Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Provedení zkoušky. Zkouška se provádí v oddělené nerušené místnosti se stálou teplotou kolem 20 °C. Ke zkoušce se použijí tři králíci, kterým je večer předtím odebrána potrava. Po upoutání do fixačního zařízení a zavedení rektálních termometrů se u každého zvířete 90 min sleduje tělesná teplota v 30min intervalech. Za "výchozí teplotu" králíka je považován průměr ze dvou odečtů, naměřených v posledních 40 min před podáním zkoušeného roztoku. "Maximální teplotou" se rozumí nejvyšší teplota naměřená v 30min intervalech v průběhu 3 h po podání zkoušeného roztoku. Reakce králíka je vyjádřena rozdílem mezi jeho výchozí a maximální naměřenou teplotou. Jestliže je tento rozdíl negativní, je výsledek počítán jako nulová odpověď. Ze zkoušky se vyřadí králík, u kterého se při stanovení "výchozí teploty" liší naměřené dvě hodnoty o více než 0,2 °C nebo"výchozí teplota" je vyšší než 39,8 °C nebo nižší než 38,0 °C. U jednotlivých zvířat ve skupině se jejich "výchozí teploty" mezi sebou neliší o více než 1 °C.

Zkoušený roztok, zahřátý na teplotu asi 38,5 °C, se pomalu vstříkne do marginální ušní žíly králíka s dobou podání nejvýše 4 min, není-li v příslušném článku uvedeno jinak. Zkoušená látka se může rozpustit nebo zředit nepyrogenním roztokem chloridu sodného (9 g/l) nebo jiným předepsaným ředidlem. Množství látky pro provedení zkoušky se liší podle zkoušeného přípravku a je předepsáno v příslušném článku. Objem vstřikovaného roztoku má být nejméně 0,5 ml/kg a nejvýše 10 ml/kg tělesné hmotnosti.

Zhodnocení výsledků. Výsledek zkoušky se posoudí na základě naměřených vzestupů rektální teploty u použité skupiny králíků podle tabulky 2.6.8-1.

Jestliže součet reakcí (tj. vzestupů rektální teploty u jednotlivých králíků ve skupině) je vyšší než hodnoty uvedené v druhé kolonce, ale menší než limity uvedené ve třetí kolonce, zkouška se opakuje na další trojici králíků až do celkového a konečného počtu dvanácti zvířat.

Králíci, u nichž vzestup rektální teploty ve zkoušce na pyrogen přestoupí 1,2 °C,se trvale vyřadí.

Tab. 2.6.8-1

Počet králíků	Přípravek vyhovuje, není-li součet reakcí vyšší než	Přípravek nevyhovuje, je-li součet reakcí vyšší než
3	1,15 °C	2,65 °C
6	2,80 °C	4,30 °C
9	4,45 °C	5,95 °C
12	6,60 °C	6,60 °C

• 2.6.9 Zkouška na neškodnost

Všeobecná zkouška

Zkouška se provede na skupině pěti zdravých myší, vážících 17 g až 22 g. Množství zkoušené látky, předepsané v příslušném článku, se rozpustí v 0,5 ml vody na injekci R nebo sterilního roztoku chloridu sodného (9 g/l) a vstříkne se myším do ocasní žíly během 15 s až 30 s, není-li předepsáno jinak.

Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádná myš neuhyne během 24 h nebo během doby, která je předepsána v příslušném článku. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu jednoho zvířete ze skupiny se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže z druhé skupiny neuhyne během určené doby pozorování žádná myš.

Imunní séra a vakcíny pro humánní použití

Pokud není předepsáno jinak, vstříkne se intraperitoneálně pěti zdravým myším, vážícím 17 g až 22 g, po jedné lidské dávce, nejvýše však po 1,0 ml zkoušeného přípravku. Lidskou dávkou se rozumí dávka uvedená v označení zkoušeného přípravku nebo v jeho příbalovém letáku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné zvíře nemá příznaky onemocnění. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu nebo příznacích onemocnění jednoho zvířete se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování z druhé skupiny žádné zvíře neuhyne ani nemá žádné příznaky onemocnění.

Zkouška se také provede na dvou zdravých morčatech vážících 250 g až 350 g. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříkne jedna lidská dávka, nejvýše však 5,0 ml zkoušeného přípravku. Lidskou dávkou se rozumí dávka uvedená v označení zkoušeného přípravku nebo v jeho příbalovém letáku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné zvíře nemá příznaky onemocnění. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu nebo příznacích onemocnění jednoho zvířete se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování z druhé skupiny žádné zvíře neuhyne ani nemá žádné příznaky onemocnění.

Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití

Pokud není předepsáno jinak, vstříkne se podkožně pěti zdravým myším, vážícím 17 g až 22 g, po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje, jestliže žádné zvíře nemá významné místní nebo systémové reakce. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Uhyne-li jedno zvíře nebo má významné místní nebo systémové reakce, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování žádné zvíře z druhé skupiny neuhyne ani nemá významné místní ani systémové reakce.

Zkouška se také provede na dvou zdravých morčatech vážících 250 g až 350 g. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříknou nejméně 2 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní.

Přípravek vyhovuje, jestliže žádné zvíře nemá významné místní nebo systémové reakce. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Uhyne-li jedno zvíře nebo má významné místní nebo systémové reakce, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování žádné zvíře z druhé skupiny neuhyne ani nemá významné místní ani systémové reakce.

• 2.6.10 Zkouška na přítomnost histaminu

Podstata zkoušky. Přítomnost znečištěnin typu histaminu ve zkoušeném přípravku vyvolá na izolovaném tenkém střevě morčete kontrakce, které se porovnávají s účinkem standardu (histaminiumdichloridu).

Příprava zvířete. Ke zkoušce se použije zdravé morče o hmotnosti 250 g až 350 g, které bylo předchozích 24 h ponecháno bez krmiva. Po usmrcení vykrvácením se odejme distální část tenkého střeva v délce 2 cm a vymyje se šetrně pomocí stříkačky roztokem B, zahřátým na teplotu 34 °C až 36 °C. Na oba konce střevního segmentu se připevní tenká nit, kterou se prošije střevní stěna tak, aby střevo zůstalo průchodné. Jeden konec střeva se touto nití připevní ke skleněnému nosiči a vloží se na dno orgánové lázně o objemu 10 ml až 20 ml naplněné roztokem B, který je udržován na stálé teplotě 34 °C až 36 °C a probublává se směsí 95 % (V/V) kyslíku a 5 % (V/V) oxidu uhličitého. Druhý konec střeva se napojí na izotonický snímač kontrakcí, které se registrují pomocí kymografu nebo jiným vhodným kontinuálním zapisovačem při zvětšení přibližně dvacetinásobném. Napnutí střeva má být asi 9,8 mN (1 g) a mělo by být upraveno podle citlivosti orgánu.

Příprava roztoků.

Roztok A:	chlorid sodný	160,0 g
chlorid draselný	4,0 g
chlorid vápenatý bezvodý	2,0 g
chlorid hořečnatý bezvodý	1,0 g
hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát	0,10 g
voda na injekci do	1000,0 ml
Roztok B:	roztok A	50,0 ml
atropiniumsulfat	0,0005 g
hydrogenuhličitan sodný	1,0 g
glukosa monohydrát	0,5 g
voda na injekci do	1000,0 ml

Roztok B se má připravovat vždy čerstvý pro spotřebu do 24 h.

Porovnávací roztok. Jako porovnávací roztok se používá roztok histaminiumdichloridu R o doporučené koncentraci 0,1 mg/ml. Připraví se vždy čerstvý.

Provedení zkoušky. Orgánová lázeň se vypláchne roztokem B a nechá se 10 min stabilizovat. Po následném dvoj- až trojnásobném propláchnutí roztokem B se vyvolají stahy střeva přidáváním roztoku histaminiumdichloridu R v objemech mezi 0,2 ml až 0,5 ml, aby se zjistila dávka, která způsobí reprodukovatelnou submaximální kontrakci. Tato dávka se nazývá "dávka vysoká". Před každým přidáním histaminu se lázeň třikrát propláchne roztokem B (kontinuálním průtokem bez vyprázdnění lázně). Dávky se aplikují v pravidelných intervalech umožňujících úplnou relaxaci střevního segmentu (asi 2 min).

Po zjištění "vysoké dávky" se určuje dávka zvaná "nízká" tím, že se do lázně přidává roztok histaminiumdichloridu R ve větším zředění (ale ve stejných objemech) tak, aby se dosáhla reprodukovatelná kontrakce střevního segmentu přibližně poloviční ve srovnání s dávkou "vysokou".

