kuřeti se nakape do oka deset dávek vakcíny rekonstituované tak, aby se získala koncentrace vhodná pro zkoušku. Kuřata se pozorují 21 dnů. U vakcín určených k vakcinaci kuřat starých dva týdny nebo více se použijí kuřata inokulovaná ve zkoušce na cizí antigeny. Jestliže v období pozorování uhyne více než dvě kuřata z příčin, které nelze přisoudit vakcíně, zkouška se opakuje. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže žádné z kuřat nemá vážné klinické příznaky, zvláště příznaky dýchací, a žádné z kuřat neuhyne z příčin, které lze přisoudit vakcíně.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na leukózní viry.

Cizí viry při použití buněčných kultur (2.6.5). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití buněčných kultur.

Cizí viry při použití kuřecích embryí (2.6.3). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití kuřecích embryí.

Cizí antigeny (2.6.6). Vakcína vyhovuje zkoušce na cizí antigeny při použití kuřat.

Bakterie a houby. Provede se kvantitativní zkouška na bakterie a houby. Vakcína neobsahuje více než jeden saprofytický mikroorganismus v dávce a je prosta patogenních mikroorganismů. Vakcíny určené pro parenterální podání a tekutiny s nimi dodávané vyhovují zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Rekonstituovaná vakcína se titruje v buněčných kulturách nebo inokulací do alantoidní dutiny kuřecích embryí starých 9 až 11 dnů. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použijí se vnímavá kuřata z jednoho chovu prostého specifikovaných patogenů a nejnižšího stáří, které je pro vakcinaci uvedeno v označení. Každému z nejméně dvaceti kuřat pro každý z udávaných způsobů podání se podá takový objem rekonstituované vakcíny, který obsahuje množství viru, jež odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení. Pro kontrolu se použije deset kuřat. Po 14 až 21 dnech se každé kuře čelenžuje intramuskulárně 10^5 LD50 virulentního kmene viru pseudomoru ptáků. Zvířata se pozorují 10 dnů. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže na konci doby pozorování nejméně 90 % vakcinovaných kuřat přežívá a nejeví příznaky onemocnění a všechna kontrolní kuřata uhynula do 6 dnů po inokulaci virulentním čelenžním kmenem.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede stáří zvířat, jež se mají vakcinovat.

Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum [image omitted]

Humánní vakcína proti vzteklině připravená v buněčných kulturách

Je to lyofilizovaný přípravek vhodného stabilního kmene viru vztekliny pomnoženého v buněčných kulturách a inaktivovaného validovanou metodou.

Vakcína se rozpustí bezprostředně před použitím podle návodu, vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Vakcína vyhovuje požadavkům článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu. Jestliže není stanoveno oprávněnou autoritou jinak, virus v konečné vakcíně neprojde více pasážemi od matečného inokula než virus vakcíny, která vyhověla v klinické zkoušce na neškodnost a účinnost: dokonce podle autorizované výjimky počet pasáží pro klinickou studii nepřesáhne pět.

Výrobní metoda se validuje, aby se dokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro imunní séra a vakcíny pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnoží v buňkách lidské diploidní linie (5.2.3), v kontinuální linii schválené oprávněnou autoritou nebo v buňkách kuřecích embryí odvozených z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Inokula

Použitý kmen viru je identifikován záznamy, včetně informace o původu kmene a následné manipulaci s ním.

Pracovní inokulum se připraví nejvýše pěti pasážemi od matečného inokula. Jen takové pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím zkouškám, se může použít pro pomnožování viru.

Totožnost. Každé pracovní inokulum se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.

Virová koncentrace. Aby se zajistila stejnorodost výroby, stanoví se virová koncentrace v každém pracovním inokulu metodou buněčné kultury za použití imunofluorescence.

Cizí agens (2.6.16). Pracovní inokulum vyhovuje požadavkům na virová inokula. Je-li virus pasážován na myších mozcích, provedou se specifické zkoušky na myší viry.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami probíhají za aseptických podmínek v prostoru, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do médií se může použít schválené sérum živočišného, nikoli humánního původu, ale konečné udržovací médium pro buněčný růst při pomnožování viru neobsahuje živočišné sérum: média mohou obsahovat lidský albumin vyhovující článku Albumini humani solutio. Sérum a trypsin použité pro přípravu buněčné suspenze a médií prokazatelně neobsahují infekční cizí agens: trypsin vyhovuje článku Trypsinům. Média pro buněčnou kulturu mohou obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá neinfikovaných (kontrolní buňky). Virová suspenze se sklízí jednou nebo vícekrát během inkubace. Více sklizní z téže produkční buněčné kultury se může spojit a považovat za jednu sklizeň. Jen taková jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu inaktivované virové sklizně.

