Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů (20 mm x 3 mm) po 10 μl a 20 μl obou roztoků; vzdálenost mezi jednotlivými pruhy je 1 cm. Vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, vody R a acetonu R (3 + 7 + 90) po dráze 10 cm. Vrstva se suší 15 min při 100 °C až 105 °C. Po ochlazení se postříká jodobismutitanem draselným RS2 do vzniku oranžových nebo hnědých skvrn na žlutém pozadí. Skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou (hyoscyamin v dolní třetině, skopolamin v horní třetině chromatogramu) a zbarvením skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku. Skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku nepřevyšují velikostí skvrny na chromatogramu porovnávacího roztoku při nanášce shodných objemů. Na chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být patrné další méně výrazné skvrny; při nanášce 20 μl ve střední části chromatogramu, při nanášce 10 μl v blízkosti startu. Vrstva se postříká dusitanem sodným RS tak, aby byla průsvitná. Pozoruje se po 15 min. Hnědé skvrny odpovídající hyoscyaminu na chromatogramech zkoušeného i porovnávacího roztoku se zbarví červenohnědě, ne však šedomodře (atropin), další skvrny již nejsou patrné.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 16,0 %.

Popel nerozpustný v kyselině chlorovodíkové (2.8.1). Nejvýše 4,0 %.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 5,0 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Stanovení obsahu

10,00 g se navlhčí směsí složenou z 5 ml amoniaku 17,5% RS, 10 ml lihu 96% R a 30 ml etheru prostého peroxidických látek R a důkladně se promíchá. Směs se převede do vhodného perkolátoru, je-li třeba pomocí extrakční směsi, a nechá se 4 h stát. Pak se perkoluje směsí složenou z objemových dílů chloroformu R a etheru prostého peroxidických látek R(1 + 3) tak dlouho, dokud vytékající perkolát reaguje pozitivně na přítomnost alkaloidů. Několik mililitrů perkolátu se odpaří do sucha, zbytek se rozpustí v kyselině sírové 0,25 mol/l RS a nepřítomnost alkaloidů se ověří tetrajodortuťnatanem draselným RS. Perkolát se zahustí na vodní lázni na objem asi 50 ml a převede se do dělicí nálevky pomocí etheru prostého peroxidických látek R. Přidá se ether prostý peroxidických látek R tak, aby jeho objem tvořil nejméně 2,1násobek objemu perkolátu a aby tekutina měla hustotu zřetelně nižší než voda. Protřepe se nejméně třikrát 20 ml kyseliny sírové 0,25 mol/l RS, je-li třeba, oddělí se vrstvy odstřeďováním. Spojené spodní vrstvy se převedou do druhé dělicí nálevky, zalkalizují se amoniakem 17,5% RS a protřepávají se třikrát 30 ml chloroformu R. Ke spojeným chloroformovým výtřepkům se přidají 4 g síranu sodného bezvodého R a nechá se stát 30 min za občasného protřepávání. Pak se chloroform slije a síran sodný se promyje třikrát 10 ml chloroformu R. Spojené chloroformové roztoky se odpaří na vodní lázni do sucha, odparek se suší 15 min v sušárně při 100 °C až 105 °C. Odparek se rozpustí v několika mililitrech chloroformu R, přidá se 20 ml kyseliny sírové 0,01 mol/l RS a chloroform se odstraní zahřátím na vodní lázni. Přidá se červeň methylová směsný indikátor R a titruje se hydroxidem sodným 0,02 mol/l VS.

Celkový obsah alkaloidů v procentech, počítáno jako hyoscyamin (C17H23NO3), se vypočítá podle vztahu:

57,88 . 20-n100-d . m ,

v němž značí:

d - ztrátu sušením v procentech,

n - spotřebu hydroxidu sodného 0,02 mol/l VS v mililitrech,

m - navážku zkoušené látky v gramech.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Factor VIII coagulationis sanguinis humani cryodesiccatus[image omitted]

Lidský koagulační faktor VIII lyofilizovaný

Připravuje se frakcionací plazmy získané od více než deseti dárců, která odpovídá požadavkům článku Plasma humanum ad separationem.

Sortiment přípravků lišících se účinností a čistotou je široký. Účinnost přípravku rozpuštěného předepsaným způsobem je nejméně 3 m.j. v mililitru a nejméně 0,1 m.j. v miligramu celkových bílkovin.

Výroba

Metoda přípravy zahrnuje postup nebo postupy, u nichž bylo dokázáno, že odstraňují nebo inaktivují známé původce infekcí; jsou-li při výrobě použity látky k inaktivaci virů, je následující čisticí postup validován, aby se prokázalo, že koncentrace těchto látek byla snížena na vhodnou úroveň a že případné zbytky neovlivní bezpečnost přípravku pro nemocného.

Po přípravě se frakce obsahující faktor VIII rozpustí ve vhodném rozpouštědle a roztok se rozplní do obalů a ihned zmrazí. Poté se lyofilizuje a obaly se uzavřou ve vakuu nebo pod dusíkem tak, aby se předešlo kontaminaci. Nepřidává se žádná protimikrobní přísada, může se však přidat heparin.

Vlastnosti

Bílý nebo slabě žlutý prášek nebo drobivá pevná hmota.

Zkoušky totožnosti

A. Vhodným souborem druhově specifických antisér se provedou precipitační zkoušky se zkoušeným přípravkem, který se bezprostředně před zkouškou rozpustí předepsaným způsobem. Doporučuje se provést zkoušky se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám všech druhů domácích zvířat obvykle používaných k přípravě látek biologického původu v příslušné zemi. Zkoušený přípravek prokazatelně obsahuje lidské bílkoviny a negativně reaguje se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám jiných živočišných druhů.

B. Stanovení účinnosti zkoušeného přípravku je zároveň zkouškou jeho totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 6,8 až 7,4; měří se rozpuštěný přípravek.

Rozpustnost. Do obalu se zkoušeným přípravkem se přidá předepsaný objem vody na injekci R teplé 20 °C až 25 °C a mírně se 30 min protřepává. Přípravek se zcela rozpustí za tvorby bezbarvého nebo slabě nažloutlého, čirého nebo lehce zakaleného roztoku. V tomto roztoku do 3 h po rozpuštění při 20 °C až 25 °C nevzniknou žádné stopy koagula.

Celkové bílkoviny. Je-li třeba, zředí se rozpuštěný přípravek roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby se získal roztok obsahující ve 2 ml asi 15 mg bílkoviny.

Ke 2,0 ml tohoto roztoku v centrifugační zkumavce s kulatým dnem se přidají 2 ml roztoku molybdenanu sodného R (75 g/l) a 2 ml směsi, která obsahuje 1 objemový díl kyseliny sírové prosté dusíku R a 30 objemových dílů vody R. Protřepe se, 5 min se odstřeďuje, supernatantní tekutina se sleje a převrácená zkumavka se nechá odkapat na filtrační papír. Ve zbytku se stanoví dusík mineralizací kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah bílkovin se vypočítá vynásobením výsledku faktorem 6,25.

Fibrinogen. Nejvýše 80 % z celkového množství bílkovin. Rozpuštěný přípravek se zředí v poměru 1 : 10 roztokem chloridu sodného R (9 g/l). K objemu zředěného přípravku s předpokládaným obsahem asi 15 mg fibrinogenu se přidá dostatečné množství trombinu lidského R k vysrážení bílkovin a nechá se 2 h stát. (Dostatečným množstvím trombinu lidského R se rozumí desetinásobek množství potřebného k vysrážení 1 ml roztoku lidského fibrinogenu (1 g/l) v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) během 15 s při teplotě 37 °C a pH 7,2 až 7,3.) Koagulum se oddělí a promyje roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Obsah dusíku se stanoví mineralizací kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah bílkoviny (fibrinogenu) se vypočítá vynásobením výsledku faktorem 6,25.

Hemaglutminy anti-A a anti-B. Rozpuštěný přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby obsahoval 3 m.j. v mililitru. Provedou se zkoušky na hemaglutininy anti-A a anti-B nepřímou metodou (2.6.20). Do ředění 1 : 64 nenastane aglutinace.

Povrchový antigen hepatitidy B. Rozpuštěný přípravek se vyzkouší vhodnou citlivou metodou, jako je radioimunoanalýza. Povrchový antigen hepatitidy B se neprokáže.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 2 %; 0,500 g se 24 h suší v exsikátoru nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřevyšujícím 3 Pa.

Sterilita (2.6.1). Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne nitrožilně objem obsahující 10 m.j.

Neškodnost (2.6.9). Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití. Každé myši se vstříkne objem rozpuštěného přípravku obsahující 1,5 m.j. a každému morčeti se vstříkne objem obsahující 15 m.j.

Stanovení účinnosti

Provede se stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VIII (2.7.4).