V dalším postupu se pravidelně střídá podávání "vysoké" a "nízké" dávky roztoku histaminu s podáním zkoušené látky, jejíž koncentrace se upravuje tak, aby vyvolaná kontrakce střeva (pokud je vůbec pozorovatelná) byla menší než stah po “vysoké dávce“ histaminu. Kontrakce střeva po zkoušené látce mají být reprodukovatelné a velikost stahů po "vysoké" i "nízké" dávce histaminu má v průběhu sledování zůstat nezměněna.

Zhodnocení výsledků. Ze srovnání velikosti kontrakce střeva po podání zkoušené látky s kontrakcemi dosaženými po "vysoké" a "nízké" dávce histaminu se provede odhad obsahu histaminové účinnosti ve zkoušené látce, vyjádřený v mikrogramech báze histaminu. Tato hodnota nemá přesáhnout limit uvedený v lékopisném článku.

Jestliže zkoušený roztok nevyvolá žádný stah střeva, připraví se čerstvý roztok zkoušené látky s přidaným histaminem v množství, které představuje povolené maximum pro zkoušenou látku podle lékopisného článku, a pozoruje se, zda po přidání do lázně odpovídá kontrakce střeva přidanému histaminu. Jestliže tomu tak není nebo není-li kontrakce, vyvolaná zkoušeným roztokem reprodukovatelná nebo jsou-li následné odpovědi na "vysokou" a "nízkou" dávku histaminu sníženy, výsledky zkoušky nejsou hodnotitelné a provede se Zkouška na hypotenzivní látky (2.6.11).

• 2.6.11 Zkouška na hypotenzivní látky

Podstata zkoušky. Nežádoucí příměs látek snižujících krevní tlak ve zkoušeném přípravku se zjišťuje na krevním tlaku anestezované kočky v porovnání s účinkem histaminu.

Příprava zvířete. Ke zkoušce se použije zdravá kočka o hmotnosti nad 2 kg, která se uvede do celkové anestezie pomocí chloralosy nebo barbiturátu tak, aby se zajistilo udržování stálého krevního tlaku.^4)

Zvíře se upevní na operačním stole v poloze na zádech a dbá se na to, aby tělesná teplota, měřená rektálním teploměrem, neklesla pod fyziologickou hodnotu. Do průdušnice se zavede dýchací kanyla. Druhá kanyla, naplněná heparinizovaným roztokem chloridu sodného (9 g/l), se zavede do arteria carotis communis a spojí se s vhodným snímačem krevního tlaku a s registračním zařízením, umožňujícím kontinuální záznam. Pro nitrožilní podávání zkoušeného přípravku a referenční látky se zavede do vena femoralis třetí kanyla, naplněná též heparinizovaným roztokem chloridu sodného (9 g/l). Po deseti- až patnáctiminutové stabilizaci krevního tlaku se přistoupí k vlastní zkoušce.

Příprava roztoků. Zkoušená látka se rozpustí v roztoku chloridu sodného (9 g/l) nebo v jiném předepsaném rozpouštědle na koncentraci předepsanou v příslušném článku.

Referenční látkou je histaminiumdichlorid R, který se rozpustí v roztoku chloridu sodného (9 g/l) na koncentraci odpovídající 0,1 μg histaminové báze v 1 ml (roztok histaminu).

Provedení zkoušky. Nejdříve je třeba ověřit citlivost zvířete na histamin tím, že se mu vstřikuje v pravidelných intervalech roztok histaminu v dávkách, odpovídajících 0,1 μg a 0,15 μg histaminové báze (tj. 1,0 ml a 1,5 ml roztoku histaminu RS) na kilogram tělesné hmotnosti. Každá následující dávka se vstříkne nejdříve za 1 min po navrácení krevního tlaku k normě. Kočka se použije ke zkoušce pouze tehdy, jestliže po nižší dávce histaminu dojde ke zřetelnému a konstantnímu poklesu krevního tlaku a jestliže vyšší dávka histaminu vyvolá vyšší odpověď.

Při vlastní zkoušce se zvířeti vstříkne 1 ml roztoku histaminu na kilogram, pak dvakrát roztok zkoušeného přípravku v objemu a koncentraci předepsané v příslušném článku a nakonec opět 1 ml roztoku histaminu na kilogram. Tato čtveřice dávek se dvakrát opakuje a celá zkouška se zakončí podáním 1,5 ml roztoku histaminu RS na kilogram. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže pokles krevního tlaku na vyšší dávku histaminu (1,5 ml/kg) je větší než na dávku nižší (1,0 ml/kg).

Zhodnocení výsledků. Zkoušený přípravek nevyhovuje:

• a) jestliže průměrná hodnota ze série odpovědí na zkoušený přípravek je větší než průměr odpovědí na 1,0 ml roztoku histaminu na kilogram, nebo

• b) jestliže některá z dávek zkoušeného přípravku vyvolá větší pokles krevního tlaku než závěrečná dávka roztoku histaminu (1,5 ml/kg).

Kočka se nemůže použít ke zkoušení jiného přípravku na obsah hypotenzivních látek, jestliže platí kritérium b) nebo jestliže odpověď na konečnou vyšší dávku histaminu je menší než průměr odpovědí na předchozí nižší dávky histaminu.

• 2.6.12 Zkouška mikrobiálního znečištění nesterilních výrobků (celkový počet živých aerobů)

Celkový počet živých aerobů se stanoví metodou membránové filtrace, počítáním na agarových půdách nebo za pomoci řady ředění podle předpisu.

Stanovení se provádí za podmínek vylučujících nahodilé znečištění. Opatření k vyloučení znečištění nepůsobí na prokazované mikroorganismy.

Pokud není předepsáno jinak, používá se 10 g nebo 10 ml zkoušené látky, odebrané za výše uvedených podmínek. K získání požadovaného množství se smíchá více vzorků látky náhodně odebraných nebo obsah dostatečného množství nádob. Podle povahy zkoušené látky se ředí, rozpouští, suspenduje nebo emulguje za použití vhodné tekutiny.

Pokud má látka protimikrobní vlastnosti, odstraní se tyto zředěním, neutralizací nebo filtrací.

Použije se vhodný stupeň ředění, aby počet kolonie tvořících jednotek byl v doporučených mezích použité metody.

Doporučené živné půdy jsou uvedeny dále.

Příprava vzorku

Látky rozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se rozpustí nebo zředí v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 (viz dále) nebo v jiné vhodné tekutině, která v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek, a doplní se jí na 100 ml (povaha některých látek vyžaduje použít větší objem). Pokud je třeba, upraví se pH na asi 7.

Látky nerozpustné ve vodě (nelipofilní). 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se suspenduje v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo jiné vhodné tekutině, která v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek a doplní se jí na 100 ml (povaha některých látek vyžaduje použít větší objem). Zkoušená látka se v případě potřeby rozdrtí a suspenze se mechanicky zhomogenizuje. Je možné přidat vhodnou, povrchově aktivní látku, např. ke špatně smáčivým látkám se může přidat polysorbát 80 v koncentraci 1 g/l k usnadnění tvorby suspenze. Pokud je třeba, upraví se pH na asi 7.

Látky lipofilní. 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se zhomogenizuje s 5 g polysorbátu 20 nebo 80, přičemž se, pokud je to třeba, zahřeje na 40 °C (výjimečně lze v nezbytných případech zahřát po krátkou dobu na 45 °C). Při této teplotě se na vodní lázni nebo v sušárně dobře promíchá a přidá se 85 ml tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 zahřátého, pokud je to třeba, na nejvýše 40 °C. Tato teplota se udržuje jen po dobu potřebnou k vytvoření emulze a nesmí překročit 30 min. Pokud je třeba, upraví se pH emulze na asi 7.

Zkoušení vzorku

Membránová filtrace

Používají se membránové filtry s nominální velikostí pórů nejvýše 0,45 μm a jejichž účinnost zadržet bakterie byla ověřena. Filtry z dusičnanů celulosy se např. používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky a filtry z octanu celulosy se např. používají pro silně lihové roztoky.

Dále popsaná metoda se vztahuje na použití membránových filtrů o průměru asi 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacích a promývacích roztoků. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil přenesení filtru na povrch živné půdy. Použijí se dva membránové filtry, na každý se přenese 10 ml nebo množství roztoku odpovídající 1 g zkoušeného vzorku a ihned se zfiltruje. Je-li třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby byl očekávaný počet kolonií 10 až 100. Oba filtry se promyjí nejméně třikrát asi 100 ml vhodné tekutiny, jako např. tlumivým roztokem s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Pro lipofilní látky může tato tekutina obsahovat vhodnou povrchově aktivní látku, jako je polysorbát 20 nebo 80. Jeden z filtrů, určený pro stanovení počtu bakterií, se přenese na povrch agarové půdy B a druhý, určený pro stanovení počtu hub, na povrch agarové půdy C. Půda B se inkubuje při teplotě 30 °C až 35 °C po dobu 5 dní a půda C při teplotě 20 °C až 25 °C též po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se počet mikroorganismů na 1 g nebo 1 ml zkoušené látky, pokud je třeba zvlášť bakterie a zvlášť houby.