Totožnost. Jednotlivá sklizeň obsahuje virus, který se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.

Virová koncentrace. Infekční virus se stanoví na buněčných kulturách: titrem se sleduje stejnoměrnost výroby.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z produkční buněčné kultury, z níž se odvozují jednotlivé sklizně, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Purifikace a inaktivace

Virová sklizeň se může koncentrovat a případně též purifikovat vhodnými metodami: virová sklizeň se inaktivuje validovanou metodou v pevně definovaném stadiu výroby, které může být před, během nebo po koncentraci nebo purifikaci. Metoda je prokazatelně schopna inaktivovat rabický virus bez zničení imunogenní aktivity. Při použití betapropiolaktonu nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli 1 : 3500.

Pro přípravu konečné várky vakcíny se použije jen taková inaktivovaná virová suspenze, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na zbytkový infekční rabický virus buďto ihned po inaktivaci, nebo se použije vzorek zmražený bezprostředně po inaktivaci a uchovávaný při -70 °C. Naočkuje se takové množství inaktivované virové suspenze, které odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny na buněčnou kulturu téhož typu, jaký byl použit pro výrobu vakcíny. Subkultury po 7 dnech a po 14 dnech se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.

Zbytková DNK hostitelských buněk. Jestliže se pro pomnožování viru použije kontinuální buněčná linie, stanoví se obsah zbytkové DNK hostitelských buněk vhodnou metodou, jak je uvedeno v článku Producta ab ADN recombinante, a není větší než 100 pg v jedné lidské dávce.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných virových suspenzí. Může se přidat schválený stabilizátor k uchování účinnosti přípravku při lyofilizaci a po ní.

K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Obsah glykoproteinu. Vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) se stanoví obsah glykoproteinu, např. jednoduchou radiální imunodifuzí, metodou ELISA nebo Zkouškou vazby protilátek. Obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou živnou půdu použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních obalů a lyofilizuje až do obsahu vlhkosti, který zaručuje optimální stabilitu přípravku. Obaly se uzavírají tak, aby se vyloučila kontaminace a pronikání vlhkosti.

K použití se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkouška na čistotu a Stanovení účinnosti. Za předpokladu, že zkouška na inaktivaci byla provedena v inaktivované virové suspenzi s vyhovujícím výsledkem a zkouška na bovinní sérumalbumin v konečné várce s vyhovujícím výsledkem, mohou být tyto zkoušky vynechány u šarže.

Zkouška totožnosti

Přítomnost antigenu rabického viru se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití protilátek, nejlépe mnonoklonálních. Vedle toho také stanovení účinnosti slouží jako zkouška totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Inaktivace. Množství odpovídající nejméně dvaceti pěti lidským dávkám vakcíny se naočkuje na buněčnou kulturu téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny. Subkultury po 7 dnech a po 14 dnech se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce. Obsah se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 25 m.j. v jedné lidské dávce.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vakcína vyhovuje ve zkoušce na pyrogenní látky, při níž se, pokud není stanoveno jinak, vstříkne každému králíkovi jedna lidská dávka desetkrát zředěná.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší proti účinku letální dávky rabického viru intracerebrálně podané s množstvím referenčního přípravku nezbytným k vytvoření stejné ochrany. Pro toto porovnání je zapotřebí referenční vakcína kalibrovaná v mezinárodních jednotkách a vhodný rabický virus používaný jako čelenžní přípravek.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Dále uvedená zkouška používá rovnoběžný model s nejméně třemi body pro zkoušený přípravek i pro referenční přípravek. Pouze pracovník se zkušenostmi s touto metodou podání je oprávněn provádět zjednodušenou zkoušku s jedním ředěním zkoušeného přípravku. Taková zkouška dovoluje pracovníkovi určit, že vakcína má účinnost signifikantně vyšší, než je požadované minimum, ale nedává plnou informaci o validitě každého jednotlivého stanovení účinnosti. Užití jednoho ředění dovoluje značnou redukci počtu zvířat předepsaných pro zkoušku a je zvažováno každou laboratoří ve vztahu k ustanovením Evropské konvence pro ochranu obratlovců používaných pro vědecké a jiné experimentální účely.

