Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Tento plán je užitečný, je-li možné pokus rozdělit do bloků, z nichž každý obsahuje pouze dvě ošetření, například blok tvoří jedna pokusná jednotka ošetřená dvakrát při různých podnětech. Tento plán pokusu sleduje zvýšení přesnosti omezením vlivu rozdílu mezi pokusnými jednotkami tím, že vyvažuje efekt rozdílu odpovědí na oba podněty.

Pokus, v kterém se testují dvě dávky standardu proti dvěma dávkám přípravku, se nazývá dvoudávkový křížový pokus a podobně pro test se třemi dávkami obou podnětů se používá název třídávkový křížový pokus.

Pokus je rozdělen do dvou vhodných časových intervalů. Pokusné jednotky jsou rozděleny do čtyř (případně šesti) skupin a ošetřeny nejprve jednou ze čtyř (šesti) dávek a později jsou tytéž jednotky ošetřeny tak, že ty jednotky, které byly ošetřeny menší dávkou, budou ošetřeny dávkou větší a naopak. U jednotlivých pokusných jednotek se též zamění aplikace standardu za přípravek a naopak. Rozložení dávek je zobrazeno v tabulce 3.2.2-I.

Tab. 3.2.2-I Rozdělení jednotlivých dávek v křížovém pokusu

| | Dvoudávkový křížový pokus | Třídavkový křížový pokus | | | | Skupina jednotek | Čas I | Čas II | Čas I | Čas II | | --- | --- | --- | --- | --- | | 1 | s1 | u2 | s1 | u3 | | 2 | s2 | u1 | s2 | u2 | | 3 | u1 | s2 | s3 | u1 | | 4 | u2 | s1 | u1 | s3 | | 5 | - | - | u2 | s2 | | 6 | - | - | u3 | s1 |

• 3.2.2.4 Latinské čtverce

Tento plán experimentu je vhodný, ovlivňují-li odpověď dva různé rušivé vlivy nabývající k různých úrovní. Například zkouška antibiotik se provádí na destičce rozdělené do k x k polí tak, že každé z k ošetření je právě jednou v každém sloupci a v každém řádku destičky. Tento plán pokusuje použitelný při stejném počtu sloupců, řádků i ošetření.

Výsledky jsou zaznamenávány do tabulky k x k, nazývané latinský čtverec. Variabilita odpovědi způsobená rozdíly v poloze ošetření na destičce (mezi k sloupci a k řádky) je rovnoměrně rozdělena a tím je tedy snížena chyba.

V tabulce 3.2.3-V jsou uvedena schémata latinských čtverců, ve kterých se každé ošetření objevuje v každém řádku a každém sloupci právě jednou. Použití je popsáno v příkladu 3.2.8.3. Vzorce a příklady pro opakované latinské čtverce jsou popsány v publikacích textu o biologických zkouškách.

Instrukce pro náhodný výběr latinského čtverce se najde v tabulkách (viz Statistical Tables for Biological, Agricultural and Medical Research, R. A. Fisher and F. Yates, Oliver and Boyd). Při každém použití tohoto plánu by měl být výběr pokusných jednotek do bloků proveden náhodně a pokusné jednotky by měly být vystaveny stejným podmínkám před i během pokusu.

• 3.2.3 Analýza rozptylu

Bez ohledu na některé úpravy chybového členu je základ analýzy výsledků zkoušek stejný pro všechny výše zmíněné plány experimentu. Tato kapitola obsahuje vzorce pro provedení analýzy a v příkladech kapitoly 3.2.8 je podrobněji objasněna interpretace výsledků analýzy. Vzorce jsou přizpůsobeny provádění jednoduchých zkoušek porovnávajících jeden přípravek (U) se standardem (S) a vícenásobných zkoušek s několika testovanými přípravky (U... Z). Vzorce pro vyhodnocení křížových pokusů nelze plně schematizovat, analýza jednoho takovéhoto pokusuje obsažena v příkladě 3.2.8.4.

Vezmou-li se v úvahu body diskutované v kapitole 3.1 a v případě potřeby se transformují odpovědi, mohou se hodnoty y sečíst pro každé ošetření a každý přípravek, jak je to patrné v tabulkách 3.2.3-I, 3.2.3-II a 3.2.3-III. Dále se může stanovit lineární kontrast, který odpovídá sklonu přímky vyjadřující závislost odpovědi na logaritmu dávky. V modelu se třemi dávkami se dá testovat nelinearita tohoto vztahu pomocí kvadratického kontrastu.

Celková variabilita odpovědí, kterou způsobují různá ošetření, se rozkládá na složky uvedené v tabulce 3.2.3-IV. Součty čtverců se vypočtou z hodnot v tabulkách 3.2.3-I, 3.2.3-II nebo 3.2.3-III.

Reziduální chyba zkoušky se získá odečtením složek variability tvořených modelem od celkové variability odpovědi (tabulka 3.2.3-V). V této tabulce Σy^2 představuje součet čtverců všech odpovědí ve zkoušce. Součet čtverců pro ošetření je roven součtu čtverců v tabulce 3.2.3-IV přes všechny zdroje variability. Pro latinské čtverce je počet opakovaných odpovědí (n) stejný jako počet řádků, sloupců a ošetření (k).

Tab. 3.2.3-I Vzorce pro zkoušky s dvěma dávkami přípravků

	Standard (S)	1. testovaný přípravek (U)	(h - 1) testovaný přípravek (Z)
celková odpověď - nízká dávka	S1	U2	Z1
celková odpověď - vysoká dávka	S2	U2	Z2
celková odpověď pro přípravek	S1+S2=S	U1+U2=U	Z1+Z2=Z
lineární kontrast	S2-S1=LS	U2-U1=LU	Z2-Z1=LZ

Tab. 3.2.3-II Vzorce pro zkoušky s třemi dávkami přípravků

	Standard (S)	1. testovaný přípravek (U)	(h - 1) testovaný přípravek (Z)
celková odpověď - nízká dávka	S1	U2	Z1
celková odpověď - střední dávka	S2	U2	Z2
celková odpověď - vysoká dávka	S3	U3	Z3
celková odpověď pro přípravek	S1+S2+S3=S	U1+U2+U3=U	Z1+Z2+Z3=Z
lineární kontrast	S3-S1=LS	U3-U1=LU	Z3-Z1=LZ
kvadratický kontrast	S1-2S2+S3=QS	U1-2U2+U3=QU	Z1-2Z2+Z3=QZ

Tab. 3.2.3-III Vzorce pro zkoušky se čtyřmi dávkami přípravků

	Standard (S)	1. testovaný přípravek (U)	(h -1) testovaný přípravek (Z)
celková odpověď - nízká dávka	S1	U1	Z1
celková odpověď - 2. dávka	S2	U2	Z2
celková odpověď - 3. dávka	S3	U3	Z3
celková odpověď - 4. dávka	S4	U4	Z4
celková odpověď pro přípravek	S1+S2+S3+S4=S	U1+U2+U3+U4=U	Z1+Z2+Z3+Z4=Z
lineární kontrast	3S4+S3-S2-3S1=LS	3U4+U3-U2-3U1=LU	3Z4+Z3-Z2-3Z1=LZ
kvadratický kontrast	S1-S2-S3+S4=QS	U1-U2-U3+U4=QU	Z1-Z2-Z3+Z4=QZ
kubický kontrast	3S2-S1+S4-3S3=JS	3U2-U1+U4-3U3=JU	3Z2-Z1+Z4-3Z3=JZ

Tab. 3.2.3-IV Testy validity

| Zdroj variability | Stupně volnosti (f) | Součet čtverců u zkoušky | | | | 2dávkové | 3dávkové | 4dávkové | | | | --- | --- | --- | --- | --- | | přípravky | h - 1 | S2+U2+…+Z22n-K | S2+U2+…+Z23n-K | S2+U2+…+Z24n-K | | lineární regrese | 1 | LS+LU+…+LZ22nh=E | LS+LU+…+LZ22nh=E | LS+LU+…+LZ220nh=E | | nerovnoběžnost | h - 1 | LS2+LU2+…+LZ22n-E | LS2+LU2+…+LZ22n-E | LS2+LU2+…+LZ220n-E | | kvadratická regrese | | nelze | QS+QU+…+QZ26nh=Q | QS+QU+…+QZ24nh=Q | | diference kvadratických členů | h - 1 | nelze | QS2+QU2+…+QZ26n-Q | QS2+QU2+…+QZ24n-Q | | nelinearita | h (3 dávky) 2h (4 dávky) h = K | nelze | QS2+QU2+…+QZ26n | QS2+QU2+…+QZ24n+JS2+JU2+…+JZ220n |

Tab. 3.2.3-V Odhad reziduální chyby

| Součet čtverců | | | | | | Zdroj variability | Stupně volnosti (f) | Úplně náhodný plán | Pokus v náhodných blocích bez opakování | Pokus v latinském čtverci | | --- | --- | --- | --- | --- | | ošetření | k - 1 | S12+S22+…Zd2n-R | S12+S22+…Zd2n-R | S12+S22+…Zd2n-R | | bloky (řádky) | n -1 | nelze | R12+R22+…Rn2k-R | R12+R22+…Rn2k-R | | bloky (sloupce) | n - 1 | nelze | nelze | C12+C22+…Cn2k-R | | reziduální chyba | odečtením | * | * | * | | celkem | N - 1 | ∑y2-R | ∑y2-R | ∑y2-R |

• Získá se odečtením všech ostatních součtů od součtu celkového.

• 3.2.4 Testy validity

K ověření významnosti zdrojů variability v tabulce 3.2.3-IV je nutné každý součet čtverců v tabulce dělit odpovídajícím počtem stupňů volnosti, čímž se získá průměrný čtverec.

Průměrný čtverec reziduální chyby (s^2) je stejný podíl odvozený z odpovídajícího řádku tabulky 3.2.3-V.

Průměrný čtverec pro každou testovanou veličinu se dělí s^2. Významnost takto získaných hodnot (nazývaných podíly F) se posoudí porovnáním s kritickými hodnotami F-rozdělení, které jsou uvedeny v tabulce 3.2.4-I. Kritické hodnoty F pro pravděpodobnost chyby 0,05 a 0,01 jsou ve sloupci, který odpovídá počtu stupňů volnosti testované veličiny (f1), a řádku, který odpovídá počtu stupňů volnosti reziduálního rozptylu s^2 (f2). Je-li vypočtená hodnota F větší než odpovídající tabelovaná hodnota, pokládá se testovaný zdroj variability za statisticky významný na hladině významnosti (0,05 nebo 0,01).

Pokud se nenajdou odpovídající počty stupňů volnosti f (f1, f2) v tabulce kritických hodnot, použije se největší uvedený počet stupňů volnosti menší než f. Pokud je vypočtená hodnota F větší než tato tabelovaná kritická hodnota, považuje se test poměru rozptylů za statisticky významný. Je-li vypočtená hodnota F menší než tabelovaná kritická hodnota, použije se kritická hodnota pro nejmenší uvedený počet stupňů volnosti větší než f. Je-li vypočtená hodnota testovací statistiky F menší, považuje se test podílu rozptylů za statisticky nevýznamný. Pokud však tento postup nevede k rozhodnutí, je nutno použít podrobnější tabulky.