Počítání na pevných půdách

Pro bakterie. Používají se Petriho misky o průměru 9 cm až 10 cm; do každé se dá směs 1 ml zkoušeného roztoku a asi 15 ml agarové půdy B ohřáté na nejvýše 45 °C. Alternativně se zkoušený roztok rozetře na povrch ztuhlé půdy v Petriho misce o stejném průměru. Pokud je třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby počet kolonií nepřesahoval 300. Od každého ředění se připraví nejméně dvě Petriho misky a inkubují se při 30 °C až 35 °C po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se výsledek z misky s nejvyšším počtem kolonií s přihlédnutím k tomu, že 300 kolonií na plotně je maximum pro správné vyhodnocení.

Pro houby. Používají se Petriho misky o průměru 9 cm až 10 cm; do každé se dá směs 1 ml zkoušeného roztoku a asi 15 ml agarové půdy C ohřáté na nejvýše 45 °C. Alternativně se zkoušený roztok rozetře na povrch ztuhlé půdy v Petriho misce o stejném průměru. Pokud je třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby počet kolonií nepřesahoval 100. S každým ředěním se připraví nejméně dvě Petriho misky a inkubují se při 20 °C až 25 °C po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se výsledek z misek s počtem kolonií menším než 100.

Sériové ředění

Připraví se série dvanácti zkumavek, z nichž každá obsahuje 9 ml až 10 ml živné půdy A. Do každé z prvních tří zkumavek se přidá 1 ml 10krát zředěné, rozpuštěné nebo zhomogenizované látky, jak je popsáno výše. Do dalších tří zkumavek se přidá po 1 ml 100krát zředěné a do následujících tří po 1 ml 1000krát zředěné látky. Do posledních tří zkumavek se přidá po 1 ml rozpustidla. Zkumavky se inkubují při 30 °C až 35 °C nejméně po dobu 5 dnů. V posledních třech zkumavkách nemá dojít k růstu mikroorganismů. Pokud odečítání výsledků je nesnadné nebo nejisté z důvodů přítomnosti zkoušené látky, provede se vyočkování do tekuté půdy nebo na pevnou půdu a výsledky se odečítají až po další inkubační době. Nejpravděpodobnější počet mikrobů v 1 g nebo v 1 ml se stanoví z tabulky 2.6.12-1.

Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů

| Počet zkumavek s mikrobiálním růstem pro použité množství zkoušeného přípravku | Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů v 1 g (nebo v 1 ml) | | | | 100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce | 100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce | 100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce | | | --- | --- | --- | --- | | 3 | 3 | 3 | > 1100 | | 3 | 3 | 2 | 1100 | | 3 | 3 | 1 | 500 | | 3 | 3 | 0 | 200 | | 3 | 2 | 3 | 290 | | 3 | 2 | 2 | 210 | | 3 | 2 | 1 | 150 | | 3 | 2 | 0 | 90 | | 3 | 1 | 3 | 160 | | 3 | 1 | 2 | 120 | | 3 | 1 | 1 | 70 | | 3 | 1 | 0 | 40 | | 3 | 0 | 3 | 95 | | 3 | 0 | 2 | 60 | | 3 | 0 | 1 | 40 | | 3 | 0 | 0 | 23 |

Jestliže v prvním sloupci vykazují mikrobiální růst dvě zkumavky nebo méně, je nejpravděpodobnější počet mikroorganismů v 1 g (nebo v 1 ml) menší než 100.

Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu

Je-li třeba, postupuje se takto: dále uvedené testovací kmeny se kultivují 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C nebo pro Candida albicans 48 h při 20 °C až 25 °C ve zkumavkách s půdou A.

Staphylococcus aureus, např.	ATCC 6538 P (NCIB 8625, CIP 53.156, CCM 2022, CNCTC Mau 28/58)
nebo	ATCC 6538 (NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Bacillus subtilis, např.	ATCC 6633 (NCIB 8054, CIP 52.62, CCM 1999, CNCTC Bs 8/58)
Escherichia coli, např.	ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Candida albicans, např.	ATCC 2091 (CIP 1180.79, CCM 8226, CNCTC 55/79)
nebo	ATCC 10231 (NCPF 3179, CIP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91)

Část vyrostlé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 tak, aby vzniklá suspenze obsahovala v 1 ml asi 100 živých zárodků.

Je-li třeba, použije se samostatně suspenze každého mikroorganismu jako kontrola metod na stanovení počtu zárodků za přidání a též za nepřítomnosti zkoušené látky.

Při ověřování metody se počet u každého testovaného mikroorganismu nesmí lišit o více než desetinásobek od vypočteného množství referenční suspenze. K ověření sterility půd, ředicího roztoku a aseptického provedení zkoušky se stanoví celkový počet živých aerobních zárodků za použití sterilního tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 jako zkoušeného přípravku. Nemá v něm být prokázán žádný růst mikroorganismů.

Vyhodnocení výsledků

Je-li v článku uveden limit počtu, interpretuje se takto:

10^2 mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 . 10^2;

10^3 mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 . 10^3 atd.

Následující část se uvádí pro informaci a jako vodítko; netvoří závaznou součást celkové metody.

Doporučené živné půdy a roztoky

Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Jiné půdy mohou být použity, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, které se mají zjišťovat.

Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

dihydrogenfosforečnan draselný	3,56 g5)
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,23 g2)
chlorid sodný	4,30 g2)
pepton (z masa nebo kaseinu)	1,0 g
voda	1000 ml

Může se přidat polysorbát 20 nebo 80 (1 g/l až 10 g/l). Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
papainový hydrolyzát sóji	5,0 g
chlorid sodný	5,0 g
agar	15,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)

pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
glukosa monohydrát	40,0 g
agar	15,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku nebo e přidá 50mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.

Tekutá půda D (laktosová půda)

masový výtažek	3,0 g
pankreatický hydrolyzát želatiny	5,0 g
laktosa	5,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.

Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)

pankreatický hydrolyzát želatiny	10,0 g
glukosa mohohydrát	5,0 g
sušená hovězí žluč	20,0 g
dihydrogenfosforečnan draselný	2,0 g
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	8,0 g
brilantní zeleň	15 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.

Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení)

kvasničný výtažek	3,0 g
pankreatický hydrolyzát želatiny	7,0 g
žlučové soli	1,5 g
laktosa	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
glukosa monohydrát	10,0 g
agar	15,0 g
neutrální červeň	30 mg
krystalová violeť	2 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.

Tekutá půda G (MacConkeyova půda)

pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
laktosa	10,0 g
sušená hovězí žluč	5,0 g
bromkresolová červeň	10 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda H (MacConkeyův agar)

pankreatický hydrolyzát želatiny	17,0 g
pepton (z masa a kaseinu)	3,0 g
laktosa	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
žlučové soli	1,5 g
agar	13,5 g
neutrální červeň	30 mg
krystalová violeť	1 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení)

pepton	8,6 g
sušená hovězí žluč	8,0 g
chlorid sodný	6,4 g
uhličitan vápenatý	20,0 g
tetrathionan draselný	20,0 g
brilantní zeleň	70 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.

Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)

masový výtažek	10,0 g
pepton z masa	10,0 g
laktosa	10,0 g
citronan sodný	20,0 g
citronan železitý	1,0 g
deoxycholan sodný	5,0 g
agar	13,5 g
neutrální červeň	20 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Povaří se 1 min, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem)

xylosa	3,5 g
L-lysin	5,0 g
laktosa	7,5 g
sacharosa	7,5 g
chlorid sodný	5,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
fenolová červeň	80 mg
agar	13,5 g
deoxycholan sodný	2,5 g
thiosíran sodný	6,8 g
citronan amonno-železitý	0,8 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou)

pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
laktosa	10,0 g
sacharosa	10,0 g
agar	20,0 g
fenolová červeň	80 mg
brilantní zeleň	12,5 mg
voda	1000 ml

Povaří se 1 min. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.

Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)

masový výtažek	3,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
pepton (z masa a kaseinu)	20,0 g
chlorid sodný	5,0 g
laktosa	10,0 g
sacharosa	10,0 g
glukosa monohydrát	1,0 g
citronan amonno-železitý	0,3 g
thiosíran sodný	0,3 g
fenolová červeň	25 mg
agar	12,0 g
voda	1000 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.

Agarová půda N (cetrimidový agar)

pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
chlorid hořečnatý	1,4 g
síran draselný	10,0 g
cetrimid	0,3 g
agar	13,6 g
voda	1000 ml
glycerol	10,0 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
masový výtažek	5,0 g
kvasničný výtažek	1,0 g
chlorid lithný	5,0 g
agar	20,0 g
glycin	12,0 g
pyruvan sodný	10,0 g
voda	950 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 45 °C až 50 °C a přidá 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.

