Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

V situaci 5 se jedná o podobný případ uvedený v části 12 "Validace zkoušky pro nové přípravky".

• 2.6.15 Aktivátor prekalikreinu

Podstata zkoušky. Aktivátor prekalikreinu aktivuje štěpení prekalikreinu na kalikrein. Štěpí též chromofor ze syntetického polypeptidického substrátu a rychlost štěpení je měřitelná spektrofotometricky. Koncentrace zkoušeného přípravku se vypočítá porovnáním s referenčním přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v určitém množství mezinárodního standardu, který pozůstává z lyofílizovaného aktivátoru prekalikreinu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Příprava substrátu prekalikreinu. Krev nebo plazma pro přípravu prekalikreinu může přijít do styku pouze s plastem nebo sklem, jehož povrch je silikonovaný, činu se zabrání aktivaci srážení.

Devět objemových dílů lidské krve se smíchá s 1 objemovým dílem antikoagulačního roztoku (ACD, CPD nebo roztoku citronanu sodného R, 38 g/l), do kterého se přidá 1 mg hexadimethriniumdibromidu A na 1 ml. Po odstředění směsi při 3600 gn po dobu 5 min se oddělí plazma a znovu se 20 min odstřeďuje při 6000 gn, aby sedimentovaly destičky. Po oddělení se plazma chudá na destičky 20 h dialyzuje proti desetinásobnému objemu tlumivého roztoku A. Dialyzovaná plazma se nanese na chromatografickou kolonu obsahující agarosu-DEAE pro výměnnou iontovou chromatografii R. Agarosa se nejprve uvede do rovnováhy s tlumivým roztokem A. Objem nabobtnalého gelu je dvakrát větší než objem plazmy. Eluce z kolony tlumivým roztokem A probíhá rychlostí 20 ml/cm^2/h. Eluát se shromažďuje do frakcí a zaznamenává se jejich absorbance při 280 nm (2.2.25). Spojují se a zachycují frakce, které obsahují bílkovinu zobrazenou na záznamu jako první pík. Jejich objem je asi 1,2krát větší než objem plazmy chudé na destičky.

Spojený objem substrátu se zkouší na nepřítomnost aktivity kalikreinu tak, že se 1 objemový díl smíchá s 20 objemovými díly předehřátého roztoku chromogenního substrátu, jenž se použije při stanovení, a směs se inkubuje 2 min při 37 °C. Substrát je vhodný, jestliže vzrůst absorbance za minutu je menší než 0,001. Ke spojenému objemu substrátu se přidá chlorid sodný R (7 g/l) a filtruje se membránovým filtrem (o velikosti pórů 0,45 μm). Filtrát se rozdělí na části, které se dají zmrznout, a uchovávají při -25 °C. Substrát se může též lyofilizovat.

Postup od začátku chromatografie po zmrazení v rozdělených částech se provede v průběhu jednoho pracovního dne.

Postup zkoušky. Stanovení je výhodné provádět na automatickém enzymovém analyzátoru při 37 °C a nastavit objemy, koncentrace substrátů a inkubační doby tak, aby rychlost reakce probíhala lineárně alespoň do 35 m.j./ml. Porovnávací roztoky, zkoušené roztoky a substrát prekalikreinu se, je-li to nutné, mohou ředit tlumivým roztokem B.

Zředěné porovnávací roztoky nebo zkoušené roztoky se 10 min inkubují se substrátem prekalikreinu. Je nutné, aby objem nezředěného vzorku nebyl vyšší než 1/10 celkového objemu inkubační směsi. Tím se vyloučí chyby způsobené změnami iontové síly a pH inkubační směsi. Směs nebo její část se inkubuje s nejméně stejným objemem roztoku vhodného syntetického chromogenního substrátu, o kterém je známo, že je specifický pro kalikrein (např. N-benzoyl-L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-(4-nitrofenyl)amoniumacetat R nebo D-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-nitroanilid dihyd-rochloridu R), rozpuštěného v tlumivém roztoku B. Zapisuje se rychlost změny absorbance za minutu po dobu 2 min až 10 min při vlnové délce specifické pro použitý substrát. Pro každou směs zkoušeného nebo referenčního přípravku se připraví kontrolní tekutina, která místo substrátu prekalikreinu obsahuje tlumivý roztok B.

Zjištěné změny absorbance za minutu se korigují odečtením odpovídající změny absorbance za minutu u kontrolní tekutiny. Pro referenční přípravek se vynese kalibrační křivka, která zobrazuje závislost korigovaných výsledků změny absorbance za minutu na koncentracích. Tato křivka se použije pro stanovení účinnosti prekalikreinového aktivátoru ve zkoušeném vzorku.

Tlumivý roztok A

trometamol R	6,055 g
chlorid sodný R	1,17 g
hexadimethriniumdibromid R	50 mg
azid sodný R	0,100 g

Chemikálie se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l RS na 8,0 a zředí se vodou R na 1000 ml.

Tlumivý roztok B

trometamol R	6,055 g
chlorid sodný R	8,77 g

Chemikálie se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l RS na 8,0 a zředí se vodou R na 1000 ml.

• 2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách

Pokud tyto zkoušky vyžadují nejprve neutralizaci viru, použijí se specifické protilátky, které nejsou humánního ani opičího původu: jestliže byl virus pomnožen na tkáni ptačího původu, nemohou to být ani protilátky ptačího původu. K přípravě antiséra se užívá imunizační antigen připravený na buněčné kultuře z odlišného druhu, než je kultura užívaná pro přípravu vakcíny, a prosté cizích agens. Jestliže je předepsáno použití SPF vajec, tato vejce odpovídají požadavkům předepsaným ve stati Chovy kuřat prostých specifikovaných patogenů, která jsou určena pro výrobu a kontrolu jakosti očkovacích látek (5.2.2).

Virové inokulum

Vzorky inokula se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovávají se při teplotě nižší než -40 °C.

Dospělé myši. Každé z nejméně deseti dospělých myší o hmotnosti 15 g až 20 g se vstříkne intracerebrálně 0,03 ml a intraperitoneálně 0,5 ml inokulačního viru. Myši se pozorují nejméně 21 dní. U všech myší uhynulých po prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti dospělým myším, které se pozorují 21 dní. Inokulační virus vyhovuje, jestliže žádná myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulačnímu viru. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných myší.

Sající myši. Každé z nejméně dvaceti myší mladších než 24 h se vstříkne intracerebrálně 0,01 ml a intraperitoneálně 0,1 ml inokulačního viru. Myši se pozorují denně nejméně 14 dní. U všech myší uhynulých po prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti sajícím myším, které se denně pozorují 14 dní. Inokulační virus vyhovuje, jestliže žádná sající myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulačnímu viru. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných sajících myší.

Morčata. Nejméně pěti morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se vstříkne intraperitoneálně po 5 ml inokulačního viru. Zvířata se sledují nejméně 42 dní, aby se odhalily všechny příznaky nemoci. U všech zvířat, která po prvních 24 h uhynou nebo která mají příznaky nemoci, se provede pitva s makroskopickým vyšetřením; tkáně se vyšetří mikroskopicky a kultivačně na přítomnost infekce. Zvířata, která přežila dobu pozorování, se usmrtí a vyšetří se stejným způsobem. Inokulační virus vyhovuje, jestliže žádné morče nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulačnímu viru. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných morčat.

Inokulační virus a virus sklizený

Vzorky se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovají se při teplotě nižší než -40 °C.

Bakteriální a houbová sterilita. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Mykoplazmata (2.6.7). 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata; pokud nebyl při výrobě použit substrát ptačího původu, provede se pouze zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata.

Mykobakterie (2.6.2). 5 ml vzorku se zkouší na přítomnost Mycobacterium spp. kultivačními metodami uznanými za citlivé pro detekci těchto organismů.

Zkoušky na jiná cizí agens na tkáňových kulturách. Množství vzorku, jestliže není předepsáno jinak, které odpovídá 500 lidských dávek nebo 50 ml vakcíny, podle toho, co je více, se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk kontinuální linie opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže virus rostl na lidských diploidních buňkách, neutralizovaný sklizený virus se také zkouší na oddělené kultuře diploidních buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než lidském nebo opičím, naočkují se také buňky tohoto druhu z oddělené kultury. Tyto buňky se kultivují při (36 ± 1) °C a prohlížejí se 14 dní. Inokulační virus nebo sklizený virus vyhovují, jestliže žádná z buněčných kultur nevykazuje známky přítomnosti jakéhokoli cizího agens, jež nelze přičíst náhodné kontaminaci. Zkoušku lze hodnotit, jestliže přežívá nejméně 80 % buněčných kultur.