Výběr a rozložení zkušebních zvířat. Používají se zdravé samičky myší staré asi 4 týdny hmotnosti 11 g až 15 g a pocházející z jednoho chovu. Myši se rozdělí do šesti skupin o tolika zvířatech, aby byly splněny požadavky na validitu zkoušky. Pro titraci čelenžní suspenze se rozdělí do čtyř skupin po pěti.

Příprava čelenžní suspenze. Myším se intracerebrálně vstříkne kmen CVS rabického viru, a když myši vykazují známky onemocnění, ale před jejich úhynem, se usmrtí, vyjmou se mozky a připraví se homogenát mozkové tkáně ve vhodném ředidle. Větší částice se oddělí odstředěním a supernatant se použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 °C. Jedna ampule se suspenzí se rozmrazí, vhodným ředidlem se připraví sériová ředění. Každé ředění se intracerebrálně vstříkne skupině pěti myší po 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují po dobu 14 dnů. Hodnota LD50 neředěné suspenze se vypočítá z počtu zvířat v každé skupině, která vykazují známky onemocnění nebo uhynula mezi pátým a čtrnáctým dnem.

Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Připraví se tři pětinásobná sériová ředění zkoušeného přípravku a tři pětinásobná sériová ředění referenčního přípravku. Připraví se ředění tak, že u nejkoncentrovanějšího ředění lze očekávat, že ochrání více než 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a u nejméně koncentrovaných ředění lze očekávat ochranu nižší než 50 % u zvířat, kterým bylo toto ředění podáno. Každé ze šesti ředění se podá jedné ze šesti šestnáctičlenných skupin zvířat a každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml toho ředění, které bylo přiděleno skupině. Po sedmi dnech se připraví tři identická ředění zkoušeného přípravku a referenčního přípravku a injekce se opakuje. Sedm dní po druhé injekci se připraví na základě předchozí titrace taková suspenze čelenžního viru, aby 0,03 ml obsahovalo 50 LD50. Intracerebrálně se každé vakcinované myši vstříkne 0,03 ml této suspenze. Připraví se tři vhodná sériová ředění čelenžní suspenze a suspenze a ředění se přičlení ke čtyřem skupinám po deseti zvířatech. Čelenžní suspenze a tři ředění se intracerebrálně vstříknou čtyřem skupinám myší po 0,03 ml. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní a zaznamenávají se počty zvířat vykazujících známky onemocnění vzteklinou nebo uhynulých v období od pátého do čtrnáctého dne po čelenži.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže 50% ochranná dávka referenčního přípravku i zkoušeného přípravku leží mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou myši; jestliže titrace čelenžní suspenze prokáže, že 0,03 ml čelenžní suspenze obsahuje nejméně 10 LD50 jestliže statistická analýza vykazuje signifikantní sklon a nesignifikantní odchylku linearity nebo rovnoběžnosti v závislosti dávka - odpověď; jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti.

Vakcína vyhovuje, jestliže stanovená účinnost je nejméně 2,5 m.j. v lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede biologický původ buněk použitých k přípravě vakcíny.

Vaccinum rabiei inactivatum ad usum veterinarium [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti vzteklině pro veterinární použití

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek z fixního viru vztekliny inaktivovaný vhodným způsobem. Virus se pomnoží ve vhodné buněčné kultuře nebo v jiných vhodných substrátech a může se purifikovat a koncentrovat. Vakcína může obsahovat adjuvans a vhodnou protimikrobní konzervační látku.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vakcíny z tkáňových kultur se připravují pomnožením viru v primárních buněčných kulturách ze zdravých zvířat nebo ve vhodných buněčných liniích (5.2.4). Virová suspenze se sklízí jedenkrát nebo vícekrát během 28 dní po naočkování. Vícenásobné sklizně z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň. Virus vztekliny se inaktivuje vhodnou metodou.

U vakcín z buněčných kultur se na buněčných kulturách stejného druhu, jaké byly použity při výrobě vakcíny, provede zkouška na zbytkový infekční virus vztekliny, aby se potvrdila účinná inaktivace viru vztekliny. Množství inaktivovaného viru pro tuto zkoušku odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny. Nezjistí se živý virus.

Účinnost reprezentativní šarže vakcíny se prokazuje přímou čelenží a nepřímou metodou prokazující tvorbu neutralizačních protilátek na každém druhu zvířat, pro který je vakcína určena.

Následující požadavky platí pro tekuté přípravky a pro lyofilizované přípravky rekonstituované podle údajů v označení.