Půda P (obohacená půda pro klostridia)

masový výtažek	10,0 g
pepton	10,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
rozpustný škrob	1,0 g
glukosa monohydrát	5,0 g
cysteiniumchlorid	0,5 g
chlorid sodný	5,0 g
octan sodný	3,0 g
agar	0,5 g
voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se hodnota pH tak, aby po sterilizaci byla asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Půda Q (Columbia agar)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
peptický hydrolyzát masa	5,0 g
pankreatický hydrolyzát srdce	3,0 g
kvasničný výtažek	5,0 g
kukuřičný škrob	1,0 g
chlorid sodný	5,0 g
agar, podle schopnosti tvořit gel	10,0 až 15,0 g
voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se hodnota pH tak, aby po sterilizaci byla 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.

Půda R (laktoso-siřičitanová půda)

pankreatický hydrolyzát kaseinu	5,0 g
kvasničný výtažek	2,5 g
chlorid sodný	2,5 g
laktosa	10,0 g
cysteiniumchlorid	0,3 g
voda	1000 ml

Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ±0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu železito-amonného (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).

• 2.6.13 Zkoušky na specifické mikroorganismy

Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie

Důkaz. Zkoušený přípravek se zpracuje postupem uvedeným v části 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 se použije živná půda D. Zhomogenizuje se a inkubuje při 35 °C až 37 °C po dobu postačující k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení (obvykle 2 h, ale ne více než 5 h). Tekutina se protřepe, homogenizát a množství odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušené látky se přenese do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misky s agarovou půdou F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Přípravek vyhovuje, jestliže na žádné misce nevyrostou kolonie gramnegativních bakterií.

Kvantitativní stanovení. Do vhodných množství živné půdy E se přidají z homogenizátu a nebo roztoku zkoušeného přípravku množství odpovídající 1,0 g, 0,1 g a 0,01 g nebo 1,0 ml, 0,1 ml a 0,01 ml přípravku. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Z každé kultury se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F. Inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Růst dobře vyvinutých, červených nebo načervenalých kolonií gramnegativních bakterií se hodnotí jako pozitivní výsledek. Zaznamená se nejmenší množství zkoušeného přípravku, které dává pozitivní výsledek, a největší množství zkoušeného přípravku, které dává negativní výsledek.

Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.

Tab. 2.6.13-1

| Výsledky pro množství přípravku | Pravděpodobný počet bakterií v 1 g přípravku | | | | 1 g nebo 1 ml | 0,1 g nebo 0,1 ml | 0,01 g nebo 0,01 ml | | | --- | --- | --- | --- | | + | + | + | více než 102 | | + | + | - | méně než 102 a více než 10 | | + | - | - | méně než 10 a více než 1 | | - | - | - | méně než 1 |

Escherichia coli

Do 100 ml živné půdy G se přidá objem kultury připravený jako pro zkoušku na enterobakterie a jiné vybrané gramnegativní bakterie v živné půdě D, v množství odpovídajícím 1 g nebo 1 ml zkoušené látky. Inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Vyočkuje se na agarovou půdu H a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Nárůst červených, obvykle nemukózních kolonií gramnegativních tyčinek, obklopených někdy načervenalou precipitační zónou, indikuje možnou přítomnost E. coli. Tento výsledek je možné potvrdit tvorbou indolu při (44 ± 0,5) °C nebo jinými biochemickými reakcemi. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné takovéto kolonie nejsou pozorovány nebo když jsou potvrzující biochemické zkoušky negativní.

Salmonella

Množství odpovídající 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se inkubuje 5 h až 24 h v půdě D při 35 °C až 37 °C, aby se zajistilo optimální obohacení. 10 ml obohacené kultury se přenese do 100 ml živné půdy I a inkubuje se 18 h až 24 h při 42 °C až 43 °C. Potom se vyočkuje na nejméně dvě různé pevné půdy, vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Pravděpodobná přítomnost salmonel je indikována růstem kolonií tohoto vzhledu:

• na půdě J: dobře rozvinuté bezbarvé kolonie,

• na půdě K: dobře rozvinuté červené kolonie s černým středem nebo bez něho,

• na půdě L: malé průsvitné bezbarvé nebo růžové až matně bílé kolonie, často obklopené růžovou nebo červenou zónou.

K potvrzení nálezu se samostatně naočkuje několik podezřelých kolonií na povrch a vpichem do agarové půdy M. Přítomnost salmonel je předběžně potvrzena, jestliže uvnitř půdy, ale nikoliv na jejím povrchu, dojde ke změně barvy z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu. Tvoří se nebo též netvoří sirovodík. Potvrzení se může zpřesnit vhodnými biochemickými a sérologickými zkouškami. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se nenajdou kolonie popsaného typu nebo jestliže jsou potvrzující biochemické a sérologické zkoušky negativní.

Pseudomonas aeruginosa

Do 100 ml živné půdy A se dá 10 ml upraveného zkoušeného vzorku (viz 2.6.12) nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml přípravku. Promíchá se a inkubuje 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na agarovou půdu N a inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Není-li zjištěn růst mikroorganismů, přípravek vyhovuje. Jestliže vyrostou gramnegativní tyčinky, obvykle se zelenavou fluorescencí, provede se oxidasová zkouška a sleduje se, zda dojde k růstu v půdě A při 42 °C. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se nezjistí kolonie popsaného typu a jestliže je ověřovací biochemická zkouška negativní.

Staphylococcus aureus

Připraví se obohacená kultura, jak je uvedeno u Ps. aeruginosa, a vyočkuje se na vhodnou půdu, např. na agarovou půdu O. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Není-li pozorován žádný růst, přípravek vyhovuje. Černé kolonie grampozitivních koků, často obklopené jasnými zónami, mohou indikovat přítomnost S. aureus. Ty mohou být potvrzeny jako katalasa-pozitivní koky, a dále např. koagulasovou a deoxyribonukleasovou zkouškou. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se neobjeví popsané kultury nebo jestliže jsou ověřovací biochemické zkoušky negativní.

Růstové a selektivní vlastnosti půd a validace zkoušky na specifické mikroorganismy

Pokud je třeba, postupuje se takto: dále uvedené kmeny se odděleně kultivují 18 h až 24 h ve zkumavkách v uvedených půdách při 30 °C až 35 °C.

Staphylococcus aureus, např.	ATCC 6538P	půda A
	(NCIB 8625, CIP 53.156, CCM 2022, CNCTC Mau 28/58)
nebo	ATCC 6538	půda A
	(NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Pseudomonas aeruginosa, např.	ATCC 9027	půda A
	(NCIB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65)
Escherichia coli, např.	ATCC 8739	půda D
	(NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Salmonella typhimurium6)		půda D

Část roztoku každé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 tak, aby suspenze obsahovala asi 1000 živých zárodků v 1 ml. Smíchají se stejné díly od všech suspenzí a použije se 0,4 ml (přibližně 100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na E. coli, Salmonelly, Ps. aeruginosa a S. aureus, a to za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného přípravku, je-li to nutno.Použitá metoda má umožnit důkaz hledaného mikroorganismu.

Klostridie

Dále popsané zkoušky jsou určeny pro vymezené účely. První metoda je určena pro přípravky, u nichž je nezbytné vyloučit přítomnost patogenních klostridií, a které je proto nutno zkoušet na jejich nepřítomnost. Tyto přípravky mají obecně nízký celkový počet zárodků. Druhá metoda je semikvantitativním stanovením Clostridium perfringens a je určena pro přípravky, kde množství tohoto druhuje kritériem jejich kvality.

• 1. Zkouška na klostridie. Zkoušený přípravek se zpracuje tak, jak je uvedeno v části 2.6.12. Připraví se dvě stejné dávky odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného přípravku. Jedna se zahřívá na 80 °C po dobu 10 min a potom se rychle ochladí. Po protřepání se z ní naočkuje 10 ml do zkumavky (38 mm x 200 mm) nebo do jiné vhodné nádoby obsahující 100 ml živné půdy P. Druhá dávka se nezahřívá a naočkuje se stejným způsobem do druhé zkumavky. Obě zkumavky se inkubují za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se obě zkumavky vyočkují na živnou půdu Q, do níž byl přidán gentamicin, a inkubují se opět 48 h při 35 °C až 37 °C. Přípravek vyhovuje, jestliže není pozorován růst mikroorganismů.

Je-li pozorován růst, přeočkuje se každá odlišná kolonie na živnou půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se za aerobních a anaerobních podmínek. Dojde-li jenom k anaerobnímu růstu grampozitivních tyčinek (s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí, indikuje to přítomnost rodu Clostridium. Je-li to nutné, porovná se růst kolonií na obou plotnách a použije se katalasová zkouška k vyloučení aerobních a fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus, které dávají pozitivní katalasovou reakci. Tato zkouška může být provedena na rozlišení stejných kolonií na agarové půdě nebo nepřímo po přenesení kolonie na podložní sklíčko přidáním kapky peroxidu vodíku zředěného RS. Tvorba bublinek plynu indikuje pozitivní katalasovou reakci.