Ptačí viry (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Neutralizuje se množství vzorku odpovídající buď 100 lidským dávkám, nebo 10 ml, podle toho, co je více. Na jedno kuřecí embryo se použije 0,5 ml, inokuluje se skupina oplozených SPF vajec, 9 až 11 dní starých, alantoidní cestou a druhá skupina, 5 až 7 dní starých, do žloutkového vaku. Inkubuje se 7 dní. Inokulační virus nebo sklizený virus vyhovují, jestliže alantoidní tekutiny ani tekutiny žloutkového vaku nevykazují přítomnost hemaglutinačního agens a jestliže všechna embrya a chorioalantoidní membrány, makroskopicky vyšetřené, jsou normální. Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % embryí přežije 7 dní.

Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky

Aby se ověřila nepřítomnost virů způsobujících cytopatickou degeneraci, posuzují se kontrolní buňky mikroskopicky buď po celou dobu inkubace, nebo 14 dní od naočkování výrobních nádob, podle toho, která doba je delší. Zkoušku lze hodnotit, jestliže pozorovací období přežije nejméně 80 % kontrolních kultur.

Po 14 dnech nebo v čase poslední sklizně, podle toho, které období je delší, se provedou níže popsané zkoušky.

Zkouška na hemadsorbující viry. Nejméně 25 % kontrolních kultur se zkouší na přítomnost hemadsorbujících virů přidáním morčecích červených krvinek. Jestliže jsou morčecí krvinky skladovány, uchovávají se nejdéle 7 dní při (5 ± 3) °C. Polovina kultur se odečítá po 30 min inkubace při (5 ± 3) °C, druhá polovina po 30 min inkubace při 20 °C až 25 °C. Nezjistí se přítomnost hemadsorbujících agens.

Zkouška na jiná cizí agens v tkáňových kulturách. Směs supernatantních tekutin z kontrolních buněk se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než lidském nebo opičím, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z oddělené kultury. V každém buněčném systému se zkouší nejméně 5 ml. Naočkované kultury se inkubují při (36 ± 1) °C a pozorují se 14 dní. Nezjistí se přítomnost cizího agens.

Viry ptačí leukózy (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Zkouška na viry ptačí leukózy se provede s 5 ml supernatantní tekutiny z kontrolních buněk.

Kontrolní vejce

Hemaglutinační agens. 0,25 ml alantoidní tekutiny z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutinačního agens přímým smísením s kuřecími červenými krvinkami a po pasáži na SPF vejcích se postupuje takto: 5 ml vzorku ze směsi amniových tekutin z kontrolních vajec se naočkuje po 0,5 ml do alantoidních dutin a do amniových dutin SPF vajec. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže v následujících dvou zkouškách nejsou nalezeny známky přítomnosti hemaglutinačních agens.

Viry ptačí leukózy. Použije se 10 ml směsné amniové tekutiny z kontrolních vajec. Provede se rozhojnění pěti pasážemi na buněčných kulturách z kuřecích embryí, které prokazatelně neobsahují viry ptačí leukózy; zkouška na přítomnost ptačí leukózy se provede použitím buněk z páté pasáže. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se zkouškou neprokážou žádné známky přítomnosti viru ptačí leukózy.

Ostatní cizorodá agens. 5 ml směsné amniotické tekutiny z kontrolních vajec se naočkuje do lidských a opičích buněčných kultur. Buněčné kultury se sledují 14 dní. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže není nalezena přítomnost cizích agens. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % naočkovaných kultur.

• 2.6.17 Zkouška antikomplementární účinnosti imunoglobulinu

Podstata zkoušky. Pro měření antikomplementární účinnosti (ACA) imunoglobulinu se inkubuje definované množství zkoušeného materiálu (10 mg imunoglobulinu) s definovaným množstvím morčecího komplementu, které je 20 CH50 a stanoví se zbývající komplement. Antikomplementární účinnost je vyjádřena jako procenta spotřeby komplementu vzhledem ke kontrole komplementu, která je 100 %.

Hemolytická jednotka účinnosti komplementu (CH50) je množství komplementu, které za daných podmínek reakce způsobí lýzu 2,5.10^8 z celkových 5.10^8 optimálně senzibilizovaných erytrocytů. Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého R a 5,083 g chloridu horečnatého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného R a 25,48 g barbitalu sodné soli R se rozpustí ve 4000 ml vody R a upraví se hodnota pH kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního roztoku hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml. Zfiltruje se membránovým filtrem (póry velikosti 0,22 μm) a uchovává se ve skleněných nádobách při 4 °C.

Roztok želatiny. 12,5 g želatiny R se rozpustí v asi 800 ml vody R a zahřeje se na vodní lázni k varu. Ochladí se na 20 °C a zředí vodou R na 10 l. Filtruje se membránovým fitrem (póry velikosti 0,22 pm). Uchovává se při 4 °C. Používá se jen čirý roztok.

Citronanový roztok. 8,0 g citronanu sodného R, 4,2 g chloridu sodného R a 20,5 g glukosy R se rozpustí v 750 ml vody R. Roztokem kyseliny citrónové R (100 g/l) se upraví hodnota pH na 6,1 a zředí se vodou R na 1000 ml.

Tlumivý roztok želatino-barbitalový. Smíchají se 4 objemové díly roztoku želatiny a 1 objemový díl zásobního tlumivého roztoku barbitalového. Je-li to nutné, upraví se hydroxidem sodným 1 mol/l RS nebo kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS pH na hodnotu 7,3. Uchovává se při 4 °C. Denně se připravuje čerstvý roztok.

Stabilizovaná beraní krev. Odebere se 1 objemový díl beraní krve do 1 objemového dílu citronanového roztoku a promíchá se. Uchovává se při 4 °C nejméně 7 dní a nejvýše 28 dní. (Stabilizovaná beraní krev a beraní erytrocyty jsou dostupné od řady výrobců).

Hemolyzin. Antisérum proti beraním erytrocytům připravené na králících. (Taková antiséra jsou dostupná od řady výrobců.)

Morčecí komplement. Připraví se směs sér z krve alespoň deseti morčat. Ze sražené krve se sérum oddělí odstřeďováním při asi 4 °C. Sérum se uchovává v malých objemech při teplotě nižší než - 70 °C.

Metoda

Příprava standardizované 5% suspenze beraních erytrocytů. Erytrocyty se odstřeďováním oddělí z přiměřeného objemu stabilizované beraní krve; buňky se nejméně třikrát promyjí tlumivým roztokem želatino-barbitalovým a připraví se 5% suspenze (V/V) v tomto roztoku. Měření koncentrace buněk v suspenzi se provádí takto: 0,2 ml se převede do 2,8 ml vody R a lyžovaný roztok se odstřeďuje 5 min při 1000 gn Koncentrace buněk vyhovuje, jestliže absorbance (2.2.25) vrchní vrstvy měřená při 541 nm je 0,62 ± 0,01. Úprava koncentrace buněk se provádí přidáním tlumivého roztoku želatino-barbitalového podle vzorce:

Vf=Vi.A0,62,

v němž značí:

Vf - konečný připravovaný objem,

Vi - počáteční objem,

A - absorbanci původní suspenze při 541 nm.

Upravená suspenze obsahuje asi 1 x 109 buněk v 1 ml.

Titrace hemolyzinu. Schéma přípravy ředění hemolyzinu je uvedeno v tabulce 2.6.17-1.

Do každé zkumavky, počínaje ředěním 1 : 75, se dá 1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů a promíchá se. Inkubuje se 30 min při 37 °C. Z každé zkumavky takto inkubované směsi se odeberou 0,2 ml do nové zkumavky, přidá se 1,10 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,2 ml ředěného morčecího komplementu (např. 1 : 150). Provádí se dvojmo.

Jako nehemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky s 1,4 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů.

Jako plně hemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky s 1,4 ml vody R a 0,1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů.