Stanovená účinnost je 80 % až 120 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti stanovení účinnosti (P = 0,95) je v rozmezí 80 % až 120 %.

Uchovávání

Uchovává se chráněn před světlem, při teplotě do 8 °C.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet m.j. v obalu,

• obsah bílkovin v obalu,

• množství heparinu v nádobce, pokud je obsažen,

• podmínky uchovávání,

• objem vody na injekci R, jež se použije k rozpouštění přípravku,

• upozornění, že přípravek se musí použít ihned po rozpuštění,

• upozornění, že přípravek se nesmí použít, jestliže se vše nerozpustilo nebo vzniklo koagulum,

• upozornění, že obsah je jen na jedno použití,

• název a množství všech přidaných látek,

• že přípravek nemůže být považován za prostý viru hepatitidy,

• nejvyšší obsah fibrinogenu,

• pokud je to vhodné, že přípravek lze použít na léčbu von Willebrandovy nemoci.

Factor IX coagulationis sanguinis humani cryodesiccatus[image omitted]

Lidský koagulační faktor IX lyofílizovaný

Připravuje se frakcionací plazmy, která vyhovuje požadavkům článku Plasma humanum ad separationem.

Výroba

Metody přípravy se navrhují tak, aby se zejména předcházelo vzniků trombů a přenosu známých původců infekcí nebo aby se inaktivovaly. Přípravek, jež kromě faktoru IX může obsahovat také faktory II, X a VII, prochází filtry zadržujícími bakterie, plní se do sterilních obalů a ihned se zmrazí. Poté se lyofilizuje a obaly se uzavřou ve vakuu nebo v atmosféře inertního plynu. Nepřidává se žádná protimikrobní konzervační látka, mohou se však přidat jiné plazmatické bílkoviny a heparin. Po rozpuštění předepsaným způsobem je účinnost nejméně 20 m.j. v mililitru a specifická účinnost nejméně 0,6 m.j. v miligramu celkových bílkovin.

Vlastnosti

Bílý nebo slabě zbarvený prášek nebo pevná drobivá hmota, velmi hygroskopická. V závislosti na metodě frakcionace plazmy může být rozpuštěný přípravek zbarven např. modře, žlutě nebo zeleně.

Zkoušky totožnosti a Zkoušky na čistotu, s výjimkou zkoušek Rozpustnost a Ztráta sušením, se provedou předepsaným způsobem ihned po rozpuštění zkoušeného přípravku.

Zkoušky totožnosti

A. Vhodným souborem druhově specifických antisér se provedou precipitační zkoušky s rozpuštěným přípravkem. Zkoušky se provedou se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám všech druhů domácích zvířat obvykle používaných k přípravě látek živočišného původu. Zkoušený přípravek obsahuje lidské bílkoviny a nereaguje se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám jiných živočišných druhů.

B. Zkouška Stanovení účinnosti je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 6,5 až 7,5; měří se rozpuštěný přípravek.

Rozpustnost. Do 10 min se za pokojové teploty úplně rozpustí mírným třepáním v předepsaném objemu rozpouštědla.

Aktivované koagulační faktory. Jestliže zkoušený přípravek obsahuje heparin, stanoví se jeho obsah v přípravku zkouškou na heparin a heparin se zneutralizuje přidáním protaminiumsulfatu R. Rozpuštěný zkoušený přípravek se zředí 1 : 10 a 1 : 100 tlumivým roztokem trometamolovým o pH 7,5. Do vodní lázně o teplotě 37 °C se umístí řada polystyrenových zkumavek a do každé se přidá 0,1 ml plazmy chudé na krevní destičky R a 0,1 ml vhodného ředění zkoumadla cefalinového R nebo krevních destiček náhrady R Inkubuje se 60 s a poté se do zkumavek napipetuje buď 0,1 ml příslušného ředění přípravku, nebo 0,1 ml tlumivého roztoku (kontrolní roztok). Ihned nato se do každé zkumavky přidá 0,1 ml roztoku chloridu vápenatého R (3,7 g/l) předem ohřátého na 37 °C. V průběhu 30 min od výchozího ředění se měří čas, který uplyne mezi přidáním roztoku chloridu vápenatého a tvorbou koagula. Pro všechna ředění má být srážecí čas nejméně 150 s.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže srážecí čas kontrolního roztoku je alespoň 200 s.

Heparin. Nejvýše 0,5 m.j. heparinu v 1 m.j. faktoru IX. Připraví se řada roztoků obsahujících v 1 ml 0 mg až 20 mg protaminiumsulfatu R. Připraví se řada směsí obsahujících 0,5 ml rozpuštěného zkoušeného přípravku a 10 μl jednotlivých roztoků protaminiumsulfatu R.

Do vodní lázně na 37 °C se umístí řada polystyrenových zkumavek a do každé zkumavky se dá 0,1 ml plazmy chudé na krevní destičky R a 0,1 ml vhodného ředění zkoumadla cefalinového R nebo krevních destiček náhrady R. Inkubuje se 60 s a poté se do zkumavek napipetuje po 0,1 ml příslušné směsi rozpuštěného zkoušeného přípravku s protaminiumsulfatem R nebo 0,1 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 7,5 (kontrolní roztok). Ihned nato se do každé zkumavky přidá 0,1 ml roztoku chloridu vápenatého R (3,7 g/l) předem ohřátého na 37 °C a měří se čas, který uplyne mezi přidáním roztoku chloridu vápenatého a tvorbou koagula. Množství protaminiumsulfatu potřebného k neutralizaci heparinu v 0,5 ml zkoušeného přípravku odpovídá množství, které je obsaženo ve směsi s nejkratším zaznamenaným srážecím časem. Obsah heparinu se vypočte z předpokladu, že 10 μg protaminiumsulfatu neutralizuje 1 m.j. heparinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže srážecí čas v kontrolním roztoku je nejméně 200 s.

Povrchový antigen hepatitidy B. Rozpuštěný přípravek se zkouší vhodnou citlivou metodou jako je radioimunoanalýza. Povrchový antigen hepatitidy B se neprokáže.

Trombin. Jestliže zkoušený přípravek obsahuje heparin, stanoví se jeho množství, jak je uvedeno ve zkoušce Heparin, a heparin se neutralizuje přídavkem protaminiumsulfatu R. Ve dvou zkumavkách se smíchají stejné objemy rozpuštěného přípravku a roztoku fibrinogenu R (3 g/l). Jedna zkumavka se uchovává 6 h při 37 °C, druhá 24 h při pokojové teplotě. Ve třetí zkumavce se smíchají stejné objemy roztoku fibrinogenu a roztoku trombinu R (1 m.j./ml) a zkumavka se zahřívá ve vodní lázni při 37 °C. Ve zkumavkách obsahujících zkoušený přípravek nedojde ke srážení, ve zkumavce s trombinem se koagulum vytvoří do 30 s.

Celkové bílkoviny. Je-li to třeba, zředí se přesně odměřený objem rozpuštěného přípravku vodou R tak, aby se získal roztok obsahující ve 2 ml asi 15 mg bílkoviny. Ke 2 ml tohoto roztoku v centrifugační zkumavce s kulatým dnem se přidají 2 ml roztoku molybdenanu sodného R (75 g/l) a 2 ml směsi objemových dílů kyseliny sírové prosté dusíku R a vody R (1 + 30). Protřepe se, 5 min se odstřeďuje, supernatantní tekutina se sleje a převrácená zkumavka se nechá odkapat na filtrační papír. Ve zbytku se stanoví dusík mineralizací kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah bílkovin se vypočítá násobením výsledku faktorem 6,25.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 2,0 %; 0,200 g se 24 h suší v exsikátoru nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřevyšujícím 3 Pa.

Sterilita (2.6.1). Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne nitrožilně objem rozpuštěného přípravku odpovídající 30 m.j., počítáno podle účinnosti uvedené v označení na obalu.

Neškodnost (2.6.9). Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití. Každé myši se vstříkne objem rozpuštěného přípravku odpovídající 2 m.j. a každému morčeti se vstříkne objem rozpuštěného přípravku odpovídající 15 m.j., počítáno podle účinnosti uvedené v označení na obalu.