• 1. Stanovení počtu Clostridium perfringens. Zkoušený přípravek se zpracuje tak, jak je popsáno v části 2.6.12, a připraví se ještě stonásobné a tisícinásobné zředění v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0.

Stanoví se nejpravděpodobnější počet mikrobů tak, jak je popsáno při stanovení celkového počtu živých aerobních mikrobů (2.6.12). Přenese se vždy 1 ml zhomogenizovaného roztok do zkumavky (16 mm x 160 mm) nebo jiné vhodné nádoby obsahující 9 ml živné půdy R a malou Durhamovu zkumavku. Opatrně se promíchá a inkubuje při (45 ± 0,5) °C po dobu 24 h až 48 h.

Zkumavky, které zčernají od sirníku železitého a v nichž je Durhamova zkumavka naplněna plynem nejméně v jedné desetině objemu, indikují přítomnost Cl. perfringens. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se odečte z tabulky 2.6.12-1.

Ke kontrole se použijí tyto kmeny:

pro 1. metodu Clostridium sporogenes, např.	ATCC 19404 (NCTC 532, CIP 79.03, CCM 4409, CNCTC Cl 66/79);
pro 2. metodu Clostridium perfringens, např.	ATCC 13124 (NCIB a NCTC 6125, CIP 103.409, CCM 4435, CNCTC Cl 68/83).

Je-li to nutné, použije se Cl. sporogenes ke kontrole selektivity a anaerobních podmínek.

• 2.6.14 Bakteriální endotoxiny

Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny (LAL-test) se používá lyzát z amébocytů ostrorepa, Limulus polyphemus. Po přidání roztoku s obsahem endotoxinů k roztoku lyzátu vzniká ve směsi zákal, sraženina nebo gel. Rychlost reakce závisí na koncentraci endotoxinů, hodnotě pH a teplotě.

K reakci je nutná přítomnost některých dvojmocných iontů, pro-enzymatického srážecího komplexu a srážlivého proteinu, které jsou obsaženy v lyzátu.

V článcích jsou uvedeny požadavky na obsah bakteriálních endotoxinů jako limitní koncentrace endotoxinu; přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže má nejvýše limitní koncentraci endotoxinu. Splnění tohoto požadavku může být ale doloženo jedině důkazem, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu. Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje mikrobiální kontaminaci.

Před provedením zkoušky na endotoxiny se u zkoušeného vzorku ověří:

• zda použité zařízení neadsorpuje endotoxiny;

• citlivost lyzátu (λ);

• nepřítomnost interferujících faktorů.

Je-li třeba, očistí se laboratorní zařízení od endotoxinů.

Ve zkoušce se používají tato zkoumadla a referenční přípravek.

Referenční přípravek endotoxinu BRP. Je kalibrován v mezinárodních jednotkách porovnáním s mezinárodním standardem.

Lyzát z amébocytů limula. Lyzát se rozpustí podle návodu. U každé šarže se ověří deklarovaná citlivost (λ), jak je předepsáno v části Citlivost lyzátu.

Citlivost lyzátu je definována jako nejnižší koncentrace endotoxinu, při které dojde v podmínkách zkoušky ke vzniku pevného gelu, a vyjadřuje se počtem endotoxinových jednotek v mililitru.

Voda pro LAL. Voda má požadovanou jakost, jestliže v podmínkách předepsaných pro zkoušku na endotoxin ve zkoušeném přípravku dává negativní výsledek. Je možno ji připravit trojnásobnou destilací vody na přístroji vybaveném účinným zařízením, které zabraňuje hromadění kapek, nebo jinými prostředky dávajícími vodu požadované jakosti.

Kyselina chlorovodíková pro LAL 0,1 mol/l RS a hydroxid sodný pro LAL 0,1 mol/l RS. Připravují se z kyseliny chlorovodíkové R a hydroxidu sodného R a vody pro LAL. Obě látky jsou vhodné pro zkoušku, jestliže po úpravě pH na 6,5 až 7,5 dávají v podmínkách zkoušky negativní výsledek. Postup zkoušky

Pokud není stanoveno jinak, provádí se příprava roztoků pro zkoušku a jejich ředění vodou pro LAL.

Je-li třeba, upraví se pH zkoušeného roztoku kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l RS, hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l RS nebo vhodným tlumivým roztokem na hodnotu 6,5 - 7,5. Odpovídající objem lyzátu se nakape na vhodný povrch (např. podložní sklo nebo zkumavka) předmětů vyhřátých na teplotu (37 ± 1) °C. V dostatečně dlouhých intervalech umožňujících odečtení jednotlivých výsledků se k jednotlivým lyzátům přidá stejný objem zkoušeného roztoku a ihned se opatrně smíchá s lyzátem. Reakční směs se za vyloučení vibrací a odpařování vody inkubuje po konstantní dobu, která byla zjištěna experimentálně (obvykle 20 min až 60 min) a poté se odečtou výsledky. Jako pozitivní se hodnotí tvorba pevného gelu, který se nerozpadne při opatrném otočení nádoby. Výsledek je negativní, jestliže se takový gel nevytvoří.

Citlivost lyzátu. Připraví se nejméně čtyři sériová dvojnásobná ředění referenčního přípravku endotoxinu BRP tak, aby v jednotlivých ředěních byla dosažena koncentrace 2 X, X, 0,5 X a 0,25 X, kde X je deklarovaná citlivost použitého lyzátu. Alespoň v posledním ředění každé série musí být negativní výsledek. Zkouší se ředění a negativní kontrolní roztok, kterým je voda pro LAL, postupem uvedeným v části Postup zkoušky. Vypočítá se průměr logaritmů nejnižší koncentrace endotoxinu v každé sérii ředění, u které došlo k pozitivní reakci. Antilogaritmus tohoto průměru vyjadřuje citlivost lyzátu. Pokud se její hodnota neliší o více než o dvojnásobek od hodnoty deklarované, je citlivost ověřena a používá se ve všech zkouškách prováděných s tímto lyzátem.

Interferující faktory. Postupuje se stejně, jak je popsáno v části Citlivost lyzátu, ale připraví se ředění referenčního přípravku endotoxinu BRP v neošetřených vzorcích zkoušeného přípravku neobsahujících už zjistitelný endotoxin. Tyto vzorky se použijí v nejvyšším účinném ředění (MVD), které se vypočítá ze vzorce:

MVD=limitní koncentrace endotoxinucitlivost lyzátu

Obě hodnoty jsou vyjádřeny v mezinárodních jednotkách endotoxinu na mililitr.

Jestliže je limitní koncentrace endotoxinu v jednotlivém lékopisném článku uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru přípravku nebo v mezinárodní jednotce přípravku, vynásobí se limit endotoxinu koncentrací přípravku v zkoušeném roztoku (v miligramech na ml nebo v mezinárodních jednotkách zkoušeného přípravku na mililitr), aby se získala limitní koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru zkoušeného přípravku. Výše popsaný postup násobení se použije u roztoků připravených rozpuštěním podle návodu uvedeného na štítku.

Jestliže se citlivost lyzátu stanovená v přítomnosti zkoušeného přípravku neliší více než dvojnásobně od citlivosti stanovené bez přítomnosti zkoušeného přípravku, pak přípravek neobsahuje faktory, které interferují v experimentálních podmínkách, a může se zkoušet bez dalších úprav. Jinak se u přípravků, které způsobují inhibici nebo aktivaci, musí interferující faktory odstranit vhodným způsobem, jako je ředění, filtrace, neutralizace, dialýza nebo přidání látek schopných uvolnit adsorpované endotoxiny. Použití citlivějšího lyzátu umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a usnadňuje tak odstranění interference.

Ultrafiltraci je možno použít tehdy, jestliže interferující faktory procházejí filtrem s nominálním separačním limitem odpovídajícím relativní molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000. Je možno použít asymetrické membránové filtry z triacetatcelulosy, které se však musí přezkoušet na přítomnost složek způsobujících falešně pozitivní výsledky. Látky zachycené na filtru, které obsahují endotoxin, se opláchnou vodou pro LAL nebo vhodným tlumivým roztokem. Zkoušený objem a konečný objem pro zpětné uvolnění endotoxinu jsou přesně stanoveny pro každý zkoušený přípravek.

Pro ověření, že zvolený způsob účinně odstraňuje interferenci a přitom neodstraňuje endotoxiny, se zkouška na interferující vlivy opakuje s přípravkem, ke kterému se přidá referenční přípravek endotoxinu BRP, a použije se jeden ze způsobů na odstranění interferujících faktorů.