Tab. 2.6.17-1

| Požadované ředění hemolyzinu | Připraveno za použití | | | | tlumivý roztok želatino-barbitalový | | hemolyzin | | | objem (ml) | Ředění 1 : | objem (ml) | | | --- | --- | --- | --- | | 7,5 | 0,65 | neředěno | 0,1 | | 10 | 0,90 | neředěno | 0,1 | | 75 | 1,80 | 7,5 | 0,2 | | 100 | 1,80 | 10 | 0,2 | | 150 | 1,00 | 75 | 1,0 | | 200 | 1,00 | 100 | 1,0 | | 300 | 1,00 | 150 | 1,0 | | 400 | 1,00 | 200 | 1,0 | | 600 | 1,00 | 300 | 1,0 | | 800 | 1,00 | 400 | 1,0 | | 1200 | 1,00 | 600 | 1,0 | | 1600 | 1,00 | 800 | 1,0 | | 2400 | 1,00 | 1200 | 1,0 | | 3200 | 1,00 | 1600 | 1,0 | | 4800 | 1,00 | 2400 | 1,0 |

^* Odstraní se 1 ml směsi.

Všechny zkumavky se inkubují 60 min při 37 °C a odstřeďují se 5 min při 1000 gn. Změří se absorbance (2.2.25) vrchních vrstev při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy v každé zkumavce v procentech ze vzorce:

Aa-A1Ab-A1·100,

v němž značí:

Aa - absorbanci zkumavek s ředěným hemolyzinem,

Ab - průměr absorbanci tří zkumavek s plnou hemolýzou,

A1 - průměr absorbanci tří zkumavek bez hemolýzy.

Sestrojí se lineární graf: na ordinátu se nanese procentuální stupeň hemolýzy, na abscisu odpovídající převrácená hodnota ředění hemolyzinu. Z grafu se určí optimální ředění hemolyzinu. Vybere se to ředění, kde již další vzestup obsahu hemolyzinu nezpůsobuje patrné změny ve stupni hemolýzy. Toto ředění je 1 minimální hemolytická jednotka (1 MHU) v 1,0 ml. Optimální hemolytické ředění hemolyzinu pro přípravu senzibilizovaných beraních erytrocytů obsahuje 2 MHU v mililitru.

Titrace hemolyzinu není hodnotitelná, jestliže maximum hemolýzy není mezi 50 % a 70 %. Není-li maximum v tomto rozmezí, je nutno titraci opakovat s více nebo méně ředěným roztokem komplementu.

Příprava optimálně senzibilizovaných beraních erytrocytů (hemolytický systém). Připraví se vhodný objem ředěného hemolyzinu, který obsahuje 2 MHU v mililitru a stejný objem standardizované 5% suspenze beraních erytrocytů. Ke standardizované buněčné suspenzi se přidá ředěný hemolyzin a smíchá se.Inkubuje se 15min při 37 °C,uchovává se při 2°C až 8°C a použije se do 6h.

Titrace komplementu. Připraví se vhodné ředění komplementu (např. 1 : 250) tlumivým roztokem želatino-barbitalovým a provede se dvojmo titrace podle tabulky 2.6.17-2.

Tab. 2.6.17-2

Číslo zkumavky	Objem ředěného komplementu v ml (např. 1 : 250)	Objem tlumivého roztoku želatino-barbitalového v ml
1	0,1	1,2
2	0,2	1,1
3	0,3	1,0
4	0,4	0,9
5	0,5	0,8
6	0,6	0,7
7	0,7	0,6
8	0,8	0,5
9	0,9	0,4
10	1,0	0,3
11	1,1	0,2
12	1,2	0,1
3 zkumavky s 0% hemolýzy	-	1,3
3 zkumavky se 100% hemolýzou	-	1,3 ml vody

Do každé zkumavky se přidá 0,2 ml senzibilizovaných beraních erytrocytů, dobře se promíchá a inkubuje se 60 min při 37 °C. Zkumavky se potom ochladí v ledové lázni a odstřeďují se 5 min při 1000 g. Změří se absorbance vrchní vrstvy při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy (F) ze vzorce:

Ac-A1Ab-A1,

v němž značí:

Ac - absorbanci zkumavek 1 až 12,

Ab - průměr absorbanci zkumavek se 100% hemolýzou,

A1 - průměr absorbanci buněčných kontrol s 0% hemolýzou.

Na logaritmický papír se vynese Y/(1 - Y) jako abscisa proti obsahu ředěného komplementu v mililitru jako ordináta. Body se co nejlépe proloží křivka a určí se ordináta pro 50% hemolytickou dávku komplementu, kde Y/(1 - Y) = 1,0. Vypočítá se účinnost v hemolytických jednotkách (CH50/ml) ze vzorce:

CdCa.5,

v němž značí:

Cd - převrácenou hodnotu ředění komplementu,

Ca - objem ředěného komplementu, kde došlo k 50% hemolýze, v mililitrech,

5 - přepočítací faktor v souvislosti s počtem erytrocytů.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže křivka mezi 15 % a 85 % hemolýzy je přímkou, jejíž sklon je 0,15 až 0,40, přednostně 0,18 až 0,30.

Zkouška antikomplementární účinnosti. Připraví se ředění komplementu o 100 CH50/ml ředěním vytitrovaného morčecího komplementu tlumivým roztokem želatino-barbitalovým. Je-li to nutné, upraví se pH zkoušeného imunoglobulinu na 7. Pro imunoglobulin o obsahu 50 mg/ml se připraví směs k inkubaci takto:

Tab. 2.6.17-3

	Zkoušený imunoglobulin	Kontrola komplementu (dvojmo)
imunoglobulin (50 mg/ml)	0,2 ml	-
tlumivý roztok želatino-barbitalový	0,6 ml	0,8 ml
komplement	0,2 ml	0,2 ml

Současně se zkoušeným přípravkem se provede zkouška s lidským imunoglobulinem BRP, jak je doporučeno v původním letáku referenčního přípravku pro negativní a pozitivní kontrolu antikomplementární účinnosti. Jestliže koncentrace zkoušeného imunoglobulinu kolísá kolem 50 mg/ml, přidá se větší nebo menší objem vzorku a tlumivého roztoku želatino-barbitalového, např. 0,47 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového je přidáno k 0,33 ml imunoglobulinu o obsahu 30 mg/ml -do objemu 0,8 ml. Zkumavky se uzavřou a inkubují se 60 min při 37 °C. 0,2 ml z každé inkubované směsi se přidá k 9,8 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového, aby se zředil komplement. Provede se titrace komplementu v každé zkumavce tak, jak je popsáno výše, aby se určila zbytková účinnost komplementu (viz tabulka 2.6.17-2). Antikomplementární účinnost zkoušeného přípravku ve vztahu ke kontrole komplementu, která je uvažována jako 100%, se vypočítá ze vzorce:

a-ba.100,

v němž značí:

a - průměr účinnosti kontrolního komplementu (CH50/ml),

b - účinnost komplementu (CH50/ml) zkoušeného přípravku.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže jsou splněny následující podmínky:

• antikomplementární účinnost nalezená pro negativní a pozitivní kontroluje v limitech stanovených v průvodním letáku referenčního přípravku,

• účinnost u kontroly komplementu (a) je v rozmezí 80 CH50 až 120 CH50 v mililitru.

• 2.6.18 Zkouška neurovirulence živých virových vakcín

Podstata zkoušky. Neurovirulence se zjišťuje naočkováním zkoušeného přípravku opicím a jejich sledováním.

Postup zkoušky. Pro každou zkoušku se použije nejméně deset opic séronegativních na zkoušený virus. Každé opici se vstříkne nejvýše 0,5 ml zkoušeného přípravku do talamické oblasti každé hemisféry, pokud není uvedeno jinak.

Celkové množství viru podaného každé opici není nižší než množství obsažené v jedné doporučené lidské dávce vakcíny. Jako kontrola proti zavlečení divokého neurovirulentního viru je chována skupina nejméně 4 kontrolních opic v druhé části klece nebo v bezprostředním sousedství naočkovaných zvířat. Očkované opice se pozorují 17 dní až 21 dní, sledují se příznaky ochrnutí nebo jiné známky neurologického poškození; kontrolní opice jsou sledovány stejně dlouhou dobu a navíc ještě 10 dní. Zvířata, která uhynou do 48 h po injekci, se vyřadí jako úhyn z nespecifických příčin a mohou být nahrazena.

