Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

P - nalezený obsah dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného v g/l, viz zkouška Dihydrogenfosforečnan sodný,

C - nalezený obsah monohydrátu kyseliny citronové v g/l, viz zkouška Kyselina citronová,

Cʹ - nalezený obsah bezvodé kyseliny citronové v g/l, viz zkouška Kyselina citronová.

Redukující cukry. 5,0 ml se zředí vodou R na 100,0 ml. 25,0 ml tohoto roztoku se převede do 250ml kuželové baňky se zabroušenou zátkou a přidá se 25,0 ml citronanu měďnatého RS1 a několik kousků porézního materiálu. Zahřívá se 2 min pod zpětným chladičem k varu a potom se přesně 10 min vaří. Po ochlazení se přidají 3 g jodidu draselného R rozpuštěného ve 3 ml vody R a opatrně po malých dávkách se přidává 25 ml roztoku kyseliny sírové R (25%). Titruje se thiosíranem sodným 0,1 mol/ VS za použití škrobu RS jako indikátoru přidaného před koncem titrace(n1 ml). Provede se slepá zkouška s 25,0 ml vody R (n2 ml).

Obsah redukujících cukrů se vypočítá jako glukosa bezvodá nebo jako monohydrát glukosy podle potřeby s použitím tabulky 1.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných zabezpečených obalech, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• složení a objem přípravku,

• nejvyšší množství krve, které lze odebrat do obalu.

† Somatropinum pro iniectione[image omitted]

Somatropin pro injekci

Je to lyofilizovaný sterilní přípravek obsahující bílkovinu se strukturou (191 aminokyselinových zbytků) hlavní složky růstového hormonu produkovaného lidskou hypofýzou. Obsahuje 89,0 % až 105,0 % deklarovaného obsahu somatropinu^3) (C990H1528N262O300S7). Vyhovuje požadavkům článků Parenteralia a Producta ab ADN recombinante.

Výroba

Připravuje se ze somatropinu nebo z roztoku somatropinu nebo biotechnologicky metodou založenou na rekombinaci DNK (rDNK), při které je injekční přípravek připravován bez izolace pevných nebo tekutých meziproduktů. V posledním případě se při vývoji výroby prokáže vhodnou validovanou metodou stanovení biologické účinnosti založenou na stimulaci růstu a schválenou oprávněnou autoritou, že látka získaná daným výrobním postupem má biologickou účinnost nejméně 2,5 m.j. v miligramu. Přečištěný přípravek, popř. s přidanými tlumivými roztoky nebo stabilizujícími přísadami, se filtruje filtrem zachycujícím bakterie, asepticky se rozplňuje do sterilních nádob ze skla třídy I (3.2.1) a provede se lyofilizace. Nádoby se ihned uzavřou tak, aby přípravek byl chráněn před mikrobiální kontaminací a vlhkostí.

Před propuštěním se na každé šarži provedou následující zkoušky, pokud oprávněná autorita neudělí výjimku:

Bílkoviny hostitelské buňky. Požadavek stanoví oprávněná autorita.

DNK hostitelské buňky a vektoru. Požadavek stanoví oprávněná autorita.

Pokud se somatropin pro injekci připravuje ze somatropinu nebo z roztoku somatropinu a byla vydána výjimka oprávněnou autoritou, nemusí výrobce injekčního přípravku provádět zkoušku totožnosti C.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek.

Zkoušky totožnosti

A. Vyhodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Izoelektrická fokusace. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá hlavní zóna polohou hlavní zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (c) je pouze jedna hlavní zóna.

B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné bílkoviny. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

C. Provede se peptidové mapování.

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušeného přípravku v tlumivém roztoku trisacetatovém o pH 8,5 tak, aby obsahoval 2,0 mg v mililitru. Asi 1,0 ml takto připraveného roztoku se přenese do zkumavky z vhodného materiálu, např. polypropylenu. Připraví se čerstvý roztok trypsinu pro peptidové mapování R (1 g/l) ve vhodném tlumivém octanovém roztoku o pH asi 5,0 a 30 μl se přidá k roztoku zkoušené látky. Zkumavka se uzavře a vloží se na 4 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se zkumavka vyjme z vodní lázně a ihned se probíhající reakce přeruší přidáním 200 μl kyseliny octové ledové R.

Porovnávací roztok. Současně se za stejných podmínek připraví porovnávací roztok s tím rozdílem, že zkoušený přípravek se nahradí somatropinem CRL.

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),

• mobilní fáze, která je směsí mobilní fáze A a mobilní fáze B, které se připraví následujícím způsobem:

• mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,

• mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem R na 1000 ml.

Průtoková rychlost je 1 ml/min. Použije se následující gradient:

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
0	100	0
20	80	20
40	75	25
65	50	50

• detektoru spektrofotometrického, 214 nm.

Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází A. Potom se kolona promývá za použití výše uvedeného gradientu a pokračuje se v promývání po dobu 5 min s průběžně se zvyšující koncentrací mobilní fáze B až na 80 %. Potom se kolona opět promývá mobilní fází A po dobu 15 min. Nastříkne se odděleně po 100 μl obou roztoků. Na konci gradientově eluce a před dalším nástřikem se zvýší koncentrace mobilní fáze B na 80 % v průběhu 5 min a poté se kolona 15 min promývá mobilní fází A.

Chromatogram zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy jednotlivých roztoků kvalitativně odpovídají porovnávacímu chromatogramu dodávanému se somatropinem CRL.

D. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografíe (2.2.29).

Zkoušený roztok (a). Připraví se roztok zkoušeného přípravku v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). 100 μl zkoušeného roztoku (a) se zředí tlumivým roztokem trometamolovým o pH 7,5 (1) na 1,5 ml.

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg.

Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg. K takto připravenému roztoku se přidá čerstvě připravený koncentrovaný roztok peroxidu vodíku R tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace 0,01 % (V/V) a nechá se 5 h stát při 4 ° C. Potom se na mililitr roztoku přidá 4,5 mg L-methioninu R.

Roztoky se uchovávají při teplotě 2 °C až 8 °C a použijí se do 24 h. Pokud se používá automatický dávkovač, je nutno jej udržovat při teplotě 2 °C až 8 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),

• mobilní fáze, která je směsí objemových dílů 1-propanolu R a tlumivého roztoku trometamolového o pH 7,5 (1) (29 + 71), s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min,

• detektoru spektrofotometrického, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje na 45 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Je-li třeba, upraví se koncentrace 1-propanolu v mobilní fázi tak, aby retenční čas hlavního píku byl (33 ± 3) min. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Určí se píky pomocí porovnávacího chromatogramu dodávaného se somatropinem CRL. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi somatropinem a jeho oxidačním produktem je nejméně 1,0.

Nastříkne se po 20 μl všech roztoků a zaznamenávají se chromatogramy po dobu nejméně 50 min. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) (6,67 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) (13 %). Nepřihlíží se k píku rozpouštědla.

Dimer a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30), jak je popsána ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 50 μl porovnávacího roztoku (a). Citlivost detektoru se nastaví tak, aby výška hlavního píku dosahovala 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače. Rozlišení dané poměrem výšky minima mezi píky monomeru a dimeru k výšce dimeru je menší než 0,6 (relativní retenční časy vztažené k monomeru jsou přibližně 0,94 pro dimer a 0,87 pro polymery). Několikrát se nastříkne porovnávací roztok (a) (nejméně třikrát); zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy hlavního píku je nejvýše 2,5 %.

Nastříkne se po 50 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch všech píků s retenčním časem menším než je retenční čas hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (6,0 %).

Izoelektrická fokusace. Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok (a). Připraví se roztok zkoušeného přípravku v roztoku hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg.

Zkoušený roztok (b). 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) na 1,5 ml.

Zkoušený roztok (c). Smíchá se 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) a 0,1 ml porovnávacího roztoku. Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL ve vodě R tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg.

Roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5. Připraví se a použije podle návodu výrobce.

Se zařízením se pracuje podle návodu výrobce. Izoelektrická fokusace se provádí na hotových deskách s vrstvou gelu o rozměrech 245 mm x 110 mm x 1 mm a pH v rozmezí 4,0 až 6,5. Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 μl každého roztoku. Jako anodický roztok se použije roztok kyseliny glutamové R (147,1 g/l) v roztoku kyseliny fosforečné R (50 g H3PO4/l) a jako katodický roztok se použije roztok β-alaninu R (89,1 g/l). Pracovní podmínky se nastaví na 2000 V a 25 mA. Nechá se proběhnout fokusace při konstantním napětí po dobu 2,5 h. Vrstva gelu se ponoří na 30 min do roztoku obsahujícího kyselinu trichloroctovou R (115 g/l) a kyselinu sulfosalicylovou R (34,5 g/l) a potom na 5 min do směsi objemových dílů kyseliny octové R, ethanolu R a deionizované vody R (8 + 25 + 67) (odbarvovací roztok). Vrstva gelu se vybarvuje ponořením na 10 min do roztoku modře kyselé 83 R (1,15 g/l) v odbarvovacím roztoku zahřátého na 60 °C a potom se ponoří do odbarvovacího roztoku do odstranění nadbytku barviva. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón roztoku pro kalibraci izoelektrického bodu odpovídá požadavkům výrobce. Na eletroforeogramu porovnávacího roztoku je viditelná hlavní zóna s izoelektrickým bodem okolo 5 a kyselejší menší zóna okolo 4,8. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) žádná zóna, kromě hlavní zóny, nepřevyšuje svou intenzitou hlavní zónu na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (b) (6,25 %).