Zkouška se pokládá za "statisticky validní" při těchto výsledcích testů:

• 1. Lineární složka variability je silně významná, tj. příslušná vypočtená hodnota F je větší než kritická hodnota pro P = 0,01. Tento test prokazuje, že sklon lineární závislosti odpovědí na logaritmu dávky je dostatečně různý od 0 (odpověď závisí na dávce podnětu).

• 1. Nelineární složky variability nejsou statisticky významné, tj. vypočtená hodnota F je menší než kritická hodnota pro P = 0,05. Tento test kontroluje splnění podmínky 4A z kap. 3.1.

• 1. Nerovnoběžnost není statisticky významná (viz podmínka 5A kapitoly 3.1).

Významnost odchylky od rovnoběžnosti ve vícenásobných zkouškách může být způsobena zahrnutím zkoušeného přípravku s jiným sklonem regresní přímky, než mají ostatní přípravky. V tomto případě by se měly počítat testovací statistiky t’ zvlášť pro každý přípravek U, ..., Z:

t'=LS-LU2ns2. (3.2.4-1)

Tab. 3.2.4-I Tabulka kritických hodnot testu poměru rozptylů (F)

Stupně volnosti f1 v čitateli
f2 ve j m e n o v a t e l i		1	2	3	4	5	6	7	8	20	∞
12	4,75 (9,33)	3,89 (6,93)	3,49 (5,95)	3,26 (5,41)	3,11 (5,06)	3,00 (4,82)	2,91 (4,64)	2,85 (4,50)	2,54 (3,86)	2,30 (3,36)
15	4,54 (8,68)	3,68 (6,36)	3,29 (5,42)	3,06 (4,89)	2,90 (4,56)	2,79 (4,32)	2,71 (4,14)	2,64 (4,00)	2,33 (3,37)	2,07 (2,87)
20	4,35 (8,10)	3,49 (5,85)	3,10 (4,94)	2,87 (4,43)	2,71 (4,10)	2,60 (3,87)	2,51 (3,70)	2,45 (3,56)	2,12 (2,94)	1,84 (2,42)
25	4,24 (7,77)	3,38 (5,57)	2,99 (4,68)	2,76 (4,18)	2,60 (3,86)	2,49 (3,63)	2,40 (3,46)	2,34 (3,32)	2,01 (2,70)	1,71 (2,17)
30	4,17 (7,56)	3,32 (5,39)	2,92 (4,51)	2,69 (4,02)	2,53 (3,70)	2,42 (3,47)	2,33 (3,30)	2,27 (3,17)	1,93 (2,55)	1,62 (2,01)
40	4,08 (7,31)	3,23 (5,18)	2,84 (4,31)	2,61 (3,83)	2,45 (3,51)	2,34 (3,29)	2,25 (3,12)	2,18 (2,99)	1,84 (2,37)	1,51 (1,80)
60	4,00 (7,08)	3,15 (4,98)	2,76 (4,13)	2,53 (3,65)	2,37 (3,34)	2,25 (3,12)	2,17 (2,95)	2,10 (2,82)	1,75 (2,20)	1,39 (1,60)
∞	3,84 (6,63)	3,00 (4,61)	2,60 (3,78)	2,37 (3,32)	2,21 (3,02)	2,10 (2,80)	2,01 (2,64)	1,94 (2,51)	1,57 (1,88)	1,00 (1,00)

Při náhodné odchylce rozptylů s pravděpodobností překročení hodnoty tabelované na horním řádku 0,05 je pravděpodobnost nepřekročení této hodnoty 0,95. Pravděpodobnost překročení hodnoty v dolním řádku je rovna 0,01, takže s pravděpodobností 0,99 překročena nebude.

Pro čtyřdávkové zkoušky se tʹ počítá:

LS-LU210ns2.

Každá vypočtená hodnota t’ se porovná s kritickou hodnotou z tabulky 3.2.4-II, kde f1 = h - 1 a f2 je počet stupňů volnosti s^2. Pokud je některá z hodnot t´ statisticky významná, je nutno příslušný přípravek vyloučit ze zkoušky a znovu vyhodnotit.

Ve zkouškách s neobvykle velkou reziduální chybou může být vysoká významnost F-statistiky způsobena špatným odhadem předpokládané účinnosti. Pokud je tomu tak, může se získaný odhad účinnosti použít k stanovení předpokládané účinnosti pro další zkoušky tohoto přípravku.

V testech rovnoběžnosti a linearity se může nahodile vyskytnout hodnota F menší než 1. Pokud se však objevuje opakovaně, ukazuje to na odchylku od předpokladů platnosti modelu, která by se měla později vyšetřit. Pokud je potvrzena platnost modelu, může být vypočtena účinnost a její meze spolehlivosti. Postup je popsán v následující kapitole.

Tab. 3.2.4-II Kritické hodnoty t' dvoustranného testu porovnání h - 1 přípravků a standardu

| f1 = (h - 1) = počet zkoušených přípravků | | | | | | | | | | | f2 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 5 | 2,57 | 3,03 | 3,29 | 3,48 | 3,62 | 3,73 | 3,82 | 3,90 | 3,97 | | 6 | 2,45 | 2,86 | 3,10 | 3,26 | 3,39 | 3,49 | 3,57 | 3,64 | 3,71 | | 7 | 2,36 | 2,75 | 2,97 | 3,12 | 3,24 | 3,33 | 3,41 | 3,47 | 3,53 | | 8 | 2,31 | 2,67 | 2,88 | 3,02 | 3,13 | 3,22 | 3,29 | 3,35 | 3,41 | | 9 | 2,26 | 2,61 | 2,81 | 2,95 | 3,05 | 3,14 | 3,20 | 3,26 | 3,32 | | 10 | 2,23 | 2,57 | 2,76 | 2,89 | 2,99 | 3,07 | 3,14 | 3,19 | 3,24 | | 11 | 2,20 | 2,53 | 2,72 | 2,84 | 2,94 | 3,02 | 3,08 | 3,14 | 3,19 | | 12 | 2,18 | 2,50 | 2,68 | 2,81 | 2,90 | 2,98 | 3,04 | 3,09 | 3,14 | | 13 | 2,16 | 2,48 | 2,65 | 2,78 | 2,87 | 2,94 | 3,00 | 3,06 | 3,10 | | 14 | 2,14 | 2,46 | 2,63 | 2,75 | 2,84 | 2,91 | 2,97 | 3,02 | 3,07 | | 15 | 2,13 | 2,44 | 2,61 | 2,73 | 2,82 | 2,89 | 2,95 | 3,00 | 3,04 | | 16 | 2,12 | 2,42 | 2,59 | 2,71 | 2,80 | 2,87 | 2,92 | 2,97 | 3,02 | | 17 | 2,11 | 2,41 | 2,58 | 2,69 | 2,78 | 2,85 | 2,90 | 2,95 | 3,00 | | 18 | 2,10 | 2,40 | 2,56 | 2,68 | 2,76 | 2,83 | 2,89 | 2,94 | 2,98 | | 19 | 2,09 | 2,39 | 2,55 | 2,66 | 2,75 | 2,81 | 2,87 | 2,92 | 2,96 | | 20 | 2,09 | 2,38 | 2,54 | 2,65 | 2,73 | 2,80 | 2,86 | 2,90 | 2,94 | | 24 | 2,06 | 2,35 | 2,51 | 2,61 | 2,70 | 2,76 | 2,81 | 2,86 | 2,90 | | 30 | 2,04 | 2,32 | 2,47 | 2,58 | 2,66 | 2,72 | 2,77 | 2,82 | 2,86 | | 40 | 2,02 | 2,29 | 2,44 | 2,54 | 2,62 | 2,68 | 2,73 | 2,77 | 2,81 | | 60 | 2,00 | 2,27 | 2,41 | 2,51 | 2,58 | 2,64 | 2,69 | 2,73 | 2,77 | | 120 | 1,98 | 2,24 | 2,38 | 2,47 | 2,55 | 2,60 | 2,65 | 2,69 | 2,73 | | ∞ | 1,96 | 2,21 | 2,35 | 2,44 | 2,51 | 2,57 | 2,61 | 2,65 | 2,69 |

Dunnett, C. W.: Biometrics, 20, 1964, 482-491.

Při náhodné odchylce porovnávaných přípravků je pravděpodobnost překročení hodnoty tabelované na horním řádku rovna 0,05 as pravděpodobností 0,95 tedy tato hodnota překročena nebude.

• 3.2.5 Odhad účinností a její meze spolehlivosti

Nejprve se vypočtou průměry odpovědí (yS¯,yU¯,...yZ¯) pro každý přípravek:

yS¯=SNS, (3.2.5-1)

a podobně pro ostatní přípravky (viz graf 3.2.5-I).

Jestliže je I rozdíl logaritmů sousedních dávek každého přípravku, pak společný sklon (b) všech d-dávkových zkoušek je:

b=LS+LU+…+LZd-1Inh. (3.2.5-2)

Pro čtyřdávkové zkoušky se b počítá:

b=LS+LU+…+LZ10Inh.

Logaritmus relativní účinnosti R̕̕U zkoušeného přípravkuU— pak je:

M'U=yU¯-yS¯b. (3.2.5-3)

[image omitted]

Obr. 3.2.4-III Vývojový diagram testu validity rutinní zkoušky

Vývojový diagram ukazuje jednotlivé kroky analýzy výsledků zkoušky. Pokud se tento vývojový diagram použije pro vytvoření počítačového programu, musí být pro konečné rozhodnutí o přijetí, zamítnutí nebo modifikaci zkoušky vzaty v úvahu i výsledky jednotlivých kroků tohoto algoritmu.

Vypočtená účinnost je odhadem "skutečné účinnosti" zkoušeného přípravku. Interval spolehlivosti, který s 95% pravděpodobností obsahuje skutečnou hodnotu účinnosti, se vypočte jako antilogaritmus výrazu:

CM'U±stCb1NS+1NU+y¯S-y¯U2E-s2t2, (3.2.5-4)

kde:

C=EE-s2t2, (3.2.5-5)

E se najde v tabulce 3.2.3-IV, s^2 je podíl reziduálního součtu čtverců (tabulka 3.2.3-V) a odpovídajícího počtu stupňů volnosti; t je kritická hodnota t-rozdělení z tabulky 6.1 se stejným počtem stupňů volnosti pro pravděpodobnost 0,95.

Pro vyvážené zkoušky se dá tento vzorec zjednodušit na:

CM'U±C-1CM'U2+2H, (3.2.5-6)

kde:

H=Eb2dn

C je míra významnosti regrese. Ve zkouškách s dobře vymezeným sklonem je hodnota C velmi blízká jedné. Záporná hodnota C indikuje statisticky nevýznamnou závislost.