Stanovení účinnosti

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním množství potřebného ke snížení srážecího času směsi obsahující látky jiné než faktor IX, jež se podílejí na srážení krve, s množstvím porovnávacího přípravku, kterého je zapotřebí k vyvolání stejného účinku. K tomu je nutné, aby porovnávací přípravek byl kalibrován v mezinárodních jednotkách. Mezinárodní jednotkou je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncentrát lidského koagulačního faktoru IX. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Stanovená účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) je v rozmezí 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se samostatně rozpustí podle návodu uvedeného v označení na obalu a ihned se zkouší. Jestliže zkoušený přípravek obsahuje heparin, stanoví se jeho množství, jak je uvedeno ve zkoušce Heparin, viz Zkoušky na čistotu, a heparin se neutralizuje přídavkem protaminiumsulfatu R. Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se zředí dostatečným množstvím tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 tak, aby se získaly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. v mililitru. Za použití směsi objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 (1 + 5) se připraví řada dvojnásobných ředění v rozmezí 1 : 10 až 1 : 80. Tato ředění je třeba připravit přesně a ihned je použít. Inkubační zkumavky se vloží do vodní lázně zahřáté na 37 C. Do každé z nich se dá 0,1 ml plazmy substrátu R2 a 0,1 ml příslušného ředění zkoušeného nebo porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml vhodného ředění zkoumadla cefalinového R nebo krevních destiček náhrady R a 0,1 ml suspenze kaolinu lehkého R 0,5 g ve 100 ml v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) a zkumavky se 10 min pravidelně jemně protřepávají. Do každé zkumavky se pak přidá 0,1 ml roztoku chloridu vápenatého R (7,4 g/l). Na stopkách se změří srážecí čas, což je interval mezi přidáním chloridu vápenatého a prvními příznaky tvorby fibrinu, který je možno určit vizuálně nebo vhodným přístrojem.

Aby se zajistilo, že plazma substrát neobsahuje zjistitelnou kontaminaci faktorem IX, provede se slepá zkouška, v níž se místo zkoušeného přípravku použije odpovídající množství směsi objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 (1 + 5). Zkoušku lze hodnotit, jestliže srážecí čas slepé zkoušky je v rozmezí 100 s až 200 s.

Uchovávání

Při teplotě pod 8 C, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet m.j. v obalu,

• množství heparinu v obalu, pokud je obsažen,

• název a množství tekutiny, která se použije k rozpuštění,

• upozornění, že přípravek se musí použít ihned po rozpuštění, a to pouze jednou,

• upozornění, že přípravek se nesmí použít, jestliže je roztok zakalený nebo se vše nerozpustilo,

• podmínky uchovávání,

• název a množství všech přidaných látek,

• množství bílkovin v obalu,

• upozornění, že přípravek nemůže být považován za prostý přenosných původců infekčních one- mocnění.

Fibrinogenum humanum cryodessicatum [image omitted]

Lyofilizovaný lidský fibrinogen

Je to rozpustná složka lidské plazmy, která se přemění na fibrin přídavkem trombinu. Získává se z plazmy, která vyhovuje článku Plasma humanum ad separationem.

Přípravek může obsahovat pomocné látky, jako j sou soli, tlumivé přísady a stabilizátory. Když se rozpustí v objemu rozpouštědla uvedeného v označení,roztok obsahuje nejméně 10g/l fibrinogenu.

Výroba

Výrobní metody zahrnují krok nebo kroky, které prokazatelně odstraňují nebo inaktivují známá infekční agens. Pokud se při výrobě používají látky k inaktivaci virů, následující purifikační postupy se validují tak, aby se dokázalo, že koncentrace těchto látek je snížena na vhodnou úroveň a žádný ze zbytků nemůže ohrozit bezpečnost přípravku pro nemocného.

K použité plazmě se nepřidávají žádná antibiotika a přípravek neobsahuje žádnou protimikrobní konzervační látku.

Použité metody výroby jsou takové, aby se získal fíbrinogen se specifickou účinností (obsah fibrinogenu vzhledem k celkovému obsahu bílkovin) nejméně 80 %. Obsah fibrinogenu se stanoví vhodnou metodou, jakou je metoda popsaná v odstavci Stanovení obsahu, a celkový obsah bílkovin se stanoví vhodnou metodou popsanou v článku Albumini humani solutio. Pokud se přidává bílkovinný stabilizátor (například lidský albumin), požadavek na specifickou účinnost platí pro fíbrinogen před přidáním stabilizátoru. Albumin se může též získat spolu s fibrinogenem při frakcionaci a specifické stanovení albuminu se potom provádí vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) a pro výpočet specifické účinnosti se zjištěné množství albuminu odečte od celkového obsahu bílkovin.

Vlastnosti

Bílý nebo slabě žlutý prášek nebo drobivá pevná látka.

Zkoušky totožnosti

A. Za použití vhodných druhově specifických antisér se provedou se zkoušeným přípravkem precipitační zkoušky. Přípravek se rozpustí podle údajů v označení bezprostředně před použitím. Doporučuje se použití specifických antisér proti plazmatickým bílkovinám všech druhů domácích zvířat obvykle používaných k přípravě látek biologického původu. Přípravek prokazatelně obsahuje lidské bílkoviny a dává negativní výsledek se specifickými antiséry proti plazmatickým bílkovinám jiných druhů.

B. Stanovení obsahuje zároveň zkouškou totožnosti přípravku.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 6,5 až 7,5; měří se rozpuštěný vzorek.

Osmolalita (2.2.35). Osmolalita rozpuštěného vzorku je nejméně 240 mosm/kg.

Rozpustnost. K obsahu nádoby se přidá objem rozpouštědla uvedený v označení. Přípravek se rozpustí do 30 min při 20 °C až 25 °C a tvoří se téměř bezbarvý lehce opalescentní roztok.

Stabilita roztoku. Vzniklý roztok se nechá stát při 20 °C až 25 °C. Do 60 min se netvoří gel.

Povrchový antigen hepatitidy B. Rozpuštěný přípravek se zkouší imunochemickou metodou (2.7.1) vhodné citlivosti takové, jakou má radioimunoanalýza. Povrchový antigen hepatitidy B není zjištěn.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Sterilita (2.6.1). Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne nitrožilně objem rozpuštěného vzorku odpovídající nejméně 30 mg fibrinogenu, vypočítáno z množství uvedeného v označení.

Stanovení obsahu

0,2 ml rozpuštěného přípravku se smíchá s 2 ml vhodného tlumivého roztoku (pH 6,6 až 6,8) obsahujícího dostatečné množství thrombinu (přibližně 3 m.j./ml) a vápníku (0,05 mol/l). Udržuje se 20 min při 37 °C, precipitát se oddělí odstřeďováním (5000 gn, 20 min), důkladně se promyje roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Obsah dusíku se stanoví po mineralizaci kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah fibrinogenu (srazitelné bílkoviny) se vypočítá vynásobením výsledku faktorem 6,0. Obsah je 70 % až 130 % množství fibrinogenu uvedeného v označení.

Uchovávání

Chráněn před světlem.

Označování

V označení se uvede:

• množství fibrinogenu v obalu,

• název a objem rozpouštědla, které se má použít k rozpuštění přípravku,

• kde je to vhodné, název a množství bílkovinného stabilizátoru v přípravku.

† Hyoscyami pulvis normatus [image omitted]

Práškovaný blínový list titrovaný

Je to práškovaný (180) list blínu, jehož obsah alkaloidů je upraven přidáním laktosy nebo drogy s nižším obsahem alkaloidů tak, aby celkový obsah alkaloidů, počítáno jako hyoscyamin (C17H23NO3; Mr 289,4), činil 0,05 % až 0,07 %, vztaženo na vysušenou drogu.

Vlastnosti

Droga má nepříjemný pach nutkající ke zvracení.

Mikroskopický popis, viz Zkouška totožnosti A.

Zkoušky totožnosti

A. Prášek je šedozelený. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: úlomky čepele s buňkami pokožky se zvlněnými stěnami a hladkou kutikulou, anizocytické a anomocytické průduchy (2.8.3) četnější na spodní straně listu; mnohobuněčné, jednořadé krycí chlupy a žláznaté chlupy s tenkými hladkými stěnami; žláznaté chlupy mají dlouhé mnohobuněčné nohy nebo krátké jednobuněčné nohy a dvoubuněčné nebo mnohobuněčné kyjovité hlavičky. Dorziventrální mezofyl s jednořadým parenchymem a houbovým parenchymem obsahujícím jednoduché nebo zdvojené krystaly šťavelanu vápenatého; kruhovitě a šroubovitě ztlustlé cévy. Vlákna a šroubovitě ztlustlé cévy stonku; kulovitá pylová zrna o průměru až 60 μm, se třemi klíčními póry, s téměř hladkou exinou. Úlomky koruny s papilózní pokožkou; úlomky semen obsahující žlutohnědé, zprohýbané, ztlustlé sklereidy osemení; občas drúzy nebo písek šťavelanu vápenatého.

Při hodnocení v glycerolu 85% R mohou být patrné krystaly laktosy.

B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Chromatografie, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou, zbarvením i velikostí skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku při nanášce shodných objemů.

