Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

V dolní třetině chromatogramu zkoušeného roztoku je patrna hlavní skvrna odpovídající svojí polohou hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a), v horní části je patrna úzká skvrna odpovídající svojí polohou skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (b). Ve střední části chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být patrné další méně intenzivně zbarvené skvrny.

Zkoušky na čistotu

Cizí příměsi (2.8.2). Nejvýše 7 % stonků a nejvýše 2 % cizích organických příměsí. Stanoví se s 50 g drogy.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 2,000 g práškované drogy (355) se suší 4 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 7,0 %.

Popel nerozpustný v kyselině chlorovodíkové (2.8.1). Nejvýše 2,0 %.

Stanovení obsahu

Zkouška se provádí, pokud možno, za ochrany před světlem.

Pro přípravu roztoků se používá voda prostá oxidu uhličitého R.

0,750 g práškované drogy (180) se v kuželové baňce smíchá se 150 ml vody R. Zahřeje se k varu a zahřívá se dalších 30 min ve vodní lázni. Ochladí se pod tekoucí vodou, směs se převede do odměrné baňky a zředí se vodou R na 250,0 ml. Po usazení částic drogy se roztok zfiltruje filtračním papírem o průměru 12 cm. Prvních 50 ml filtrátu se odstraní.

Veškeré polyfenoly. 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R na 25,0 ml. 5,0 ml tohoto filtrátu se smíchá se 2,0 ml kyseliny fosfowolframové RS a uhličitanem sodným RS se zředí na 50,0 ml. Přesně 3 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance (2.2.25) v maximu při 715 nm (A ) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Polyfenoly neadsorbovatelné na kožní prášek. Ke 20,0 ml filtrátu se přidá 0,20 g kožního prášku CRL a intenzivně se protřepává 60 min, pak se zfiltruje. 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R na 25,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se smíchá se 2,0 ml kyseliny fosfowolframové RS a uhličitanem sodným RS se zředí na 50,0 ml. Přesně 3 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance (2.2.25) v maximu při 715 nm (A2) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Porovnávací roztok. 50,0 mg pyrogallolu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se smíchá se 2,0 ml kyseliny fosfowolframové RS a uhličitanem sodným RS se zředí na 50,0 ml. Přesně 3 min po přidání posledního roztoku a do 15 min po rozpuštění pyrogallolu se měří absorbance (2.2.25) roztoku v maximu při 715 nm (A3) za použití vody R jako kontrolní tekutiny.

Obsah tříslovin v procentech se vypočítá podle vztahu:

13,12A1-A2A3 . m ,

v němž značí:

m - navážku drogy v gramech.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Harpagophyti radix[image omitted]

Synonymum. Radix harpagophyti

Je to řezaný usušený hlíznatý sekundární kořen druhu Harpagophytum procumbens DC. Obsahuje nejméně 1,2 % harpagosidu (C24H30O11; Mr 494,5), vztaženo na vysušenou drogu.

Vlastnosti

Droga šedohnědá až tmavohnědá, hořké chuti.

Makroskopický a mikroskopický popis, viz Zkoušky totožnosti A a B.

Zkoušky totožnosti

A. Silné plátky vějířovitého nebo okrouhlého tvaru nebo hrubě nalámané kotouče, na povrchu tmavší, podélně brázdité. Na světlejší řezné ploše je patrné tmavé kambium a zřetelně paprsěitě uspořádané dřevní svazky. Centrální cylindr s jemným soustředným vrstvením. Pod lupou jsou na řezu patrna žlutá až hnědočervená zrna.

B. Droga se upráškuje (355). Prášek je hnědožlutý. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: úlomky korku s velkými, žlutohnědými tenkostěnnými buňkami; úlomky korkového parenchymu s velkými tenkostěnnými buňkami občas obsahují červenohnědá zma inkluzí a jednotlivé žluté kapky; úlomky žebříčkovitě ztlustlých cév a cévic provázené dřevním parenchymem centrálního cylindru; v parenchymu malé jehlice nebo krystaly šťavelanu vápenatého. Práškovaná droga může obsahovat pravoúhlé nebo mnohohranné tečkované sklereidy s tmavě červenohnědým obsahem. Parenchym se floroglucinem RS barví zeleně.

C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

Zkoušený roztok. 1,0 g práškované drogy (355) se zahřívá 10 min na vodní lázni při 60 °C s 10 ml methanolu R. Zfiltruje se a filtrát se odpaří za sníženého tlaku a teploty nepřevyšující 40 °C na asi 2 ml.

Porovnávací roztok. 1 mg harpagosidu R se rozpustí v 1 ml methanolu R.

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 20 μl obou roztoků. Vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, methanolu R a ethylacetatu R (8 + 15 + 77) po dráze 10 cm. Vrstva se usuší v proudu horkého vzduchu. Pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Ve střední části chromatogramů zkoušeného i porovnávacího roztoku je patrna skvrna harpagosidu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou patrny další zřetelné skvrny, převážně nad skvrnou harpagosidu. Vrstva se postříká roztokem floroglucinu R (10 g/l) v lihu 96% R a pak kyselinou chlorovodíkovou R. Vrstva se suší 5 min až 10 min při 80 °C. Na chromatogramu zkoušeného i porovnávacího roztoku je zelená skvrna harpagosidu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku je několik žlutých až hnědých skvrn pod a nad skvrnou odpovídající harpagosidu.

Zkoušky na čistotu

Škrob. Práškovaná droga se pozoruje pod mikroskopem ve vodě R. Přidá se jod RS1; droga se nebarví modře.

Cizí příměsi (2.8.2). Vyhovuje požadavkům zkoušky Cizí příměsi.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 12,0 %; 1,000 g práškované drogy (355) se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 8,0 %.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) za použití methylcinnamatu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 0,130 g methylcinnamatu R se rozpustí v 50 ml methanolu R a zředí se jím na 100,0 ml.

Zkoušený roztok. 0,500 g práškované drogy (355) se protřepává 1 h s 50 ml methanolu R a pak se zfiltruje. Filtr se zbytkem drogy se převede do baňky na 100 ml, přidá se 50 ml methanolu R, vaří se 1 h pod zpětným chladičem a po ochlazení se zfiltruje. Baňka i filtr se promyjí dvakrát 5 ml methanolu R. Spojené filtráty a promývací tekutiny se odpaří za sníženého tlaku do sucha, při teplotě nepřesahující 40 °C. Zbytek se smíchá třikrát s 5 ml methanolu R, tekutina se zfiltruje do odměrné baňky na 25 ml; filtr se promyje a tekutina se zředí methanolem R na 25,0 ml. K 10,0 ml tohoto roztoku se přidá 1,0 ml roztoku vnitřního standardu a zředí se methanolem R na 25,0 ml. Porovnávací roztok. 0,5 ml porovnávacího roztoku ze Zkoušky totožnosti C se zředí methanolem R na 2,0 ml.

Chromatografický postup se provádí obvykle za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,10 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

• mobilní fáze, kterou je směs stejných objemových dílů methanolu R a vody R, s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min,

• spektrofotometrického detektoru, 278 nm,

• injektorové smyčky, 10 μl.

Nastříkne se zkoušený roztok. Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška píku methylcinnamatu nebyla menší než 50 % celé stupnice zapisovače.

Stanoví se retenční čas harpagosidu za použití 10 μl porovnávacího roztoku za podmínek stejných jako u zkoušeného roztoku.