Zkouška totožnosti

Vakcína po podání zvířatům podporuje tvorbu specifických neutralizačních protilátek.

Zkouška na čistotu

Bezpečnost. Jestliže je vakcína určena pro více než jeden druh zvířat, včetně psa, provede se zkouška na psech. Jinak se použije jeden z druhů zvířat, pro který je vakcína určena. Dvěma vnímavým zvířatům se vstříkne způsobem uvedeným v označení dvojnásobek nejmenší dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Nevzniknou významné místní nebo systémové reakce.

Inaktivace. Nejméně deseti myším hmotnosti 11 g až 15 g se intracerebrálně vstříkne po 0,03 ml ředění, které odpovídá nejméně pětinásobku udané nejmenší dávky. Pokud vakcína obsahuje protimikrobní konzervační látku nebo adjuvans, rozředí se před aplikací nejvýše desetkrát. V tomto případě, a nebo když vakcinační kmen je patogenní jen pro sající myšky, provede se zkouška na jednodenních až čtyřdenních myškách. Zvířata se pozorují 21 dní. Jestliže více než dvě zvířata uhynou v průběhu prvních 48 h, zkouška se opakuje. Zvířata nemají od 3. do 21. dne po podání žádné příznaky vztekliny nebo jiné anomálie, které by bylo možno přičítat vakcíně.

Místo této zkoušky je možno použít u tkáňových vakcín, které neobsahují žádné adjuvans, vhodnější pomnožovací zkoušky na přítomnost zbytkového infekčního viru, pro kterou se použije stejný druh tkáňových kultur, jaký byl použit pro výrobu vakcíny.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší před klinickými účinky dále definované dávky vzteklinového viru intracerebrálně podaného v porovnáním s množstvím referenčního přípravku inaktivované vakcíny proti vzteklině pro veterinární použití BRP kalibrované v mezinárodních jednotkách nezbytným k dosažení stejné ochrany.

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se používají zdravé myši ve stáří asi 4 týdnů a hmotnosti 11 g až 15 g z jednoho chovu. Myši se rozdělí do nejméně deseti skupin po nejméně deseti zvířatech. Všechny myši jsou stejného pohlaví.

Příprava suspenze k čelenži. Jedné skupině myší se intracerebrálně vstříkne kmen CVS viru vztekliny. Při vzniku příznaků vztekliny ještě před jejich uhynutím se myši usmrtí, odeberou se mozky a z mozkové tkáně se připraví ve vhodném rozpouštědle homogenní suspenze. Po oddělení hrubých částic odstředěním se supernatant použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 °C. Jedna ampule se rozmrazí a ve vhodném rozpouštědle se připraví sériové ředění. Každé ředění se použije pro jednu skupinu deseti myší. Každé myši se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují 14 dní a v každé skupině se zaznamenává počet zvířat, u kterých se mezi 5. až 14. dnem vyvinuly příznaky vztekliny. Potom se vypočte ID50 neředěné suspenze.

Postup zkoušky. Připraví se nejméně tři sériová ředění zkoušeného přípravku a tři podobné řady ředění porovnávacího přípravku.

Ředění se vyberou tak, aby ředění s nejvyšší koncentrací vakcíny chránilo nejméně 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a ředění s nejnižší koncentrací vakcíny chránilo méně než 50 % zvířat, jimž bylo podáno. Každé ředění se použije u jedné skupiny myší. Každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml příslušného ředění. Za 14 dní po podání vakcíny se připraví suspenze čelenžního viru tak, aby na podkladě předtitrace obsahovala každá čelenžní dávka 50 ID 50 v 0,03 ml. Všem vakcinovaným myším se intracerebrálně vstříkne po 0,03 ml čelenžní suspenze. Mimo to se připraví tři další sériová ředění použitého čelenžního viru. Ředění použité k čelenži a připravená tři další ředění se intracerebrálně vstříknou v dávce 0,03 ml na myš dalším čtyřem skupinám po deseti nevakcinovaných myších. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní. V každé skupině mohou do 4 dní po čelenži uhynout nejvýše dvě myši. V každé skupině se zaznamenává počet zvířat, u kterých se v době od 5 do 14 dní po čelenži vyskytly příznaky vztekliny.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže:

• 50% ochranná dávka zkoušeného i referenčního přípravku je mezi největší a nejmenší dávkou vakcíny podanou myším,

• kontrolní titrace čelenžní suspenze prokáže, že v dávce 0,03 ml bylo dosaženo nejméně 10 ID 50,

• interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti,

• statistická analýza ukazuje signifikantní vzestup a žádné signifikantní odchylky od linearity a rovnoběžnosti přímek závislosti odpovědi na dávce.