C. 1 g se protřepává 2 min s 10 ml kyseliny sírové 0,05 mol/l RS. Zfiltruje se, k filtrátu se přidá 1 ml amoniaku 26% R a 5 ml vody R. Protřepává se opatrně s 15 ml etheru prostého peroxidických látek Risk, aby se netvořila emulze. Etherová vrstva se vysuší síranem sodným bezvodým R a pak se zfiltruje. Ether se odpaří na porcelánové misce, přidá se 0,5 ml kyseliny dusičné R a odpaří se na vodní lázni do sucha. Přidá se 10 ml acetonu R a po kapkách roztok hydroxidu draselného R (30 g/l) v lihu 96 % R; vznikne tmavě fialové zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Chromatografie. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

Zkoušený roztok. 2,0 g se protřepávají 15 min s 20 ml kyseliny sírové 0,05 mol/l RS a pak se zfiltruje. Filtr se promývá kyselinou sírovou 0,05 mol/l RS až do konečného objemu 25 ml filtrátu. K filtrátu se přidá 1 ml amoniaku 26% R a protřepe se dvakrát 10 ml etheru prostého peroxidických látek R. Je-li třeba, oddělí se vrstvy odstředěním. Spojené etherové výtřepky se vysuší síranem sodným bezvodým R, zfiltrují se a odpaří se na vodní lázni do sucha. Zbytek se rozpustí v 0,5 ml methanolu R.

Porovnávací roztok. 50 mg hyoscyaminiumsulfatu R se rozpustí v 9 ml methanolu R. 15 mg skopolaminiumbromidu R se rozpustí v 10 ml methanolu R. 3,8 ml roztoku hyoscyaminiumsulfatu a 4,2 ml skopolaminiumbromidu se zředí methanolem R na 10 ml.

Na vrstvu se nanese se odděleně do pruhů (20 mm x 3 mm) po 10 μl a 20 μl obou roztoků; vzdálenost mezi jednotlivými pruhy je 1 cm. Vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, vody R a acetonu R (3 + 7 + 90) po dráze 10 cm. Vrstva se suší 15 min při 100 °C až 105 °C. Po ochlazení se postříká jodobismutitanem draselným RS2 do vzniku oranžových nebo hnědých skvrn na žlutém pozadí. Skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou (hyoscyamin v dolní třetině, skopolamin v horní třetině chromatogramu) a zbarvením skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku. Skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku nepřevyšují velikostí skvrny na chromatogramu porovnávacího roztoku při nanášce shodných objemů. Na chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být patrny i další skvrny; při nanášce 20 μl ve střední části chromatogramu, při nanášce 10 μl v blízkosti startu. Vrstva se postříká dusitanem sodným RS tak, aby byla průsvitná. Pozoruje se 15 min. Skvrny odpovídající hyoscyaminu na chromatogramech zkoušeného i porovnávacího roztoku se zbarví červenohnědě, nejsou však šedomodré (atropin); další skvrny již nejsou patrné.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 30,0 %.

Popel nerozpustný v kyselině chlorovodíkové (2.8.1). Nejvýše 12,0 %.

Ztráta sušením (2.3.32). Nejvýše 5,0 %. 1,000 g drogy se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Stanovení obsahu

40,0 g se povlhčí směsí složenou z 8 ml amoniaku 26% R, 10 ml lihu 96% R a 30 ml etheru prostého peroxidických látek R a důkladně se promíchá. Směs se převede do vhodného perkolátoru, je-li třeba pomocí extrakční směsi, a nechá se 4 h stát. Pak se perkoluje směsí složenou z objemových dílů chloroformu R a etheru prostého peroxidických látek R(1 + 3) tak dlouho, dokud vytékající perkolát reaguje pozitivně na přítomnost alkaloidů. Několik mililitrů perkolátu se odpaří do sucha, zbytek se rozpustí v kyselině sírové 0,25 mol/l RS a přítomnost alkaloidů se ověří tetrajodortuťnatanem draselným RS. Perkolát se zahustí na vodní lázni na asi 50 ml a pomocí etheru prostého peroxidických látek R se převede do dělicí nálevky. Přidá se ether prostý peroxidických látek R tak, aby jeho objem tvořil nejméně 2,lnásobek objemu perkolátu a aby tekutina měla hustotu zřetelně nižší než voda. Protřepává se nejméně třikrát 20 ml kyseliny sírové 0,25 mol/l RS, je-li třeba, oddělí se vrstvy odstřeďováním. Spojené spodní vrstvy se převedou do druhé dělicí nálevky, zalkalizují se amoniakem 17,5% RS a protřepávají se třikrát 30 ml chloroformu R. Ke spojeným chloroformovým výtřepkům se přidají 4 g síranu sodného bezvodého R, nechá se stát 30 min za občasného protřepávání. Chloroform se slije a síran sodný se promyje třikrát 10 ml chloroformu R. Spojené chloroformové roztoky se odpaří na vodní lázni do sucha a odparek se suší 15 min v sušárně při 100 °C až 105 °C. Odparek se rozpustí v několika mililitrech chloroformu R, přidá se 20,0 ml kyseliy sírové 0,01 mol/l VS; chloroform se odstraní zahřátím na vodní lázni. Přidá se červeň methylová směsný indikátor R a nadbytek kyseliny se titruje hydroxidem sodným 0,02 mol/l VS.

Celkový obsah alkaloidů v procentech, počítáno jako hyoscyamin (C17H23NO3), se vypočítá ze vztahu:

57,88 . 20-n100-d . m ,

v němž značí:

d - ztrátu sušením v procentech,

n - spotřebu hydroxidu sodného 0,02 mol/l VS v mililitrech,

m - navážku drogy v gramech.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Immunoglobulinum humanum anti-D [image omitted]

Lidský imunoglobulin anti-D

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Přípravek je určen k nitrosvalovému podání. Získává se z plazmy D-negativních dárců krve, kteří byli imunizováni proti antigenu D. Obsahuje specifické protilátky proti antigenu D červených krvinek a může též obsahovat malá množství protilátek proti jiným krevním skupinám, např. anti-C, anti-E, anti-A nebo anti-B. Může se přidat normální lidský imunoglobulin. Je rozplňován do obalů obsahujících nejméně 1 ml, což se vztahuje i na lyofilizovaný přípravek po rozpuštění.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

U tekutého přípravku se provádí zrychlená stabilitní zkouška zahříváním hotového výrobku po čtyři týdny při 37 °C; ztráta anti-D účinnosti po zahřívání nepřekročí 20 % výchozí hodnoty.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním množství, které je zapotřebí k aglutinaci D-pozitivních červených krvinek, s množstvím referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí k dosažení stejného účinku.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Použijí se smíšené D-pozitivní červené krvinky, ne starší než 7 dní, vhodně uchovávané a získané od nejméně čtyř dárců R,R,. Ke vhodnému objemu krvinek třikrát propraných roztokem chloridu sodného R (9 g/l) se přidá stejný objem bromelinu RS, nechá se 10 min stát při 37 °C, odstředí se, supernatantní tekutina se odstraní a krvinky se třikrát promyjí roztokem chloridu sodného R (9 g/l). 20 objemových dílů červených krvinek se suspenduje ve směsi 15 objemových dílů séra inertní skupiny AB, 20 objemových dílů roztoku hovězího albuminu R (300 g/l) a 45 objemových dílů roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tato suspenze se umístí do vody s ledem a stále se promíchává.

Použitím kalibrovaného automatického dilutoru se připraví vhodná ředění zkoušeného a referenčního přípravku. K ředění se použije roztok albuminu hovězího R(5 g/l) v roztoku chloridu sodného R(9 g/l).

Použije se vhodný přístroj pro automatickou kontinuální analýzu. Teplota potrubí, kromě inkubačních zavitů, se udržuje na 15 °C. Do potrubí přístroje se napumpuje suspenze červených krvinek rychlostí 0,1 ml/min a roztok methylcelulosy 450 R (3 g/l) rychlostí 0,05 ml/min. Ředění zkoušeného a referenčního přípravku se provádějí rychlostí 0,1 ml/min po dobu 2 min a po každém z nich se provede opláchnutí ředicím roztokem rychlostí 0,1 ml/min po dobu 4 min před zavedením dalšího ředění.

Vzduch se přivádí rychlostí 0,6 ml/min. Inkubuje se 18 min při 37 °C a pak se shluk rozptýlí přivedením roztoku chloridu sodného R (9 g/l) obsahujícího vhodné smáčedlo (např. polysorbát 20 v konečné koncentraci 0,02 % (V/V)) rychlostí 1,6 ml/min, aby se zabránilo roztržení bublinové struktury. Aglutináty se nechají usadit a dvakrát se promyjí, nejprve při 0,4 ml/min a poté 0,6 ml/min. Neaglutinované červené krvinky se lyžují roztokem, který obsahuje oktoxinol 10 R (5 ml/l), ferrikyanid draselný R (0,2 g/l), hydrogenuhličitan sodný R (1 g/l) a kyanid draselný R (0,05 g/l) přiváděným rychlostí 2,5 ml/min. Desetiminutová prodlévací spirála je zavedena ke konverzi hemoglobinu. Průběžně se zaznamenává absorbance (2.2.25) hemolyzátu při vlnové délce mezi 540 nm až 550 nm. Stanoví se rozmezí koncentrace protilátek, při němž je mezi koncentrací a výslednou změnou absorbance (ΔA) lineární závislost. Z výsledků se sestrojí standardní křivka a její lineární část se použije ke stanovení účinnosti zkoušeného přípravku.