Obsah harpagosidu v procentech se vypočítá podle vzorce:

m2 . F1 . 7,622F2 . m1 ,

v němž značí:

m1 - navážku drogy v gramech,

m2 - navážku methylcinnamatu R ve 100,0 ml roztoku vnitřního standardu,

F1 - plochu píku harpagosidu na chromatogramu zkoušeného roztoku,

F2 - plochu píku methylcinnamatu na chromatogramu zkoušeného roztoku.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Helianthi oleum[image omitted]

Slunečnicový olej

CAS 8001-21-6

Je to čištěný olej získaný lisováním nebo extrakcí částečně loupaných zralých semen druhu Helianthus annuus L.

Vlastnosti

Světle žlutá čirá průhledná kapalina. Je velmi těžce rozpustný v lihu 96%, snadno rozpustný v etheru, mísitelný s etherem petrolejovým.

Tuhne při teplotě asi -16 °C.

Zkoušky totožnosti

A. Provede se zkouška Totožnost olejů tenkovrstvou chromatografií (2.3.2). Chromatogram zkouše-ného roztoku se shoduje s charakteristickým chromatogramem pro slunečnicový olej.

B. Zkouška Cizí oleje, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Relativní hustota (2.2.5). 0,918 až 0,923.

Index lomu (2.2.6). 1,473 až 1,476.

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 1,0; stanoví se s 10,0 g zkoušené látky.

Číslo jodové (2.5.4). 125,0 až 136,0.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). 188,0 až 194,0.

Cizí oleje. Provede se zkouška (2.4.22) Cizí oleje v olejích plynovou chromatografií.

Podíl mastných kyselin má toto složení:

• kyselina palmitová: 3,0 % až 10,0 %,

• kyselina stearová: 1,0 % až 10,0 %,

• kyselina olejová (délkou řetezce odpovídá makrogoladipatu 18,3): 62,0 % až 86,0 %,

• kyselina linolová (délkou řetězce odpovídá makrogoladipatu 18,9): 60,0 % až 75,0 %.

Steroly. Provede se zkouška Steroly v olejích (2.4.23). Podíl sterolů oleje obsahuje:

• kampesterol: 5,0 % až 10,0 %,

• stigmasterol: 5,0 % až 10,0 %,

• β-sitosterol: 55,0 % až 65,0 %.

• delta 5-avenasterol: 2,0 % až 6,0 %,

• delta 7-stigmasterol: 12,0 % až 18,0 %,

• delta 7-avenasterol: 2,0 % až 6,0 %.

Bělené nebo zkažené oleje. 1 ml se ve zkumavce protřepává 1 min s 1 ml kyseliny chlorovodíkové R, pak se smíchá s 1 ml resorcinolu RS a protřepává se 5 s. Po 5 min stání není vodná vrstva zbarvena intenzivněji (2.2.2) než 1 ml směsi složené z 0,5 ml manganistanu draselného 0,002 mol/l RS a 9,5 ml vody R.

Uchovávání

Ve zcela naplněných, dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

† Heparina massae molecularis minoris[image omitted]

Nízkomolekulární hepariny

Jsou to soli sulfatovaných glukosaminoglykanů o průměrné molekulové hmotnosti menší než 8000, z nichž nejméně 60 % látky má molekulovou hmotnost menší než 8000. Jejich různá chemická struktura se projevuje na koncových skupinách polysacharidových řetězců, které jsou povahy redukující nebo neredukující.

Počítáno na vysušenou látku, je v miligramu nejméně 70 m.j. účinnosti protifaktoru Xa. Poměr účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru Ha podle postupu popsaného ve zkoušce Stanovení účinnosti činí nejméně 1,5.

Výroba

Při výrobě se používají postupy, které omezují na minimum možnost mikrobiální kontaminace.

Získávají se frakcionací nebo depolymerizací heparinu přirozeného původu, který podle svého složení vyhovuje článku Heparinum natricum nebo Heparinum calcicum pro parenterální použití, pokud není zdůvodněno a schváleno jinak. Homogenita jednotlivých šarží pro každý typ nízko-molekulárního heparinu je zajištěna důkazem, např. takovým, že průměrná molekulová hmotnost a procentuální podíl látky v definovaném rozmezí molekulové hmotnosti nižší než 8000 jsou v rozmezí 75 % až 125 % průměrné hodnoty, kterou je typ specifikován. Stejné rozmezí platí též pro hodnotu poměru účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru IIa.

Nukleotidy a bílkovinné nečistoty v surovině. Před frakcionací se rozpustí 40 mg surového materiálu v 10 ml vody A. Absorbance (2.2.25) měřená při 260 nm a 280 nm není větší než 0,20, popř. 0,15.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek, hygroskopický, snadno rozpustný ve vodě.

Zkoušky totožnosti

A. Provede se nukleární magnetická rezonanční spektrometrie (2.2.33) s použitím pulzního (Fourierova transformace) spektrometru, který pro ^13C měří při 75 MHz.

Zkoušený roztok. 0,200 g se rozpustí ve směsi 0,2 ml deuteriumoxidu R a 0,8 ml vody R.

Porovnávací roztok. 0,200 g nízkomolekulárního heparinu CRL vhodné specifikace se rozpustí ve směsi 0,2 ml deuteriumoxidu R a 0,8 ml vody R.

Spektra se zaznamenávají při 40 °C za použití kyvety o průměru 5 mm. Jako vnitřní standard se použije methanol deuterizovaný R při 6 = 50,0 ppm.

Spektrum zkoušeného roztoku se shoduje se spektrem porovnávacího roztoku obsahujícího nízkomolekulární heparin CRL vhodné specifikace.

B. Poměr účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru IIa stanovený podle postupu popsaného ve Stanovení účinnosti je nejméně 1,5.

C. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 20 mg se rozpustí ve 2 ml mobilní fáze.

Porovnávací roztok. 20 mg nízkomolekulárního heparinu pro kalibraci CRL se rozpustí ve 2 ml mobilní fáze.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kolony délky 0,30 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné porézními křemennými kuličkami (5 μm), která má nejméně 20 000 teoretických pater na metr a schopnost frakcionace bílkovin v rozmezí přibližně 15 000 až 100 000,

• mobilní fáze, kterou je roztok síranu sodného R (28,4 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou sírovou zředěnou RS na 5,0, o průtokové rychlosti 0,5 ml/min,

• detektoru, kterým je diferenční refraktometr.

Kalibrace systému. Nastříkne se 25 μl porovnávacího roztoku. Detekce se provádí diferenčním refraktometrem (RI) spojeným do série s UV spektrofotometrem nastaveným na vlnovou délku 234 nm. UV monitor je připojen k výstupu z kolony a diferenční refraktometr k výstupu z UV monitoru.

Je potřebné změřit přesně časový posun mezi oběma detektory, aby se mohly zaznamenané chromatogramy správně přiřadit. Pro kalibraci se použijí retenční časy získané RI detektorem.

Normalizační faktor, používaný pro výpočet molekulové hmotnosti z poměru RI/UV, se získá takto: vypočítá se celková plocha pod křivkami UV 234(ΣUV234) a RI (ΣRI) v požadovaném rozsahu (tj. bez píků soli a rozpouštědla na konci chromatogramu). Vypočítá se poměr r:

∑RI∑UV234 .

Vypočítá se faktor f který násobením hodnotou r dává Mna(známou průměrnou molekulovou hmotnost kalibrační látky). Hodnota Mna kalibrační látky je uvedena v přiloženém certifikátu:

Mnar.

Jestliže jsou křivky UV234a RI správně přiřazeny, je možno molekulovou hmotnost v kterém-koliv bodě vypočítat podle vztahu:

fRIUV234.