Zkouška není platná, jestliže více než 20 % inokulovaných zvířat uhyne z nespecifických příčin nebo jestliže ve vzorcích séra odebraných od kontrolních opic v době očkování zkoušených zvířat a také 10 dní po usmrcení zkoušených zvířat je prokázána infekce divokým virem typu zkoušeného viru nebo viru spalniček. Na závěr pozorování se provede pitva a histopatologické vyšetření odpovídajících oblastí mozku, jež by prokázalo poškození centrálního nervového systému. Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže zvířata nevykazují žádné neočekávané klinické příznaky nebo histopatologické důkazy poškození centrálního nervového systému, které by bylo možno přisuzovat inokulovanému viru.

• 2.6.19 Zkouška neurovirulence vakcíny proti obrně (per os)

Opice použité v této zkoušce vyhovují požadavkům uvedeným v článku Vaccinum poliomyelitidis perorale a váží nejméně 1,5 kg. Patogenita se stanoví u opic rodu Macaca nebo Cercopithecus v porovnání s referenčním virem připraveným pro zkoušku neurovirulence inokulací do bederní oblasti centrálního nervového systému po předchozím podání vhodného sedativa, např. ketaminiumchloridu. Vzorky séra odebrané před injekcí prokazatelně neobsahují neutralizační protilátky v ředění 1 : 4 při zkoušení proti nejvýše 1000 CCID 50 každého ze tří typů polioviru.

Počet opic. Vakcína a vhodný homotypický referenční virus se zkouší současně v téže skupině opic. Stejnému počtu zvířat se vstříkne zkoušená vakcína a referenční přípravek. Zvířata se rozdělí náhodně do ošetřovacích skupin a klecí a jejich totožnost se kóduje při očkování. Zařazení jednotlivých zvířat se před ošetřovatelem a pitvajícím tají. Počet naočkovaných opic je takový, aby při vyhodnocení zkoušené vakcíny a referenčního přípravku bylo nejméně jedenáct pozitivních opic u typů 1 a 2 a nejméně osmnáct pozitivních opic u typu 3 (pozitivní opice jsou takové, které v centrálním nervovém systému mají specifické poliovirové léze neuronu). S týmž homotypickým referenčním přípravkem může být zkoušena více než jedna šarže vakcíny. Je-li to možné, použijí se opice z téže karanténní skupiny. V opačném případě se použijí opice ze dvou skupin a stejná množství z každé skupiny se použijí pro podání vakcíny a referenčního přípravku. Jestliže se zkouška provádí ve dvou pracovních dnech, naočkuje se stejné množství opic z každé skupiny v týž den vakcínou a homotypickým referenčním přípravkem.

Obsah viru. Obsahy viru ve vakcíně a homotypickém referenčním přípravku se upraví tak, aby byly titry pokud možno stejné a v rozmezí od 10^5,5 do 10^6,5 CCID50/0,1 ml.

Pozorování. Všechny opice se pozorují 17 až 22 dní, aby se zjistily příznaky poliomyelitidy nebo jiné virové infekce. Opice, které přežijí prvních 24 h, ale uhynou před jedenáctým dnem po očkování, se pitvají, aby se určilo, zda byla poliomyelitida příčinou smrti. Zvířata, která uhynula z jiných příčin, než je poliomyelitida, se vyloučí z hodnocení. Umírající nebo těžce paralyzovaná zvířata se usmrtí a pitvají. Všechna zvířata, která přežijí do konce pozorovacího období, se též pitvají. Zkouška není platná, jestliže více než 20 % zvířat vykazuje během pozorovacího období interkurentní infekci.

Počet vyšetřovaných řezů. Z každé opice se histologicky vyšetří nejméně bederní mícha, krční mícha a nižší i vyšší část prodloužené míchy, střední mozek, talamus a motorická oblast kůry mozkové. Zkoumají se řezy tenčí než 15 μm a barvené gallocyaninem.

Nejnižší počet vyšetřovaných řezů je následující:

• a) 12 řezů reprezentujících celou bederní ztluštěninu,

• b) 10 řezů reprezentujících celou krční ztluštěninu,

• c) 2 řezy z prodloužené míchy,

• d) 1 řez z mostu a mozečku,

• e) 1 řez ze středního mozku,

• f) 1 řez z levé a pravé části thalamu,

• g) 1 řez z levé a pravé části motorické oblasti mozkové kůry.

Určení aktivity viru. Pro hodnocení virové aktivity v řezech ze hřbetní míchy a mozkového kmene se používá hodnotící systém pro stupeň poškození, který rozlišuje buněčnou infiltraci a destrukci neuronů následovně:

• 1. pouze buněčná infiltrace (tyto opice se nepovažují za pozitivní),

• 1. buněčná infiltrace s minimálním poškozením neuronu,

• 1. buněčná infiltrace s rozsáhlým poškozením neuronu,

• 1. masivní poškození neuronu s buněčnou infiltrací nebo bez ní.

Výsledky se zaznamenávají do standardního formuláře. ^7)Opice s neuronálními lézemi v řezech, které ale nevykazují stopy po vpichu, jsou počítány jako pozitivní. Opice vykazující stopy po vpichu v řezech, ale nikoli neuronální léze nejsou počítány jako pozitivní. Řezy, které vykazují traumatické poškození, ale nemají žádné specifické virové léze, se nezahrnují do počtu.

Závažnost nálezu je založena na odečtení výsledků z bederních (L), krčních (C) a mozkových (B) histologických řezů.

Ohodnocení lézí (LS) pro každou pozitivní opici se vypočítá takto:

LS=součet hodnot Lpočet řezů+součet hodnot Cpočet řezů+součet hodnot Bpočet řezů∶3.

Pro každou skupinu pozitivních opic se vypočítá průměrný počet lézí.

Hodnocení. Srovnání virové aktivity ve vakcíně a referenčním přípravku je založeno na aktivitě v bederním ztluštění míchy a stupni šíření aktivity z této oblasti do krčního ztluštění a mozku. Vhodnost nebo nevhodnost je založena na celkovém poměru u všech zvířat ve zkoušce. Jednotlivá zvířata vykazující neobvykle vysokou aktivitu jak v bederní oblasti, tak i v důsledku šíření z této oblasti jsou také zavzata do konečného hodnocení. Monovalentní várka vyhovuje ve zkoušce, jestliže je požadovaný počet zvířat pozitivní a žádné z histopatologických a klinických vyšetření nevykazuje významný rozdíl v patogenitě mezi vakcinačním virem a referenčním přípravkem. Podmínky vhodnosti jsou uvedeny níže.

Požadavky. S každou referenční vakcínou (typ 1,2 a 3) se provede vhodný počet neurovirulenčních kvalifikačních zkoušek (např. čtyři zkoušky) a získaná data o její aktivitě slouží jako základ pro požadavky na zkoušenou vakcínu. Celkový průměrný počet lézí (M) pro opakované zkoušky každého referenčního viru se hodnotí společně se shromážděnými výsledky v testu (s^2) jako odhad směrodatné odchylky (s).

Požadavky na platnost výsledků ve zkoušce referenčního přípravku jsou stanoveny na základě kumulativních dat z kvalifikačních zkoušek. Nejsou stanoveny všeobecně platné podmínky; pro pomoc zkoušejícím laboratořím jsou doporučeny následující empirické metody pro získání přijatelných limitů průměrného počtu lézí pro referenční přípravek (Xref).

Tab. 2.6.19-1

	Spodní limit	Horní limit
Typy 1 a 2 Typ 3	M - s M - s/2	M + s M + s

Jestliže je průměrný počet lézí ve vakcíně stanoven Xtesta C1, C2 aC 3 jsou konstanty stanovené postupem uvedeným níže, pak vakcína nevyhovuje, jestliže:

Xtest-Xref>C1.

Vakcína se může zkoušet znovu, jestliže:

C1<Xtest-Xref<C2.

Při opakovaném zkoušení vakcíny se přepočítává průměrný počet lézí ve zkoušené vakcíně a v referenčním přípravku. Přípravek nevyhovuje, jestliže:

Xtest1+test2-Xref1+ref22>C3.

Konstanty C1, C2 a C3 se vypočítají ze vzorců:

C1=2,3.2s2N1,

C2=2,6.2s2N1,

C3=2s2N2,

v nichž značí:

N1 - počet pozitivních opic ve zkoušce vakcíny,

N2 - počet pozitivních opic ve dvou zkouškách,

2,3 - normální odchylku na 1% hladině,

2,6 - normální odchylku na 0,5% hladině,

1,6 - normální odchylku na 5% hladině.