Odhadovaná účinnost (RU) a odpovídající meze spolehlivosti se vypočtou z hodnot získaných pomocí vzorců 3.2.5-3 a 3.2.5-6 buď vynásobením číslem Au po odlogaritmování, nebo přičtením logaritmu Au před odlogaritmováním. Na základě předpokládané účinnosti A se testuje shoda odpovědí na tři dávky u1, u2 a u3 testovaného přípravku s odpovědí na příslušné dávky standardu s1, s2 a s3. Protože je uvažována lineární závislost na logaritmu dávky, má osa dávek logaritmické měřítko.

Rozdíl logaritmů sousedních dávek I je konstantní:

ln⁡s2-ln⁡s1=ln⁡s3-ln⁡s2,

kde:

yS - průměrná odpověď standardu,

yU - průměrná odpověď neznámého přípravku.

Svislé úsečky představují rozmezí naměřených odpovědí na danou dávku, b je společný sklon rovnoběžných přímek proložených průměrnými hodnotami odpovědí standardu (yS) a přípravku (yU).

[image omitted]

Obr. 3.2.5-I Model rovnoběžnosti pro trojdávkovou zkoušku 3 + 3

• 3.2.6 Chybějící hodnoty

Ve vyvážených zkouškách se může přihodit, že v souvislosti s ošetřením dojde ke ztrátě jedné nebo více odpovědí, například tak, že některá zvířata uhynou. Úplná statistická analýza je pak mnohem složitější. Nicméně pokud je prokazatelné, že výskyt chybějící hodnoty nijak nesouvisí s přidělením pokusných jednotek do jednotlivých skupin, může být zachována jednoduchost vyhodnocení vyváženého plánu experimentu tak, že se nahradí chybějící hodnota hodnotou vypočtenou na základě ostatních pozorovaných hodnot. Ztráta informace se pak vezme v úvahu zmenšením počtu stupňů volnosti celkového a reziduálního součtu čtverců o jeden a použitím vzorce pro výpočet chybějící hodnoty.

Pokud chybí více než jedno pozorování, může se použít stejný vzorec. Postup je takový, že se hrubě odhadnou všechny chybějící hodnoty kromě jedné, a ta se vypočte podle uvedeného vzorce ze všech ostatních hodnot, včetně těch hrubě odhadnutých. Vypočtená hodnota se vezme za pozorovanou a pokračuje se stejným postupem pro všechny další chybějící hodnoty. Po vypočtení všech chybějících hodnot tímto postupem se provede cyklus znovu od začátku, přičemž se místo hrubých odhadů použijí posledně vypočtené hodnoty pro všechny chybějící odpovědi. To vše se opakuje několikrát, až se získají ve dvou po sobě následujících cyklech stejné hodnoty. Konvergence tohoto postupu je obvykle rychlá.

Pokud je počet nahrazovaných hodnot relativně malý v porovnání s celkovým rozsahem zkoušky (řekněme menší než 5 %), je použitá aproximace chybějících hodnot a redukce stupňů volnosti o počet chybějících hodnot obvykle uspokojivá. Nicméně výsledky by se měly interpretovat velmi opatrně, obzvláště pokud chybějící hodnoty v některém ošetření nebo bloku převažují. Pak by měl biometr uvážit, zda nepůsobily v průběhu zkoušky nějaké další nežádoucí vlivy. Nahrazení chybějících hodnot ve zkoušce bez jejího opakování je vždy choulostivé.

Úplné znáhodnění

Při úplném znáhodnění se za odhad chybějící hodnoty bere aritmetický průměr všech ostatních odpovědí daného ošetření.

Plán náhodných bloků

Chybějící hodnota (y´) se vypočte podle vzorce:

y'=nB'+kT'-G'n-1k-1, (3.2.6-1)

kde B´ je součet odpovědí v bloku obsahujícím příslušné chybějící pozorování, T´ součet odpovědí při příslušném ošetření a G´ součet všech odpovědí ve zkoušce.

Jako příklad nechť chybí odpověď u1 v prvém bloku zkoušky antibiotik (příklad 3.2.8.2).

B´	= 1050
T´	= 869
G´	= 7189
y´	= 174
k	= 6
n	= 6

Místo hodnoty 174 = u1 v tabulce odpovědí se získá podle vzorce (3.2.6-1) odhad 173. Hodnocení zkoušky bude stejné jako v příkladu 3.2.8.2, ale počet stupňů volnosti pro reziduální chybu bude roven 24 a pro celkový součet čtverců 34.

Latinské čtverce

Chybějící hodnota (y´) se nahradí podle vzorce:

y'=kB'+C'+T'-2G'k-1k-2, (3.2.6-2)

kde B´ a C´ jsou součty odpovědí v řádce a sloupci s chybějícím pozorováním. V tomto případě je k = n. Když v příkladu 3.2.8.3 chybí hodnota 165 v sedmém sloupci a v šestém řádku, dostane se její odhad 169 podle vzorce (3.2.6-2) z hodnot:

B´	= 1582
C´	= 1663
T´	= 1355
G´	= 15956
k	= 9

Stupně volnosti reziduální chyby budou redukovány na 55 a celkového součtu čtverců na 79.

Dvoudávková křížová zkouška

Když se chybějící pozorování vyskytne v dvoudávkové křížové zkoušce, je důležité konzultovat situaci se statistikem, protože vyhodnocení závisí na konkrétní kombinaci ošetření.

• 3.2.7 Částečně vyvážená zkouška

Liší-li se předpokládaná účinnost testovaného přípravku výrazně od skutečné účinnosti, může se stát, že nejvyšší dávka poskytuje již jen nejvyšší možnou odpověď, nebo naopak, že odpověď na nejnižší dávkuje minimální možná. Tyto odpovědi neleží v lineární části regresní křivky, testy validity indikují odchylku od linearity nebo nerovnoběžnost ve vztahu standardu a testovaného přípravku.

V daném případě se může odpověď na nejnižší nebo nejvyšší dávku ze zkoušky vyloučit. Ze zbývajících dat se vypočte provizorní odhad relativní účinnosti. Tento odhad účinnosti umožňuje vhodnější volbu dávek standardu a zkoušeného přípravku v nové zkoušce.

Logaritmus relativní účinnosti se získá ze vzorce:

M'U=y-U-y-Sb±I2, (3.2.7-1)

který je velmi podobný vzorci 3.2.5-3, pouze jedna polovina rozdílu logaritmů sousedních dávek se odčítá při vypuštění nejnižší dávky nebo přičítá při vypuštění dávky nejvyšší.

Průměrné odpovědi yU a yS se získají stejně jako v úplně vyvážené zkoušce (rovnice 3.2.5-1), ale vzhledem k plánu zkoušky je nutné poněkud modifikovat výpočet sklonu (b).

Ve vícenásobné zkoušce, původně se dvěma dávkami pro každý přípravek, se dají vypočítat všechny lineární kontrasty, (LS...LZ) s výjimkou kontrastu LU. (Při vyloučení jedné z dávek u1 nebo u2 není možné vypočíst kontrast LU).

Sklon se získá vypočtením průměru L a vydělením In:

b=LS+…+LZInh-1. (3.2.7-2)

Ve zkoušce pouze jednoho přípravku je:

b=LSIn. (3.2.7-3)

Ve vícenásobných třídávkových zkouškách se získá LU z tabulky 3.2.3-I a všechny ostatní lineární kontrasty z tabulky 3.2.3-II. Vzorec pro výpočet sklonu je:

b=2LS+…+LZ+LUIn4h-3. (3.2.7-4)

Při testování pouze jediného přípravku se vzorec redukuje na:

b=2LS+LU5In. (3.2.7-5)

• 3.2.8 Příklady

Příklady v této kapitole ilustrují použití vzorců vztahujících se k modelu rovnoběžnosti.

Příklady 3.2.8.1, 3.2.8.2 a 3.2.8.3 zahrnují dvou- a třídávkové zkoušky, včetně vícenásobných, a pokusné plány: úplně znáhodněný, náhodné bloky i latinské čtverce.

Příklad 3.2.8.4 ilustrující křížový dvoudávkový pokus obsahuje dosud nezavedené značení. Pro každou skupinu odpovědí ve zkoušce je zvlášť třeba vypočítat součet, lineární kontrasty a celkovou odpověď. Je potřebné znát i celkovou odpověď pro každého jedince. I když se v příkladu užívá označení den I a den II, není nutné provádět zkoušku ve dvou dnech. Podstatnou předností je, že efekt ošetření z první části křížové zkoušky se u každé pokusné jednotky vyloučí jejím ošetřením v druhé části zkoušky.

Příklad 3.2.8.1 popisuje použití Dunnettova testu validity v mnohonásobné zkoušce. Bartlettův test je použit v příkladech 3.2.8.1 a 3.2.8.1, Hartleyův test v příkladu 3.2.8.4.

Příklady mají ilustrovat především statistickou metodu výpočtů. Jejich cílem není výběr nejvhodnějšího z různých zkušebních plánů použitých v lékopisných článcích.

Při analýze provedené počítačem může větší počet desetinných míst způsobit malé odchylky ve výsledných hodnotách. Na konci některých příkladů jsou uvedeny takovéto přesnější výsledky. Odchylky ilustrují efekt zaokrouhlování.

Příklad 3.2.8.1 Dvoudávková vícenásobná zkouška úplně znáhodněná

Stanovení účinnosti kortikotropinu podkožním podáním krysám

Standard se podával v dávkách 0,25 a 1,0 jednotek na 100 g tělesné hmotnosti. Testovaly se dva přípravky, oba o předpokládané účinnosti 1 jednotka na miligram. Přípravky se tedy podávaly ve stejných dávkách jako standard. Průměry a rozptyly odpovědí ve všech ošetřovaných skupinách (tabulka 3.2.8.1-I) nenaznačují vzájemnou závislost.

Tab. 3.2.8.1-I Odpovědi y-množství kyseliny askorbové (mg) ve 100 g nadledvin

| | Standard S | Přípravek U | Přípravek Z | | | | | | s1 | s2 | u1 | u2 | z1 | z2 | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | | 300 | 289 | 310 | 230 | 250 | 236 | | | 310 | 221 | 290 | 210 | 268 | 213 | | | 330 | 267 | 360 | 280 | 273 | 283 | | | 290 | 236 | 341 | 261 | 240 | 269 | | | 364 | 250 | 321 | 241 | 307 | 251 | | | 328 | 231 | 370 | 290 | 270 | 294 | | | 390 | 229 | 303 | 223 | 317 | 223 | | | 360 | 269 | 334 | 254 | 312 | 250 | | | 342 | 233 | 295 | 216 | 320 | 216 | | | 306 | 259 | 315 | 235 | 265 | 265 | | průměr | 332,0 | 248,4 | 323,9 | 244,0 | 282,2 | 250,0 | | rozptyl (vari) | 1026,7 | 483,8 | 725,0 | 718,7 | 854,6 | 784,7 | | ln rozptylu | 6,9341 | 6,1817 | 6,5862 | 6,5774 | 6,7506 | 6,6653 |

Ověření normality rozložení je provedeno Shapiro-Wilk testem v nezávislých skupinách odpovědí.

Nejprve se vypočte hodnota v pro ošetření ve skupině S1 (viz tabulka 3.2.8. l-II). Hodnoty a, q a m se najdou v tabulce 3.1.1-II pro n = 10:

a = 0,366

q = -3,26

m = 1,47

Dále se vypočte hodnota V:

V=lnv-a1-v=ln0,956-0,3661-0,956=2,60

a odtud H= -3,26 + (1,47. 2,60) = 0,56.