Účinnost zkoušeného přípravku se v mezinárodních jednotkách na mililitr vypočítá ze vzorce:

a . dD ,

v nemž značí:

d - faktor ředění zkoušeného přípravku, u kterého se zjistila daná hodnota ΔA,

D - faktor ředění referenčního přípravku, u něhož se zjistila stejná hodnota ΔA,

a - účinnost ředění D referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách na mililitr.

Pro lyofilizovaný přípravek je zjištěná účinnost v mezinárodních jednotkách v obalu nejméně 90 % a nejvíce 111 % deklarované účinnosti a interval spolehlivosti (P = 0,95) zjištěné účinnosti je nejméně 80 % a nejvíce 125 % deklarované účinnosti.

Pro tekutý přípravek je zjištěná účinnost v mezinárodních jednotkách na nádobku nejméně 90 % a nejvíce 133 % deklarované účinnosti a interval spolehlivosti (P = 0,95) zjištěné účinnosti je nejméně 80 % a nejvíce 148 % zjištěné účinnosti.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede počet mezinárodních jednotek v obalu.

Immunoglobulinum humanum hepatitidis A[image omitted]

Lidský imunoglobulin proti hepatitidě A

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Přípravek je určen k nitrosvalovému podání. Získává se z plazmy nebo séra vybraných dárců, kteří mají protilátky proti viru hepatitidy A. Může se přidat normální lidský imunoglobulin.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale. s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním titru protilátek zkoušeného přípravku s titrem referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách za použití imunoanalýzy vhodné citlivosti a specifity (2.7.1 Imunochemické metody).

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku immunoglobulinu proti hepatitidě A. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Deklarovaná účinnost je nejméně 600 I.U. v mililitru. Stanovená účinnost není menší než účinnost deklarovaná. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvýše 125 %.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

V označení na obalu se uvede počet mezinárodních jednotek v obalu.

Immunoglobulinum humanum hepatitidis B[image omitted]

Lidský imunoglobulin proti hepatitidě B

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Přípravek je určen k nitrosvalovému podání. Získává se z plazmy vybraných nebo imunizovaných dárců krve, která obsahuje protilátky proti povrchovému antigenu hepatitidy B. Může se přidat normální lidský imunoglobulin.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale. s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním titru protilátek zkoušeného přípravku s titrem referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách za použití imunoanalýzy vhodné citlivosti a specifity (2.7.1. Imunochemické metody).

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v určitém množství mezinárodního referenčního přípravku imunoglobulinu proti hepatitidě B. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Deklarovaná účinnost je nejméně 100 m.j. v mililitru. Stanovená účinnost není menší než účinnost deklarovaná. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvíce 125 %.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede počet mezinárodních jednotek v obalu.

Immunoglobulinum humanum hepatitidis B ad usum intravenosum [image omitted]

Lidský imunoglobulin proti hepatitidě B pro intravenózní použití

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Získává se z plazmy vybraných nebo též imunizovaných dárců krve, jejichž plazma obsahuje protilátky proti povrchovému antigenu hepatitidy B. Může se přidat normální lidský imunoglobulin pro intravenózní použití.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale ad usum intravenosum s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním titru protilátek zkoušeného přípravku s titrem referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách za použití imunoanalýzy vhodné citlivosti a specifity (2.7.1 Imunochemické metody).

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku imunoglobulinu proti hepatitidě B. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Deklarovaná účinnost je nejméně 50 m.j. v mililitru. Stanovená účinnost není menší než účinnost deklarovaná. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvíce 125 %.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale ad usum intravenosum.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale ad usum intravenosum.

V označení na obalu se uvede minimální počet mezinárodních jednotek v obalu.

Immunoglobulinum humanum morbillicum [image omitted]

Lidský imunoglobulin proti spalničkám

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, převážně imunoglobulin G. Je určen k nitrosvalovému podání. Získává se z plazmy obsahující specifické protilátky proti viru spalniček. Může se přidat normální lidský imunoglobulin.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou nejmenšího počtu dárců a nejnižšího obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti

Účinnost tekutého přípravku a lyofilizovaného po rekonstituci podle označení je nejméně 50 m.j. neutralizačních protilátek proti spalničkovému viru v mililitru.

Účinnost se stanoví porovnáním titru protilátek zkoušeného imunoglobulinu a referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách za použití čelenžní dávky spalničkového viru ve vhodném systému buněčné kultury. Může se použít oprávněnou autoritou schválená, stejně citlivá a přesná metoda, která odpovídá neutralizační účinnosti proti viru spalniček v porovnání s referenčním přípravkem.

Mezinárodní jednotka je specifická neutralizační účinnost proti spalničkovému viru obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku lidského séra proti spalničkám. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Připraví se řada dvojnásobných ředění zkoušeného přípravku a refenčního přípravku. Každé ředění se smíchá se stejným objemem suspenze spalničkového viru obsahující asi 100 CCID50 v 0,1 ml a inkubuje se 2 h při 37 °C chráněno před světlem. Pro každou směs se použije nejméně šest buněčných kultur, na každou z nich se inokuluje 0,2 ml připravené směsi a inkubuje se nejméně 10 dní. Kultury se vyšetří na účinnost viru a porovnává se ředění obsahující nejnižší množství imunoglobulinu, které je schopno neutralizovat virus, s odpovídajícím ředěním referenčního přípravku.

Vypočítá se účinnost zkoušeného imunoglobulinu v mezinárodních jednotkách vyjadřujících množství neutralizačních protilátek proti viru spalniček v jednom mililitru přípravku.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede množství mezinárodních jednotek v obalu.

Immunoglobulinum humanum normale [image omitted]

Normální lidský imunoglobulin

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G (IgG). Přítomny mohou být i jiné bílkoviny. Normální lidský imunoglobulin obsahuje IgG-protilátky normálních dárců krve a je určen k nitrosvalovému podání.

Získává se z plazmy, která vyhovuje požadavkům článku Plasma humanum ad separationem. K použité plazmě se nepřidávají žádná antibiotika.

Výroba

Výrobní postup zahrnuje stupeň nebo stupně, které prokazatelně odstraňují nebo inaktivují známá infekční agens; jsou-li k inaktivaci virů použity nějaké látky, ověří se, že jejich rezidua přítomná v konečném výrobku nemají žádné nežádoucí účinky na nemocné léčené imunoglobulinem.

U přípravku se prokáže vhodnými zkouškami na zvířatech a klinicky se ověří, že přípravek je dobře snášen po intramuskulámím podání.

Připravuje se ze směsi od nejméně 1000 dárců metodou, u které je prokázáno, že vede k výrobě přípravku, který:

• nepřenáší infekci,

• při koncentraci bílkoviny 160 g/l obsahuje protilátky, z nichž alespoň pro dvě (jednu virovou a jednu bakteriální) je dosažitelný mezinárodní standard nebo referenční přípravek, a koncentrace těchto protilátek je alespoň 10x vyšší oproti výchozímu směsnému materiálu.

Normální lidský imunoglobulin se připravuje jako stabilizovaný roztok např. v roztoku chloridu sodného (9 g/l), v roztoku glycinu (22,5 g/l), nebo jedná-li se o přípravek k lyofilizaci, v roztoku glycinu (60 g/l). Vícedávkové přípravky obsahují protimikrobní konzervační látky, jednodávkové přípravky je neobsahují. Jak u protimikrobních látek, tak stabilizátorů se prokáže, že v množství, ve kterém jsou přítomny, nemají škodlivý vliv na hotový přípravek. Roztok se filtruje přes bakteriální filtry.

Stabilita přípravku se dokládá vhodnými zkouškami prováděnými během vývojové studie.

Vlastnosti

Tekutý přípravek je čirý, světle žlutý nebo světle hnědý, při uchovávání se může vytvořit slabý zákal nebo malé množství jemných částic. Lyofilizovaný přípravek je bílý nebo světle žlutý prášek nebo tuhá drobivá hmota.

Lyofilizovaný přípravek se rozpouští podle návodu uvedeného v označení bezprostředně před provedením zkoušek totožnosti a zkoušek na čistotu, kromě zkoušky Rozpustnost a Voda, semimikrostanovení.

Zkoušky totožnosti

A. U zkoušeného přípravku se provedou precipitační zkoušky s druhově specifickými antiséry. Doporučuje se provést zkoušky se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám všech druhů domácích zvířat v příslušné zemi obvykle používaných k přípravě látek biologického původu. Přípravek obsahuje lidské bílkoviny a dává negativní reakci se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám jiných druhů.