Zkoušku neurovirulence, v které průměrný počet lézí pro referenční přípravek (Xref) není shodný s údaji z předešlých pokusů, nelze použít pro určení vhodnosti vakcíny. Jestliže je zkouška vakcíny platná, průměrný počet lézí pro zkoušenou vakcínu (Xtest) lze počítat a srovnávat s homotypickou referenční vakcínou.

• 2.6.20 Hemaglutininy anti-A a anti-B (nepřímá metoda)

Připraví se dvě stejné řady postupně ředěného zkoušeného přípravku roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění první řady se přidá stejný objem 5% (V/V) suspenze erytrocytů krevní skupiny A, předem třikrát promytých v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění druhé řady se přidá stejný objem 5% ( V/V) suspenze erytrocytů skupiny B předem třikrát promytých v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tyto suspenze se inkubují 30 min při 37 °C a pak se erytrocyty třikrát promyjí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Erytrocyty se ponechají 30 min v kontaktu s polyvalentním sérem proti lidským globulinům. Bez dalšího odstředění se mikrosko-

• 2.7 Metody stanovení účinnosti

• 2.7.1 Imunochemické metody

Imunochemické metody jsou založeny na selektivní, reverzibilní a nekovalentní vazbě antigenů s protilátkami. Tyto metody se používají k důkazu nebo ke stanovení antigenů nebo protilátek. Vznik komplexu antigen-protilátka lze dokázat a množství vytvořeného komplexu lze stanovit různými metodami. Ustanovení tohoto obecného článku se vztahují na imunochemické metody používající podle potřeby buď značená nebo neznačená zkoumadla.

Výsledky imunochemických metod závisí na experimentálních podmínkách a povaze a kvalitě použitých zkoumadel. Proto je nezbytné standardizovat složky imunochemických stanovení a použít k tomu, pokud to je možné, mezinárodní referenční přípravky pro ně určené.

Zkoumadla potřebná pro mnoho imunochemických metod jsou dostupná jako komerční zkušební soupravy, to jsou sady obsahující zkoumadla (zvláště antigen nebo protilátku) a látky určené ke stanovení specifikované substance in vitro, včetně návodu na jejich správné použití. Soupravy se používají podle návodu výrobce. Je důležité ověřit, zda soupravy jsou vhodné pro analýzu zkoušené látky, se zvláštním zřetelem na jejich selektivitu a citlivost. Přehled o soupravách pro imunochemická stanovení připravila Světová zdravotnická organizace (Technical Report Series 658; 1981).

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku

Metody používající značené látky mohou využívat vhodná značení, jako jsou enzymy, fluorofory, luminofory a radioizotopy. Je-li ke značení použit radioizotop, metoda se nazývá "radioimunoanalýza". Doporučení pro měření radioaktivity uvedená v článku Radiofarmaca lze použít při imunologických stanoveních spojených s radioizotopy. Veškerá práce s radioaktivním materiálem se provádí ve shodě s národním zákonodárstvím a mezinárodně přijatými pravidly o ochraně před radioaktivním zářením.

Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku

Imunoprecipitační metody

Imunoprecipitační metody zahrnují flokulaci a precipitační reakce. Je-li roztok antigenů smíchán za vhodných podmínek s odpovídající protilátkou, reagující složky vytvoří flokulační nebo precipitační agregáty. Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace nejvýraznější, se nazývá optimální poměr a je obvykle tvořen ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky. Imunoprecipitace může být stanovena vizuálně nebo metodami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení). Použitím částic (např. latex) pokrytých antigenem nebo protilátkou se může dosáhnout zvýšení citlivosti.

Ve flokulačních metodách se obvykle používá postupné ředění jedné z reagujících složek, zatímco v imunodifuzních metodách (ID) se ředění dosahuje difuzí do prostředí gelu: získají se koncentrační gradienty jedné nebo obou reagujících složek a v prostředí gelu se tak vytvoří zóny, kde poměr složek podporuje precipitaci. Zatímco flokulační metody se provádějí ve zkumavkách, v metodách imunodifuze se používají různé pomůcky, jako jsou zkumavky, destičky, sklíčka nebo komůrky.

Je-li imunoprecipitační systém složen z jednoho antigenů, který se váže na odpovídající protilátku, označuje se jako systém jednoduchý. Zahmuje-li příbuzné, ale sérologicky neidentické reagující složky, je to systém komplexní, a obsahuje-li několik sérologicky nepříbuzných složek, je to systém složený.

V jednoduchých difuzních metodách se koncentrační gradient ustaví pouze pro jednu z reagujících složek, která difunduje z vnějšího zdroje do prostředí gelu obsahujícího odpovídající druhou složku v relativně nízké koncentraci.

Jednoduchá radiální imunodifuze (SRID) je jednoduchá kvantitativní imunodifuzní technika. Když je dosaženo rovnováhy mezi vnější a vnitřní reagující složkou, vytvářejí se kruhové precipitační plochy kolem bodu s vnější složkou. Plochy jsou přímo úměrné koncentraci antigenu v gelu a nepřímo úměrné koncentraci protilátky v gelu.

V metodách dvojité difuze se koncentrační gradienty ustavují pro obě reagující složky. Antigen i protilátka difundují z oddělených míst do původně imunologicky neutrálního gelu.

Komparativní metody dvojité imunodifuze se používají pro kvalitativní porovnávání různých antigenů reakcí s vhodnou protilátkou a naopak. Srovnávání je založeno na přítomnosti nebo nepřítomnosti vzájemného působení mezi precipitačními liniemi. Mohou být rozlišeny reakce totožnosti, rozdílnosti nebo částečné totožnosti mezi antigeny nebo protilátkami.

Imunoelektroforetické metody

Imunoelektroforéza (IE) je kvalitativní technika spojující dvě metody: gelovou elektroforézu s následnou imunodifuzí.

Dvojrozměrná imunoelektroforéza je modifikace imunoelektroforetické metody. Je vhodná pro kvalitativní i kvantitativní analýzy. První část postupu je normální gelová elektroforéza, po které jsou z gelu vyříznuty podélné pásky obsahující rozdělené určované frakce a jsou přeneseny na jinou desku. Elektroforéza ve druhém směru se provádí v úhlu 90 ° k předcházející elektroforéze v gelu, který obsahuje poměrně nízkou koncentraci protilátek odpovídajících antigenům. Pro danou koncentraci protilátky a tloušťku gelu je lineární vztah mezi plochou příslušných precipitačních píků a množstvím odpovídajícího antigenu.

Elektroimunoanalýza, často označovaná jako raketková imunoelektroforéza, je rychlá kvantitativní metoda pro stanovení antigenů s nábojem odlišným od náboje protilátek nebo naopak. Elektroforéza stanovovaného antigenu se provádí v gelu, který obsahuje poměrně nízkou koncentraci odpovídající protilátky. Zkoušený materiál a roztoky standardního antigenu použité pro kalibraci jsou naneseny do odlišných jamek v gelu. V průběhu elektroforézy se vytvářejí pohyblivé precipitační zóny ve tvaru píků (raketek), které začínají u jamek. Čelo precipitátu se zastaví, není-li již antigen v přebytku. Pro danou koncentraci protilátky platí lineární vztah mezi výškou píku (raketky) precipitátu a množstvím použitého antigenu.

Protisměrná imunoelektroforéza je rychlá kvantitativní metoda, která umožňuje, aby se v elektrickém poli ustavil koncentrační gradient vnějšího antigenu a vnější protilátky v závislosti na odlišných nábojích. Naředěné roztoky standardů pro kalibraci a ředění zkoušené látky se nanesou do řady jamek v gelu a stálé množství odpovídající reagující složky je naneseno do protilehlé řady jamek. Titr zkoušené látky může být určen jako nejvyšší ředění, při kterém se tvoří precipitační linie.

Existuje mnoho modifikací dvourozměrné a raketkové imunoelektroforézy.

Jiné techniky spojují dělení antigenů podle velikosti molekuly a sérologických vlastností.

Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií

Může se provádět selektivním nebo neselektivním barvením, fluorescencí, značením enzymy nebo izotopy nebo jinou vhodnou technikou. Metody selektivního barvení se obvykle používají pro charakterizaci nebílkovinných látek v precipitátech.

V průsvitných gelech, jako jsou gely agaru nebo agarosy, jsou precipitační linie v gelu jasně viditelné, pokud je vhodná koncentrace reagujících složek.