Voda. Nejvýše 3,0 %. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití methanolu bezvodého R jako vnitřního standardu. Použije se suché skleněné nádobí, které může mít vrstvu silikonu.

Roztok vnitřního standardu. 15 μl methanolu bezvodého R se zředí 2-propanolem R1 na 100 ml.

Zkoušený roztok (a). 1,0 mg zkoušeného přípravku se suspenduje v 0,1 ml 2-propanolu R1, 30 min se třepe a potom se odstřeďuje; použije se čirá supernatantní tekutina.

Zkoušený roztok (b). 1,0 mg zkoušeného přípravku se suspenduje v 0,1 ml roztoku vnitřního standardu, 30 min se třepe a potom se odstřeďuje; použije se čirá supernatantní tekutina.

Porovnávací roztok. 10 μl vody R se přidá k 50 ml roztoku vnitřního standardu.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 1 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné styrendivinylbenzen kopolymerem R (180 μm až 250 μm),

• helia pro chromatografií R jako nosného plynu,

• tepelně vodivostního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 120 °C a teplota detektoru na 150 °C.

Nastříkne se zvolený objem všech roztoků. Vypočítá se obsah vody za předpokladu, že hustota vody (2.2.5) je při 20 °C 0,997 g/ml a odečte se množství vody obsažené v roztoku vnitřního standardu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 5 m.j. endotoxinu v miligramu účinné látky.

Stanovení obsahu

Stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v roztoku hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg.

Porovnávací roztok (a). 300 μl zkoušeného roztoku se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) na 5,0 ml.

Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok somatropinu CRL v roztoku hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky asi 0,25 m a vnitřního průměru 9,4 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografií R jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin v rozmezí molekulové hmotnosti 5000 až 60 000,

• mobilní fáze, kterou je zfiltrovaný a odplyněný roztok hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l), s průtokovou rychlostí 0,6 ml/min,

• detektoru spektrofotometrického, 214 nm.

Nastříkne se 50 μl porovnávacího roztoku (b). Citlivost detektoru se nastaví tak, aby výška hlavního píku dosahovala nejméně poloviny celé stupnice zapisovače. Několikrát se nastříkne porovnávací roztok (b) (nejméně třikrát); zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy píku somatropinu je nejvýše 2,5 %. Nastřikuje se střídavě po 50 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b).

Obsah se vypočítá z ploch píků na chromatogramu zkoušeného roztoku a na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) a deklarovaného obsahu C990H1528N262O300S7 v somatropinu CRL.

Uchovávání

Ve sterilních zabezpečených obalech, při teplotě 2 °C až 8 °C.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• obsah somatropinu v miligramech,

• složení a objem rozpouštědla přidaného k rekonstituci,

• doba, po kterou lze rekonstituovaný roztok použít, a podmínky uchovávání po tuto dobu,

• název a množství jakýchkoliv přísad,

• teplota uchovávání,

• zda přípravek během rozpouštění nemá být protřepáván,

• účinnost v mezinárodních jednotkách.

† Stramonii pulvis normatus[image omitted]

Práškovaný durmanový list titrovaný

Je to práškovaný (180) list durmanu, jehož obsah alkaloidů je upraven přidáním laktosy nebo drogy s nižším obsahem alkaloidů tak, aby celkový obsah alkaloidů, počítáno jako hyoscyamin (C17H23NO3; Mr 289,4), činil 0,23 % až 0,27 %, vztaženo na vysušenou drogu.

Vlastnosti

Droga má nepříjemný pach.

Mikroskopický popis, viz Zkouška totožnosti A.

Zkoušky totožnosti

A. Prášek je šedozelený. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: úlomky pokožky čepele listu s buňkami se stěnami mírně vlnitě zprohýbanými a s hladkou kutikulou; anizocytické a anomocytické průduchy (2.8.3) četnější na spodní straně listu, krycí chlupy kuželovité, jednořadé, tříbuněčné až pětibuněčné, s bradavčitými stěnami. Žláznaté chlupy krátké, paličkovité, s dvoubuněčnou až sedmibuněčnou hlavičkou. Dorziventrální mezofyl s jednou řadou palisádových buněk, houbový parenchym s drúzami šťavelanu vápenatého; kruhovitě a šroubovité ztlustlé cévy. Vlákna a síťovitě ztlustlé cévy stonku; kulovitá pylová zrna zpravidla 60 μl až 80 μm v průměru, se třemi klíčními póry a téměř hladkou exinou. Úlomky koruny s papilózní pokožkou; úlomky semene obsahující žlutohnědé zprohýbané silnostěnné sklereidy osemení; občas krystaly a písek šťavelanu vápenatého.