B. Provádí se vhodnou elektroforetickou technikou. Použije se sérum proti normálnímu lidskému séru a porovná se normální lidské sérum a zkoušený přípravek, obojí zředěno tak, aby 1 l obsahoval 10 g bílkovin. Hlavní složka zkoušeného přípravku odpovídá IgG složce normálního lidského séra. Roztok může vykazovat malá množství jiných plazmatických bílkovin.

Zkoušky na čistotu

Rozpustnost. Lyofilizovaný přípravek se rozpustí předepsaným způsobem. Přípavek se do 20 min při teplotě 20 °C až 25 °C úplně rozpustí.

Hodnota pH (2.2.3). 6,4 až 7,2; zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na roztok obsahující v litru 10 g bílkovin.

Celkové bílkoviny. Přípravek obsahuje 100 g až 180 g bílkovin v litru a 90 % až 110 % deklarovaného množství bílkovin. Zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby se získal roztok obsahující ve 2 ml asi 15 mg bílkovin. Ke 2,0 ml tohoto roztoku v centrifugační zkumavce s kulatým dnem se přidají 2 ml roztoku molybdenanu sodného R (75 g/l) a 2 ml směsi, která obsahuje 1 objemový díl kyseliny sírové bez dusíku R a 30 objemových dílů vody R. Protřepe se, 5 min se odstřeďuje, supernatantní tekutina se sleje a převrácená zkumavka se nechá odkapat na filtrační papír. Ve zbytku se stanoví dusík mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah bílkovin se vypočítá vynásobením výsledku faktorem 6,25.

Složení bílkovin. Stanoví se zónovou elektroforézou (2.2.31) za použití proužků vhodného celulosoacetatového gelu jako nosiče a tlumivého roztoku barbitalového o pH 8,6 (1) jako elektrolytu.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace bílkovin byla 50 g/l.

Porovnávací roztok. Lidský imunoglobulin pro elektroforézu BRP se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace bílkovin byla 50 g/l.

Na proužek se nanese 2,5 μl zkoušeného roztoku jako pruh 10 mm nebo se nanese 0,25 μl na milimetr, jsou-li použity užší proužky. Stejným způsobem se na jiný proužek nanese porovnávací roztok. Nechá se působit takové elektrické pole, aby se pruh albuminu normálního lidského séra, nanesený na kontrolní proužek, posunul alespoň o 30 mm. Proužek se 5 min barví černí amido 10B RS. Odbarvení se provede směsí 10 objemových dílů kyseliny octové ledové R a 90 objemových dílů methanolu R tak, aby došlo k odbarvení pozadí. Transparence pruhů se vyvolá směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (19 + 81). Změří se absorbance pruhů při 600 nm na přístroji, který dává lineární odpověď v rozsahu celého měření. Stanoví se výsledek jako průměr ze tří měření z každého proužku. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku má nejvýše 10 % bílkovin mobilitu odlišnou od hlavního pásu. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže na elektroforeogramu porovnávacího roztoku je podíl bílkovin hlavního pásu v mezích uvedených v příbalovém letáku referenčního přípravku.

Rozdělení podle molekulární velikosti. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29)

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) na koncentraci vhodnou pro použitý chromatografický systém. Zpravidla je tato koncentrace v rozmezí 4 g/l až 12 g/l a vstřikuje se 50 μg až 600 μg bílkovin.

Porovnávací roztok. Lidský imunoglobulin BRP se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na stejnou koncentraci bílkovin jako u zkoušeného roztoku.

Chromatografický postup se obvykle provede za použití:

• kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R,

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min, kterou je roztok obsahující v litru: 4,873 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu R, 1,741 g dihydrogenfosforečnanu sodného monohydrátu R, 11,688 g chloridu sodného R a 50 mg azidu sodného R,

• spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Na chromatogramu porovnávacího roztoku odpovídá hlavní pík monomeru IgG a pík odpovídající dimeru má relativní retenční čas asi 0,85, vztaženo k monomeru. Píky na chromatogramu zkoušeného roztoku se porovnají s chromatogramem porovnávacího roztoku. Každý pík s retenčním časem kratším, než je retenční čas dimeru, odpovídá polymerům a agregátům.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže relativní retenční čas píků monomeru a dimeru se shoduj e s odpovídajícími píky na chromatogramu porovnávacího roztoku a je 1 ± 0,02; součet ploch píků odpovídajících monomeru a dimeru je nejméně 85 % celkové plochy píků a plocha píků odpovídajících polymerům a agregátům je nejvýše 10 % celkové plochy píků.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %; zkouší se u lyofilizovaných přípravků s 0,500 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky. Na 1 kg hmotnosti králíka se vstříkne nitrožilně 1 ml zkoušeného přípravku.

Protilátky proti povrchovému antigenu hepatitidy B. Nejméně 0,5 m.j. na gram imunoglobulinu, stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Normální lidský imunoglobulin určený k profylaxi hepatitidy A vyhovuje následující doplňující zkoušce:

Protilátky proti viru hepatitidy A. Stanoví se srovnáním s porovnávacím přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách za použití imunoanalýzy vhodné citlivosti a specifity (2.7.1).

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku imunoglobulinu proti hepatitidě A. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Deklarovaná účinnost je nejméně 100 m.j. v mililitru. Stanovená účinnost není nižší než deklarovaná účinnost. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvýše 125 %.

Uchovávání

Tekutý přípravek se uchovává v bezbarvých skleněných obalech chráněn před světlem. Lyofilizovaný přípravek se uchovává v bezbarvých skleněných obalech ve vakuu nebo v atmosféře inertního plynu, chráněn před světlem.

Označování

V označení obalu se uvede:

• u tekutého přípravku jeho objem v obalu a obsah bílkovin vyjádřený v gramech na litr,

• u lyofilizovaného přípravku množství bílkovin v obalu,

• způsob podání,

• podmínky uchovávání,

• doba použitelnosti,

• u lyofilizovaného přípravku název nebo složení a objem tekutiny k rekonstituci, jež se má přidat,

• kde je to vhodné, že přípravek je vhodný k profylaxi infekce hepatitidy A,

• kde je to vhodné, účinnost proti hepatitidě A v mezinárodních jednotkách v mililitru,

• kde je to vhodné, název a množství protimikrobní konzervační látky v přípravku.

Immunoglobulinum humanum normale ad usum intravenosum [image omitted]

Normální lidský imunoglobulin pro nitrožilní podání

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G (IgG). Přítomny mohou být i jiné bílkoviny. Obsahuje IgG-protilátky normálních dárců krve. Tento článek se nevztahuje na záměrně připravené přípravky obsahující fragmenty nebo chemicky pozměněný IgG.

Získává se z plazmy, která vyhovuje požadavkům článku Plasma humanum ad separationem. K použité plazmě se nepřidávají žádná antibiotika.

Výroba

Výrobní postup zahrnuje stupeň nebo stupně, které prokazatelně odstraňují nebo inaktivuj í známá infekční agens; jsou-li k inaktivaci virů použity nějaké látky, musí být ověřeno, že jejich rezidua přítomná v konečném výrobku nemají žádný nežádoucí účinek na nemocné léčené imunoglobulinem.

U přípravku se prokáže vhodnými zkouškami na zvířatech a klinicky ověří, že přípravek je dobře snášen po nitrožilním podání.

Připravuje se ze směsi od nejméně 1000 dárců metodou, u které je prokázáno, že vede k výrobě přípravku, který:

• nepřenáší infekci,

• při koncentraci imunoglobulinu 50 g/l obsahuje protilátky, z nichž na nejméně dvě (jednu virovou a jednu bakteriální) jsou dosažitelné mezinárodní standardy nebo referenční přípravky; koncentrace těchto protilátek je ve srovnání s výchozí směsnou surovinou nejméně trojnásobná,

• má definované rozdělení podtříd imunoglobulinu G,

• vyhovuje zkoušce na Fc funkci imunoglobulinu (2.7.9).

Normální lidský imunoglobulin pro nitrožilní podání se připravuje jako stabilizovaný roztok nebo jako lyofilizovaný přípravek. Může se přidat stabilizátor. V obou případech se přípravek filtruje filtrem zadržujícím bakterie. Nepřidává se žádná protimikrobní konzervační látka ani při frakcionaci, ani k hotovému nerozplněnému roztoku.

Stabilita přípravku se doloží vhodnými zkouškami prováděnými během vývojové studie.

Vlastnosti

Tekutý přípravek je čirý nebo slabě opalizující, bezbarvý nebo slabě žlutý. Lyofilizovaný přípravek je bílý nebo světle žlutý prášek nebo tuhá drobivá hmota.