Nastříkne se 25 μl zkoušeného roztoku a zaznamenávají se chromatogramy po dobu, která zaručuje úplnou eluci píků zkoušené látky i rozpouštědla.

Průměrná molekulová hmotnost látky je vyjádřena vztahem:

∑RIiMi∑RIi ,

v němž značí:

RIi - množství látky (hmoty) eluované ve frakci i,

Mi - molekulovou hmotnost odpovídající frakci i.

Hodnota průměrné molekulové hmotnosti látky není větší než 8000 a nejméně 60 % celkové látky má molekulovou hmotnost menší než 8000, kromě toho se parametry molekulové hmotnosti zkoušené látky a odpovídající referenční látky neliší více než o 25 %.

D. Vyhovuje zkoušce (a) na sodík nebo vápník (2.3.1), podle výchozí látky.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 5,5 až 8,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,1 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Dusík (2.5.9). 1,5 % až 2,5 %, počítáno na vysušenou látku.

Těžké kovy (2.8.4). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (30 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 1,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Vápník. Je-li připraven z heparinu, který vyhovuje článku Heparinum calcicum, obsahuje 9,5 % až 11,5 % Ca, počítáno na vysušenou látku. Vápník se stanoví chelatometrickou titrací (2.5.11) s 0,200 g zkoušené látky.

Sodík. Je-li připraven z heparinu, který vyhovuje článku Heparinum natricum, obsahuje 9,5 % až 12,5 % Na, počítáno na vysušenou látku. Sodík se stanoví atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS, která v mililitru obsahuje 1,27 mg chloridu cesného R. Roztok se stejným rozpouštědlem zředí na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se porovnávací roztoky o koncentraci 25 μg Na/ml, 50 μg Na/ml a 75 μg Na/ml. K jejich přípravě se použije základní roztok sodíku (200 μg Na/ml), který se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l RS obsahující v mililitru 1,27 mg chloridu cesného R.

Měří se absorbance při 330,3 nm za použití sodíkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vhodného složení (např. 11 litrů vzduchu a 2 litry acetylenu za minutu).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 1,000 g se 3 h suší při 60 °C nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřesahujícím 670 Pa.

Molární poměr sulfátových a karboxylatových skupin iontů. Nejméně 1,8. Stanoví se titraci za vodivostní indikace (2.2.38). Vzorek zkoušené látky použitý při této titraci neobsahuje ionizovatelné nečistoty, především soli.

0,100 g se naváží do malé kuželové baňky, přičemž se dbá na to, aby se předešlo problémům spojeným s hygroskopickými vlastnostmi látky. Přidá se 20 ml vody R, dvakrát destilované ve skle a ochladí na 4 °C. 2,0 ml tohoto roztoku se nanesou na předchlazenou kolonu (asi 10 cm x 1 cm) naplněnou vhodným katexem R. Kolona se promývá dvakrát ve skle vodou destilovanou R, která se zachycuje v titrační nádobě do konečného množství 10 ml až 15 ml. (Titrační nádoba musí být dostatečně velká, aby se do ní umístily elektrody z konduktometru, míchací tělísko a jemná ohebná trubička z vývodu 2ml byrety). Míchání je magnetické. Až jsou údaje na konduktometru konstantní, zaznamenají se a začne se titrovat hydroxidem sodným 0,05 mol/l VS, který se přidává v 50 μl dávkách. Vždy po přidání se za několik sekund zaznamenají údaje na byretě a na konduktometru. Titruje se do dosažení konečného bodu.

Pro každou naměřenou hodnotu se vypočítá množství miliekvivalentů přidaného hydroxidu sodného z objemu a známé koncentrace roztoku hydroxidu sodného. Do grafu se nanesou hodnoty vodivosti (na osu y) proti hodnotám miliekvivalentů hydroxidu sodného (na ose x). Graf má tři přibližně lineární části: počáteční klesající stupeň křivky, střední mírně vzrůstající a konečný prudce vzrůstající stupeň křivky. Těmito třemi částmi grafu se proloží nejvhodnější přímky. Z bodů, v nichž se protne první přímka s druhou a druhá přímka s třetí, se spustí kolmice k ose x, na níž se odečtou miliekvivalenty hydroxidu sodného spotřebovaného při titraci vzorku v daných bodech. Bod, v němž se protnou první a druhá přímka, udává množství miliekvivalentů hydroxidu sodného spotřebovaného sulfátovými skupinami a bod, v němž se protnou druhá a třetí přímka, udává množství miliekvivalentů spotřebovaných společně sulfatovými i karboxylatovými skupinami. Rozdíl mezi těmito dvěma hodnotami udává množství miliekvivalentů spotřebovaných karboxylatovými skupinami.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,01 m.j. endotoxinu v mezinárodní jednotce účinnosti protifaktoru Xa. Pro splnění validačních požadavků může být nezbytné přidání dvojmocných kationtů.

Stanovení účinnosti

Antikoagulační účinnost nízkomolekulárního heparinu se určí in vitro dvěma metodami, které stanoví jeho schopnost urychlovat inhibici faktoru Xa (anti-Xa zkouška) a trombinu, faktoru Ha (anti-IIa zkouška) antitrombinem III.

Mezinárodními jednotkami jsou účinnosti protifaktoru Xa a protifaktoru Ha obsažené v deklarovaném množství mezinárodního standardu nízkomolekulárního heparinu.

Nízkomolekulární heparin pro stanovení účinnosti BRP je kalibrován v mezinárodních jednotkách na mezinárodní standard dvěma dále uvedenými metodami.

Účinnost protifaktoru Xa

Porovnávací a zkoušené roztoky. Připraví se čtyři nezávislé série se čtyřmi koncentracemi pro každou zkoušenou látku a referenční přípravek nízkomolekulárního heparinu v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,4. Rozmezí koncentrací je 0,025 m.j. až 0,2 m.j. účinnosti protifaktoru Xa v mililitru. Závislost mezi hodnotami absorbance a logaritmy koncentrací má být lineární.

Postup. Připraví se šestnáct zkumavek, které se vždy po dvou označí písmeny T1, T2, T3 a T4 pro ředění zkoušené látky a písmeny S1, S2, S3 a S4 pro ředění referenčního přípravku. Do každé zkumavky se převede 50 μl antitrombinu IIIRS1 a 50 μl roztoku příslušného ředění zkoušené látky nebo referenčního přípravku. Pokaždé se roztok promíchá tak, aby nevznikly bubliny. Ve vodní lázni nebo v tepelném bloku se uspořádají zkumavky v pořadí S1, S2, S3, S4, T1, T2, T3, T4, T1, T2, T3, T4, S1, S2, S3, S4 a a ponechají se 1 min při 37 °C. Pak se do každé přidá 100 μl hovězího faktoru Xa RS. Přesně za 1 min inkubace se přidá 250 μl chromoforového substrátu Rl. Reakce se zastaví přesně za 4 min přidáním 375 μl kyseliny octové R. Obsah každé zkumavky se přenese do semimikrokyvety a změří se absorbance (2.2.25) při 405 nm s použitím vhodného zapisovače. Slepé stanovení amidolytické účinnosti se provede na začátku a na konci měření stejným postupem, pouze místo zkoušeného a porovnávacího roztoku se přidá tlumivý roztok trometamolový o pH 7,4. Naměřené hodnoty obou slepých zkoušek se významně neliší. Provede se regresní analýza závislosti absorbance na logaritmech koncentrací zkoušené látky a referenčního přípravku nízkomolekulárního heparinu a vypočítá se účinnost zkoušené látky v mezinárodních jednotkách účinnosti protifaktoru Xa v mililitru pomocí obvyklých statistických metod pro model rovnoběžnosti.