Podobně se vypočtou hodnoty H pro ostatní ošetření (viz výsledky v tabulce 3.2.8.1-III).

Tab. 3.2.8.1-II Výpočet hodnoty v pro ošetření s1 (n = 10)

Pořadí	Seřazené odpovědi yi	Koeficient ai (tab. 3.1.1-I)	Součin aiyi
1	290	-0,574	-166,46
2	300	-0,329	-98,70
3	306	-0,214	-65,48
4	310	-0,122	-37,82
5	328	-0,040	-13,12
6	330	+0,040	13,20
7	342	+0,122	41,72
8	360	+0,214	77,04
9	364	+0,329	119,76
10	390	+0,574	223,86
	průměry¯=332,0	Součet∑aiyi=94,00
	∑yi-y-2=9240,00 s2=∑yi-y-2n-1=1026,67	v=∑aiyi2∑yi-y-2=8836,009240,00=0,956

Tab. 3.2.8.1-III Výpočet hodnot H pro všechna ošetření (n = 10)

	s1	s2	u1	u2	z1	z2
Σaiyi	94,00	63,63	78,60	78,28	82,90	81,96
Σyi-y¯2	9240,00	4354,40	6524,90	6468,00	7991,60	7062,00
v	0,956	0,930	0,947	0,947	0,893
0,95
1
V	2,60	2,09	2,39	2,39	1,59	2,48
H	0,56	-0,19	0,25	0,25	-0,92	0,39

Pro data z tabulky 3.2.8.1-III se vypočte testovací statistika:

t=0,56-0,19+…+0,396=0,342,45=0,14.

Porovnání vypočtené hodnoty s kritickou hodnotou v tabulce 6.1 (t = 1,96) na hladině významnosti 0,95 ukazuje, že data nejsou v rozporu s nulovou hypotézou normality.

Pokud provedeme analýzu pomocí počítačového programu, získáme hodnoty:

t=0,153 ΣH=0,375.

Bartlettův test neprokázal ani nehomogennost rozptylů.

Testovací statistika pro k skupin rozptylů o f stupních volnosti se vypočte podle vzorce:

χ2=3kf2kln∑varik-∑lnvari3kf+k+1.

Pro k = 6 a f = 9 vyjde:

χ2=14581696ln 765,58 - 39,6953=1,28.

Tato hodnota je menší než kritická hodnota 11,07 z tabulky 5.4.2-I pro P = 0,95 a (k - 1) = 5 stupňů volnosti.

Tab. 3.2.8.1-IV Součty odpovědí a kontrasty (viz tabulka 3.2.3-I)

	Standard S_	Přípravek U_	Přípravek Z_	Součet
nízká dávka	S1 = 3320	U1 = 3239	Z1 = 2822
vysoká dávka	S2 = 2484	U2 = 2440	Z2 = 2500
přípravek celkem	S = 5804	U = 5679	Z = 5322	∑y=16805
lineární kontrast	LS = -836	LU= -799	LZ = -322	∑L=-1957

Tab. 3.2.8.1-V Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F	P
přípravky	2	6256,6	3128,3
regrese	1	63 830,8	63 830,8	83,4	< 0,01
nerovnoběžnost	2	8218,2	4109,1	5,4	< 0,01
ošetření	5	78 305,7
reziduální chyba	54	41 340,9	765,6
součet	59	119 646,6

Korekční člen K:

K=∑y2N=16805260=4 706 800,42;∑y2=4 826 447.

Hodnoty součtů čtverců se získají z dat v tabulce 3.2.8.1-IV pomocí vzorců z tabulek 3.2.3-IV a 3.2.3-V.

Přípravky=S2+U2+Z220-K=6 256,63

Regrese=LS+LU+LZ260=63 830,87=E

Nerovnoběžnost=LS2+LU2+LZ220-E=8 218,233

Ošetření = S12+S22+U12+U22+Z12+Z2210-K=78 305,68

Celkový=∑y2-R=119 646,58

Reziduální chyba = Celkový - Ošetření = 41 340,90

Validita zkoušky

Výpočty potvrzují významnou regresi (závislost na dávce). Hodnota F = 83,4 pro regresi je mnohem větší než interpolovaná kritická hodnota z tabulky 3.2.4-I pro P = 0,01, f1 = 1 a f2 = 54.

Odchylka od rovnoběžnosti je však také statisticky významná (P < 0,05). Vypočtená hodnota F = 5,4. Při podrobnějším prohlédnutí lineárních kontrastů v tabulce 3.2.8.1.-IV je zřejmé, že lineární kontrast Z je menší než kontrasty S a U. Tuto domněnku lze potvrdit Dunnettovým testem:

t'=LS-LP2ns2,

kde s^2 = reziduální rozptyl, tj. 765,6, a LP je lineární kontrast testovaného přípravku P.

Pro přípravek P = U:

t'=-836 --799210.765,6=-37175,0=-0,21.

Pro přípravek P = Z:

t'=-836 --322210.765,6=-514175,0=-2,94.

Z tabulky 3.2.4-II je kritická hodnota t´= 2,27 pro P = 0,05 s f1 =2 a f2= 54 (f1 = počet testovaných přípravků).

Z těchto důvodů se pro nerovnoběžnost se standardem vyloučí přípravek Z. Výpočet se tedy provede znovu pouze pro přípravek U a standard (Σy = 11 486; ΣL = -1635).

Tab. 3.2.8.1-VI Analýza rozptylu s vyloučením dat o přípravku Z

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F	P
přípravky	1	390,6	390,6
regrese	1	66 830,60	66 830,6	90,5	< 0,01
nerovnoběžnost	1	34,2	34,2	0,05	> 0,05
ošetření	3	67 255,5
reziduální chyba	36	26 587,3	738,5
součet	39	93 842,8

Korekční člen K:

K=∑y2N=11483240=3 296 482,225;

∑y2=3 390 325.

Výsledky analýzy rozptylu ukazují, že zkouška s vynecháním přípravku Z je validní z pohledu závislosti na dávce a rovnoběžnosti.

Výpočet účinnosti a jejích mezí spolehlivosti

Po vyloučení přípravku Z se vypočte pouze jedna účinnost.

y¯S=SNS=580420=290,2

y¯U=UNU=283,95

Podíl sousedních dávek je 4,0 a je tedy I= ln 4 = 1,3863, z tabulky 6.1 je t = 2,03 pro 36 stupňů volnosti a pravděpodobnost P = 0,95.

b=LS+LUInh=-163520I=-58,970

M'=y¯U-y¯Sb=0,1060=logaritmus relativní účinnosti přípravku U–.

MU=M'U+1ndeklarovaná účinnost přípravkuU–.

Protože přípravek byl deklarován jako 1 jednotka na miligram,

MU=M'U+0=0,1060.

Účinnost získáme odlogaritmováním MU, je tedy MU = 1,11 jednotek na miligram.

C=EE-s2t2=66830,666830,6-738,5t2=1,0477

H=Eb2dn=66830,6-58,9702.2.10=0,9609108

1n (meze spolehlivosti) vypočteme:C-1CM'U2+2H=0,04770,01177 + 1,9218=0,09223

lndeklarovaná účinnost přípravkuU_+CM'U±0,09223=0+0,1110±0,3037.

Meze spolehlivosti jsou tedy od 0,82 do 1,51 jednotek na miligram.

Příklad 3.2.8.2 Třídávková metoda s náhodnými bloky bez opakování

Stanovení účinnosti antibiotik na Petriho miskách

Standardní přípravek se aplikoval v dávkách 2,4 a 8 jednotek. Na základě deklarované účinnosti AU = 1500 jednotek na mililitr byly připraveny odpovídající dávky přípravku U_. Všech šest ošetření bylo najednou aplikováno na každou misku. Rozptyl všech ošetření (tabulka 3.2.8.2-I) nejeví závislost na příslušných průměrech. Není tedy důvod pochybovat o splnění podmínky 2 z kapitoly 3.1.

Tab. 3.2.8.2-I Odpovědi y: průměry inhibiční zóny (mm. 10)

| | Standard S_ | Přípravek U_ | Součet v bloku | | | | | | miska | s1 | s2 | s3 | u1 | u2 | u3 | | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1 | 176 | 205 | 235 | 174 | 202 | 232 | R1 = 1224 | | 2 | 178 | 208 | 238 | 175 | 206 | 234 | R2 = 1239 | | 3 | 178 | 207 | 237 | 177 | 203 | 236 | R3 = 1238 | | 4 | 175 | 205 | 235 | 173 | 201 | 232 | R4 = 1221 | | 5 | 176 | 206 | 235 | 174 | 204 | 231 | R5 = 1226 | | 6 | 174 | 204 | 236 | 170 | 202 | 229 | R6 = 1215 | | průměr | 176,2 | 205,8 | 236,0 | 173,8 | 203,0 | 232,3 | | | rozptyl | 2,6 | 2,2 | 1,6 | 5,4 | 3,2 | 5,9 | |

Tab. 3.2.8.2-II Součty a kontrasty odpovědí (viz tabulka 3.2.3-II)

	Standard S_	Přípravek U_	Součet
nízká dávka	S1 = 1057	U1 = 1043
střední dávka	S2 = 1235	U2 = 1218
vysoká dávka	S3 = 1416	U3 = 1394
přípravek celkem	S = 3708	U = 3655	Σy = 7363
lineární kontrast	LS = 359	LU = 351	ΣL = 710
kvadratický kontrast	QS = 3	QU= 1	ΣQ = 4

Tab. 3.2.8.2-III Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F	P
přípravky	1	78,03	78,03
regrese	1	21 004,17	21 004,17	18 737	< 0,01
nerovnoběžnost	1	2,67	2,67	2,4	> 0,05
kvadratická regerese	1	0,22	0,22	0,2	> 0,05
odchylka kvadratických členů	1	0,06	0,06	0,05	> 0,05
5	21 085,14
ošetření	5	75,80	15,16	13,5	< 0,01
bloky (misky)	25	28,03	1,121
reziduální chyba	35	21 188,97
součet

Korekční člen K:

K=∑y2N=7363236=1 505 938,03;∑y2=1 527 127.

Hodnoty pro součty čtverců se získají z tabulky 3.2.8.2-II pomocí vzorců v tabulkách 3.2.3-IV a 3.2.3-V.

Přípravky =S2+S218-K=78,026

Lineární rgrese =LS+LU224=21004,167=E

Nerovnoběžnost =LS2+LU212-E=2,666

Kvadratická regrese =QS+QU272=0,222=Q

Odchylka kvadratických členů =QS2+QU236-Q=0,056

Ošetření =S12+S22+S32+U12+U22+U326-K=21085,137

Bloky =R12+R22+R32+R42+R52+R626-K=75,803

Celkový =∑y2-K=21 188,97

Reziduální = Celkový - Ošetření - Bloky = 28,03

Výsledky analýzy prokazují významnost (P < 0,01) rozdílu mezi jednotlivými Petriho miskami, a tedy užitečnost použití tohoto plánu experimentu. Pokud by ošetření byla rozdělena na misky náhodně, pak by rozdíly odpovědí na jednotlivých miskách způsobily zvětšení reziduálního rozptylu s^2, což by vedlo k širším mezím spolehlivosti.