Vakcína vyhovuje zkoušce, když stanovená účinnost je nejméně 1 m.j. v nejmenší předepsané dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

• druh tkáně nebo buněčné kultury, které byly použity pro přípravu vakcíny, a druh původu,

• nejmenší počet mezinárodních jednotek v dávce.

Vaccinum rabiei perorale vivum ad vulpem [image omitted]

Živá vakcína proti vzteklině perorální pro lišky

Je to přípravek z imunogenního kmene oslabeného viru vztekliny. Vakcína se vloží do návnady tak, že se mohou asepticky provést dále popsané zkoušky.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Oslabený kmen viru se pomnožuje ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4); v případě, že buněčné kultury jsou savčího původu, jsou prokazatelně prosté viru vztekliny. Virová suspenze se sklízí jedenkrát nebo vícekrát během 14 dnů po naočkování. Vícenásobné sklizně z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň. Virová suspenze se může smíchat s vhodným stabilizátorem. Vakcína může být tekutá nebo lyofilizovaná. Lyofilizovaná vakcína se před použitím rekonstituuje.

Výběr vakcinačního kmene

Pro výrobu vakcíny se může použít jen takový kmen viru, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska imunogenity (viz Stanovení účinnosti) a následujících charakteristik:

• při perorálním podání v doporučené dávce a doporučenou metodou nevzniknou u čtyřiceti lišek v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,

• při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti lišek v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,

• při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti psů v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,

• při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti koček v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,

• v přirozených a experimentálních podmínkách nedojde u divoce žijících hlodavců k rozšíření virového kmene z jednoho zvířete na druhé,

• virový kmen má jeden nebo více stabilních genetických markerů, kterými může být rozlišen od jiných virových kmenů vztekliny.

Zkoušení šarže

Pokud byla zkouška účinnosti provedena s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může se tato zkouška vypustit při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula.

Zkoušky totožnosti

A. Po smíchání s monospecifíckým vzteklinovým antisérem vakcína již není schopna infikovat vnímavé buněčné kultury, do nichž je naočkována.

B. Provede se zkouška na prokázání genetických markerů.

Zkoušky na čistotu

Cizí viry.

• a) Po smíchání se specifickým neutralizačním vzteklinovým antisérem nevyvolá vakcína po vyočkování na vnímavou buněčnou kulturu cytopatický efekt. Neprokážou se známky hemaglutinačních nebo hemadsorpčních agens.

• b) Vnímavá buněčná kultura se naočkuje ředěními vakcíny 1 : 10 a 1 : 1000 a inkubuje se při 37 °C. Po 2,4 a 6 dnech se buňky obarví různými typy monoklonálních protilátek, které nereagují s vakcinačním kmenem, ale reagují s jinými kmeny viru vztekliny (např. uliční virus, Pasteurův kmen). Vakcína nevykazuje známky znečištění jinými vzteklinovými viry.

Bakterie a houby. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Vakcína se titruje ve vhodných buněčných kulturách. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně množství viru odpovídající nejmenšímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použije se nejméně třicet pět lišek nejméně 3 měsíce starých prostých protilátek neutralizujících vzteklinu. Každému z nejméně dvaceti pěti zvířat se podá perorálně návnada uvedená v označení s vakcínou v množství odpovídajícím minimálnímu titru uvedenému v označení. Nejméně deset zvířat zůstává jako kontrolní. Všechna zvířata se pozorují po dobu 180 dnů. Žádné ze zvířat nevykazuje známky onemocnění vzteklinou. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že pozorovací dobu přežije nejméně dvacet pět vakcinovaných zvířat. Po 180 dnech po vakcinaci se všechny lišky intramuskulárně čelenžují virulentním kmenem viru vztekliny schváleným oprávněnou autoritou. Zvířata se pozorují 90 dnů po infekci. Zvířata, jež uhynula z důvodů, které nelze přisoudit vzteklině, se vyloučí. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že se počet vakcinovaných zvířat ve zkoušce nesníží na méně než dvacet pět. Vakcína vyhovuje zkoušce, když nejvýše dvě z dvaceti pěti vakcinovaných zvířat (nebo statisticky odpovídající počet, když více než dvacet pět vakcinovaných zvířat bylo čelenžováno) vykazují příznaky onemocnění vzteklinou. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejméně devět kontrolních zvířat (nebo statisticky odpovídající počet, pokud více než deset kontrolních zvířat bylo čelenžováno) vykazuje příznaky vztekliny a v mozku těchto zvířat se metodou fluorescenčních protilátek nebo jinou spolehlivou metodou prokáže přítomnost viru vztekliny.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede podstata genetického markeru virového kmene.