Validace metod

Validační požadavky

Kvantitativní imunochemická metoda je platná, jestliže:

• 1. protilátka nebo antigen nerozlišuje signifikantně mezi zkouškou a standardem. V případě značených reagujících složek odpovídající složka nerozlišuje signifikantně mezi značenou a neznačenou látkou;

• 1. metoda není ovlivněna zkoušenou matricí, to je žádnou složkou zkoušeného vzorku nebo jeho pomocnými látkami, které se mohou u vzorků lišit. V tom mohou být zahrnuty vysoké koncentrace jiných bílkovin, solí a konzervačních látek nebo kontaminující proteolytické aktivity,

• 1. limit kvantitativního vyjádření je nižší než přijatá kritéria uvedená v jednotlivém článku;

• 1. přesnost metody je taková, že odchylky výsledků vyhovují požadavkům uvedeným v jednotlivých článcích;

• 1. při postupu v provedení zkoušky nevznikají systematické chyby.

Validační metody

Ke splnění těchto požadavků validační plán obsahuje následující prvky:

• 1. stanovení se provede nejméně třikrát,

• 1. stanovení se provede nejméně se třemi různými ředěními standardu a třemi ředěními vzorku, které mají předpokládanou podobnou účinnost jako ředění standardu,

• 1. plán stanovení má náhodné uspořádání,

• 1. je-li zkoušená látka předložena ve formě séra nebo smíchána s dalšími látkami, je standard rovněž připraven stejným způsobem,

• 1. zkouška zahrnuje měření nespecifické vazby značené reagující složky,

• 1. pro vytěsňovací imunologické stanovení:

• a) je určena maximální vazba (nulové vytěsnění),

• b) ředění zasahují úplnou reakční řadu od hodnot blízkých nespecifické vazbě až po maximální vazbu, přednostně jak pro standard, tak pro zkoušené přípravky.

Statistické výpočty

K vyhodnocení výsledků mohou být analyzovány reakční křivky pro vzorek a standard metodami popsanými ve stati Statistické hodnocení výsledků biologických zkoušek (5.3).

Signifikantní nerovnoběžnost ukazuje, že protilátka nebo antigen rozlišují mezi vzorkem a standardem a výsledky nejsou platné.

Ve vytěsňovacích imunologických stanoveních nesmí být hodnoty nespecifické vazby a maximálního vytěsnění při vysokých koncentracích vzorku nebo standardu signifikantně rozdílné. Rozdíly mohou ukazovat na vliv matrice, která způsobí buď inhibici vazby nebo degradaci značení.

• 2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu citlivých mikroorganismů vyvolané známými koncentracemi zkoušeného antibiotika a referenční látky.

Referenční látky použité ke stanovení jsou ty, jejichž účinnost byla přesně stanovena v poměru k odpovídajícímu mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu přípravku.

Plán stanovení je takový, aby dovolil ověřit validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžných přímek, dvě logaritmické přímky dávky a odpovědi (nebo transformované odpovědi) zkoušeného přípravku a referenčního přípravku jsou rovnoběžné a jsou lineární v intervalu dávek použitých k výpočtu. Tyto podmínky se validují pro danou hladinu pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05. Jiné matematické modely, jako model např. regresního poměru, mohou být též použity, je-li prokázána validita zkoušky.

Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení nejméně 95 % a nejvýše 105 % stanovené účinnosti. Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.

A. Difuzní metoda

Živná půda vhodná pro stanovení (viz níže) se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní j e naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.

Pro přípravu roztoků stejných koncentrací zkoušeného přípravku a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, případně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Objem roztoků v každém cylindříků nebo otvoru musí být stejný. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.

K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných zkouškách účinnosti, u nichž je prokázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení a u nichž s tím souhlasí oprávněná autorita, nebo může postačovat i dvoudávkové stanovení; ve všech sporných případech se však použije metoda třídávková referenční látky a rovněž tři dávky zkoušeného antibiotika o předpokládané stejné účinnosti jako dávky referenční látky.

Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.

Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, může být vhodná k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.

Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s odpovídající přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.

V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inhibičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti může být opakováno a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost antibiotika není menší než požadované minimum.

Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda

Antibiotikum	Referenční látka	Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku	Tlumivý roztok (pH)	Mikroorganismus	Půda a konečné pH (± 0,1)	Inkubační teplota ve °C
Bacitracinum zincicum	Bacitracinum zincicum CRL	kyselina chlorovodíková 0,01 mol/l VS	pH 7,0 (0,05 mol/l)	Micrococcus flavus NCTC 7743 CIP 53.160 ATCC 10240 CCM 732 CNCTC M 8/58	A - pH 7,0	35 až 39
Bleomycini sulfas	Bleomycini sulfas CRL	voda R	pH 6,8 (0,1 mol/l)	Mycobacterium smegmatis ATCC 607 CCM 4622 CNCTC My 23/64	G - pH 7,0	35 až 37
Colistini sulfas	Colistini sulfas CRL			Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71	B - pH 7,3	35 až 39
Colistimethatum natricum	Colistimethatum natricum CRL	voda R	pH 6,0 (0,05 mol/l)	B - pH 7,3	35 až 39
Dihydrostreptomycini sulfas	Dihydrostreptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 37
A - pH 7,9	30 až 37
Erythromycini estolas Erythromycini ethylsuccinas Erythromycini stearas	Erythromycinum CRL	methanol R viz články	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 37
methanol R		A - pH 7,9	30 až 37
Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65	E - pH 7,9	30 až 37
E - pH 7,9	30 až 37
Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Staphylococcus epidermidis NCIB 8853 CIP 68.21 ATCC 12228 CCM 4418 CNCTC M 12/63	A - pH 7,9	35 až 39
A - pH 7,9	35 až 39
Kanamycini monosulfas Kanamycini sulfas acidus	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	A - pH 7,9	30 až 37
A - pH 7,9	35 až 39
Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	E - pH 7,9	30 až 37
E - pH 7,9	30 až 37
Nystatinum	Nystatinum CRL	dimethylformamid R	pH 6,0 (0,05 ml/l) obsahující 5 % (V/V) dimethylformamidu R	Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65	F - pH 6,0	30 až 32
Polymyxini B sulfas	Polymyxini B sulfas CRL	voda R	pH 6,0 (0,05 mol/l)	Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63	B - pH 7,3	35 až 39
Rifamycinum natricum	Rifamycinum natricum CRL	methanol R	pH 7,0 (0,05 mol/l)	Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58	A - pH 6,6	35 až 39
Spiramycinum	Spiramycinum CRL	methanol R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 32
Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 37
A - pH 7,9	30 až 37
Tobramycinum	Tobramycinum CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 37
Vancomycini hydrochloridum	Vancomycini hydrochloridum CRL	voda R	pH 8,0	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 8,0	37 až 39

B. Turbidimetrická metoda

Vhodná živná půda se inokuluje suspenzí vybraného mikroorganismu, který je citlivý na zkoušené antibiotikum tak, aby v podmínkách zkoušky bylo dosaženo vhodného potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé množství suspenze vybrané tak, aby byl asi po čtyřhodinové inkubaci dobře měřitelný zákal.

Inokulovaná půda se musí použít ihned po naočkování.

Použije se rozpouštědlo a tlumivý roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2 pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá stejná účinnost. K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušené látky. Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu tří dávek za použití odpovídajících dávek referenční látky a zkoušené látky.

Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede stejný objem roztoků a stejný objem naočkované živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy).

Zároveň se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika a s naočkovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá 0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky slouží ke standardizaci optického přístroje použitého k měření růstu.

Zkumavky se umístí buď náhodně, nebo podle latinského čtverce, nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného přístroje dovolujícího uvést rychle všechny zkumavky na uvedenou inkubační teplotu. Uchovávají se při této teplotě 3 h až 4 h a zabezpečí se stejná teplota a stejná doba inkubace.

Po inkubaci se zastaví ve všech zkumavkách růst mikroorganismů přidáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím a změří se zákal s přesností na tři místa za použití vhodného optického přístroje. Alternativně lze použít jiný postup, který dovoluje měřit zákal každé zkumavky po stejné době inkubace.

Vypočítá se účinnost za pomoci vhodných statistických metod.

Linearita vztahu dávka-odpověď, transformovaná nebo netransformovaná, je často získána pouze ve velmi omezeném intervalu; je to ten interval, který se má použít pro výpočet účinnosti a obsahuje nejméně tři následné dávky dovolující ověřit linearitu. Při běžných zkouškách, pokud byla linearita systému prokázána na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, postačí, pokud oprávněná autorita s tím souhlasí, použít k titraci jen dvě dávky. Ve všech sporných případech se však použije třídávková metoda.