Validita zkoušky

Významnost regrese (P < 0,01) a nevýznamnost (P < 0,05) nelinearity i odchylky od rovnoběžnosti potvrzují, že zkouška je validní, což umožňuje výpočet účinnosti přípravku U_ a jejích mezí spolehlivosti. Testování validity je uvedeno v kapitole 3.2.4.

Výpočet účinnosti a mezí spolehlivosti

y¯U-y¯S=U-S3n=-5318

Podíl sousedních dávek byl 2,0, takže:

I=ln2=0,69315.

Podle tabulky 6.1 je t = 2,06 pro 25 stupňů volnosti a pravděpodobnost P = 0,95.

b=LS+LU2Inh=71024I=42,6797

M'=y¯U-y¯Sb=-0,0690

Logaritmus relativní účinnosti přípravku U_ je tedy:

M=M'+1nAU=-0,0690+1n1500=7,2442.

Odhad účinnosti získaný odlogaritmováním M je tedy 1400 jednotek na mililitr:

C=EE-s2t2=21004 ,1721004 ,17-1,121 t2=1,0002,

H=Eb2dn=21 004,1742,67972.3.6=0,640605,

C-1CM'2+2H=0,00020,00476+1,28121=0,00026.

Logaritmy mezí spolehlivosti se vypočtou jako:

lnAU+CM'±0,000026=7,2442±0,0160.

Meze spolehlivosti jsou tedy 1378 až 1423 jednotek na mililitr.

Po vyhodnocení pomocí počítačového programu se obdrží hodnoty:

C = 1,000227

C-1CM'2+2H=0,00029128.

Meze spolehlivosti jsou 1376,3 - 1424,1 jednotek na mililitr.

Příklad 3.2.8.3 Třídávková vícenásobná zkouška latinskými čtverci bez opakování

Zkouška antibiotik na pravoúhlé plotně

Standardní přípravek se aplikoval v dávkách 3, 6 a 12 jednotek. Na základě předpokládané účinnosti přípravků U_ a Z_, AU= 2000 a AZ= 2500 jednotek byly připraveny ekvivalentní dávky těchto přípravků. Všech devět ošetření bylo aplikováno jednou v každém sloupci a každém řádku.

Tab. 3.2.8.3-I Uspořádání ošetření na políčkách plotny (latinský čtverec)

| Sloupce | | | | | | | | | | | Řádky | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1 | u1 | z1 | u2 | s2 | z2 | z3 | u3 | s1 | s3 | | 2 | s2 | u3 | u1 | z3 | s1 | u2 | s3 | z1 | z2 | | 3 | s1 | s2 | u3 | u1 | z1 | z2 | z3 | s3 | u2 | | 4 | z2 | s3 | s1 | z1 | u3 | u1 | u2 | s2 | z3 | | 5 | z3 | z2 | s2 | s1 | u2 | s3 | z1 | u3 | u1 | | 6 | u2 | z3 | s3 | z2 | s2 | u3 | s1 | u1 | z1 | | 7 | z1 | u2 | z2 | u3 | s3 | s1 | u1 | z3 | s2 | | 8 | s3 | s1 | z3 | u2 | u1 | z1 | s2 | z2 | u3 | | 9 | u3 | u1 | z1 | s3 | z3 | s2 | z2 | u2 | s1 |

Tab. 3.2.8.3-II Odpovědi y: průměr inhibiční zóny (mm . 10)

| Sloupce | | | | | | | | | | | | Řádky | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | řádkové součty | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1 | 164 | 171 | 194 | 206 | 211 | 237 | 237 | 172 | 224 | R1 = 1816 | | 2 | 188 | 224 | 178 | 236 | 180 | 210 | 237 | 180 | 210 | R2 = 1843 | | 3 | 168 | 203 | 230 | 175 | 175 | 209 | 236 | 238 | 207 | R3 = 1841 | | 4 | 182 | 214 | 162 | 175 | 227 | 171 | 194 | 201 | 225 | R4 = 1751 | | 5 | 220 | 186 | 192 | 169 | 205 | 230 | 169 | 237 | 167 | R5 = 1775 | | 6 | 183 | 217 | 223 | 200 | 195 | 228 | 165 | 171 | 165 | R6 = 1747 | | 7 | 163 | 195 | 203 | 229 | 230 | 175 | 179 | 233 | 196 | R7 = 1803 | | 8 | 218 | 163 | 228 | 200 | 167 | 175 | 207 | 199 | 233 | R8 = 1790 | | 9 | 218 | 163 | 162 | 216 | 233 | 194 | 204 | 199 | 166 | R9 = 1755 | | sloupcové | C1 = | C2 = | C3 = | C4= | C5 = | C6 = | C7 = | C8 = | C9 = | | | součty | 1704 | 1736 | 1772 | 1806 | 1823 | 1829 | 1828 | 1830 | 1793 | |

Tab. 3.2.8.3-III Průměrné hodnoty a směrodatné odchylky

| | Standard S_ | Přípravek U_ | Přípravek Z_ | | | | | | | | | s1 | s2 | s3 | u1 | u2 | u3 | z1 | z2 | z3 | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | průměr | 168,9 | 198,0 | 225,6 | 170,6 | 198,6 | 229,2 | 170,6 | 200,4 | 229,4 | | ošetření | | | | | | | | | | | rozptyl | 34,61 | 43,00 | 77,03 | 34,03 | 67,78 | 36,94 | 39,03 | 105,78 | 54,28 | | (vari) | | | | | | | | | | | ln (vari) | 3,5442 | 3,7612 | 4,3442 | 3,5272 | 4,2162 | 3,6094 | 3,6643 | 4,6613 | 3,9942 |

∑vari=492,48

∑lnvari=35,3222

Bartlettův test neprokázal statisticky významnou odchylku heterogenity rozptylů (i když je nutno si uvědomit, že tento test je použitelný, přísně vzato, pouze pro plně znáhodněný plán experimentu). Pro skupinu k rozptylů, každý s f stupni volnosti, test představuje výpočet:

χ2=3kf2k ln∑varik-∑ln vari3kf+k+1.

To se pro k = 9, f = 8 redukuje na:

χ2=17282269ln54,72-35,3222=5,34.

Tato hodnota je menší než kritická hodnota (15,51) z tabulky 6.2 pro (k - 1) stupňů volnosti a pravděpodobnost P = 0,95.

Tab. 3.2.8.3-IV Součty odpovědí a kontrasty

	Standard S	Přípravek U	Přípravek z	Součet
nízká dávka	S1 = 1520	U1 = 1535	Z1 = 1535
střední dávka	S2 = 1782	U2 = 1787	Z2 = 1804
vysoká dávka	S3 = 2030	U3 = 2063	Z3 = 2065
přípravek celkem	S = 5332	U = 5385	Z = 5404	Σy = 16 121
lineární kontrast	LS = 510	LU = 528	LZ = 530	ΣL = 1568
kvadratický kontrast	QS = -14	QU = 24	QZ = -8	ΣQ = 2

Tab. 3.2.8.3-V Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F	P
přípravky	2	103,14	51,57
lineární regrese	1	45 530,07	45 530,07	2921	< 0,01
nerovnoběžnost	2	13,49	6,75	0,43	> 0,05
kvadratická regerese	1	0,02	0,02	0,00	> 0,05
odchylka kvadratických členů	2	15,46	7,73	0,50	> 0,05
ošetření (celkem)	8	45 662,17
řádky	8	1229,06	153,63	9,86	< 0,01
sloupce	8	1837,95	229,74	14,74	< 0,01
reziduální chyba	56	872,77	15,585
celkem	80	49 601,95

Hodnoty pro součty čtverců se získají z tabulek 3.2.8.3-II a 3.2.8.3-IV pomocí vzorců v tabulkách 3.2.3-IV a 3.2.3-V.

Korekční člen K=∑y2N=16 121281=3 208 477,05;∑y2=3 258 079

Přípravky =S2+U2+Z227-K=103,135

Lineární regrese =LS+LU+LZ254=45 530,07=E

Nerovnoběžnost =LS2+LU2+LZ218-E=13,486

Kvadratická regrese =QS+QU+QZ2162=0,0247=Q

Odchylka kvadratických členů =QS2+QU2+QZ254-Q=15,457

Ošetření =S12+S22+S32+…+Z329-K=45 662,17

Řádky =R12+R22+…+R929-K=1229,06

Sloupce =C12+C22+…+C929-K=1837,95

Celkem =∑y2-K=49601,95

Reziduální chyba = Celkem - Ošetření - Řádky - Sloupce = 872,77

Analýza prokazuje statisticky významné (P < 0,01) rozdíly mezi řádky a mezi sloupci na plotně. Tato skutečnost ukazuje přednost plánu latinských čtverců před plně znáhodněným plánem.

Validita zkoušky

Silná významnost regrese (P < 0,01) a nevýznamnost nelinearity i odchylky od rovnoběžnosti potvrzují, že zkouška je validní, což umožňuje výpočet účinnosti přípravku.

Výpočet účinnosti a mezí spolehlivosti

Podíl sousedních dávek je 2,0, takže I= ln 2 = 0,69315.

Podle tabulky 6.1 je t = 2,00 pro 56 stupňů volnosti a pravděpodobnost P = 0,95.

y¯S=S27,	y¯U=U27,	y¯Z=Z27,

b=LS+LU+LZ2Inh=156854I=41,891.

MU=y¯U-y¯Sb=0,04686=logaritmus relativní účinnosti přípravkuU–

MU=lnAU+M'U=ln2000+0,04686=7,6478

Odhad účinnosti, získaný odlogaritmováním MU, je tedy 2096 jednotek na mililitr.

C=EE-s2t2=45 530,0745 530,07-15,585 t2=1,0014

H=Eb2dn=45 530,0741,8912.3.9=0,96093

C-1CM'U2+2H=0,00140,00220+1,92186=0,00269

Logaritmy mezí spolehlivosti se vypočtou jako:

lnAU+CM'U±0,00269=7,6478±0,0519.

Meze spolehlivosti jsou tedy 1990 až 2208 jednotek na mililitr.

Užitím stejného postupu pro přípravek Z_ se dostane:

M'Z=0,06366;MZ=7,8877.

Odhad účinnosti je 2664 jednotek na mililitr.

C-1CM'Z2+2H=0,00270

Logaritmy mezí spolehlivosti jsou 7,8878 ± 0,0520.

Meze spolehlivosti jsou tedy 2530 až 2807 jednotek na mililitr.

Poznámka: Vyloučí-li se jeden přípravek z vícenásobné zkoušky uspořádané do latinského čtverce, je nutné zbytek analyzovat jako náhodné bloky.