Při hodnocení v glycerolu 85% R mohou být patrné krystalky laktosy.

B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Chromatografie, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou, zbarvením i velikostí hlavním skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku při nanášce shodných objemů.

C. 1 g se protřepává 2 min s 10 ml kyseliny sírové 0,05 mol/l RS a zfiltruje se. K filtrátu se přidá 1 ml amoniaku 26% R a 5 ml vody R. Opatrně se protřepává s 15 ml etheru prostého peroxidických látek R tak, aby se netvořila emulze. Vrchní vrstva se oddělí a vysuší síranem sodným bezvodým R Zfiltruje se a ether se odpaří na porcelánové misce. Přidá se 0,5 ml kyseliny dusičné R a odpaří se na vodní lázni do sucha. Přidá se 10 ml acetonu R a po kapkách roztok hydroxidu draselného (30 g/l) v lihu 96% R vznikne tmavě fialové zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Chromatografie. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

Zkoušený roztok. 1,0 g se protřepává 15 min s 10 ml kyseliny sírové 0,05 mol/l RS. Roztok se zfiltruje a filtr se promývá kyselinou sírovou 0,05 mol/l RS až do konečného objemu 25 ml filtrátu. Přidá se 1 ml amoniaku 26% R a pak se protřepává dvakrát 10 ml etheru prostého peroxidických látek R, je-li třeba, oddělí se vrstvy odstřeďováním. Spojené etherové výtřepky se vysuší síranem sodným bezvodým R. Zfiltruje se a filtrát se odpaří na vodní lázni do sucha. Zbytek se rozpustí v 0,5 ml methanolu R.

Porovnávací roztok. 50 mg hyoscyaminiumsulfatu R se rozpustí v 9 ml methanolu R. 15 mg skopolaminiumbromidu R se rozpustí v 10 ml methanolu R. 3,8 ml roztoku hyoscyaminiumsulfatu a 4,2 ml roztoku skopolaminiumbromidu se zředí methanolem R na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů (20 mm x 3 mm) po 10 μl a 20 μl obou roztoků; vzdálenost mezi jednotlivými pruhy je 1 cm. Vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, vody R a acetonu R (3 + 7 + 90) po dráze 10 cm. Vrstva se suší 15 min při 100 °C až 105 °C. Po ochlazení se postříká asi 10 ml jodobismutitanu draselného RS2 do vzniku oranžových nebo hnědých skvrn na žlutém pozadí. Skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou (hyoscyamin v dolní třetině, skopolamin v horní třetině chromatogramu) a zbarvením skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku. Skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku nepřevyšují velikostí skvrny na chromatogramu porovnávacího roztoku při nanášce shodných objemů. Na chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být patrny další slabě zbarvené skvrny; při nanášce 20 μl ve střední části chromatogramu, při nanášce 10 μl v blízkosti startu. Vrstva se postříká dusitanem sodným RS tak, aby byla průsvitná. Pozoruje se po 15 min. Skvrny odpovídající hyoscyaminu na chromatogramech zkoušeného i porovnávacího roztoku se zbarví červenohnědě, ne však šedomodře (atropin), další skvrny již nejsou patrné.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 20,0 %.

Popel nerozpustný v kyselině chlorovodíkové (2.8.1). Nejvýše 4,0 %.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 5,0 %; 1,000 g drogy se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Stanovení obsahu

10,00 g se navlhčí směsí složenou z 5 ml amoniaku 17% RS, 10 ml lihu 96% R a 30 ml etheru prostého peroxidických látek R, důkladně se promíchá. Směs se převede do vhodného perkolátoru, je-li třeba pomocí extrakční směsi, a nechá se 4 h stát. Pak se perkoluje směsí složenou z objemových dílů chloroformu R a etheru prostého peroxidických látek R (1 + 3) tak dlouho, dokud vytékající perkolát reaguje pozitivně na přítomnost alkaloidů. Několik mililitrů perkolátu se odpaří do sucha, zbytek se rozpustí v kyselině sírové 0,25 mol/l RS a nepřítomnost alkaloidů se ověří tetrajodortuťnatanem draselným RS. Perkolát se zahustí na vodní lázni na objem asi 50 ml a převede se do dělicí nálevky pomocí etheru prostého peroxidických látek R. Přidá se ether prostý peroxidických látek R tak, aby jeho objem tvořil nejméně 2,lnásobek objemu perkolátu a aby tekutina měla hustotu zřetelně nižší než voda. Protřepe se nejméně třikrát 20 ml kyseliny sírové 0,25 mol/l RS, je-li třeba, oddělí se vrstvy odstřeďováním. Spojené spodní vrstvy se převedou do druhé dělicí nálevky, zalkalizují se amoniakem 17% RS a vytřepávají se třikrát 30 ml chloroformu R. Ke spojeným chloroformovým výtřepkům se přidají 4 g síranu sodného bezvodého R a nechá se stát 30 min za občasného protřepávání. Chloroform se slije a síran sodný se promyje třikrát 10 ml chloroformu R. Spojené chloroformové roztoky se odpaří na vodní lázni do sucha, odparek se suší 15 min v sušárně při 100 °C až 105 °C. Odparek se rozpustí v několika mililitrech chloroformu R, přidá se 20,0 ml kyseliny sírové 0,01 mol/l RS a chloroform R se odstraní zahřátím na vodní lázni. Přidá se červeň methylová směsný indikátor RS a titruje se hydroxidem sodným 0,02 mol/l VS.