V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik zkumavek, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti může být opakováno a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.

Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda

Antibiotikum	Referenční látka	Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku	Tlumivý roztok (pH)	Mikroorganismus	Půda a konečné pH (± 0,1)	Inkubační teplota ve °C
Colistini sulfas	Colistini sulfas CRL			Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637 CCM 2024	C - pH 7,0	35 až 37
Colistimethatum natricum	Colistimethatum natricum CRL	voda R	pH 7,0
Dihydrostreptomycini sulfas	Dihydro- streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69	C - pH 7,0	35 až 37
Erythromycini estolas	Erythromycinum CRL	methanol R viz články		Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	D - pH 7,0	35 až 37
Erythromycini ethylsuccinas			pH 8,0
Erythromycini stearas				C - pH 7,0	35 až 37
Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Gramicidin	Gramicidin CRL	methanol R	pH 7,01)	Streptococcus faecalis ATCC 10541 CCM 4533 CNCTC Str 6/58 Staphylococcus aureus ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Kanamycini monosulfas	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Kanamycini sulfas acidus
Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Rifamycinum natricum	Rifamycinum natricum CRL	methanol R	pH 7,0	Escherichia coli NICB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 32- 6/71	C - pH 7,0	35 až 37
Spiramycinum	Spiramycinum CRL	methanol R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69	C - pH 7,0	35 až 37
Tobramycinum	Tobramycinum CRL	voda R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 NCTC 6571 CIP 53.154 ATCC 9144 CCM 2107 CNCTC Mau 76/69	C - pH 7,0	35 až 37
Vancomycini hydrochloridum	Vancomycini hydrochloridum CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	37 až 39

Následující část se uvádí jako informace a rady; netvoří část, jež by byla v rozporu s obecnou metodou.

Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky zkoušky. Jiné mikroorganismy se mohou použít, pokud mají stejnou citlivost na zkoušené antibiotikum a jsou použity ve vhodné živné půdě a vhodných podmínkách teploty a pH. Výběr koncentrací roztoků musí zaručit, že v podmínkách zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky a odpovědí.

Příprava inokula

Bacillus cereus vac. mycoides, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus. Suspenze spor použitého mikroorganismu se připraví takto:

Mikroorganismy se kultivují 7 dní při 35 °C až 37 °C na vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R (1 mg/l). Nárůst, který obsahuje zejména spory, se spláchne sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá na 70 °C a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor, obvykle 10 . 10^6 až 100 . 10^6 v ml. Suspenze spor se mohou uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.

Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů v půdě C při 26 °C po dobu 4 až 6 dní. Potom se asepticky přidá dostatek síranu manganatého R do koncentrace 1 mg/l a inkubuje se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %) a suspenze se odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R tak, aby se dosáhla koncentrace spor v ml 10 . 10^6 až 100 . 10^6 a potom se zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě nepřevyšující 4 °C.

Bordetella bronchiseptica. Testovací mikroorganismus se kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Micrococcus flavus, Staphylococcus epidermidis. Připraví se stejně, jak je popsáno v odstavci Bordetella bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový zákal, který při turbidimetrickém stanovení poskytuje uspokojující vztah dávky k odpovědi nebo při difuzním stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny postačujícího průměru.

Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis. Testovací mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilním roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a zředí se jím na vhodný zákal.

Tlumivé roztoky

Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8 až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného 0,2 mol/l VS uvedeným v následující tabulce a doplněním čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.

Tab. 2.7.2-3

pH	Množství hydroxidu sodného 0,2 mol/l VS v ml
5,8	3,72
6,0	5,70
6,2	8,60
6,4	12,60
6,6	17,80
6,8	23,65
7,0	29,63
7,2	35,00
7,4	39,50
7,6	42,80
7,8	45,20
8,0	46,80

Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou bleomyciniumsulfatu, pro který se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví takto: rozpustí se 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g hydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředí se na 1000,0 ml.

Živné půdy

Mohou se použít následující půdy nebo půdy jim rovnocenné.

Půda A
pepton	6 g
pankreatický hydrolyzát kaseinu	4 g
hovězí výtažek	1,5 g
kvasničný výtažek	3 g
glukosa monohydrát	1 g
agar	15 g
voda	do 1000 ml
Půda B
---	---
pankreatický hydrolyzát kaseinu	17 g
papainový hydrolyzát sóji	3 g
chlorid sodný	5 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
agar	15 g
polysorbát 80	10 g
voda	do 1000 ml

Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních složek po jejich rozvaření a bezprostředně před upravením objemu.

Půda C
pepton	6 g
hovězí výtažek	1,5 g
kvasničný výtažek	3 g
chlorid sodný	3,5 g
glukosa monohydrát	1 g
hydrogenfosforečnan draselný	3,68 g
dihydrogenfosforečnan draselný	1,32 g
voda	do 1000 ml
Půda D
---	---
výtažek ze srdce	1,5 g
kvasničný výtažek	1,5 g
pepton z kaseinu	5,0 g
glukosa monohydrát	1 g
chlorid sodný	3,5 g
hydrogenfosforečnan draselný	3,68 g
dihydrogenfosforečnan draselný	1,32 g
dusičnan draselný	2 g
voda	do 1000 ml
Půda E
---	---
pepton	5 g
masový výtažek	3 g
hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát	26,9 g
agar	10 g
voda	do 1000 ml

Hydrogenfosforečnan sodný se přidá jako sterilní roztok po sterilizaci půdy.

Půda F
pepton	9.4 g
kvasničný výtažek	4,7 g
hovězí výtažek	2.4 g
chlorid sodný	30,0 g
glukosa monohydrát	10,0 g
agar	23,5 g
voda	do 1000 ml
Půda G
---	---
glycerol	10 g
pepton	10 g
masový výtažek	10 g
chlorid sodný	3 g
agar	15 g
voda	do 1000 ml
pH 7 ± 1 po sterilizaci

• 2.7.3 Stanovení účinností kortikotropinu

Podstata zkoušky. Účinnost kortikotropinu je přímo úměrná poklesu obsahu kyseliny askorbové v nadledvinách potkana po hypofyzektomii. Stanovení se provádí v porovnání s účinkem mezinárodního standardu kortikotropinu nebo referečního přípravku, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je čištěný a lyofilizovaný prasečí kortikotropin smíchaný s laktosou.

Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Pro stanovení se použijí laboratorní potkani o hmotnosti 100 g až 200 g, při čemž rozdíl mezi nejlehčím a nejtěžším zvířetem ve skupině nemá být větší než 15 g. Potkani se chovají za standardních podmínek nejméně 7 dní před pokusem. Den před vlastní zkouškou se zvířata zváží a provede se hypofyzektomie.^2) Po operaci se potkani umístí do místnosti se stálou teplotou mezi 24 °C až 27 °C a kromě standardní diety a vody se jim umožní volný přístup k roztoku, obsahujícímu glukosu R (50 g/l) a chlorid sodný R (1,8 g/l). Není-li předepsáno jinak, referenční přípravek i zkoušený přípravek se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS na koncentraci odpovídající 5 m.j. kortikotropinu v 1 ml. K dalšímu ředění pro odstupňované dávky se použije roztok želatiny R (150 g/l). Roztoky se použijí nejpozději do 4 h po přípravě. Za 18 h až 36 h po hypofyzektomii se potkani znovu zváží a rozdělí do šesti skupin po osmi až deseti zvířatech. Třem skupinám se podává referenční přípravek a třem skupinám zkoušený přípravek ve třech odstupňovaných dávkách. Dávky se volí tak, aby po nejnižší dávce nastalo již hodnotitelné snížení obsahu kyseliny askorbové v nadledvinách a po nejvyšší nebylo ještě dosaženo největší snížení. Dávky se přepočtou na tělesnou hmotnost jednotlivého potkana a vstříknou se podkožně v objemu 0,5 ml/kg. Obvykle jsou vhodné dávky v pořadí: 1,0 m.j., 0,5 m.j. a 0,25 m.j. kortikotropinu na 100 g tělesné hmotnosti.

Přesně za tři hodiny po podání kortikotropinu se každému potkanovi v celkové anestezii vyjmou obě nadledviny, rychle se očistí od cizí tkáně a co nejrychleji se zváží, aby se předešlo ztrátě hmotnosti.