Vaccinum rhinotracheitidis infectivae bovinae vivum cryodesiccatum [image omitted]

Živá vakcína proti infekční bovinní rinotracheitidě lyofilizovaná

Je to přípravek z jednoho nebo více oslabených kmenů viru infekční bovinní rinotracheitidy (bovinní herpesvirus 1).

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží ve vhodné buněčné kultuře (5.2.4). Virová suspenze se shromáždí a smíchá s vhodným stabilizačním roztokem. Tato směs se potom lyofilizuje.

Výběr vakcinačního kmene

Pro výrobu vakcíny se může použít jen takový kmen viru, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska následujících charakteristik: bezpečnost (včetně toho, že nevyvolává potraty a neprochází placentou), nevratnost virulence a imunogenita. Kmen může mít markery. K prokázání bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost. Pěti telatům ve stáří 3 měsíců nebo v nejnižším věku doporučeném pro vakcinaci, pokud je tento věk méně než 3 měsíce, která nemají protilátky proti infekční bovinní rinotracheitidě, se určeným způsobem podá množství viru odpovídající deseti dávkám vakcíny. Telata se pozorují 21 dní. Telata zůstávají zcela zdravá a neobjeví se významné místní nebo systémové reakce.

Schopnost vyvolat potrat a průchod placentou. Pro zkoušku se použije dvacet čtyři březích krav prostých protilátek proti infekční bovinní rinotracheitidě. Z toho je osm krav ve čtvrtém měsíci březosti, osm krav v pátém měsíci březosti, osm krav v šestém či sedmém měsíci březosti. Každé krávě se zamýšleným způsobem podá množství viru odpovídající deseti dávkám vakcíny. Krávy se pozorují až do konce březosti. Jestliže během pozorování dojde k abortu, provede se zkouška na přítomnost viru infekční bovinní rinotracheitidy. V plodu ani v placentě se nezjistí přítomnost viru ani virových antigenů. U narozených telat ještě před napitím kolostra se provede zkouška na protilátky proti infekční bovinní rinotracheitidě; nezjistí se žádné takové protilátky.

Nevratnost virulence. Od pěti telat použitých ve zkoušce na bezpečnost vakcíny se v době, kdy vakcinační virus může být snadno detekován, odeberou vhodné vzorky. Ověří se přítomnost a titr viru ve vzorcích. Vzorky se potom smíchají a podají intranazálně dvěma vnímavým telatům stejného stáří. V pěti dalších po sobě jdoucích pasážích se v každé pasáži provádí průkaz přítomnosti viru. Telata zůstanou zdravá a nezjistí se významné místní nebo systémové reakce.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná pro průkaz imunogenity.

Zkoušení šarže

Pokud se provede stanovení účinnosti s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může se tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypustit, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkoušky totožnosti

A. Vakcína se rekonstituuje podle údajů v označení. Když se smíchá s vhodným množstvím monospecifického antiséra, rekonstituovaná vakcína již není schopna infikovat vnímavé buněčné kultury, do nichž je inokulována.

B. Ověří se markery kmene.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma vnímavým telatům ve stáří tři měsíce nebo v nejnižším věku doporučeném pro vakcinaci, pokud je tento věk méně než tři měsíce, se podá po deseti dávkách rekonstituované vakcíny způsobem uvedeným v označení. Telata se pozorují 21 dní. Vakcína vyhovuje zkoušce, pokud zvířata zůstávají zcela zdravá a nezjistí se významné místní nebo systémové změny.

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článek Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Cizí viry. Vakcína se neutralizuje monospecifickým antisérem a inokuluje se do vnímavých buněčných kultur. Kultura se udržují 14 dní a za 7 dní se provede pasáž. Buněčné kultury nejeví známky virové kontaminace.