Stanovení endotoxinu ve zkoušeném vzorku. Pracuje se ve dvojicích, jak je popsáno v části Postup zkoušky, při použití maximálního účinného ředění zkoušeného přípravku, který byl ještě podroben některému ze způsobů odstranění interferujících faktorů. Zároveň se zkouší negativní kontrola složená z vody pro LAL a dvě pozitivní kontroly, které obsahují referenční přípravek endotoxinu BRP v koncentraci odpovídající dvojnásobku uvedené citlivosti lyzátu a z toho jedna obsahuj e zkoušený přípravek (podrobený, je-li třeba, postupu k odstranění interferujících faktorů po přidání referenčního endotoxinu) v koncentraci použité ve zkoušce. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže negativní a obě pozitivní kontroly dávají odpovídající výsledek.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže obě zkoušené směsi dávají negativní výsledek. Zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce, jestliže obě zkoušené směsi dávají pozitivní výsledek. Jestliže je pozitivní výsledek pouze v jedné zkoušené směsi a ve druhé negativní, zkouška se opakuje: zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže v obou zkoušených směsích je zjištěn negativní výsledek.

Následující část je uvedena pro informaci a jako návod; netvoří závaznou součást lékopisu.

Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice

• 1. Úvod

Endotoxiny pocházející z gramnegativních bakterií jsou nejčastější příčinou toxických reakcí přisuzovaných kontaminaci farmaceutických přípravků pyrogenními látkami: pyrogenní účinnost endotoxinů je mnohem vyšší než účinnost jiných pyrogenních látek. Endotoxiny jsou lipopolysacharidy. Ačkoli množství pyrogenních látek s odlišnou strukturou je malé, obecně platí, že nepřítomnost bakteriálních endotoxinů v přípravku je známkou absence pyrogenních složek za předpokladu, že lze vyloučit přítomnost neendotoxinových pyrogenních látek.

Přítomnost endotoxinů v přípravku může být zakryta faktory interferujícími s reakcí mezi amébocytárním lyzátem a endotoxiny. Proto analytik, chce-li nahradit zkoušku na pyrogenní látky na králících, která je požadována lékopisným článkem, zkouškou na endotoxin, prokáže, že přípravek lze zkoušet validovaným způsobem, který může obsahovat postup na odstranění interferujících faktorů.

Jak je uvedeno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, je třeba mít dostatečné informace o následujících aspektech dříve, než bude zkouška se vzorkem uznána za validovanou:

• 1.1 Prokáže se vhodnost materiálů ke zkoušce. Má se prokázat nepřítomnost endotoxinů ve vodě pro LAL a v ostatních zkoumadlech a má se ověřit citlivost lyzátu deklarovaná výrobcem.

• 1.2 Protože zkoušený přípravek může ve zkoušce interferovat, přezkouší se citlivost lyzátu v nepřítomnosti i v přítomnosti zkoušeného přípravku. Mezi oběma hodnotami citlivosti se nezjistí signifikantní rozdíl.

Zkouška na bakteriální endotoxin uvádí též způsob odstranění interferujících faktorů; v případě interference se provede další zkouška, aby se ověřilo, zda použitá metoda skutečně neutralizovala nebo odstranila interferenci.

Jestliže zkoušený vzorek nevyhovuje zkoušce, je možno zkoušku opakovat. Zřejmé nevyhovění přípravku požadavkům zkoušky může být způsobeno chybou v jeho přípravě nebo ředění nebo jinou náhodnou laboratorní kontaminací.

V této části jsou vysvětleny důvody pro požadavky obsažené ve zkoušce na bakteriální endotoxiny a potom je pojednáno o odečítání a interpretaci výsledků.

Nahrazení lékopisné zkoušky na pyrogenní látky prováděné na králících LAL-testem v podstatě představuje použití alternativní metody analýzy, a vyžaduje proto validaci. Některé pokyny k jejímu provedení jsou uvedeny v této části.

Použití kvantitativní metody pro stanovení koncentrace endotoxinu místo limitní zkoušky rovněž vyžaduje validaci, což bude diskutováno dále.

Ačkoli ve zkoušce na bakteriální endotoxiny je určen jako zdroj lyzátu druh Limulus polyphemus, je možno aktivní lyzát též získat z blízce příbuzných druhů, jako je rod Tachypleus. Výraz "amébocytární lyzát" se v textu používá pro označení validovaného amébocytárního lyzátu bez ohledu na jeho biologický původ.

• 1. Metoda

Ačkoliv přidání endotoxinů k roztoku amébocytárního lyzátu může vést ke vzniku zákalu, sraženiny nebo gelu, lékopisná zkouška používá ke zjištění limitu pouze gelovou metodu. Důvod je zčásti historický, zčásti je dán jednoduchostí rozhodnutí, zda zkoušený přípravek vyhovuje nebo nevyhovuje na základě vzniku nebo nepřítomnosti gelu. Kvantitativní metody založené na stupni zákalu nebo koncentraci barviva uvolněného z chromogenního peptidu se pro zkoušku kvality mohou upravit po validaci, což bude diskutováno dále.

Endotoxiny se mohou adsorpovat na povrch zkumavek nebo pipet z určitých plastů nebo typů skla. Uvolnění látek z plastických materiálů může vyvolat interferenci. Proto se mají používané materiály kontrolovat; složení následujících šarží zkumavek nebo pipet se mohou mírně lišit, a proto se doporučuje, aby laboratorní pracovník opakoval takové zkoušení u každé nové šarže materiálů.

Zatímco výsledky zkoušky na pyrogenní látky na králících jsou závislé na dávce pyrogenu, výsledky zkoušky na bakteriální endotoxiny závisí na koncentraci endotoxinu ve směsi. Rozhodnutí použít zkoušku na bakteriální endotoxin jako limitní zkoušku je dáno tím, že za prvé musí být definována prahová koncentrace endotoxinu pro zkoušený přípravek a za druhé analytik provádějící zkoušku má vědět, kdy je koncentrace endotoxinu v přípravku pod nebo nad hranicí této prahové hodnoty, a nikoliv zda koncentrace endotoxinu v produktu bude v jednotkách endotoxinu na objem, hmotnost nebo dávku.

Při stanovování prahové koncentrace endotoxinu u zkoušeného přípravku je nutno brát zřetel na lidskou dávku přípravku, s cílem mít jistotu, že pokud je koncentrace endotoxinu v přípravku pod prahovou hodnotou, pak výsledná maximální dávka podaná odpovídajícím způsobem za hodinu neobsahuje dostatečné množství endotoxinu k rozvoji toxické reakce.

Jestliže je koncentrace endotoxinu v přípravku přesně rovna prahové hodnotě, dojde ke vzniku gelu jako v případě, kdy je koncentrace endotoxinu mnohem vyšší a přípravek nevyhoví zkoušce, protože nelze rozlišit mezi koncentrací přesně se rovnající prahové koncentraci a mezi koncentrací vyšší. Pouze v případě, kdy nedojde ke vzniku gelu, může analytik rozhodnout, že koncentrace endotoxinu nepřesáhla koncentraci prahovou.

U pevných přípravků je třeba prahovou koncentraci endotoxinu na jednotku hmotnosti nebo mezinárodní jednotku přípravku převést na koncentraci endotoxinu v mililitru zkoušeného roztoku, neboť zkoušku lze provádět pouze u roztoků. Přípravky, které existují pouze v tekutém stavu, jako jsou infuzní roztoky, budou probrány později.

Stanovení prahové koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v jednotce přípravku (jednotka hmotnosti nebo mezinárodní jednotka) vyžaduje definovat:

M - maximální dávka přípravku pro dospělé vyjádřená v jednotkách hmotnosti nebo mezinárodních jednotkách na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu. Při stanovování maximální dávky pro dospělé má být použita hmotnost 70 kg pro dospělou osobu. Dětská dávka na kilogram hmotnosti za hodinu má být použita jen v případě, je-li vyšší než odpovídající dávka pro dospělé;

K - maximální dávka endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, kterou může pacient dostat předepsaným způsobem bez nevhodných účinků (tabulka 2.6.14-1).

Předpokládejme ke zkoušení roztok obsahující c mg (nebo mezinárodních jednotek) přípravku v mililitru. Potom objem M/c ml je objem obsahující maximální dávku M Jestliže tento objem obsahuje K mezinárodních jednotek endotoxinu, bude výsledek zkoušky pozitivní.

Proto limitní koncentrace endotoxinu (ELC) v mezinárodních jednotkách endotoxinu na mililitr, jež je shodná s prahovou koncentrací endotoxinu v miligramu nebo v mezinárodní jednotce přípravku v pevném stavu, je rovna:

ELC=K.cM.

K - nejvyšší přijatelná dávka endotoxinu v mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu,

c - koncentrace roztoku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách přípravku na mililitr,

M - maximální dávka přípravku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu.