Celkový obsah alkaloidů v procentech, počítáno jako hyoscyamin C17H23NO3, se vypočítá ze vztahu:

57,88 . 20-n100-d . m ,

v němž značí:

d - ztrátu sušením v procentech,

n - spotřebu hydroxidu sodného 0,02 mol/l VS v mililitrech,

m - navážku drogy v gramech.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Tuberculini aviarii derivatum proteinosum purificatum[image omitted]

Derivát purifikovaného proteinu aviárního tuberkulinu

Je to přípravek získaný ze zahřátého produktu kultivace a lýzy Mycobacterium avium, který má schopnost dokázat opožděnou přecitlivělost u zvířat senzibilizovaných proti mikroorganismům stejného druhu.

Výroba

Získává se z frakcí rozpustných ve vodě a připravených zahříváním ve volně proudící páře a následnou filtrací kultur M. avium vyrostlých v tekuté syntetické živné půdě. Účinná frakce filtrátu, kterou tvoří především bílkoviny, se izoluje srážením, promýváním a znovu se rozpouští. Může se přidat protimikrobní konzervační látka, která nevyvolává falešné pozitivní reakce, jako je např. fenol. Konečný sterilní přípravek, prostý mykobakterií, se asepticky rozplní do sterilních skleněných obalů, které se poté uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci. Přípravek se může lyofilizovat.

Zkouška totožnosti, zkoušky na čistotu a stanovení účinnosti se provádějí u tekutého přípravku nebo lyofilizovaného přípravku po rozpuštění podle návodu.

Zkouška totožnosti

Vhodným způsobem senzibilizovaným morčatům-albínům o hmotnosti nejméně 250 g se intradermálně vstříknou na několik míst odstupňované dávky zkoušeného přípravku. V místě podání se za 24 h až 28 h objeví reakce ve tvaru edematózních otoků se zarudnutím a případně s nekrózou. Velikost a závažnost reakce se mění podle dávky. U nesenzibilizovaných morčat podobné injekce nevyvolají žádnou reakci.

Zkouška čistoty

Hodnota pH (2.2.3). 6,5 až 7,5.

Fenol (2.5.15). Nejvýše 5 g/l, pokud se použil při přípravě.

Senzibilizace. Použijí se tři morčata, která nebyla podrobena žádnému léčení, jež by mohlo ovlivnit tuto zkoušku. V pětidenních intervalech se třikrát intradermálně vstříkne po asi 500 m.j. zkoušeného přípravku v objemu 0,1 ml. Za 15 dnů až 21 dnů po třetím podání se intradermálně vstříkne stejná dávka stejným morčatům a kontrolní skupině tří morčat stejné hmotnosti, kterým tuberkulin nebyl dříve podán. Za 24 h až 28 h nejsou reakce u těchto 2 skupin zvířat významně odlišné.

Toxicita. 0,5 ml se subkutánně vstříkne dvěma zdravým morčatům o hmotnosti nejméně 250 g, která nebyla podrobena žádnému léčení, jež by mohlo ovlivnit tuto zkoušku. Zvířata se pozorují 7 dnů; není vyvolán žádný nežádoucí účinek.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním reakcí vyvolaných intradermálním podáním stoupajících dávek zkoušeného přípravku senzibilizovaným morčatům s reakcemi vyvolanými podáním známých koncentrací vhodného referenčního přípravku derivátu purifikovaného proteinu aviárního stejného původu kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Nejméně devět morčat-albínů o živé hmotnosti 400 g až 600 g je senzibilizováno hluboko intramuskulárně podáním vhodné dávky inaktivovaného nebo živého kmene M. avium. Nejdříve 4 týdny po senzibilizaci se morčata vyholí na obou bocích těla tak, aby se na každé straně získalo místo pro nejvýše čtyři injekce. Zkoušený a referenční přípravek se ředí tlumivým izotonickým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným (pH 6,5 až 7,5), který obsahuje polysorbát 80 R v koncentraci 0,005 g/l. Použijí se nejméně tři dávky referenčního a tři dávky zkoušeného přípravku. Dávky se zvolí tak, aby průměr lézí jimi vyvolaných byl nejméně 8 mm a nejvýše 25 mm. Ředění se podávají náhodně podle zásad latinského čtverce. Každá dávka se vstříkne intradermálně v konstantním objemu 0,1 ml nebo 0,2 ml. Průměr lézí se měří za 24 h až 28 h a výsledek zkoušky se vypočítá obvyklými statistickými metodami za předpokladu, že průměry lézí jsou přímo úměrné k logaritmu koncentrace tuberkulinů.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) je nejméně 50 % až 200 % nalezené účinnosti. Nalezená účinnost je 75 % až 133 % deklarované účinnosti. Deklarovaná účinnost je nejméně 20 000 m.j. v mililitru.