Lyofilizovaný přípravek se rozpouští podle návodu uvedeného na štítku bezprostředně před provedením zkoušek totožnosti a zkoušek na čistotu, kromě zkoušky Rozpustnost a Voda, semimikrostanovení.

Zkoušky totožnosti

A. U zkoušeného přípravku se provede precipitační zkouška s druhově specifickými antiséry. Doporučuje se provést zkoušky se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám všech druhů domácích zvířat v příslušné zemi obvykle používaných k přípravě látek biologického původu. Přípravek obsahuje lidské bílkoviny a dává negativní reakci se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám jiných druhů.

B. Provádí se vhodnou elektroforetickou technikou. Použije se sérum proti normálnímu lidskému séru a porovná se normální lidské sérum a zkoušený přípravek, obojí zředěno tak, aby 11 obsahoval 10 g bílkovin. Hlavní složka zkoušeného přípravku odpovídá IgG složkám normálního lidského séra. Roztok může vykazovat malá množství jiných plazmatických bílkovin; je-li jako stabilizátor přidán lidský albumin, může být považován za hlavní složku.

Zkoušky na čistotu

Rozpustnost. Lyofilizovaný přípravek se rozpustí předepsaným způsobem. Přípravek se do 30 min při teplotě 20 °C až 25 °C úplně rozpustí.

Hodnota pH (2.2.3). 4,0 až 7,4; zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na roztok obsahující 10 g bílkovin v litru.

Osmolalita (2.2.35). Nejméně 240 mosmol/kg.

Celkové bílkoviny. Přípravek obsahuje nejméně 30 g/l a 90 % až 110 % deklarovaného množství bílkovin. Zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby se získal roztok obsahující ve 2 ml asi 15 mg bílkovin. Ke 2,0 ml tohoto roztoku v centrifugační zkumavce s kulatým dnem se přidají 2 ml roztoku molybdenanu sodného R (75 g/l) a 2 ml směsi, která obsahuje 1 objemový díl kyseliny sírové bez dusíku R a 30 objemových dílů vody R. Protřepe se, 5 min se odstřeďuje, supernatantní tekutina se sleje a převrácená zkumavka se nechá odkapat na filtrační papír. Ve zbytku se stanoví dusík mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah bílkovin se vypočítá vynásobením výsledku faktorem 6,25.

Složení bílkovin. Stanoví se zónovou elektroforézou (2.2.31) za použití proužků vhodného celulosoacetatového gelu jako nosiče a tlumivého roztoku barbitalového o pH 8,6 (1) jako elektrolytu.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace imunoglobulinu byla 30 g/l.

Porovnávací roztok. Lidský imunoglobulin pro elektroforézu BRP se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace bílkovin byla 30 g/l.

Na proužek se nanese 4,0 μl zkoušeného roztoku jako pruh 10 mm nebo se nanese 0,4 μl na milimetr, jsou-li použity užší proužky. Stejným způsobem se na jiný proužek nanese porovnávací roztok. Nechá se působit takové elektrické pole, aby se pruh albuminu normálního lidského séra, nanesený na kontrolní proužek, posunul alespoň o 30 mm. Proužek se 5 min barví černí amido 10BRS. Odbarvení se provede směsí 10 objemových dílů kyseliny octové ledové R a 90 objemových dílů methanolu R tak, aby došlo k odbarvení pozadí. Transparence pruhů se vyvolá směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (19 + 81). Změří se absorbance pruhů při 600 nm na přístroji, který dává lineární odpověď v rozsahu celého měření. Stanoví se výsledek jako průměr ze tří měření z každého proužku. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku má nejvýše 5 % bílkovin mobilitu odlišnou od hlavního pásu. Tuto hodnotu nelze použít, je-li k přípravku přidán albumin jako stabilizátor; u takových přípravků se zkouška na složení bílkovin provádí při výrobě před přidáním stabilizátoru. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže na elektroforeogramu porovnávacího roztoku je podíl bílkovin hlavního pásu v mezích uvedených v příbalovém letáku referenčního přípravku.

Rozdělení podle molekulární velikosti. Stanovuje se kapalinovou chromatografií (2.2.29)

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) na koncentraci vhodnou pro použitý chromatografický systém. Zpravidla je tato koncentrace v rozmezí 4 g/l až 12 g/l a vstřikuje se 50 μg až 600 μg bílkovin.

Porovnávací roztok. Lidský imunoglobulin BRP se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na stejnou koncentraci bílkovin jako u zkoušeného roztoku.

Chromatografický postup se obvykle provede za použití:

• kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R,

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min, kterou je roztok obsahující v litru: 4,873 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu R, 1,741 g dihydrogenfosforečnanu sodného monohydrátu R, 11,688 g chloridu sodného R a 50 mg azidu sodného R,

• spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Na chromatogramu porovnávacího roztoku odpovídá hlavní pík monomeru IgG a pík odpovídající dimeru má relativní retenční čas asi 0,85, vztaženo k monomeru. Píky na chromatogramu zkoušeného roztoku se porovnají s chromatogramem porovnávacího roztoku. Každý pík s retenčním časem kratším, než je retenční čas dimeru, odpovídá polymerům a agregátům.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže relativní retenční čas píků monomem a dimeru se shoduj e s odpovídajícími píky na chromatogramu porovnávacího roztoku a je 1 ± 0,02; součet ploch píků odpovídajících monomeru a dimeru je nejméně 90 % celkové plochy píků a plocha píků odpovídajících polymerům a agregátům je nejvýše 3 % celkové plochy píků. Tento požadavek se nevztahuj e na přípravky, u nichž je přidán albumin jako stabilizátor; u přípravků stabilizovaných albuminem se zkouška rozdělení podle molekulární velikosti provádí při výrobě před přidáním stabilizátoru.

Antikomplementární účinnost (2.6.17). Spotřeba komplementu je nejvýše 50 % (1 CH50 na miligram imunoglobulinu).

Aktivátor prekalikreinu (2.6.15). Nejvýše 35 m.j. v mililitru, počítáno na roztok obsahující 30 g imunoglobulinu v litru.

Hemaglutininy anti-A a anti-B (2.6.20). Provedou se zkoušky na hemaglutininy anti-A a anti-B. Obsahuje-li zkoušený přípravek více než 30 g imunoglobulinu v litru, zředí se na tuto koncentraci před přípravou ředění pro tuto zkoušku. Ředění 1 : 64 nevykazuje aglutinaci.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %; zkouší se u lyofilizovaných přípravků s nejméně 0,500 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky. Na 1 kg hmotnosti králíka se vstříkne nitrožilně objem odpovídající 0,5 g imunoglobulinu, ale nejvýše 10 ml na kilogram tělesné hmotnosti.

Protilátky proti povrchovému antigenu hepatitidy B. Nejméně 0,5 m.j. na gram imunoglobulinu, stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Uchovávání

Tekutý přípravek se uchovává v bezbarvých skleněných obalech, chráněn před světlem, při teplotě uvedené v označení. Lyofilizovaný přípravek se uchovává v bezbarvých skleněných obalech ve vakuu nebo v atmosféře inertního plynu, chráněn před světlem, při teplotě nepřevyšující 25 °C.

Označování

V označení obalu se uvede:

• u tekutého přípravku jeho objem v obalu a obsah bílkovin vyjádřený v gramech na litr,

• u lyofilizovaných přípravků množství bílkovin v obalu,

• způsob podání,

• podmínky uchovávání,

• doba použitelnosti,

• u lyofilizovaných přípravků název nebo složení a objem tekutiny k rekonstituci, jež se má přidat,

• rozdělení podtříd imunoglobulinu G obsažených v přípravku,

• kde je to vhodné, množství albuminu přidaného jako stabilizátor,

• nejvyšší obsah imunoglobulinu A.

Immunoglobulinum humanum rabicum [image omitted]

Lidský imunoglobulin proti vzteklině

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště immunoglobulin G. Přípravek je určen pro intramuskulární podání. Vyrábí se z plazmy dárců imunizovaných proti vzteklině. Obsahuje specifické protilátky neutralizující rabický virus. Může se přidat normální lidský imunoglobulin odpovídající článku Immunoglobulinum humanum normale.

Přípravek vyhovuje požadavkům uvedeným v článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky imunoglobulinu potřebné k neutralizaci infekěnosti suspenze rabického viru s dávkou referenčního přípravku, kalibrovaného v mezinárodních jednot kách, potřebnou k dosažení téhož stupně neutralizace (2.7.1 Imunochemické metody). Zkouška se provádí na citlivých buněčných kulturách a přítomnost viru, který není zneutralizován, se prokáže imunofluorescencí.