Účinnost protifaktoru IIa

Porovnávací a zkoušené roztoky. Připraví se čtyři nezávislé série se čtyřmi koncentracemi pro každou zkoušenou látku a referenční přípravek nízkomolekulárního heparinu v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,4. Rozmezí koncentrací je 0,015 m.j. až 0,075 m.j. účinnosti protifaktoru Ila v mililitru. Závislost mezi absorbancí a logaritmy koncentrací má být lineární.

Postup. Připraví se šestnáct zkumavek, které se vždy po dvou označí písmeny T1, T2, T3 a T4 pro ředění zkoušené látky a písmeny Sl5 S2,S3 a § pro ředění porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se převede 50 μl antitrombinu IIIRS2 a 50 μl roztoku příslušné koncentrace zkoušené látky nebo referenčního přípravku. Pokaždé se roztok promíchá tak, aby nevznikly bubliny. V e vodní lázni nebo v tepelném bloku se zkumavky uspořádají v pořadí S1, S2, S3, S4, T1, T2, T3, T4 , T1, T2, T3, T4, S1, S2, S3, S4 a ponechají se 1 min při 37 °C. Pak se do každé přidá 100 /d trombinu lidského RS. Přesně za 1 min se přidá 250 μl chromoforového substrátu R2. Reakce se zastaví přes-ně za 4 min přidáním 375 μl kyseliny octové R. Obsah každé zkumavky se přenese do semimikrokyvety a změří se absorbance (2.2.25) při 405 nm s použitím vhodného zapisovače. Slepé stanovení amidolytické účinnosti se provede na začátku a na konci měření stejným způsobem, pouze místo zkoušeného a porovnávacího roztoku se přidá tlumivý roztok trometamolový o pH 7,4. Naměřené hodnoty obou slepých zkoušek se významně neliší. Provede se regresní analýza závislosti absorbance na logaritmech koncentrací zkoušené a referenční látky nízkomolekulárního heparinu a vypočítá se účinnost zkoušené látky v mezinárodních jednotkách účinnosti protifaktoru Ila v mililitru pomocí obvyklých statistických metod pro model rovnoběžnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet mezinárodních jednotek účinnosti protifaktoru Xa v miligramu,

• počet mezinárodních jednotek účinnosti protifaktoru IIa v miligramu,

• typ nízkomolekulárního heparinu charakterizovaný průměrnou molekulovou hmotností a procenty molekul, které nevybočují z definovaného rozmezí molekulových hmotností,

• zdaje látka sterilní,

• zdaje látka prostá bakteriálních endotoxinů,

• zda látka obsahuje sodnou sůl,

• zda látka obsahuje vápenatou sůl.

†† Heparinum calcicum[image omitted]

Vápenatá sůl heparinu

CAS 37270-89-6

Je to vápenatá sůl sulfatovaného glykosaminoglykanu, který je obsažen v tkáních savců. Při úplné hydrolýze se uvolní D-glukosamin, kyselina D-glukuronová, kyselina L-iduronová, kyselina octová a kyselina sírová. Charakteristickou vlastností látky je zpomalení procesu srážení čerstvé krve.

Počítáno na vysušenou látku, je účinnost vápenaté soli heparinu pro parenterální použití nejméně 150 m.j. v miligramu.

Počítáno na vysušenou látku, je účinnost vápenaté soli heparinu, který není určen pro parenterální použití, nejméně 120 m.j. v miligramu.

Výroba

Připravuje se z plic hovězího dobytka nebo ze střevních sliznic hovězího dobytka, prasat nebo ovcí. Při výrobě se používají postupy omezující nebo vylučující mikrobiální kontaminaci a pří-tomnost látek snižujících krevní tlak.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je mírně hygroskopická, snadno rozpustná ve vodě.

Zkoušky totožnosti

A. Zpomaluje srážení čerstvě odebrané krve.

B. 0,40 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml. Specifická optická otáčivost (2.2.7) tohoto roztoku je nejméně +35°.

C. Provede se zónová elektroforéza (2.2.31) za použití agarosy pro elektroforézu R jako nosiče. K ustálení agarosy a jako roztok elektrolytu se použije směs 50 ml kyseliny octové ledové R a 800 ml vody R upravená přidáním hydroxidu lithného R na pH 3 a zředěná vodou R na 1000,0 ml.

Zkoušený roztok. 25 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Porovnávací roztok. Ve stejném objemu vody R se rozpustí sodná sůl heparinu BRP.

Na proužek se nanese odděleně po 2 μl až 3 μl každého roztoku. Vyvíjí se 10 min proudem 1 mA až 2 mA na centimetr šířky proužku při napětí 300 V. Proužky se barví roztokem modři toluidinové R (1 g/l), jejíž nadbytek se vymyje. Poměr pohyblivostí základní zóny nebo zón na elektroforetogramech zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku je 0,9 až 1,1.

D. Vyhovuje zkoušce na vápník (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. Množství zkoušené látky odpovídající 50 000 m.j. se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než stupeň 5 porovnávacího barevného roztoku nejvhodnější barvy (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 5,5 až 8,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,1 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Bílkoviny a nukleotidické nečistoty. 40 mg se rozpustí v 10 ml vody R. Absorbance (2.2.25) měřená při 260 nm není vyšší než 0,20 a absorbance měřená při 280 nm není vyšší než 0,15.

Dusík. Nejvýše 2,5 %, počítáno na vysušenou látku. Dusík se stanoví mineralizací kyselinou sírovou (2.5.9) za použití 0,100 g zkoušené látky.

Vápník. 9,5 % až 11,5 %, počítáno na vysušenou látku. Vápník se stanoví chelatometrickou titrací (2.5.11) za použití 0,200 g zkoušené látky.

Těžké kovy (2.4.8). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (30 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 1,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 8,0 %. 1,000 g se 3 h suší při 60 °C nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřekračujícím 670 Pa.

Síranový popel (2.4.14). 32 % až 40 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,20 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,01 m.j. endotoxinu v mezinárodní jednotce heparinové účinnosti. Pro splnění validačních požadavků může být nezbytné přidání dvojmocných kationtů.

Stanovení účinnosti

Provede se stanovení heparinu (2.7.5). Zjištěná účinnost je v rozmezí 90 % až 111 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) je v rozmezí 80 % až 125 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Venenum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet mezinárodnách jednotek v miligramu,

• název a množství všech přidaných látek,

• zdaje látka sterilní,

• zdaje látka prostá bakteriálních endotoxinů.

†† Heparinum natricum[image omitted]

Sodná sůl heparinu

Synonymum. Heparinum solubile

CAS 9041-08-1

Je to sodná sůl sulfatovaného glykosaminoglykanu, který je obsažen v tkáních savců. Při úplné hydrolýze se uvolní D-glukosamin, kyselina D-glukuronová, kyselina L-iduronová, kyselina octová a kyselina sírová. Charakteristickou vlastností látky je zpomalení srážení čerstvé krve.

Počítáno na vysušenou látku, je účinnost sodné soli heparinu pro parenterální použití nejméně 150 m.j. v miligramu.

Počítáno na vysušenou látku, je účinnost sodné soli heparinu, která není určena pro parenterální použití, nejméně 120 m.j. v miligramu.

Výroba

Připravuje se z plic hovězího dobytka nebo ze střevních sliznic hovězího dobytka, prasat nebo ovcí.

Při výrobě se používají postupy, které omezují nebo vylučují mikrobiální kontaminaci a přítomnost látek snižujících krevní tlak.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je mírně hygroskopická, snadno rozpustná ve vodě.