U přípravků, které jsou již v tekuté formě, se vyjádří maximální dávka pro dospělého na kilogram hmotnosti za hodinu v mililitrech. Výše uvedené vyjádření maximální limitní koncentrace endotoxinu platí též pro přípravky, u nichž je uvedena maximální dávka v mililitrech na kilogram hmotnosti za hodinu nahrazením M a c hodnotou jedna.

Prahová koncentrace endotoxinu byla v minulosti definována jako maximální limitní koncentrace endotoxinu (MAEC). Avšak prakticky přípravek obsahující množství endotoxinu, které se rovná přesně MAEC, by nevyhověl zkoušce stejně jako přípravek obsahující endotoxinu více. Jediný způsob, jak se přesvědčit, že MAEC v přípravku nebyla překročena, je prokázat, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než MAEC; takže je mnohem logičtější používat termín limitní koncentrace endotoxinu (ELC) jako koncentraci endotoxinu, která nesmí být dosažena.

Limitní koncentrace endotoxinu závisí na druhu přípravku a jeho použití a je uvedena v jednotlivých článcích, do nichž je třeba nahlédnout. Hodnoty K jsou uvedeny v tabulce 2.6.14-1.

Tab. 2.6.14-1

Zamýšlený způsob podání	K v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu
intravenózní	5,0
intravenózní pro radiofarmaka	2,5
intratékální	0,2

Hodnota ELC ve výluhu jednorázových pomůcek nebo zdravotnických prostředků určených k implantaci závisí nejen na hodnotě K a M, ale též na přípravě výluhu. Pro patřičnou informaci je třeba prohlédnout specifický článek.

Které ředění přípravku se má použít ve zkoušce, aby byla naprostá jistota, že negativní výsledek zkoušky znamená, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než ELC a že pozitivní výsledek znamená, že lyzát detekoval alespoň ELC? Toto ředění závisí na ELC a na citlivosti lyzátu: označuje se jako maximální platné ředění (MVD) a tato hodnota se může vypočítat ze vzorce.

MVD=ELCλ=K.cM.λ,

v němž značí:

λ - uvedenou citlivost lyzátu v mezinárodních jednotách endotoxinu na mililitr.

Jestliže hodnota maximálního platného ředění není celým číslem, pak je možno pro rutinní účel zvolit odpovídající celé číslo nižší, než je MVD (čímž je míněna hodnota ředění roztoku přípravku nižší, než je udaná hodnota MVD). V tomto případě negativní výsledek zkoušky ukazuje, že koncentrace endotoxinu v přípravku se nachází pod hladinou limitní hodnoty. Je-li však koncentrace endotoxinu v přípravku v takovéto zkoušce nižší než ELC, ale dostatečně vysoká k tomu, aby při reakci s lyzátem došlo k tvorbě gelu, může být zkouška hodnocena za těchto podmínek jako pozitivní. Tudíž, je-li zkouška s tímto "vhodným" ředicím faktorem pozitivní, je nutno přípravek ředit na MVD a zkoušku opakovat. V jakémkoli případě pochybností nebo sporu musí být použito MVD.

To zdůrazňuje důležitost potvrzení citlivosti lyzátu.

Příklad

Zkouší se roztok sodné soli fenytoinu obsahující 50 mg/ml (zamýšlený pro intravenózní podání). Stanoví se MVD za použití následujících proměnných:

M- maximální lidská dávka = 15 mg na kilogram hmotnosti za hodinu,

c - 50 mg/ml,

K - množství endotoxinu na kilogram za hodinu v mezinárodních jednotkách,

λ- 0,4 m.j. endotoxinu na mililitr.

Řešení:

ELC=K.cM=5.5015

MVD=ELCλ=5.5015.10,4=41,67

Pro rutinní zkoušení tohoto přípravku je vhodné ředit 1 ml roztoku ke zkoušce na 20 ml (MVD/2 zaokrouhleno na nejbližší menší celé číslo). Je-li však zkouška pozitivní, bude analytik muset ředit 1 ml na 41,67 ml a opakovat zkoušku. Ředění na 41,67 ml je rovněž nutné, jestliže se zkoušením má vyřešit sporný výsledek.

• 1. Referenční materiál

Referenční přípravek endotoxinu BRP je určen pro použití jako porovnávací přípravek. Byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru. Mezinárodní jednotka endotoxinu je definována jako specifická účinnost obsažená v definovaném množství mezinárodního standardu.

Pro rutinní účely je možno použít jiný přípravek endotoxinu, jestliže byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu nebo endotoxinu BRP, a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu.

Jedna ampule referenčního přípravku obvykle obsahuje větší množství, než je množství potřebné pro jednu zkoušku, a analytik potřebuje vědět, jak dlouho lze obsah otevřené ampule používat. Pokles účinnosti nebyl pozorován v ampulích, které byly otevřeny v laminárním boxu, uzavřeny vhodným materiálem a dva týdny skladovány při +4 °C. Analytik samozřejmě musí určit účinnost takovéto ampule při rutinním laboratorním režimu, je-li odkázán na prodloužené používání otevřené ampule.

• 1. Voda pro LAL

Zkoušení na nepřítomnost endotoxinu v této látce zkouškou na pyrogenní látky na králíku bylo vyloučeno z praktických a teoretických důvodů:

• králík není dostatečně citlivý, aby mohl detekovat endotoxin ve vodě pro LAL, určené ke zkoušení přípravků s velice nízkou limitní koncentrací endotoxinu;

• relativně nízká přesnost teplotní odpovědi u králíka vede k opakování na mnoha králících;

• termíny "pyrogenní látky" a "endotoxiny" označují skupiny látek, které nejsou zcela totožné.

Text zkoušky na bakteriální endotoxin ukazuje, že i jiná metoda, než je trojnásobná destilace, se může použít k přípravě vody LAL. Reverzní osmóza byla použita s dobrým výsledkem; někteří analytici mohou dávat přednost vodě destilované více než třikrát. V každém případě použitá metoda musí zaručit, že výsledný produkt je prost zjistitelného endotoxinu.

• 1. Hodnota pH směsi

Ve zkoušce na bakteriální endotoxin dochází ke vzniku gelu nejvhodněji při pH 6,0 až 7,5. Při přidání lyzátu ke vzorku může však dojít k poklesu pH. Proto, aby byla jistota, že pH směsi není nižší než 6,0, má se analytik přesvědčit o tom, že hodnota pH zkoušeného vzorku není nižší než 6,5.

• 1. Validace lyzátu pro použití v limitní gelové metodě

Při přípravě roztoku lyzátu je důležité se řídit návodem výrobce.

Pozitivní ředicí faktory se převedou na logaritmy. Důvodem toho graficky znázorněné rozložení četnosti těchto logaritmických hodnot dává obvykle normální distribuční křivku mnohem vyrovnanější, než je distribuční rozložení ředicích faktorů jako takových; v podstatě jde o tak podobné hodnoty, že je přijatelné použít normální frekvenční distribuci jako matematický model a stanovit interval spolehlivosti Studentovým t-testem.

• 1. Předběžná zkouška na interferující faktory

Některé přípravky nelze přímo zkoušet na přítomnost endotoxinu, protože je nelze smíchat se zkoumadly, nelze u nich upravit hodnotu pH v rozmezí 6,5 až 7,5 nebo inhibují nebo aktivují tvorbu gelu. Proto je nutno provést předběžnou zkoušku na zjištění přítomnosti interferujících faktorů: jsou-li nalezeny, pak analytik prokáže, že postup použitý k jejich odstranění byl dostatečně účinný.

Předmětem předběžného zkoušení je nulová hypotéza, že citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného přípravku se signifikantně neliší od citlivosti lyzátu bez přítomnosti vzorku. Jednoduché kritérium je použito v obecné metodě: nulovou hypotézu lze přijmout, jestliže citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného vzorkuje nejméně polovina a nejvýše dvojnásobek citlivosti lyzátu samotného.

Klasickým způsobem se stanoví průměrné hodnoty logaritmů ředicích faktorů lyzátu pro citlivost s přípravkem a bez něho a vypočítá se rozdíl mezi oběma průměrnými hodnotami Studentovým t-testem.

• 1. Odstranění interferujících faktorů

Postup k odstranění interference nesmí ani zvyšovat ani snižovat množství endotoxinu ve zkoušeném přípravku (např. nesmí dojít ke snížení vlivem adsorpce). Správný způsob jak toto ověřit je, že se do zkoušky zařadí vzorek přípravku, ke kterému se přidá známé množství endotoxinu, a poté se měří zpětně koncentrace endotoxinu.

Ukazálo se, že v mnoha případech je dostatečně účinná ultrafiltrace přípravku na asymetrických membránových celuloso-triacetátových filtrech. Filtry mají být patřičně validovány, protože v některých případech mohou deriváty celulosy (β-D-glykany) způsobovat falešně pozitivní výsledky.