Příklad 3.2.8.4 Dvoudávková křížová zkouška

Stanovení účinnosti insulinu na králících podkožním podáním

Standardní přípravek se aplikoval v dávkách 1 a 2 jednotky na mililitr. Na základě označené účinnosti neznámého přípravku (AU= 40 jednotek na mililitr) byly připraveny ekvivalentní dávky přípravku. Jednotliví králíci obdrželi podkožně 0,5 ml odpovídajícího ředění podle plánu v tabulce 3.2.8.4-I. Výsledné odpovědi jsou v tabulce 3.2.8.4-II. Velký rozptyl, který je zřejmě způsoben variabilitou mezi jednotlivými zvířaty, ilustruje užitečnost křížového pokusu.

Tab. 3.2.8.4-I Uspořádání ošetření

| Skupina králíků | | | | | | | 1 | 2 | 3 | 4 | | --- | --- | --- | --- | --- | | den I | s1 | s2 | u1 | u2 | | den II | u2 | u1 | s2 | s1 |

Tab. 3.2.8.4-II Odpovědi y: součty hodnot glukosy v krvi (mg/100ml) po 1 a 2 1/2 h

| | Skupina 1 | Skupina 2 | Skupina 3 | Skupina 4 | | | | | | | | | | | s1 | u2 | ∑ | s2 | u1 | ∑ | u1 | s2 | ∑ | u2 | s1 | ∑ | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | | 112 | 104 | 216 | 65 | 72 | 137 | 105 | 91 | 196 | 118 | 144 | 262 | | | 126 | 112 | 238 | 116 | 160 | 276 | 83 | 67 | 150 | 119 | 149 | 268 | | | 62 | 58 | 120 | 73 | 72 | 145 | 125 | 67 | 192 | 42 | 51 | 93 | | | 86 | 63 | 149 | 47 | 93 | 140 | 56 | 45 | 101 | 64 | 107 | 171 | | | 52 | 53 | 105 | 88 | 113 | 201 | 92 | 84 | 176 | 93 | 117 | 210 | | | 110 | 113 | 223 | 63 | 71 | 134 | 101 | 56 | 157 | 73 | 128 | 201 | | | 116 | 91 | 207 | 50 | 65 | 115 | 66 | 55 | 121 | 39 | 87 | 126 | | | 101 | 68 | 169 | 55 | 100 | 155 | 91 | 68 | 159 | 31 | 71 | 102 | | průměr | 95,6 | 82,8 | | 69,6 | 93,3 | | 89,9 | 66,6 | | 72,4 | 106,8 | | | rozptyl | 709,7 | 627,9 | | 525,1 | 1012,5 | | 479,6 | 230,6 | | 1214,3 | 1215,1 | |

Hartleyovým testem nebyla nalezena významná neshoda rozptylů.

Test spočívá ve výpočtu statistiky: největší odhad rozptylu/nejmenší odhad rozptylu. Tento podíl (1215,1/230,6 = 5,3) je menší než kritická hodnota 12,7 z tabulky 3.2.1-I pro P = 0,05 osm rozptylů, každý se sedmi stupni volnosti. Hartleyův test je jednodušší než Bartlettův a vyžaduje pouze výpočet jediného podílu. Ve většině případů je pro test heterogenity rozptylů postačující. Pro tato data dává Bartlettův test hodnotu testovací statistiky 6,4 při odpovídající kritické hodnotě 14,1.

Součty odpovědí a lineární kontrasty byly vypočteny odděleně pro každý den zkoušky. Výsledky jsou v tabulce 3.2.8.4-III.

Tab. 3.2.8.4-III Součty odpovědí a kontrasty

	Standard S	Přípravek U	Součet
Den I
	nízká dávka	S1I = 765	U1I = 719
	vysoká dávka	S2I = 557	U2I = 579
	součet	S1 = 1322	U1 = 1298	D1 = 2620
Den II
	nízká dávka	S1II = 854	U1II = 746
	vysoká dávka	S2II = 533	U2II = 662
	součet	S1 = 1387	U1 = 1408	DII = 2795
Přípravky celkem	S = 2709	U = 2706	∑y = 5415
Lineární kontrasty
	den I	LSI = -208	LUI = -140	LI = -348
	den II	LSII = -321	LUII = -84	LII = -405
	celkem	LS = -529	LU = -224	∑L = -753

Analýza rozptylu pro tento plán experimentu je složitější než pro jiné plány, protože složka součtu čtverců tvořená odchylkou od rovnoběžnosti není nezávislá na složce tvořené rozdíly mezi králíky. Test rovnoběžnosti regresních přímek vyžaduje výpočet dalšího reziduálního součtu čtverců "uvnitř králík", který se získá odečtením složky rovnoběžnosti a dvou "interakcí" od složky mezi králíky.

Díky opakování v každé skupině obsahuje analýza tři "interakce":

dny x přípravky, dny x regrese, dny x rovnoběžnost.

Tyto členy reprezentují náchylnost jednotlivých složek (efektu přípravku, regrese a rovnoběžnosti) měnit se den ode dne. Odpovídající F-test kontroluje platnost modelu se zřetelem na tuto skutečnost. Statisticky významné výsledky F-testu je třeba interpretovat opatrně, a pokud je to možné, zkoušku zopakovat.

Tab. 3.2.8.4-IV Analýza rozptylu

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců	Průměrný čtverec	F	P
nerovnoběžnost	1	1453,5	1453,5	1,06	> 0,05
dny x přípravky	1	31,6	31,6	0,02	> 0,05
dny x regrese	1	50,8	50,8	0,04	> 0,05
reziduální chyba mezi králíky	28	38 258,8	1366,4
bloky (králíci)	31	39 794,7	1283,7
přípravky	1	0,1	0,1	0,00	> 0,05
regrese	1	8859,5	8859,5	64,5	< 0,01
dny	1	478,5	478,5	3,48	> 0,05
dny x nerovnoběžnost	1	446,3	446,3	3,25	> 0,05
reziduální chyba"uvnitř"králíků	28	3844,1	137,3
součet	63	53 423,2

Korekční člen =K=∑y2N=5415264=458 159,77;mm

∑y2=511 583.

Hodnoty součtu čtverců se získají z tabulky a 3.2.8.4-III pomocí vzorců v tabulce 3.2.3-IV.

V této zkoušce je celkový počet odpovědí na každé ošetření v obou dnech n = 16.

Přípravky=S2+U232-K=0,14,

Regrese =LS+LU264=8859,52=E,

Nerovnoběžnost =LS2+LU232-E=1453,51,

Bloky =∑Bi22-K=39 794,73,

kde Bi je celková odpověď králíka z tabulky 3.2.8.4-II.

Dny =DI2+DII232-K=478,51,

kde DI a DII jsou celkové odpovědi pro každý den.

Dny x Přípravky =SI-SII-UI+UII2N=31,64,

Dny x Regrese=LSII-LSI+LUII-LUI2N=50,77,

Dny x Nerovnoběžnost =LSII-LSI-LUII+LUI2N=446,27,

∑y2-K=53 423,23.

Reziduální chyba mezi králíky = Bloky - Nerovnoběžnost - (Dny x Přípravky) - (Dny x Regrese) = 38 258,81.

Reziduální chyba "uvnitř" králíků = Celkem - Bloky - Dny - Přípravky - Regrese - (Dny x Nerovnoběžnost) = 3 844,06.

Validita zkoušky

Analýza potvrzuje, že data splňují podmínky nutné pro použití zkoušky:

• 1. významnost regrese: testovací statistika pro regresi (64,5) vypočtená s použitím rozptylu tvořeného rozdíly mezi králíky je větší než kritická hodnota interpolovaná z tabulky 3.2.4-I pro P = 0,01 s f1 = 1 a f2 = 28;

• 1. odchylka od rovnoběžnosti regresních přímek: test rovnoběžnosti v křížovém pokusu není příliš citlivý. Je totiž založen na reziduální chybě mezi králíky a ta závisí na variabilitě mezi nimi. Testovací statistika (1,06) je menší než kritická hodnota interpolovaná z tabulky 3.2.4-I pro P = 0,05 s f1 = 1 a f2 = 28;

• 1. žádná z interakcí není statisticky významná, jednotlivé hodnoty F jsou 0,02, 0,04 a 3,25.

Výpočet účinnosti a mezí spolehlivosti

Podíl sousedních dávek je 2,0, tedy I = ln 2 = 0,69315. Podle tabulky 6.1 je t = 2,05 pro 28 stupňů volnosti (P = 0,95).

y¯U-y¯S=U-S2n=-332

b=LS+LU2nI=75332I=-33,948

M'=y¯U-y¯Sb=0,00276 = logaritmus relativní pčinnosti přípravkuU–

M=M'+lnAU=0,00276+ln40=3,6916.

Odhad účinnosti se získá odlogaritmováním M. Účinnost je tedy 40,1 jednotek na mililitr.

C=EE-s2t2=8859,58859,5-137,3t2=1,0697

H=Eb2dn=8859,5-33,9482.2.16=0,24023

C-1CM’2+2H=0,06970,0000081+0,48045=0,033488

Pro logaritmy mezí spolehlivosti se dostane:

lnAU+CM'±0,033498=3,6918±0,1830.

Meze spolehlivosti jsou tedy 33,4 až 48,2 jednotek na mililitr.

• 3.3 Model poměru sklonů

Tento model je vhodný například pro mikrobiologické zkoušky, v nichž je nezávisle proměnnou koncentrace.

• 3.3.1 Podmínky validity

Stejně jako ve zkouškách založených na modelu rovnoběžnosti by se mělo testovat splnění podmínek 1, 2 a 3 kapitoly 3.1. Po přezkoušení platnosti podmínek 4B a 5B kapitoly 3.1 se může provést analýza rozptylu popsaná dále v kapitole 3.3.3.

Použití dále uvedených jednoduchých metod statistické analýzy vyžaduje splnění následujících podmínek:

• 1. standard i testovaný přípravek musí být testován pomocí dvou různých ředění;

• 1. musí existovat pátá skupina pokusných jednotek, které jsou bez ošetření.

• 3.3.2 Plán pokusu

Analýza modelu poměru sklonů se dá provést (2 + 2)dávkovou nebo (3 + 3)dávkovou zkouškou. Při celkově stejném počtu pokusných jednotek se však dá zmenšit rozptyl poměru účinností vytvořením skupiny bez ošetření (blank). Je tedy např. plán pětidávkových skupin se společnou skupinou bez ošetření vhodnější než (2 + 2)dávkový plán. Má minimální počet skupin uvažující ověření linearity závislosti na dávce pro oba přípravky. Přesnost odhadu účinnosti závisí na rozdělení pokusných jednotek do dávkových skupin a na volbě dávek. Přesnost odhadu účinnosti je možno zvýšit určitým nerovnoměrným rozdělením pokusných jednotek do skupin, což však snižuje přesnost indikace odchylky od linearity. Splnění následujících tří podmínek, kladených na plán pěti skupin se společnou skupinou bez ošetření, zajišťuje uspokojivou přesnost odhadu a vyhovující schopnost odhalení nelinearity:

• 1. všech pět skupin ošetření má stejný rozsah;

• 1. dávka standardu s2 je co možná nejvyšší dávkou, jejíž průměrná odpověď leží ještě v lineární části regresní křivky, nízká s1 je rovna její polovině;

• 1. dávky testovaného přípravku u1 a u2 jsou odvozeny z jeho deklarované účinnosti R.