Zkoušky totožnosti

A. Zpomaluje srážení čerstvě odebrané krve.

B. 0,40 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml. Specifická optická otáčivost (2.2.7) tohoto roztoku je nejméně +35°.

C. Provede se zónová elektroforéza (2.2.31) za použití agarosy pro elektroforézu R jako nosiče. K ustálení agarosy a jako roztok elektrolytu se použije směs 50 ml kyseliny octové ledové R a 800 ml vody R. pH směsi se upraví přidáním hydroxidu lithného R na hodnotu 3 a zředí se vodou R na 1000,0 ml.

Zkoušený roztok. 25 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Porovnávací roztok. Ve stejném objemu vody R se rozpustí sodná sůl heparinu BRP.

Na proužek se nanese odděleně po 2 μl až 3 μl každého roztoku. Vyvíjí se 10 min proudem 1 mA až 2 mA na centimetr šířky proužku při napětí 300 V. Barví se roztokem toluidinové modři R(1 g/l), jejíž nadbytek se vymyje vodou R. Poměr pohyblivostí základní zóny nebo zón na elektroforetogramech zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku je 0,9 až 1,1.

D. Zbytek získaný při stanovení síranového popela, viz Zkoušky na čistotu, vyhovuje zkoušce (a) na sodík (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. Množství zkoušené látky odpovídající 50 000 m.j. se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než stupeň 5 porovnávacího barevného roztoku nejvhodnější barvy (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 5,5 až 8,0. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,1 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Bílkoviny a nukleotidické nečistoty. 40 mg se rozpustí v 10 ml vody R. Absorbance (2.2.25) měřená při 260 nm není vyšší než 0,20 a absorbance měřená při 280 nm není vyšší než 0,15.

Dusík. Nejvýše 2,5 %, počítáno na vysušenou látku. Dusík se stanoví mineralizací kyselinou sírovou (2.5.9) s 0,100 g zkoušené látky.

Sodík. 9,5 % až 12,5 %, počítáno na vysušenou látku. Stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS, která v mililitru obsahuje 1,27 mg chloridu česného R, a zředí se stejným rozpouštědlem na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se porovnávací roztoky o koncentraci sodíku 25 μg Na/ml, 50 μg Na/ml a 75 μg Na/ml. K jejich přípravě se použije základní roztok (200 μg Na/ml), který se ředí na odpovídající koncentraci kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l RS, která obsahuje v mililitru 1,27 mg chloridu česného R.

Změří se absorbance při 330,3 nm za použití sodíkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vhodného složení (např. 11 litrů vzduchu a 2 litry acetylenu za minutu).

Těžké kovy (2.4.8). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (30 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 1,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 8,0 %. 1,000 g se 3 h suší při 60 °C nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřekračujícím 670 Pa.

Síranový popel (2.4.14). 30 % až 43 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,20 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,01 m.j. endotoxinu v mezinárodní jednotce heparinové účinnosti.

Stanovení účinnosti

Provede se stanovení heparinu (2.7.5). Zjištěná účinnost je v rozmezí 90 % až 111 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) je v rozmezí 80 % až 125 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Venenum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet mezinárodnách jednotek v miligramu,

• název a množství všech přidaných látek,

• zda je látka sterilní,

• zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

Hexachlorophenum[image omitted]

Hexachlorofen

[image omitted]

C13H6Cl6O2	Mr 406,91	CAS 70-30-1

Je to 2,2´-methylenbis(3,4,6-trichlorfenol). Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 100,5 % sloučeniny C13H6Cl6O2.

Vlastnosti

Bílý nebo slabě nažloutlý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 96 %, velmi snadno rozpustný v acetonu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Teplota tání (2.2.14). 161 °C až 167 °C.

B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety hexachlorofenu CRL.

C. 0,1 g zkoušené látky se zahřívá v suché zkumavce. Vznikne bezbarvá tekutina, která se dalším zahříváním postupně barví zeleně, modře až hnědofialově.

D. 5 mg zkoušené látky se rozpustí v 5 ml lihu 96 %R a přidá se 0,05 ml chloridu železitého RS1; vznikne fialové zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Chloridy (2.4.4). 0,5 g zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml lihu 96 %R, zředí se vodou R na 25 ml a zfiltruje se. 5 ml čirého filtrátu se zředí vodou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (500 μg/g).

Cizí organické látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití silikagelu HF254R Zkoušený roztok. 0,1 g zkoušené látky se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

Na vrstvu se nanesou 2 μl zkoušeného roztoku a vyvíjí se 2-butanonem R po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a 10 min se suší v sušárně při 105 °C. Po vychladnutí se pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku, kromě hlavní skvrny, není žádná skvrna.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 1,0 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,000 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

1,000 g se rozpustí v 25 ml lihu 96 % R předem upraveného na hodnotu pH 9,0 a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do pH 9,0 za potenciometrické indikace (2.2.20) bodu ekvivalence.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 40,69 mg C13H6Cl6O2.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

† Hexobarbitalum[image omitted]

Hexobarbital

[image omitted]

C12H16N2O3	Mr 236,27	CAS 56-29-1

Je to kyselina (RS)-5-(1-cyklohexenyl)-1,5-dimethylbarbiturová. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C12H16N2O3.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, mírně rozpustný v lihu 96% a v etheru. S alkalickými hydroxidy, alkalickými uhličitany a s amoniakem tvoří ve vodě rozpustné soli.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Stanoví se teplota tání (2.2.14) zkoušené látky. Potom se smíchají stejné díly zkoušené látky a hexobarbitalu CRL a stanoví se teplota tání této směsi. Rozdíl mezi stanovenými teplotami tání (má být asi 146 °C) není větší než 2 °C.

B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem hexobarbitalu CRL.

C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu GF254R.

Zkoušený roztok. 0,1 g se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 100 ml.

Porovnávací roztok. 0,1 g hexobarbitalu CRL se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 100 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 10 μl obou roztoků a vyvíjí se za použití spodní vrstvy směsi objemových dílů amoniaku 26% R, lihu 96% R a chloroformu R (5 + 15 + 80) po dráze 18 cm. Po vyjmutí z komory se vrstva ihned pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku.

D. K asi 10 mg se přidá 1,0 ml roztoku vanilinu R (10 g/l) v lihu 96% R a 2 ml ochlazené směsi objemových dílů vody R a kyseliny sírové R (1 + 2), protřepe se a 5 min se nechá stát; vzniká zelenožluté zbarvení. Potom se směs zahřívá 10 min na vodní lázni; zbarvení se změní na tmavě červené.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 1,0 g se rozpustí ve směsi 4 ml hydroxidu sodného zředěného RS a 6 ml vody R. Tento roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž6 (2.2.2, Metoda II).

Kysele reagující látky. K 1,0 g se přidá 50 ml vody R, 2 min se vaří a po ochlazení se zfiltruje. K 10 ml filtrátu se přidá 0,15 ml červeně methylové RS; roztok je oranžově žlutý. Ke změně zbarvení na jasně žluté se spotřebuje nejvýše 0,1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu GF254 R.

Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 100 ml.

Porovnávací roztok. 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí chloroformem R na 100 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 20 obou roztoků a vyvíjí se za použití spodní vrstvy směsi objemových dílů amoniaku 26% R, lihu 96% R a chloroformu R (5 + 15 + 80) po dráze 15 cm. Po vyjmutí z komory se vrstva ihned pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,5 %).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,200 g se rozpustí v 5 ml pyridinu R, přidá se 0,5 ml thymolftaleinu RS a 10 ml dusičnanu stříbrného v pyridinu RS. Titruje se hydroxidem sodným v ethanolu 0,1 mol/l VS do jasně modrého zbarvení. Provede se slepá zkouška.