Polysulfonové filtry, uvedené v dřívějším textu, byly shledány nevhodnými, protože někteří uživatelé při jejich použití získali falešně pozitivní výsledky.

• 1. Poslání kontrol

Účelem kontroly vody pro LAL a referenčního přípravku endotoxinu ve dvojnásobné koncentraci, než je vyznačená citlivost lyzátu, je ověřit aktuální citlivost lyzátu v podmínkách zkoušky. Účelem negativní kontroly je ověřit nepřítomnost měřitelné koncentrace endotoxinu ve vodě pro LAL.

Druhá pozitivní kontrola, která obsahuje zkoušený přípravek v koncentraci použité ve zkoušce, je zařazena proto, aby byla prokázána nepřítomnost interferujících faktorů v průběhu a v podmínkách prováděné zkoušky.

• 1. Hodnocení a interpretace výsledků

Jak je uvedeno v úvodním odstavci textu, zkouška s lyzátem z amébocytů se používá jako limitní test a stanovení limitu závisí na popsaných faktorech. Nepatrné množství endotoxinu ve vodě pro LAL nebo v některém jiném zkoumadle nebo materiálu, jemuž je vystaven lyzát při zkoušce, nemusí být zjištěno, pokud nedosáhne limitu citlivosti lyzátu. Může však zvyšovat množství endotoxinu v roztoku se zkoušeným přípravkem právě na hranici hodnoty citlivosti lyzátu a způsobovat pozitivní reakci.

Riziko tohoto případu lze snížit přezkoušením vody pro LAL a ostatních zkoumadel a materiálů s co nejcitlivějším lyzátem, který je dostupný, nebo s takovým, který je mnohem citlivější, než je lyzát použitý pro zkoušený přípravek. Ani takto nelze zcela vyloučit riziko falešně pozitivního výsledku. Tento postup by měl být zařazen, aby byla zajištěna bezpečná interpretace výsledků oproti případu falešně negativního testu, který může vést k propuštění nevyhovujícího přípravku ohrožujícího zdraví pacienta.

• 1. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících předepsané v lékopisném článku

O použití zkoušky s lyzátem z amébocytů lze uvažovat i u lékopisného přípravku, pro který je předepsána zkouška na pyrogenní látky na králících. Obecné stanovisko k použití alternativní metody namísto lékopisné je uvedeno v Obecných zásadách (1.2).

"Popsané zkoušky na čistotu a stanovení jsou oficiální metody, na nichž je založena standardnost lékopisu. Se souhlasem příslušné autority lze při kontrole použít alternativní analytické metody za předpokladu, že užitými metodami se dosáhne shodného výsledku jako s ustanoveními v článku, jestliže by byla použita oficiální metoda. V případě pochybnosti nebo sporného výsledku je lékopisná metoda jako jediná rozhodující".

Jako směrnice jsou doporučeny následující postupy:

• 11.1 Postupy, materiály a zkoumadla používané ve zkoušce s lyzátem z amébocytů mají být validovány, jak je popsáno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny.

• 11.2 Přítomnost interferujících faktorů (a je-li to třeba, postupy k jejich odstranění) se prověří na vzorkách nejméně ze tří výrobních šarží.

• 11.3 Jestliže jsou dostupné vzorky z výrobní šarže, které ve zkoušce na pyrogenní látky na králících byly pozitivní, měly by se také přezkoušet na bakteriální endotoxiny. Nejsou-li tyto vzorky dostupné, pak je rozhodující zkouška na pyrogenní látky a zkouška na bakteriální endotoxiny je zbytečná.

• 1. Validace zkoušky pro nové přípravky

Postup uvedený v části 11.1 a 11.2 se použije u všech nových přípravků pro parenterální podání, které se mají zkoušet na přítomnost bakteriálních endotoxinů podle požadavků lékopisu.

• 1. Nové přípravky ovlivňující tělní teplotu

Jestliže se u nového přípravku během jeho vývoje ukáže, že by mohl ovlivňovat tělní teplotu, je možno použít zkoušku na bakteriální endotoxiny k důkazu jejich nepřítomnosti. V tomto případě se postupuje, jak je uvedeno v části 11.1 a . Avšak jsou-li patrny známky kontaminace přípravku neendotoxinovými pyrogenními látkami, je nutno získat podklady z mnohem rozsáhlejšího zkoušení.

• 1. Kvantitativní stanovení endotoxinů

Stávající text zkoušky na bakteriální endotoxiny se zabývá podmínkami pro limitní zkoušku s tvorbou gelu jako krajním bodem. Kvantitativní stanovení endotoxinů založené na vzniku zákalu nebo na štěpení chromogenního peptidu komplexem endotoxin-lyzát jsou již dnes dostupná i pro rutinní zkoušení. Rozeznávají se čtyři metody na kvantitativní stanovení:

• 1. Zákalová metoda stanovení v konečném bodě: zákal ve vzorku se měří po dosažení vrcholu;

• 1. Kinetická zákalová metoda: měří se rychlost vývoje zákalu;

• 1. Chromogenní peptidová metoda stanovení v konečném bodě: komplex endotoxin-lyzát štěpí chromogenní peptid a koncentrace uvolněného barviva se měří jako indikátor koncentrace endotoxinu;

• 1. Kinetická chromogenní peptidová metoda: měří se rychlost vzniku zbarvení po rozštěpení chromogenního peptidu a to je indikátorem koncentrace endotoxinů.

Obě metody stanovení v konečném bodě se obvykle provádějí s koncentrací lyzátu, která je ve srovnání s koncentrací endotoxinu vyšší. Jako výsledek lze považovat odpověď, která vyjadřuje koncentraci endotoxinu jako lineární funkci s tím, že tato koncentrace nepřesáhne horní limit. Odpovídajícím matematickým modelem je model poměru sklonů.

V obou kinetických metodách je možno logaritmus reakčního času považovat za lineární funkci logaritmu koncentrace endotoxinu. Proto je v tomto případě odpovídajícím matematickým modelem model rovnoběžnosti.

Nyní je limitní gelový test na bakteriální endotoxin oficiální metodou lékopisu. Pracovník, který hodlá použít některou ze čtyř výše uvedených kvantitativních metod, prokáže, že tato alternativní metoda splní požadavky uvedené v úvodu všeobecné části (viz část 11, "Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících předepsané v lékopisném článku).

Nejprve je nutno prokázat, že metoda splňuje požadavky pro lineární regresi:

• dostatečný sklon,

• nevýznamné odchylky od lineárního průběhu.

Pro metodu stanovení v konečném bodě je ještě požadavek, aby se rozdíly mezi naměřenými hodnotami blížily nule.

Dodatek Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek (5.3) obsahuje informace o statistických postupech, jež se mají použít na tyto zkoušky.

Je nepravděpodobné, že by přesnost kterékoli z kvantitativních metod byla nižší, než je limit pro gelovou zkoušku. Předešlá směrnice FD A "Draft guideline on the validation of the Limulus amoebocyte lysáte test" určuje horní limit 0,3654 v dekadickém logaritmu pro standardní odchylku pro limitní koncentraci v gelovém testu. Pokud reziduální chyba kvantitativní metody tento limit nepřekročí, je nepravděpodobné, že přesnost bude nedostatečná.

Může nastat pět druhů situací, ve kterých má analytik prokázat platnost kvantitativní metody:

• 1. vzrůst teploty způsobený novým přípravkem při jeho vývoji;

• 1. průkaz, že použitá zkoumadla a materiály neobsahují endotoxin;

• 1. průkaz, že zkoušený přípravek neinterferuje se zkouškou na bakteriální endotoxiny nebo, jestliže interferuje, že kroky použité k odstranění interference jsou dostatečné;

• 1. validace citlivosti metody;

• 1. rutinní zkoušení šarží přípravku po předchozích typech zkoušky bylo ukončeno jako uspokojivé.

V prvním případě je postup popsaný v části 12 "Validace zkoušky pro nové přípravky" a 13 "Nové přípravky ovlivňující tělní teplotu" přijatelný. Avšak, jestliže byl limit pro nový přípravek validován v gelovém limitním testu, pak je nepravděpodobné, že kvantitativní metodou by bylo dosaženo jiného závěru.

V situacích 2 a 3 je nutno pamatovat na to, že obě metody používající chromogenní peptid vyžadují zkoumadla, která se nepoužívají v gelové limitní zkoušce, a tudíž vyhovuje-li limitní gelová zkouška požadavkům, nelze to vztáhnout na chromogenní peptidovou metodu bez dalšího přezkoušení. Navrhuje se provést zkoušku na interferenci nejméně na třech výrobních šaržích zkoušeného přípravku.

V situaci 4 se doporučuje, aby analytik ověřil citlivost metody s metodou, kterou hodlá použít, a to obzvlášť v případě, použije-li lyzát, který nebyl přesně vyvinut pro stejný typ kvantitativní zkoušky.