Mezinárodní jednotka je specifická neutralizační účinnost proti rabickému viru obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu lidského imunoglobulinu proti vzteklině. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Zkouška se provede na vhodných citlivých buňkách. Obvykle se používají buňky buněčné linie BHK 21, rostoucí v médiu popsaném dále, mezi 18. a 30. pasáží od ATCC inokula. Buňky se sklízejí po 2 až 4 dnech růstu, uvolňují se trypsinem a připraví se suspenze obsahující 500 000 buněk v mililitru (buněčná suspenze). Je-li třeba, 10 min před použitím suspenze se přidá 10 μg diethylaminoethyldextranu R na mililitr ke zvýšení citlivosti buněk.

Použije se stálý virový kmen rostoucí na citlivých buňkách, jako je např. kmen CVS viru rabies adaptovaný na růst na buňkách linie BHK 21 (inokulační virová suspenze). Metodou popsanou dále se stanoví titr inokulační virové suspenze.

Připraví se sériová ředění virové suspenze. Do komůrek na sklech pro tkáňové kultury (8 komůrek na sklo) se nakape po 0,1 ml každého ředění a 0,1 ml média a přidá se 0,2 ml buněčné suspenze. Inkubuje se 24 h v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C. Po fixaci a imunofluorescenčním barvení se skla vyhodnotí. Stanoví se konečný bod titrace inokulační virové suspenze a připraví se pracovní ředění viru, které v 0,1 ml obsahuje 100 CCID50.

Pro každou zkoušku se ověří množství použitého viru provedením kontrolní titrace: z ředění odpovídajícího 100 CCID50 v 0,1 ml se připraví tři desetinásobná ředění. Po 0,1 ml každého ředění se nakape do čtyř komůrek obsahujících 0,1 ml média a přidá se po 0,2 ml buněčné suspenze. Zkouška je platná, když titr leží mezi 30 CCID50 a 300 CCID50.

Referenční přípravek se zředí neobohaceným médiem na koncentraci 2 m.j. v mililitru (zásobní referenční ředění; uchovává se při teplotě nižší než -80 °C). Připraví se dvě vhodná předředění (1 : 8 a 1 :10) ze zásobního referenčního ředění tak, aby ředění referenčního přípravku, které sníží počet fluoreskujících polí o 50 %, bylo v rozsahu čtyř ředění na kultivačním skle. Přidá se 0,1 ml média do všech komůrek s výjimkou prvních ve dvou řadách, do kterých se případně přidá 0,2 ml ze dvou předředění zásobního referenčního ředění postupným přenášením 0,1 ml do dalších komůrek.

Zkoušený přípravek se zředí v poměru 1 : 100 neobohaceným médiem (zásobní ředění imunoglobulinu), aby se snížily na minimum chyby způsobené viskozitou neředěného přípravku. Připraví se tři vhodná předředění tak, aby ředění zkoušeného přípravku, které sníží počet fluoreskujících polí o 50 %, bylo v rozsahu čtyř ředění na kultivačním skle. Přidá se 0,1 ml média do všech komůrek s výjimkou prvních ve všech třech řadách, do nichž se přidá 0,2 ml ze tří předředění zásobního ředění imunoglobulinu. Připraví se řada dvojnásobných ředění postupným přenášením 0,1 ml do dalších komůrek.

Do všech komůrek obsahujících ředění referenčního přípravku a ředění zkoušeného přípravku se přidá 0,1 ml virové suspenze odpovídající 100 CCID50 v 0,1 ml (pracovní ředění viru), protřepe se v ruce a inkubuje se 90 min v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C. Přidá se 0,2 ml buněčné suspenze, protřepe se v ruce a inkubuje 24 h v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C.

Po 24 h se odstraní médium a sejmou se plastové stěny. Buněčný monolayer se promyje tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a směsí objemových dílů vody R a acetonu R (20 + 80). Fixuje se 3 min směsí objemových dílů vody R a acetonu R (20 + 80) při -20 °C. Na skla se nanese fluorescein-konjugované rabické antisérum R. Ponechá se 30 min při 37 °C v prostoru s vysokou vlhkostí. Promyje se tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a usuší se. Vyšetří se dvacet polí v každé komůrce mikroskopem se zařízením pro fluorescenci při zvětšení 250x. Zaznamenává se počet polí s nejméně jednou fluorescenčně označenou buňkou. Přepočítá se zkoušená dávka použitá při titraci viru a stanoví se ředění referenčního přípravku a ředění zkoušeného přípravku, které snižuje počet fluorescenčních polí o 50 %. Ředění se spočítá ze dvou nebo tří ředění společně použitím probitové analýzy. Zkoušku lze hodnotit pouze tehdy, jestliže statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od křivky dávka - odpověď a odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti.

Deklarovaná účinnost je nejméně 150 m.j. v mililitru. Stanovená účinnost není menší než deklarovaná účinnost a není větší než dvojnásobek deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvýše 125 %.

Médium pro růst buněk BHK 21

Komerčně vyráběná média, která mají pouze malé odchylky od dále uvedeného média, se mohou také použít.

chlorid sodný	6,4 g
chlorid draselný	0,40 g
chlorid vápenatý bezvodý	0,20 g
síran hořečnatý heptahydrát	0,20 g
dihydrogenfosforečnan sodný monohydrát	0,124 g
glukosa monohydrát	4,5 g
dusičnan železitý nonahydrát	0,10 mg
L-argininiumchlorid	42,0 mg
L-cystin	24,0 mg
L-histidin	16,0 mg
L-isoleucin	52,0 mg
L-leucin	52,0 mg
L-lysiniumchlorid	74,0 mg
L-fenylalanin	33,0 mg
L-threonin	48,0 mg
L-tryptofan	8,0 mg
L-tyrosin	36,0 mg
L-valin	47,0 mg
L-methionin	15,0 mg
L-glutamin	0,292 g
i-inositol	3,60 mg
choliniumchlorid	2,0 mg
kyselina listová	2,0 mg
nikotinamid	2,0 mg
pantothenan vápenatý	2,0 mg
pyridoxaliumchlorid	2,0 mg
thiaminiumchlorid	2,0 mg
riboflavin	0,2 mg
červeň fenolová	15,0 mg
hydrogenuhličitan sodný	2,75 mg
voda	do 1000 ml

Médium se doplňuje:

sérum telecí fetální (30 min zahřáté na 56 °C)	10 %
trypton-fosforečnanová půda	10%
sodná sůl benzylpenicilinu	60 mg/l
streptomycin	0,1 g/l

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede počet mezinárodních jednotek v balení.

Immunoglobulinum humanum rubellae [image omitted]

Lidský imunoglobulin proti zarděnkám

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Přípravek je určen k nitrosvalovému podání. Získává se z plazmy, která obsahuje specifické protilátky proti viru zarděnek. Může se přidat normální lidský imunoglobulin.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním účinnosti zkoušeného přípravku ve zkoušce inhibice hemaglutinace s účinností referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku lidského séra proti zarděnkám. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Stanovená účinnost je nejméně 4500 m.j. v mililitru. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 50 % a nejvíce 200 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede počet mezinárodních jednotek v mililitru.

Immunoglobulinum humanum tetanicum [image omitted]

Lidský tetanický imunoglobulin

Synonymum. Immunoglobulinum antitetanicum humanum

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Získává se z plazmy obsahující specifické protilátky proti toxinu vytvářenému mikroorganismem Clostridium tetani. Může se přidat normální lidský imunoglobulin.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Výroba

Při vývoji přípravku se má určit uspokojivý vztah mezi účinností stanovenou imunoanalýzou, jak je uvedeno ve zkoušce Stanovení účinnosti, a mezi účinností stanovenou následující zkouškou schopnosti neutralizovat toxin, provedenou na myších.

Schopnost neutralizovat toxin. Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné na ochranu myší před paralytickým účinkem neměnné dávky tetanického toxinu s množstvím porovnávacího přípravku lidského tetanického imunoglobulinu kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je potřebné k dosažení stejné ochrany.

Mezinárodní jednotka antitoxinu je specifická neutralizační účinnost proti tetanickému toxinu obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu lidského tetanického imunoglobulinu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace. Lidský tetanický imunoglobulin BRP je kalibrován v mezinárodních jednotkách porovnáním s mezinárodním standardem.

Výběr zvířat. Použijí se myši hmotnosti 16 g až 20 g.

Příprava zkušebního toxinu. Zkušební toxin se připraví vhodnou metodou ze sterilního filtrátu Cl. tetani v tekuté živné půdě. Jako příklad jsou uvedeny dvě metody a může se použít i jiná vhodná metoda.

• 1. K filtrátu asi devítidenní kultury se přidají 1 až 2 objemové díly glycerolu R a uchovává se těsně pod 0 °C.

• 1. Vysráží se toxin přidáním síranu amonného R k filtrátu, sraženina se vysuší ve vakuu nad oxidem fosforečným R, upráškuje se a uchovává v suchu buď v zatavených ampulkách, nebo ve vakuu nad oxidem fosforečným R.