1 ml hydroxidu sodného v ethanolu 0,1 mol/l VS odpovídá 23,63 mg C12H16N2O3.

Uchovávání

Separandum.

†† Histamini dihydrochloridum[image omitted]

Histaminiumdichlorid

Synonymum. Histaminium dichloratum

[image omitted]

C5H11Cl2N3	Mr 184,07	CAS 56-92-8

Je to 4-(2-aminioethyl)imidazoliumdichlorid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C5H11Cl2N3.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je hygroskopický, velmi snadno rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a D.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem histaminiumdichloridu CRL. Zkouší se tablety připravené za použití 1 mg zkoušené látky a 1 mg referenční látky.

B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Histidin, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

C. Asi 0,1 g se rozpustí v 7 ml vody R a přidají se 3 ml roztoku hydroxidu sodného R (200 g/l) (roztok 1). 50 mg kyseliny sulfanilové R se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml dusitanu sodného RS (roztok 2). Roztok 2 se přidá k roztoku 1 a promíchá se; vznikne červené zbarvení.

D. Vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R připravené z vody destilované R a zředí se stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž7 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 2,85 až 3,60; měří se roztok S.

Histidin. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R

Zkoušený roztok (a). 0,5 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 2 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 0,1 g histaminiumdichloridu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Porovnávací roztok (b). 50 mg monohydrátu histidiniumchloridu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100 ml.

Porovnávací roztok (c). 1 ml zkoušeného roztoku (a) a 1 ml porovnávacího roztoku (b) se smíchají.

Na vrstvu se odděleně nanese 1 μl zkoušeného roztoku (a), 1 μl zkoušeného roztoku (b), 1 μl porovnávacího roztoku a), 1 μl porovnávacího roztoku (b) a 2 μl porovnávacího roztoku © a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, vody R a acetonitrilu R (5 + 20 + 75) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší v proudu vzduchu a vyvíjení se opakuje stejným způsobem. Vrstva se vysuší v proudu vzduchu, postříká se ninhydrinem RS1 a zahřívá se 10 min při 110 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídající histidinu není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Sírany (2.4.13). 3 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (0,1 %).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 0,200 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 0,50 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

80,0 mg se rozpustí v 5 ml kyseliny mravenčí bezvodé R, přidá se 20 ml kyseliny octové bezvodé R a 6 ml octanu rtuťnatého RS. Titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20). Provede se slepá zkouška.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 9,203 mg C5H11Cl2N3.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Venenum.

†† Histamini phosphas[image omitted]

Histaminiumfosfat

[image omitted]

C5H15N3O8P2 . H2O	Mr 325,15 Mr bezvodého 307,14	CAS 23297-93-0

Je to monohydrát 4-(2-aminioethyl)imidazolium-bis(dihydrogenfosfatu). Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C5H15N3O8P2.

Vlastnosti

Bezbarvé dlouhé prismatické krystaly. Je snadno rozpustný ve vodě a těžce rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a D.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem histaminiumfosfatu CRL. Zkouší se tablety připravené za použití 1 mg zkoušené látky a 1 mg referenční látky.

B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Histidin, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

C. 0,1 g se rozpustí v 7 ml vody R a přidají se 3 ml roztoku hydroxidu sodného R (200 g/l) (roztok 1). 50 mg kyseliny sulfanilové R se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml dusitanu sodného RS (roztok 2). Roztok 2 se přidá k roztoku 1 a promíchá se; vznikne červené zbarvení.

D. Vyhovuje zkoušce (a) na fosforečnany (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R připravené z vody destilované R a zředí se stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ7 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 3,75 až 3,95; měří se roztok S.

Histidin. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R

Zkoušený roztok (a). 0,5 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 2 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 0,1 g histaminiumfosfatu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Porovnávací roztok (b). 50 mg monohydrátu histidiniumchloridu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100 ml.

Porovnávací roztok (c). 1 ml zkoušeného roztoku (a) a 1 ml porovnávacího roztoku (b) se smíchají.

Na vrstvu se odděleně nanese 1 μl zkoušeného roztoku (a), 1 μl zkoušeného roztoku (b), 1 μl porovnávacího roztoku (a), 1 μl porovnávacího roztoku (b) a 2 μl porovnávacího roztoku (c) a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, vody R a acetonitrilu R (5 + 20 + 75) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší v proudu vzduchu a vyvíjení se opakuje stejným způsobem. Vrstva se vysuší v proudu vzduchu, postříká se ninhydrinem RS1 a zahřívá se 10 min při 110 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídající histidinu není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Sírany (2.4.13). 3 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (0,1 %).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 5,0 % až 6,2 %; stanoví se s 0,300 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,140 g se rozpustí v 5 ml kyseliny mravenčí bezvodé R, přidá se 20 ml kyseliny octové bezvodé R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20). Provede se slepá zkouška.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 15,36 mg C5H15N3O8P2.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Venenum.

† Histidini hydrochloridum monohydricum[image omitted]

Monohydrát histidiniumchloridu

[image omitted]

C6H10ClN3O2 . H2O	Mr 209,63	CAS 5934-29-2

Je to monohydrát (S)-[1-karboxyl-2-(4-imidazolyl)ethyl]amoniumchloridu. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C6H10ClN3O2

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je snadno rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B, C a F.

Alternativní sestava zkoušek: A, B, D, E a F, viz Obecné zásady (1.2).

A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

B. Zkouška Hodnota pH, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety monohydrátu histidiniumchloridu CRL.

D. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

E. Asi 0,1 g se rozpustí v 7 ml vody R a přidají se 3 ml roztoku hydroxidu sodného R (200 g/l) (roztok 1). 50 mg kyseliny sulfanilové R se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml dusitanu sodného RS (roztok 2). Roztok 2 se přidá k roztoku 1 a promíchá se; vzniká oranžově červené zbarvení.

F. Asi 20 mg vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R připravené z vody destilované R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ6 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 5,0; měří se roztok S.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +9,2° až +10,6°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,75 g ve 12,0 ml kyseliny chlorovodíkové RS1 a zředěním vodou R na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg monohydrátu histidiniumchloridu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg monohydrátu histidiniumchloridu CRL a 10 mg prolinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku, vysuší se v proudu vzduchu a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu a postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Sírany (2.4.13). 10 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g).

Amonium. Připraví se komůrka sestávající ze dvou hodinových sklíček o průměru 60 mm, která se položí okraji na sebe. Na vnitřní stěnu horního sklíčka se přilepí čtvereček papíru lakmusového červeného R o straně 5 mm a zvlhčí se několika kapkami vody R. 50 mg upráškované zkoušené látky se umístí na spodní sklíčko a rozpustí se v 0,5 ml vody R. K roztoku se přidá 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R a rychle se zamíchá skleněnou tyčinkou. Sklíčko s papírem lakmusovým se ihned přiloží na sklíčko se zkoušenou látkou a zahřívá se 15 min při 40 °C. Papír lakmusový není intenzivněji modře zbarvený než porovnávací vzorek připravený současně stejným způsobem za použití 0,1 ml základního roztoku amonia (100 μg NH4/ml), 0,5 ml vody R a 0,30 g oxidu hořečnatého těžkého R (200 μg/g).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vy-třepává se třikrát po 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu R1. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 μg/g). Připraví se porovnávací roztok za použití základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). 7,0 % až 10 %; suší se 1,000 g v sušárně při 145 °C až 150 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,160 g se rozpustí v 50 ml vody prosté oxidu uhličitého R a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 19,16 mg C6H10ClN3O2.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Histidinum[image omitted]

Histidin

[image omitted]

C6H9N3O2	Mr 155,16	CAS 71-00-1

Je to kyselina (S)-2-amino-3-(4-imidazolyl)propanová. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C6H9N3O2.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je snadno rozpustný ve vodě, velmi těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety histidinu CRL.