Uchovávání

Při teplotě (5 ± 3) °C, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• účinnost v mezinárodních jednotkách v mililitru,

• název a množství každé přidané látky,

• u lyofilizovaného přípravku:

• název a objem rozpouštědla, které se má přidat,

• že přípravek se použije ihned po rozpuštění.

Tuberculini bovini derivatum proteinosum purificatum[image omitted]

Derivát purifikovaného proteinu bovinního tuberkulinu

Je to přípravek získaný z tepelně ošetřeného produktu kultivace a lýzy Mycobacterium bovis, který má schopnost prokázat opožděnou přecitlivělost u zvířat senzibilizovaných proti mikroorganismům stejného druhu.

Výroba

Získává se z frakcí rozpustných ve vodě a připravených zahříváním ve volně proudící páře a následnou filtrací kultur M. bovis vyrostlých v tekuté syntetické živné půdě. Účinná frakce filtrátu, kterou tvoří především bílkoviny, se izoluje srážením, promýváním a znovu se rozpouští. Může se přidat protimikrobní konzervační látka, která nevyvolává falešné pozitivní reakce, jako je např. fenol. Konečný sterilní přípravek, prostý mykobakterií, se asepticky rozplní do sterilních skleněných obalů, které se poté uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci. Přípravek se může lyofilizovat.

Zkouška totožnosti, zkoušky na čistotu a stanovení účinnosti se provádějí u tekutého přípravku nebo lyofilizovaného přípravku po rozpuštění podle návodu.

Zkouška totožnosti

Vhodným způsobem senzibilizovaným morčatům-albínům o hmotnosti nejméně 250 g se intradermálně vstříknou na několik míst odstupňované dávky zkoušeného přípravku. V místě podání se za 24 h až 28 h objeví reakce ve tvaru edematózních otoků se zarudnutím a případně s nekrózou. Velikost a závažnost reakce se mění podle dávky. U nesenzibilizovaných morčat podobné injekce nevyvolají žádnou reakci.

Zkouška čistoty

Hodnota pH (2.2.3). 6,5 až 7,5.

Fenol (2.5.15). Nejvýše 5 g/l, pokud se použil při přípravě.

Senzibilizace. Použijí se tři morčata, která nebyla podrobena žádnému léčení, jež by mohlo ovlivnit tuto zkoušku. V pětidenních intervalech se třikrát intradermálně vstříkne asi 500 m.j. zkoušeného přípravku v objemu 0,1 ml. Za 15 dnů až 21 dnů po třetím podání se intradermálně vstříkne stejná dávka stejným morčatům a kontrolní skupině tří morčat stejné hmotnosti, kterým tuberkulin nebyl dříve podán. Za 24 h až 28 h nejsou reakce u těchto 2 skupin zvířat významně odlišné.

Toxicita. 0,5 ml se subkutánně vstříkne dvěma zdravým morčatům o hmotnosti nejméně 250 g, která nebyla podrobena žádnému léčení, jež by mohlo ovlivnit tuto zkoušku. Zvířata se pozorují 7 dnů; není vyvolán žádný nežádoucí účinek.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním reakcí vyvolaných intradermálním podáním stoupajících dávek zkoušeného přípravku senzibilizovaným morčatům s reakcemi vyvolanými známými koncentracemi derivátu purifikovaného proteinu bovinního tuberkulinu BRP nebo referenčního přípravku, který je kalibrován v jednotkách Evropského lékopisu.