Titr viru. Titr rekonstituované vakcíny se stanoví na vnímavých buněčných kulturách při teplotě podporující replikaci viru. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně množství viru odpovídající minimálnímu titru viru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použijí se vnímavá telata 2 až 3 měsíce stará a prostá neutralizačních protilátek proti infekční bovinní rinotracheitidě. Pěti telatům se způsobem uvedeným v označení podá množství rekonstituované vakcíny obsahující množství viru, které odpovídá minimálnímu titru viru uvedenému v označení. Dvě telata jsou jako kontrola. Po 21 dnech se podá sedmi telatům intranazálně množství viru infekční bovinní rinotracheitidy, které u vnímavých telat vyvolá vznik typických příznaků onemocnění, jako je teplota, výtok z očí a nosu a ulcerace na nosní sliznici. Zvířata se pozorují 21 dní. Vakcinovaná telata mají jen mírné příznaky, kontrolní mají typické příznaky. Nejméně u čtyř z pěti vakcinovaných telat se v nazální mukóze zjistí maximální titr viru, který je stokrát nižší než průměr maximálního titru viru zjištěný u kontrolních telat. Průměrný počet dní, kdy je virus vylučován, je nejméně o tři dny kratší u telat vakcinovaných než u telat kontrolních.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum rubellae vivum [image omitted]

Živá vakcína proti zarděnkám

Synonymum. Živá očkovací látka proti zarděnkám

Je to lyofilizovaná suspenze schváleného oslabeného kmene zarděnkového viru. Vakcína se ředí podle návodu bezprostředně před použitím. Vznikne čirá tekutina, jež může být zbarvena přítomným indikátorem pH.

Výroba

Výroba je založena na systému jednotné inokulace a buněčné banky. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu přiměřené imunogenity a bezpečnosti pro člověka. Pokud není prokázáno a schváleno jinak, neprochází virus v hotovém přípravku od základní kultury do přípravy vakcíny více pasážemi, než bylo použito u vakcíny, jejíž bezpečnost a účinnost byla prokázána v klinické studii.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že výrobek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v lidských diploidních buňkách (5.2.3).

Výchozí kultura viru

Kmen použitého zarděnkového viru má průkaznou dokumentaci, která obsahuje informace o jeho původu a následném zacházení. Aby se předešlo nezbytnému použití opic na zkoušku neurovirulence, připraví se výchozí kultura viru ve velkém množství a uchovává se při teplotách pod -20 °C, pokud je lyofilizována, anebo při teplotě pod60 °C, pokud lyofilizována není. Pro pomnožení viru se použije jenom ta výchozí kultura, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Totožnost. Matečné a pracovní inokulum se prokáží jako zarděnkový virus v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.

Koncentrace viru. Koncentrace viru v matečném a pracovním inokulu se stanovuje k zajištění stejnorodosti výroby.

Cizí antigeny (2.6.16). Pracovní výchozí kultura vyhovuje požadavkům na výchozí kulturu viru.

Neurovirulence (2.6.18). Pracovní výchozí kultura vyhovuje zkoušce na neurovirulenci živých virových vakcín. Pro zkoušku jsou vhodné opice Macaca a Cercopithecus.

Pomnožení viru a jeho sklizeň

Všechny pracovní postupy v buněčné bance a se získanými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do růstových médií se může použít schválené zvířecí (nikoliv lidské) sérum, ale konečné médium pro udržování růstu buněk při pomnožování viru neobsahuje žádné zvířecí sérum. Sérum a trypsin, použité při přípravě buněčné suspenze a při přípravě médií, se zkouší na nepřítomnost cizích antigenů. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a vhodné antibiotikum v nejnižší účinné koncentraci. Je však výhodnější mít po dobu výroby substrát bez antibiotik. Nejméně 500 ml výrobní buněčné kultury se odloží jako neinfikovaná buněčná kultura (kontrolní buňky). V průběhu pomnožování viru se kontroluje teplota inkubace a za 28 dní od naočkování nebo dříve se odebírá virus, a to najednou nebo opakovaně. Opakované odběry z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednu sklizeň viru.

K přípravě konečné várky vakcíny se použije jenom ta sklizeň viru, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Totožnost. Sklizeň viru obsahuje viry, které se prokáží jako zarděnkový virus v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.

Koncentrace viru. Koncentrace viru ve sklizni viru se stanoví ke sledování stejnorodosti výroby a k výpočtu ředění pro konečnou vakcínu. Postupuje se tak, jak je uvedeno v odstavci Stanovení účinnosti.

Cizí antigeny (2.6.16).

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z přípravy buněčné kultury, z níž se získává virus, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na nepřítomnost cizích antigenů (2.6.16).