Jestliže se spektrum zkoušené látky liší od spektra referenční látky, rozpustí se odděleně obě látky v co nejmenším množství vody R, odpaří se při 60 °C do sucha a se získanými zbytky se zaznamenají nová spektra.

C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

D. Asi 0,1 g se rozpustí v 7 ml vody R a přidají se 3 ml roztoku hydroxidu sodného R (200 g/l) (roztok 1). 50 mg kyseliny sulfanilové R se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml dusitanu sodného RS (roztok 2). Roztok 2 se přidá k roztoku 1 a promíchá se; vzniká oranžově červené zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí zahřátím na vodní lázni ve vodě destilované R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ7 (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +11,8° až +12,8°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,75 g ve 12,0 ml kyseliny chlorovodíkové RS a zředěním vodou R na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg histidinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí sejí na 50 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg histidinu CRL a 10 mg prolinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku, vysuší se v proudu vzduchu a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu a postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Chloridy (2.4.4). 5 ml roztoku S zředěného vodou R na 15 ml vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (200 μg/g).

Sírany (2.4.13). 10 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g)-

Amonium. Připraví komůrka sestávající ze dvou hodinových sklíček o průměru 60 mm, která se položí okraji na sebe. Na vnitřní stěnu horního sklíčka se přilepí čtvereček papíru lakmusového červeného R o straně 5 mm a zvlhčí se několika kapkami vody R. 50 mg upráškované zkoušené látky se umístí na spodní sklíčko a rozpustí se v 0,5 ml vody R. K roztoku se přidá 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R a krátce se zamíchá skleněnou tyčinkou. Sklíčko s papírem lakmusovým se ihned přiloží na sklíčko se zkoušenou látkou a zahřívají se 15 min při 40 °C. Papír lakmusový není intenzivněji modře zbarvený než porovnávací vzorek připravený současně stejným způsobem za použití 0,1 ml základního roztoku amonia (100 μgNH4/ml), 0,5 ml vody R a 0,30 g oxidu hořečnatého těžkého R (200 μg/g).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vytřepává se třikrát po 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu Rl. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí ve směsi 3 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a 15 ml vody R je-li třeba mírným zahřátím, a zředí se vodou R na 20 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 μg/g). Připraví se porovnávací roztok za použití základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; suší se 1,000 g v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,130 g se rozpustí v 50 ml vody R a titruje se kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l VS odpovídá 15,52 mg C6H9N3O2.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

†† Homatropini hydrobromidum[image omitted]

Homatropiniumbromid

Synonymum. Homatropinium bromatum

[image omitted]

C16H22BrNO3	Mr 356,26	CAS 51-56-9

Je to 3a-(RS)-mandeloyloxy-1αH,5αH-tropaniumbromid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C16H22BrNO3.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je snadno rozpustný ve vodě, mírně rozpustný v lihu 96%, velmi těžce rozpustný v etheru.

Taje při asi 215 °C, za rozkladu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a D.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem homatropiniumbromidu CRL.

B. 50 mg se rozpustí v 1 ml vody R, přidají se 2 ml kyseliny octové zředěné RS, zahřeje se, přidají se 4 ml trinitrofenolu RS a ochladí se za občasného zatřepání. Vzniklé krystaly se odfiltrují, promyjí se dvakrát 3 ml ledové vodyR a vysuší se při 100 °C až 105 °C. Krystaly tají (2.2.14) při 182 °C až 186 °C.

C. Asi 10 mg se rozpustí v 1 ml vody R, přidá se mírný nadbytek amoniaku 17,5% RS a třepe se s 5 ml chloroformu R. Po oddělení se chloroformová vrstva odpaří do sucha na vodní lázni, přidá se 1,5 ml roztoku chloridu rtuťnatého R (20 g/l) v lihu R 60% (V/V); vznikne žluté zbarvení, které zahřátím přechází na červené.

D. Vyhovuje zkoušce (a) na bromidy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 1,25 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 25 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není intenzivněji zbarven než porovnávací barevný roztok H9 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 5,0 až 6,5; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R. Zkoušený roztok. 0,2 g se rozpustí ve směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1 + 9) a stejnou směsí se zředí na 5 ml.

Porovnávací roztok. 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů vody R a methanolu R(1 + 9) na 100 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 5 každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny mravenčí bezvodé R, vody R a ethylacetatu R (16,5 + 16,5 + 67) po dráze 15 cm. Vrstva se suší při 100 °C až 105 °C do vymizení pachu rozpouštědel a po ochlazení se stříká jodobismutitanem draselným zředěným RS do objevení skvrn. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku 0,5 %.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 0,500 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C. Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 0,50 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,300 g se rozpustí ve 20 ml kyseliny octové bezvodé R, přidá se 7 ml octanu rtuťnatého RS a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 35,63 mg C16H22BrNO3.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Venenum.

†† Homatropini methylbromidum[image omitted]

Homatropiniummethylbromid

[image omitted]

C17H24BrNO3	Mr 370,29	CAS 80-49-9

Je to 3α-(RS)-mandeloyloxy-N-methyl-1αH,5αH-tropaniubromid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C17H24BrNO3.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je snadno rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Taje při asi 190 °C.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a C.

Alternativní sestava zkoušek: B a C, viz Obecné zásady (1.2).

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem homatropiniummethylbromidu CRL.

B. 50 mg se rozpustí v 1 ml vody R, přidají se 2 ml kyseliny octové zředěné RS, zahřeje se, přidají se 4 ml trinitrofenolu RS a ochladí se za občasného zatřepání. Vzniklé krystaly se odfiltrují, promyjí se dvakrát 3 ml ledové vody R a vysuší se při 100 °C až 105 °C. Krystaly tají (2.2.14) při 132 °C až 138 °C.

C. Vyhovuje zkoušce (a) na bromidy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 1,25 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 25 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 6,5; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

Zkoušený roztok. 0,20 g se rozpustí ve směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1 + 9) a stejnou směsí se zředí na 5 ml.

Porovnávací roztok. 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů vody R a methanolu R (1 + 9) na 100 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny mravenčí bezvodé R, vody R a ethylacetatu R (16,5 + 16,5 + 67) po dráze 15 cm. Vrstva se suší při 100 °C až 105 °C do vymizení pachu rozpouštědel a po ochlazení se postříká jodobismutitanem draselným zředěným RS a potom peroxidem vodíku zředěným RS. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,5 %).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 0,500 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 0,50 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,300 g se rozpustí v 10 ml vody R a titruje se dusičnanem stříbrným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20) za použití stříbrné elektrody jako indikační a argentchloridové elektrody jako srovnávací.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS odpovídá 37,03 mg C17H24BrNO3

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Venenum.

† Hyaluronidasum[image omitted]

Hyaluronidasa

Je to enzym extrahovaný z varlat savců (např. býčích varlat), který hydrolyzuje mukopolysacharidy typu kyseliny hyaluronové. Počítáno na vysušenou látku, účinnost hyaluronidasy je nejméně 300 m.j. v miligramu. Může obsahovat vhodný stabilizátor.