Vloží se do homogenizační zkumavky obsahující 2 ml čerstvě připraveného roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Potkani se usmrtí a provede se kontrola úplnosti hypofyzektomie.

Nadledviny se zhomogenizují a obsah zkumavky se zředí stejným roztokem kyseliny metafosforečné R (25 g/l) na 10 ml. Za 30 min stání při pokojové teplotě se homogenát odstřeďuje a 7 ml čiré supematantní tekutiny se přidá k čerstvě připravené směsi tohoto složení: 7 ml roztoku octanu sodného R (45,3 g/l) upraveného přidáním kyseliny octové R na pH 7,3 ml vody R, 2 ml dichlotfenolin dofenolatu sodného RS.

Za 30 s po smíchání se měří kolorimetricky absorpce. Použije se filtr s největší transmisí při 470 nm a transmise s rozsahem od 450 nm do 520 nm. Obsah kyseliny askorbové se odečte ze standardní kalibrační křivky, která se sestrojí z výsledků měření vhodných objemů čerstvě připraveného roztoku kyseliny askorbové R přidaných do roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Obsah kyseliny askorbové se vyjádří v miligramech na 100 g tkáně nadledvin každého potkana. Vypočtou se průměrné hodnoty pro potkany ve všech třech dávkových skupinách referenčního přípravku a zkoušeného přípravku a výsledky se vyhodnotí vhodnou statistickou metodou (5.3).

• 2.7.4 Stanovení účinnosti krevního koagulačního faktoru VIII

Podstata zkoušky. Při stanovení účinnosti krevního koagulačního faktoru VIII se využívá jeho biologického účinku jako kofaktoru aktivace faktoru X aktivovaným faktorem IX (faktor IXa) v přítomnosti iontů vápníku a fosfolipidů. Účinnost přípravku faktoru VIII se stanoví porovnáním množství potřebného k dosažení určité rychlosti tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky, jež se účastní aktivace faktoru X, s množstvím mezinárodního standardu nebo referenčního přípravku kalibrovaného v m.j., jež je zapotřebí k dosažení stejné rychlosti tvorby faktoru Xa.

Mezinárodní jednotka faktoru VIII je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncetrát krevního koagulačního faktoru VIII. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Lidský koagulační faktor VIII BRP se kalibruje porovnáním s mezinárodním standardem a jeho účinnost se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách.

Chromogenní způsob stanovení se skládá ze dvou následných kroků: z aktivace faktoru X, která probíhá v reakční směsi složené z purifikovaných koagulačních faktorů a závisí na obsahu přítomného faktoru VIII, a z enzymatického štěpení chromogenního substrátu faktoru Xa, které je provázeno vznikem chromoforu, jehož množství se dá stanovit kvantitativně spektrofotometricky. Za vhodných podmínek stanovení je závislost rychlosti tvorby faktoru Xa na koncentraci faktoru VIII lineární. Stanovení se dá shrnout do následujícího schématu:

Krok 1 faktor Xaktivovaný faktor VIIIfaktor IXa, fosfolipid, Ca++→faktor Xa

Krok 2 chromogenní substrát→faktor Xapeptid+chromofor

Oba kroky zahrnují zkoumadla, která se dají zajistit z různých komerčních zdrojů. Ačkoliv složení jednotlivých zkoumadel může mít některé odlišnosti, jejich základní rysy jsou popsány v následující specifikaci. Odchylky od tohoto popisu jsou přípustné, pokud se prokáže, že výsledky získané za použití mezinárodního standardu lidského koagulačního faktoru VIII se významně neliší.

Při použití komerčních testovacích souprav se zachovává návod výrobce; je důležité prokázat, že použitá testovací souprava je pro stanovení vhodná.

Zkoumadla

Názvem koagulační zkoumadla (dále zkoumadla) se označuje skupina přečištěných bílkovin lidského nebo hovězího původu. Zahrnuje faktor X, faktor IXa a aktivátor faktoru VIII, obvykle trombin. Tyto bílkoviny jsou částečně přečištěné, nejlépe alespoň na 50 % a neobsahují nečistoty, které by mohly zasahovat do aktivace faktoru VIII nebo faktoru X. Faktor X je přítomen v množstvích, jejichž konečná koncentrace během prvého kroku stanovení je 10 nmol/l až 350 nmol/l, obvykle 15 nmol/l až 30 nmol/l. Faktor IXa vzniká aktivací přečištěného faktoru IX na faktor IXaβ pomocí faktoru XIa a následným přečištěním faktoru IXaβ z reakční směsi. Jeho konečná koncentrace během tvorby faktoru Xa je méně než 30 % koncentrace faktoru X, obvykle 1 nmol/l až 100 nmol/l, nejlépe 1 nmol/l až 10 nmol/l. Trombin může být přítomen ve formě svého prekurzoru protrombinu za předpokladu, že jeho aktivace ve zkoumadle je dostatečně rychlá, aby se při stanovení zajistila téměř okamžitá a úplná aktivace faktoru VIII. Fosfolipidy mohou být přírodního původu, např. extrakt z hovězího mozku nebo míchy nebo extrakt ze sójových bohů, nebo se mohou připravit synteticky a musí obsahovat v dostatečné míře, obvykle 15 % až 35 %, fosfatidylserin. Konečná koncentrace fosfolipidu během tvorby faktoru Xa je 1 nmol/l až 50 nmol/l, nejlépe 10 nmol/l až 35 nmol/l. Zkoumadlo obsahuje ionty vápníku v konečné koncentraci 5 nmol/l až 15 mmol/l. Ke konečné tvorbě faktoru Xa dochází v roztoku, který obsahuje nejméně 1 mg/ml lidského nebo hovězího albuminu, jehož pH je vhodně upraveno na hodnotu 7,3 až 8,0. Složky konečného zkoumadla se obvykle rozdělují alespoň do dvou oddělených zkoumadel, z nichž žádné nemá vlastní schopnost tvorby faktoru Xa. Po rekonstituci mohou být spojeny za předpokladu, že v nepřítomnosti faktoru VIII nemůže vzniknout významné množství faktoru Xa. V konečné inkubační směsi musí být faktor VIII jedinou složkou, která určuje rychlost.

V druhém kroku se vytvořený faktor Xa stanoví pomocí chromogenního substrátu specifického pro faktor Xa. Tím je obvykle derivát krátkého peptidu ze tří až pěti aminokyselin s připojenou skupinou chromoforu. Při odštěpení této skupiny z peptidického substrátu se její chromoformní vlastnosti posunou do vlnové délky, která umožňuje její spektrofotometrické stanovení. Substrát je obvykle rozpuštěný ve vodě a používá se v konečné koncentraci 0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může dále zahrnovat vhodné inhibitory pro zastavení další tvorby faktoru Xa a pro potlačení aktivity trombinu a tím se zlepšuje selektivita stanovení faktoru Xa.

Postup stanovení

Pomocí odpovídajícího množstvím vody R se rekonstituuje celý obsah ampule s referenčním přípravkem i obsah ampule se zkoušeným přípravkem; přípravky se použijí ihned po rozpuštění. Rekonstituované přípravky se ještě dostatečně předředí na roztoky s obsahem mezi 0,5 m.j./ml až 2,0 m.j./ml.

Předředění se provádí plazmou pacienta s těžkou formou hemofilie A nebo uměle připraveným zkoumadlem poskytujícím výsledky, které se významně neliší od výsledků stanovení s hemofilickou plazmou a se stejným referenčním a zkoušeným přípravkem. Předředěné roztoky musí být stabilní po dobu potřebnou na stanovení, nejméně 30 min při 20 °C a použijí se do 15 min.

Připraví se další ředění referenčního a zkoušeného přípravku. K tomu se použije izotonický tlumivý roztok bez chelatotvorných složek, který obsahuje 1 % lidského nebo hovězího albuminu a např. trometamol nebo imidazol a jehož pH se upraví na 7,3 až 8,0. Připraví se alespoň tři samostatná, nezávislá ředění obou přípravků, nejlépe každé samostatné ředění dvojmo. Připravují se ředění tak, aby konečná koncentrace faktoru VIII byla během kroku, kdy dochází k tvorbě faktoru Xa, nižší než 0,03 m.j./ml, přednostně nižší než 0,01 m.j./ml.

Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky kromě faktoru VIII.

Všechna ředění se připravují ve zkumavkách z plastu a ihned se použijí.