Podobně jako v kapitole 3.2.2 se může použít plně či po blocích náhodný plán pokusu nebo latinský čtverec. Použití kteréhokoliv z těchto plánů vyžaduje podobnou úpravu postupu pro odhad reziduálního součtu čtverců jako u modelu rovnoběžnosti. K ní se dá využít tabulka 3.2.3-V.

Dále je popsána analýza zkoušky jednoho neznámého přípravku v porovnání se standardem. Analýzu se dvěma nebo více neznámými přípravky popsali Clarke^11) a Barraclough^12).

• 3.3.3 Analýza rozptylu

Tato zkouška se obvykle analyzuje pomocí modelu vícenásobné regrese:

y=a+bSvS+bUbU, (3.3.3-1)

kde y je odpověď a vS, vU jsou dávky standardu a testovaného přípravku.

Každou skupinu ošetření určují hodnoty vS a vU. Pro skupiny, které neobdržely dávku standardu, je vS = 0. Stejně pro testovaný přípravek. Ruční zpracování se zjednoduší kódováním nižší a vyšší dávky standardu i přípravku hodnotami 0,45, resp. 1,0. Použije-li se toto značení (jako v tabulce 3.3.3-I), musí se nakonec provést korekce vypočtené účinnosti a regresních koeficientů. Vzorce pro výpočet jsou v tabulce 3.3.3-I. Po zkontrolování odpovědí a případné transformaci odpovědi se vypočtou jejich součty. Je třeba podotknout, že sklony regresní přímky jak pro standard, tak i pro zkoušený přípravek se počítají odděleně. Takže nejsou nezávislé, protože obě zčásti závisí na odpovědích ve skupině bez ošetření. Kontrast průsečíků (LI) měří rozdíl odhadů odpovědí při nulové koncentraci, počítaných zvlášť pro standard i neznámý přípravek. Tímto kontrastem se testuje základní předpoklad modelu, tj. stejná odpověď při nulové dávce přípravků.

Kontrast nulové dávky (LB) měří odchylku průměrné odpovědi na nulovou dávku od odpovědi na nulovou dávku, vypočítané pouze z odpovědí na nenulové dávky obou přípravků.

Tyto vzorce se použijí k porovnání zdrojů variability pomocí součtů čtverců popsaných v tabulce 3.3.3-II. Podobně jako dříve se vypočte korekční člen K, čtverec celkového součtu dělený počtem odpovědí a ∑y^2 součet čtverců všech odpovědí.

Tab. 3.3.3-I Vzorce pro pětibodovou zkoušku se společnou skupinou bez ošetření

Součet odpovědí na nulovou dávku	B
Součet odpovědí na nižší dávku standardu	S1
Součet odpovědí na vyšší dávku standardu	S2
Součet odpovědí na nižší dávku testovaného přípravku	U1
Součet odpovědí na vyšší dávku testovaného přípravku	U2
Součet součinů pro standard	0,5S1+S2-3B+S1+S2+U1+U210=JS
Součet součinů pro testovaný přípravek	0,5U1+U2-3B+S1+S2+U1+U210=JU
Sklon regresní přímky standardu	-15B+S1+17S2-6U1+3U235n2=bS
Sklon regresní přímky testovaného přípravku	-15B-6S1+3S2+U1+17U235n2=bU
Kontrast nulové dávky	2B-2S1+S2-2U1+U2=LB1)
Kontrast průsečíků	2S1-S2-2U1+U2=LI1)

^1) LB a LI se nesmí zaměňovat s LS...LZ.

→ Tento vývojový diagram ilustruje jednotlivé kroky analýzy výsledků zkoušky. Při použití tohoto grafu k vytvoření počítačového programu se při konečném rozhodnutí o přijetí, zamítnutí nebo modifikaci testu přihlíží k podrobnějším výsledkům, které poskytl počítač.

Tab. 3.3.3-II Validita zkoušky

Zdroj variability	Stupně volnosti	Součet čtverců
regrese	2	bSJS+bUJU
nulová dávka	1	LB214n
průsečík	1	LI210n
reziduální chyba	5n - 5	*
celkem	5n -1	∑y2-R

• Vypočte se odečtením všech součtů čtverců od celkového součtu čtverců.

• 3.3.4 Test validity

Testovací statistiky pro test závislosti na dávce, kontrastu nulové dávky a kontrastu průsečíku se vypočtou dělením příslušných součtů čtverců jejich stupni volnosti a reziduálním rozptylem s^2, který se získá dělením reziduálního součtu čtverců jeho stupni volnosti. Významnost těchto podílů (F-statistik) se zjistí porovnáním s kritickými hodnotami v tabulce 3.2.4-I.

Podmínky validity:

• 1. kontrast průsečíků nesmí být statisticky významný;

• 1. variabilita způsobená dávkou musí být vysoce statisticky významná (hladina významnosti musí být menší než 0,01);

• 1. kontrast nulové dávky nesmí být statisticky významný. Významnost tohoto kontrastu může být způsobena nelinearitou vztahu dávky a odpovědi pro velmi malé dávky. Pokud k tomu dojde při zavádění metody v laboratoři, může se zkouška vylepšit přidáním malé konstantní dávky standardu ke všem dávkám. Pro další analýzu se pak berou za dávky pouze dávky standardu a testovaného přípravku nad tímto konstantním pozadím. Dojde-li k tomu během rutinního hodnocení, měl by se analytik poradit se statistikem, jak analyzovat zkoušku po vyloučení nulové dávky. Prokáží-li příslušné testy validitu zkoušky, může být vypočtena účinnost a její meze spolehlivosti postupem popsaným v kapitole 3.3.5.

• 3.3.5 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti

Účinnost neznámého přípravku vyjádřená ve vyšší dávce standardu jako jednotce je:

R=bUbS. (3.3.5-1)

Meze spolehlivosti jsou:

[image omitted]

Obr. 3.3.4-I Vývojový diagram testů validity v rutinní zkoušce: model podílu sklonů

kde:

CR-36t2s235nbS2±tbS8s235n8-9R+8R2-10t2s2nbS2, (3.3.5-2)

C=35nbS235nbS2-64t2s2. (3.3.5-3)

Kritická hodnota t z tabulky 6.1 má stupně volnosti reziduálního rozptylu.

Účinnost zkoušeného přípravku se získá vynásobením relativní účinnosti a jejích mezí spolehlivosti vyšší dávkou standardu v obsahových jednotkách mezinárodního systému (viz obr. 3.3.5-I).

[image omitted]

Obr. 3.3.5-I Model podílu sklonů, plán pěti skupin se společnou nulovou skupinou

Na základě deklarované účinnosti zkoušeného přípravku jsou jeho dávky u1 a u2 stanoveny tak, aby byly ekvivalentní dávkám standardu s1 a s2 dávky s2 a u2 jsou označeny hodnotou 1,0, dávky s1 a u1 hodnotou 0,5. Svislé úsečky vyjadřují rozpětí odpovědí v jednotlivých skupinách na dávky vyznačené na vodorovné ose. V tomto modelu mají regresní přímky závislosti odpovědi na dávce standardu a testovaného přípravku sklony bS a bU.

• 3.3.6 Chybějící hodnoty

Při náhradě chybějících dat se postupuje stejně jako v kapitole 3.2.6.

• 4 Kvantální zkoušky

• 4.1 Úvod

V některých zkouškách je nemožné nebo extrémně náročné měřit působení přípravku na každé pokusné jednotce. Místo toho je pozorován nějaký efekt působení přípravku na pokusné jednotky, jako například uhynutí nebo hypoglykemický symptom pokusných jednotek. Výsledek pak závisí na počtu jednotek, u kterých se projeví tento efekt. Takové zkoušky se nazývají kvantální "vše nebo nic".

Situace je velmi podobná kvantitativní zkoušce popsané v kapitole 3.1, ale místo n různých odpovědí v každé ošetřené skupině se získá pouze jediná hodnota, tj. procento jednotek s pozitivní odpovědí. Grafem závislosti tohoto procenta na logaritmu dávky je zpravidla spíše křivka tvaru S než přímka. Uspokojivějšího lineárního vztahu se dá dosáhnout transformací procenta pomocí vhodné matematické funkce. Nejpoužívanější je probitová transformace, další používané jsou arcsin a log-log transformace.

• 4.2 Probitová metoda

Podrobná statistická analýza lineární regresní závislosti transformované odpovědi na logaritmu dávky je velmi pracná. Dá se provést iteračně metodou maximální věrohodnosti. K dispozici jsou však počítačové programy. Tato analýza je popsána v mnohých učebnicích.

Za předpokladu, že je dostatečný počet odpovědí různých od nulových a stoprocentních, a za předpokladu, že není významná odchylka od linearity, dávají dostatečně přesné výsledky často již i prvé dva kroky probitové metody. Následující metoda se týká porovnání jednoho přípravku se standardem. Při porovnání více přípravků se standardem je nutná porada s biometrem. Výpočet se dá provést pomocí tabulek a kalkulačky. Kroky 1 až 5 poskytují první aproximaci, kroky 6 až 9 druhou. Kroky 10 až 11 obsahují test linearity a rovnoběžnosti závislosti probitu na logaritmu dávky pro standard a testovaný přípravek a v kroku 12 je počítán logaritmus účinnosti M’ a jeho meze spolehlivosti.

Stejná posloupnost kroků se dá použít k vytvoření počítačového programu s využitím modifikací popsaných na konci každého z následujících kroků.

Probit je jednoduchá lineární funkce standardní normální veličiny T. Počítačový program se dá sestavit s využitím následujících proměnných:

• 1. standardizovaná normální veličina T;

• 1. hustota D odpovídající hodnotě standardizované normální veličiny T, pro T = Ti je D = Di;

• 1. pravděpodobnost P, že veličina T má hodnotu nejvýše Ti (T ≤ Ti).

První algoritmus odhaduje T z hodnot P a druhý umožňuje získat odhady D a P odpovídající hodnotě T. Veličiny T, D a P se odhadují pro každou dávkovou skupinu i (Ti, Di a Pi).

Postup

• 1. Sestavení tabulek výsledků

Použije se tabulka 4.2-I pro zapsání každé skupiny ošetření do sloupců označených čísly:

• 1. přípravek (standardní nebo testovaný),

• 1. X je logaritmus dávky (nebo jeho jednoduchý kód),

• 1. počet testovaných jedinců n při této dávce,

• 1. počet reagujících jedinců r při této dávce.

Počítačový program může obsahovat převod dávek na jejich logaritmus X.

• 1. Výpočet podílu (procenta) reagujících v dávkové skupině

Výpočet empirického podílu p = r/n a jeho zapsání do sloupce 5. Obvykle stačí dvě desetinná místa. Ošetřené skupiny s p = 0 a p = 1 se vyloučí.

• 1. Empirické probity

Z tabulky 4.2-II se získají pro každou skupinu ošetření empirické probity Ye odpovídající empirickému podílu p (vyjádřenému v procentech) a zapíší se do sloupce 6.