Nejméně 9 morčat-albínů o živé hmotnosti 400 g až 600 g je senzibilizováno hluboko intramuskulárně dávkou 0,0001 mg vlhké masy živého M. bovis-kmen AN5 resuspendované v 0,5 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Nejdříve 4 týdny po senzibilizaci se morčata vyholí na obou bocích těla tak, aby se na každé straně získalo místo pro nejvýše čtyři injekce. Zkoušený a referenční přípravek se ředí tlumivým izotonickým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným (pH 6,5 až 7,5), který obsahuje polysorbát 80 R v koncentraci 0,005 g/l. Použijí se nejméně tři dávky referenčního a tři dávky zkoušeného přípravku. Dávky se zvolí tak, aby průměr lézí jimi vyvolaných byl nejméně 8 mm a nejvýše 25 mm. Ředění se podávají náhodně podle zásad latinského čtverce. Každá dávka se vstříkne intradermálně v konstantním objemu 0,1 ml nebo 0,2 ml. Průměr lézí se měří za 24 h až 28 h a výsledek zkoušky se vypočítá obvyklými statistickými metodami za předpokladu, že průměry lézí jsou přímo úměrné k logaritmu koncentrace tuberkulinů.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) je nejméně 50 % až 200 % nalezené účinnosti. Nalezená účinnost je 66 % až 150 % deklarované účinnosti. Deklarovaná účinnost je nejméně 20 000 Ph.Eur. jednotek v mililitru.

Uchovávání

Při teplotě (5 ± 3) °C, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• účinnost v Ph.Eur. jednotkách v mililitru,

• název a množství každé přidané látky,

• u lyofilizovaného přípravku:

• název a objem rozpouštědla, které se má přidat,

• že přípravek se použije ihned po rozpuštění.

Tuberculini derivatum proteinosum purificatum ad usum humanum [image omitted]

Derivát purifikovaného proteinu tuberkulinu pro humánní použití

Je to přípravek získaný ze zahřátého produktu kultivace a lýzy jednoho nebo více kmenů Mycobacterium tuberculosis, který má schopnost prokázat opožděnou přecitlivělost u zvířat senzibilizovaných proti mikroorganismům stejného druhu.

Výroba

Připravuje se z frakcí rozpustných ve vodě získaných tepelným zpracováním v proudící páře nebo autoklávu z kultur mykobakterií v tekuté syntetické živné půdě. Dále se filtruje. Účinná frakce filtrátu, kterou tvoří především bílkoviny, se izoluje srážením a promýváním a znovu se rozpouští. Přípravek neobsahuje mykobakteria. Může se přidat protimikrobní konzervační látka, která nevyvolává falešně pozitivní reakce, jako je např. fenol v koncentraci 5 g/l, a vhodný stabilizátor, který zabrání adsorpci na povrch ze skla nebo plastu. Konečný sterilní přípravek se asepticky rozplní do sterilních skleněných obalů, které se poté uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci. Přípravek j e bezbarvá nebo světle žlutá tekutina. Zředěný přípravek se může lyofilizovat. Do přípravků, které mají být lyofilizovány, se fenol nepřidává.

Koncentrovaná forma zkoušeného přípravku vyhovuje zkoušce totožnosti, zkouškám na čistotu a požadavku na účinnost uvedeným dále; zředěný přípravek vyhovuje zkoušce totožnosti, zkouškám na hodnotu pH, na obsah fenolu a na sterilitu a požadavku na účinnost uvedeným dále.

Zkoušky totožnosti

Zdravým bílým nebo světle zbarveným morčatům specificky senzibilizovaným se intradermálně vstříknou odstupňované dávky zkoušeného přípravku. V místě podání vznikne reakce přecházející z erytému až do nekrózy. U nesenzibilizovaných morčat podobné injekce nevyvolají žádnou reakci.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). Hodnota pH tekuté formy a lyofilizované formy po rozpuštění podle návodu je 6,5 až 7,5.

Fenol (2.5.15). Nejvýše 5 g/l, pokud se použil při přípravě.

Živé mykobakterie. Dvěma morčatům o hmotnosti 300 g až 400 g se intraperitoneálně nebo subkutánně vstříkne 5,0 ml. Zvířata se pozorují nejméně 42 dnů, potom se usmrtí a pitvají. Žádné ze zvířat nemá známky infekce mykobakteriemi.

Na vhodných živných půdách se provede zkouška na přítomnost živých mykobakterií ve zkoušeném přípravku. Výsledek zkoušky je negativní.

Senzibilizace. Použijí se tři morčata, která nebyla podrobena žádnému léčení, jež by mohlo ovlivnit tuto zkoušku. V pětidenních intervalech se třikrát intradermálně vstříkne asi 500 m.j. zkoušeného přípravku v objemu 0,1 ml. Za dva až tři týdny po třetím podání se intradermálně vstříkne stejná dávka stejným morčatům a kontrolní skupině tří morčat stejné hmotnosti, kterým tuberkulin nebyl dříve podán. Za 48 h až 72 h nejsou reakce u těchto dvou skupin zvířat výrazně odlišné.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Toxicita. 50 000 m.j. se subkutánně vstříkne dvěma zdravým morčatům o hmotnosti 250 g až 350 g, která nebyla podrobena žádnému léčení, jež by mohlo ovlivnit tuto zkoušku. Zvířata se pozorují 7 dnů; není vyvolán žádný nežádoucí účinek.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním reakcí vyvolaných intradermálním podáním stoupajících dávek zkoušeného přípravku senzibilizovaným morčatům s reakcemi vyvolanými podáním známých koncentrací vhodného referenčního přípravku derivátu purifikovaného proteinu tuberkulinu stejného původu kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, jejichž účinnost u člověka je klinicky prokázána.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