Konečná várka vakcíny

Virové sklizně, které vyhověly výše uvedeným zkouškám, se spojí a vyčeří, aby se odstranily buňky. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se naředí, jak je zapotřebí.

K přípravě konečné šarže se použije jenom ta konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícímu požadavku.

Bakterie a houby. Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1); na každou živnou půdu se použije 10 ml zkoušené konečné várky vakcíny.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených nádobek a lyofilizuje se, až obsah vlhkosti dosáhne hodnoty příznivé pro stabilitu vakcíny. Nádobky se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci a přístupu vlhkosti.

K použití se propustí jenom ta šarže, která vyhovuje požadavku na tepelnou stabilitu a požadavkům uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Jestliže u konečné várky vakcíny byla s vyhovujícím výsledkem provedena zkouška na hovězí sérový albumin, může být tato zkouška u šarže vypuštěna.

Tepelná stabilita. Provede se zrychlená rozkladná zkouška zahřátím lyofilizované vakcíny na 37 °C po 7 dní. Koncentrace viru po této době neklesne od výchozí hodnoty o více než 1 log10 a v každém případě musí být nejméně 10^3 TKD50 v jedné dávce.

Zkouška totožnosti

Zkoušený přípravek rozpuštěný předepsaným způsobem a smíchaný se specifickým protizarděnkovým sérem není již schopen infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rozpuštěný zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Hovězí sérový albumin. Nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce, stanoveno vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Infekční virové částice se stanoví nejméně trojmo, při čemž se použije nejméně pět buněčných kultur pro každé 0,5 log10 sériové ředění nebo jinou metodu se stejnou přesností. K ověření každé zkoušky se použije vhodný virový porovnávací přípravek. Stanovená koncentrace viru je rovna nejméně koncentraci uvedené v označení; minimální koncentrace uvedená v označení je nejméně 10^3 CCID50 v jedné lidské dávce. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) logaritmu koncentrace viru je menší než ±0,3.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

• kmen viru použitý k přípravě vakcíny,

• typ a původ buněk použitých k přípravě vakcíny,

• minimální koncentrace viru,

• varování před stykem s dezinfekčními prostředky,

• doba, v níž se vakcína po rozpuštění musí použít,

• že vakcína se nesmí podat těhotným ženám a že žena nesmí 2 měsíce po očkování otěhotnět.

Vaccinum tetani adsorbatum [image omitted]

Adsorbovaná vakcína proti tetanu

Synonymum. Adsorbovaná očkovací látka proti tetanu

Je to tetanický toxoid adsorbovaný na minerální nosič. Toxoid se připravuje formaldehydovou inaktivací toxinu vytvořeného při růstu kultury mikroba Clostridium tetani.

Výroba

Várka přečištěného toxoidu

Výchozí pracovní kultury, které vytvářejí tetanický toxin pro výrobu toxoidu, se připravují definovaným systémem jednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuje novým cíleným výběrem. Vysoce toxinogenní kmen Clostridium tetani známého původu a udržování se pěstuje ve vhodné tekuté živné půdě. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Asepticky se shromáždí živné půdy obsahující toxin. Kontroluje se obsah toxinu (Lf v ml), aby bylo možno sledovat pravidelnost výroby. Jednotlivé sklizně se mohou spojit, aby se připravila várka přečištěného toxoidu. Toxin se čistí, aby se odstranily složky, které by mohly u člověka způsobit nežádoucí reakce. Vyčištěný toxin se detoxikuje formaldehydem takovou metodou, která zabrání poškození imunogenní účinnosti toxoidu a jeho zpětné přeměně na toxin, zvláště působením tepla. Přečištění lze také provést až po detoxikaci.

K přípravě konečné várky vakcíny se může použít pouze várka přečištěného toxoidu, který vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Nepřítomnost tetanického toxinu. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně nejméně 500 Lf přečištěného toxoidu v 1 ml. Jestliže se u některého ze zvířat během 21 dnů následujících po injekci projeví příznaky tetanu nebo na něj zvíře uhyne, toxoid nevyhovuje zkoušce. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, toxoid nevyhovuje.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ±3) °Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního tetanického toxinu, jako je podání myším nebo morčatům.

Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající tetanickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1000 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví adsorpcí vhodného množství přečištěného tetanického toxoidu na hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý; vzniklá směs je přibližně izotonická s krví. Je možné přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Některé z nich, zvláště fenolového typu, působí nepříznivě na antigenní aktivitu, a nelze je tedy použít.

K přípravě šarže se může použít pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.