Výroba

Zvířata, ze kterých je hyaluronidasa získávána, musí splňovat požadavky oprávněné autority na zdravá zvířata určená pro humánní konzumaci. Pokud se pro výrobu použije tkáň bovinního původu, má být zvířecí zdroj prostý bovinní spongiformní encefalopatie a neměl být nikdy vystaven rizikovým faktorům, jako je výkrm bílkovinami přežvýkavců. K dosažení tohoto cíle mají zvířata pocházet z ověřených zdrojů. Při výběru zdroje zvířecí tkáně, jež se má použít, se má vzít v úvahu relativní nakažlivost a možné riziko spojené s různými tkáněmi. Různé kategorie rizika popisuj í platná pravidla Evropské Unie "Směrnice pro snížení na minimum rizika přenosu původců spongiformní encefalopatie prostřednictvím léčivých přípravků" (Guidelines for minimising the risk of transmission of agents causing spongiform encephalopathies via medicinal products) a platné pokyny Světové zdravotnické organizace.

Hyaluronidasa se vyrábí validovanými metodami extrakce a purifikace v podmínkách zajišťujících minimalizování stupně mikrobální kontaminace; výrobní metody musí prokazatelně redukovat jakoukoliv kontaminaci viry nebo jinými známými původci infekce na přijatelné limity.

Vlastnosti

Bílý nebo nažloutle bílý amorfní prášek. Je dobře rozpustná ve vodě, prakticky nerozpustná v acetonu, v ethanolu a v etheru.

Zkoušky totožnosti

Roztok obsahující 100 m.j. hyaluronidasy v 1 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l) depolymerizuje za 1 min stejný objem roztoku hyaluronatu sodného BRP (10 g/l) při 20 °C, což se projeví výrazným poklesem viskozity. Toto působení se zastaví zahříváním hyaluronidasy 30 min při 100 °C.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,1 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml; roztok je čirý (2.2.1).

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 7,5; měří se roztok připravený rozpuštěním 30 mg v 10 ml vody prosté oxidu uhličitého R.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 5,0 %; 0,500 g se 2 h suší při 60 °C a tlaku nepřevyšujícím 670 Pa.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 0,2 m.j. endotoxinu v mezinárodní jednotce hyaluronidasové účinnosti.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Účinnost zkoušené látky se stanoví porovnáním rychlosti, kterou hydrolyzuje hyaluronat sodný BRP, s rychlostí zjištěnou při použití mezinárodního standardu nebo referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách za použití modelu poměru sklonů.

Roztok substrátu. K 0,1 g hyaluronatu sodného BRP se v 25ml kuželové baňce pomalu přidá 20,0 ml vody R při 4 °C. Rychlost přidávání musí být dostatečně pomalá, aby částice substrátu mohly nabobtnat (asi 5 min). Směs se udržuje při 4 °C a míchá se nejméně 12 h. Uchovává se při 4 °C a použije se během 4 dnů.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v rozpouštědle pro hyaluronidasu R tak, aby výsledný roztok obsahoval v 1 ml (0,6 ± 0,3 ) m.j. hyaluronidasy.

Porovnávací roztok. Vhodné množství hyaluronidasy BRP se rozpustí v rozpouštědle pro hyaluronidasu R tak, aby výsledný roztok obsahoval v 1 ml 0,6 m.j. hyaluronidasy.

V reakční nádobě se smíchá 1,50 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 6,4 a 1,0 ml roztoku substrátu a udržuje se při (37 ± 0,1) °C. V čase t1 = 0 (první časoměřič) se přidá 0,5 ml zkoušeného roztoku obsahujícího Etmg zkoušeného enzymu, zamíchá se, pomocí vhodného visko-zimetru se změří viskozita roztoku při (37 ± 0,1) °C a během 20 min se zaznamená několikrát průtokový čas za použití druhého časoměřiče (děleného po 0,1 s) (odečte se první časoměřič). Vhodným viskozimetrem je Ubbelohdeho mikroviskozimetr (DIN 51 562, část 2) kapilární typ M II s konstantou viskozimetru asi 0,1 mm^2/s^2.

Postup se opakuje s 0,50 ml porovnávacího roztoku obsahujícího ET mg hyaluronidasy BRP. Poměr viskozit se vypočítá ze vzorce:

ηr=k . t20,6915 ,

v němž značí:

k - konstantu viskozimetru v mm^2/s^2 uvedenou na viskozimetru,

t2 - průtokový čas roztoku v sekundách,

0,6915 - kinematickou viskozitu v mm2/s tlumivého roztoku při 37 °C.

Protože enzymatická reakce pokračuje během měření průtokových časů, skutečný čas reakce se rovná t1 + t2/2, přičte se polovina průtokového času (t2/2) zjištěného při daném měření k času při kterém měření začalo. Vynese se (ln ηr)^-1 jako funkce reakčního času (t1 + t2/2) v sekundách. Získá se lineární poměr. Vypočítá se sklon pro zkoušenou látku (bt) a pro referenční látku (bt).

Vypočítá se specifická účinnost v m.j./mg ze vzorce:

btbr . ErEt . A,

v němž značí:

A - specifickou účinnost hyaluronidasy BRP v m.j./mg.

Celý postup se provede nejméně třikrát a vypočte se průměrná účinnost zkoušené látky.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech při teplotě 2 °C až 8 °C. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• účinnost v mezinárodních jednotkách na miligram,

• zdaje látka sterilní.

† Hydralazini hydrochloridum[image omitted]

Hydralaziniumchlorid

[image omitted]

C8H9ClN4	Mr 196,64	CAS 304-20-1

Je to 1-ftalazinylhydraziniumchlorid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % C8H9ClN4.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je dobře rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, velmi těžce rozpustný v dichlormethanu.

Taje při asi 275 °C, za rozkladu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B a E.

Alternativní sestava zkoušek: A, C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

A. 50 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100 ml. 2 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100 ml. Měří se absorbance (2.2.25) při 220 nm až 350 nm; roztok vykazuje čtyři absorpční maxima: při 240 nm, 260 nm, 303 nm a 315 nm. Poměr absorbance zjištěné v maximu při 240 nm k absorbanci zjištěné v maximu při 303 nm je 2,0 až 2,2.

B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety hydralaziniumchloridu CRL.

C. 0,5 g se rozpustí ve směsi 8 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a 100 ml vody R přidají se 2 ml dusitanu sodného RS, nechá se 10 min stát a zfiltruje se. Sraženina promytá vodou R a vysušená při 100 °C až 105 °C taje (2.2.14) při 209 °C až 212 °C.

D. 10 mg se rozpustí ve 2 ml vody R. Přidají se 2 ml roztoku nitrobenzaldehydu R (20 g/l) v lihu 96% R; vznikne oranžová sraženina.

E. Vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 25 ml.

Vzhled roztoku. 4 ml roztoku S se zředí vodou R na 20 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není intenzivně-ji zbarven než porovnávací barevný roztok ZŽ6 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 3,5 až 4,2; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí mobilní fází na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 25,0 mg ftalazinu R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 50,0 ml. 4,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 4,0 ml zkoušeného roztoku a 10,0 ml porovnávacího roztoku (c) se smíchají a zředí se mobilní fází na 100,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem nitrilovaným pro chromatografii R1 (10 μm),

• mobilní fáze při průtokové rychlosti 1 ml/min, kterou je směs připravená takto: k 22 objemovým dílům acetonitrilu R se přidá 78 objemových dílů roztoku obsahujícího 1,44 g laurylsíranu sodného R a 0,75 g tetrabutylamoniumbromidu R v litru, jehož pH byl upraveno kyselinou sírovou 0,05 mol/l RS na hodnotu 3,0,

• spektrofotometrického detektoru, 230 nm.