Pro výpočet empirických probitu se může použít algoritmus 4.2-I k vyjádření odpovědi tvaru Ye = T + 5 (tím se odstraní záporné odpovědi).

• 1. Nevážená lineární regrese odpovědi na logaritmu dávky

Počáteční odhad tohoto vztahu se může získat buď graficky (viz obr. 4.3-I), nebo početně. Při použití první metody se nejprve sestrojí bodový graf hodnot Ye v závislosti na X a získanými body se zvlášť pro standardní a testovaný přípravek "od oka" proloží rovnoběžné přímky s větším důrazem na body s empirickými probity mezi 4,0 a 6,0 než na body mimo tyto meze.

Druhý způsob spočívá v proložení přímek metodou nevážené lineární regrese. Vypočtou se:

b=ΣΣX-X¯Ye-Y¯eΣΣX-X¯2, (4.2-1)

(dvojitě jsou označeny součty pro všechny skupiny ošetřené standardním nebo zkoušeným přípravkem dohromady),

a=Y¯e-bX¯. (4.2-2)

(Parametr se vypočte zvlášť pro standardní a zkoušený přípravek.)

Počítačový program používá k získání regresních parametrů a a b rovněž tyto vzorce.

• 1. První aproximace očekávaných probitů

Při použití grafické metody se na přímkách pro obě ošetření na grafu odečtou hodnoty F a zapíší se do sloupce 7.

Při použití početní metody poskytuje počáteční aproximaci Yi ke každé hodnotě X zvlášť pro standardní a testovaný přípravek rovnice:

YI=a+bX. (4.2-3)

Stejná rovnice se užívá i v počítačovém programu.

• 1. Váhové koeficienty

Pro každé YI se v tabulce 4.2.-III najde hodnota váhového koeficientu w a zapíše se do sloupce (8), součin nw pak do sloupce (9). Všechny hodnoty nw se udávají na stejný počet desetinných míst. Obvykle stačí jedno desetinné místo.

V počítačovém programu se k výpočtu váhových koeficientů použije algoritmus 4.2-II (viz dále): k vstupním hodnotám které odpovídají hodnotám Yi, se vypočtou hodnoty Pi a Di. Z nich se vypočtou váhy wi pro každou hodnotu Yi podle vzorce:

wi=Di2Pi1-Pi. (4.2-4)

• 1. Pracovní probity

Pomocí tabulky 4.2.-III a následujících vzorců se vypočtou pracovní probity yi pro všechny skupiny i:

yi=Y0+PA proYI<3,5, (4.2-5)

yi=Y1-1-PA pro YI>6,5, (4.2-6)

yi=1-PY0+PY1pro 3,5<YI<6,5. (4.2-7)

Y0, Y1 a A značí minimální probit, maximální probit a rozsah, P je pravděpodobnost příslušná k první aproximaci empirického probitu YI Pracovní probity, se zapíše do sloupce (10) v tabulce 4.2-I. Obvykle stačí dvě desetinná místa. Jejich počet by měl být stejný pro všechny ošetřené skupiny.

Pro počítačový program jsou vhodné následující dva vzorce pro pracovní probity yi odpovídající hodnotám YI:

pro YI≤5,0 yi=YI-PiDi+piDi, (4.2-8)

pro YI>5,0 yi=YI+1-PiDi-1-piDi. (4.2-9)

Hodnota Di odpovídá empirickému podílu pi (jakožto pravděpodobnosti).

• 1. Vážené průměry, součty čtverců a součty součinů

Pro všechna ošetření se vytvoří součiny nwy, nwX a nwXy a zapíší se do sloupců (11), (12) a (13). Zvlášť pro standard a přípravek se vypočtou součty sloupců (9), (11) a (12) a z nich vážené průměry:

X¯=ΣnwXΣnw, (4.2-10)

y¯=ΣnwyΣnw. (4.2-11)

Dále se vypočtou součiny nwX^2, nwy^2 a nwXy, z nich vážené součty čtverců ^2X a^2y a součty součinů Xy, opět zvlášť pro standard a testovaný přípravek. S jejich pomocí se vypočtou veličiny Sxx, SXy a Syy podle těchto vzorců:

SXX=ΣnwX-X¯2=ΣnwX2-ΣnwX2Σnw, (4.2-12)

SXy=ΣnwX-X¯y-y¯=ΣnwXy-ΣnwXΣnwyΣnw, (4.2-13)

Syy=Σnwy-y¯2=Σnwy2-Σnwy2Σmw. (4.2-14)

Stejné vzorce se použijí i v počítačovém programu.

• 1. Druhá a další aproximace probitu

Pro druhou (lineární) aproximaci probitu se nejprve vypočte společný parametr sklonu b2 podle vzorce:

b2=ΣSXyΣSXX. (4.2-15)

(Sčítají se hodnoty pro standardní a zkoušený přípravek.)

Tato hodnota se použije k výpočtu parametru a2 zvlášť pro každý z přípravků:

a2=y¯-b2X¯. (4.2-16)

Tak se získá druhá aproximace YII pro standard a přípravek odděleně ve tvaru dvou regresních přímek:

YII=a2+b2X. (4.2-17)

Podle těchto rovnic se vypočtou hodnoty YII pro všechny skupiny ošetřované oběma přípravky a porovnají se s odpovídajícími hodnotami YI. Jsou-li alespoň některé rozdíly mezi nimi velké, např. větší než 0,1 při počítání na jedno desetinné místo, vypočte se další aproximace zopakováním kroků 6 až 9, přičemž se všechny hodnoty YI nahradí příslušnými hodnotami YII. Stejně se postupuje i tehdy, jeví-li uvedené rozdíly závislost na dávce.

V počítačovém programu se vypočtou pro všechny ošetřené skupiny čtverce rozdílů YII - YI a jejich součet. Je-li tento součet čtverců větší než například 10-7, nahradí se všechny hodnoty YI příslušnými hodnotami YII a opakují se kroky 6 až 9.

• 1. Test odchylky od linearity

Ve zkoušce alespoň se třemi dávkami pro každý přípravek se dá testovat významnost odchylky od linearity pomocí statistiky:

χ2=ΣSyy-ΣSXy2SXX, (4.2-18)

s f = (k - 4) stupni volnosti. Odpovídající kritické hodnoty jsou v tabulce 6.2. Při významné hodnotě χ^2 je nutno konzultovat vyhodnocení zkoušky se statistikem. Počítačový program může poskytnout obsluze vypočtený χ^2 a příslušné stupně volnosti bez dalšího komentáře. Jiná možnost je vytvořit soubor kritických hodnot z podprogramu, který vypočte aproximaci pravděpodobnosti překročení hodnoty χ2 Vhodné vzorce k těmto výpočtům jsou v knize Abramowitz a Stegun^13).

• 1. Test odchylky od rovnoběžnosti

Pokud se neprokázala významná odchylka od linearity, pak se testuje ještě rovnoběžnost pomocí statistiky:

χ2=ΣSXy2SXX-ΣSXy2ΣSXX (4.2-19)

s jedním stupněm volnosti.

• 1. Výpočet účinnosti a jejích mezí spolehlivosti

Při nevýznamné odchylce od rovnoběžnosti je možno počítat logaritmus účinnosti M´podle vzorce:

M'=yU-ySb+XS-XU. (4.2-20)

Účinnost je pak antilogaritmus M´ (exp(M´)). Meze spolehlivosti se vypočtou jako antilogaritmy hodnot:

XS-XU+CM'-XS+XU±tCb1ΣSnw+1ΣUnw+yS-yU2Cb2ΣSXX,(4.2-21)

kde

C=b2ΣSXXb2ΣSXX-t2. (4.2-22)

Je patrná analogie těchto výrazů s výrazem 3.2.5-4 pro výpočet mezí spolehlivosti ve zkouškách účinnosti s kvantitativní odpovědí. Součet čtverců pro regresi v kapitole 3.2.3 se dá psát ve tvaru:

E=ΣX-Xy-y2ΣX-X2=b2ΣX-X2. (4.2-23)

Při probitové transformaci je reziduální rozptyl odpovědí roven jedné. Kritická hodnota t s ∞ stupni volnosti se najde v tabulce 6.1.

Pro nekonečný počet stupňů volnosti má veličina t standardní normální rozdělení, takže počítačový program může počítat požadovanou hodnotu t algoritmem 4.2-I s pravděpodobností P odpovídající polovině požadované hladiny významnosti.

Algoritmus 4.2-I

Algoritmus požaduje jako vstup pravděpodobnost Pi a počítá Ti aproximované pomocí:

Ti=∑j=0j=2ajwj∑j=0j=3bjwj-w,

kde:

w=ln1p2pro 0<PTi≤T≤0,5.

a0 = 2,515517	b0 = 1,0
a1 = 0,802853	b1 = 1,1432788
a2 = 0,010328	b2 = 20,189269
	b3 = 0,001308

Je-li P > 0,5, dosadí se ve vzorci pro w za P hodnota (1 - P) a výsledné Ti se vynásobí -1.

Tento a následující algoritmus jsou převzaty z příručky Abramowitze a Steguna^14).

Algoritmus 4.2-II

Algoritmus požaduje Ti jako vstup a počítá hustotu D a aproximaci P pomocí následujících formulí:

D=e-12Ti22π

PT≤Ti=1-D∑j=1j=5ajwjpro Ti≥0,

kde:

w=11+0,2316419Ti.

a1 = 0,3193815

a2 = -0,3565638

a3 = 1,781478

a4 = -1,821256

a5 = 1,330724

Je-li Ti < 0, dosadí se ve vzorci pro w za Ti hodnota -Ti a místo vypočtené hodnoty P, se vezme 1 – Pi.

Tab. 4.2-I Výsledné veličiny

Přípravek	X	n	r	p	Ye	YI	w	nw	y	nwy	nwX	nwXy	YII
(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)	(7)	(8)	(9)	(10)	(11)	(12)	(13)	(14)

Tab. 4.2-II Probity odpovídající procentům P

p	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9
0	—	2,67	2,95	3,12	3,25	3,36	3,45	3,52	3,59	3,66
10	3,72	3,77	3,82	3,87	3,92	3,96	4,01	4,05	4,08	4,12
20	4,16	4,19	4,23	4,26	4,29	4,33	4,36	4,39	4,42	4,45
30	4,48	4,50	4,53	4,56	4,59	4,61	4,64	4,67	4,69	4,72
40	4,75	4,77	4,80	4,82	4,85	4,87	4,90	4,92	4,95	4,97
50	5,00	5,03	5,05	5,08	5,10	5,13	5,15	5,18	5,20	5,23
60	5,25	5,28	5,31	5,33	5,36	5,39	5,41	5,44	5,47	5,50
70	5,52	5,55	5,58	5,61	5,64	5,67	5,71	5,74	5,77	5,81
80	5,84	5,88	5,92	5,95	5,99	6,04	6,08	6,13	6,18	6,23
90	6,28	6,34	6,41	6,48	6,55	6,64	6,75	6,88	7,05	7,33
	0,0	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
99	7,33	7,37	7,41	7,46	7,51	7,58	7,65	7,75	7,88	8,09

Tab. 4.2-III Minimální a maximální pracovní probity, rozsah a váhové koeficienty