V minerálním oleji s emulgátorem nebo bez něho se připraví suspenze, která v mililitru obsahuj e 0,1 mg teplem inaktivovaných, vysušených mykobakterií kmene stejného typu jako ve zkoušeném přípravku. Senzibilizuje se nejméně šest světle zbarvených morčat vážících nejméně 400 g intramuskulárním nebo intradermálním podáním celkově asi 0,5 ml suspenze rozdělené, pokud je to nutné, i do několika míst. Zkouška se provádí nejdříve zajeden měsíc a nejdéle za šest měsíců po senzibilizaci. Depilují se boky morčat tak, aby se mohly podat nejméně tři injekce na každou stranu, ale nejvýše dvanáct injekcí jednomu zvířeti. Připraví se ředění zkoušeného přípravku a referenčního přípravku v tlumivém izotonickém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným (pH 6,5 až 7,5), který obsahuje 0,05 g/l polysorbátu 80. Jestliže zkoušený přípravek je lyofilizovaný a neobsahuje stabilizátor, rozpustí se ve výše uvedeném tlumivém roztoku. Použijí se nejméně tři dávky referenčního přípravku a nejméně tři dávky zkoušeného přípravku. Nejvyšší dávka u obou přípravků je asi desetinásobkem nejnižší dávky. Vyberou se takové dávky, aby reakce po podání měly průměr nejméně 8 mm a nejvýše 25 mm. U jakékoliv zkoušky se pořadí podávaných koncentrací vybírá náhodně podle latinského čtverce. Každá dávka se vstříkne intradermálně v konstantním objemu 0,1 ml nebo 0,2 ml. Průměr lézí se měří za 24 h až 48 h a výsledek zkoušky se počítá obvyklými statistickými metodami za předpokladu, že průměry lézí jsou přímo úměrné logaritmu koncentrace zkoušeného přípravku.

Stanovená hodnota účinnosti je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) je nejméně 64 % a nejvýše 156 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Při teplotě (5 ± 3) °C, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet mezinárodních jednotek v mililitru,

• typ mykobakteria použitého při přípravě přípravku,

• název a množství protimikrobních konzervačních látek a jiných látek přidaných k přípravku,

• u lyofilizovaných přípravků údaj, že se přípravek rozpustí v roztoku, který dodává výrobce.

Jestliže balení neobsahuje příbalový leták s upozorněním, že inhalace koncentrovaného derivátu purifikovaného proteinu tuberkulinu může vyvolat toxickou reakci, je toto upozornění uvedeno v označení na obalu společně s údajem o opatrnosti při zacházení s lyofilizátem.

Výstraha: Derivát purifikovaného proteinu tuberkulinu se nepodává neředěný.

Tuberculinum pristinum ad usum humanum [image omitted]

Starý tuberkulin pro humánní užití

Synonyma. Kochův starý tuberkulin, Tuberculinum Koch vetus

Je to zahřátím koncentrovaný filtrát obsahující rozpustné produkty kultury a lýzy jednoho nebo více kmenů mykobakterií.

Výroba

Připravuje se z kultur vyrostlých v tekuté živné půdě, kterou může být bujon s glycerolem nebo syntetická živná půda. Růst kultury je rychlý a hojný. Kultury se inaktivují v autoklávu nebo proudící parou nejméně 1 h při 100 °C. Tekutá kultura, ze které mikroorganismy mohou být odstraněny filtrací nebo nemusí, se koncentruje odpařením obvykle na 1/10 původního objemu, dále se přidává fenol v koncentraci 5 g/l nebo jiná vhodná protimikrobní konzervační látka, která nevyvolá falešně pozitivní reakce. Přípravek se filtruje, kvantitativně analyzuje a ředí. Konečný sterilní přípravek se asepticky rozplní do sterilních skleněných obalů, které jsou poté uzavřeny tak, aby se předešlo kontaminaci. Neobsahuje mykobakteria. Přípravek je čirá, viskózní, žlutá až hnědá tekutina.

Koncentrovaná forma zkoušeného přípravku vyhovuje zkoušce totožnosti, zkouškám na čistotu a požadavku na účinnost uvedeným dále; zředěný přípravek vyhovuje zkoušce totožnosti, zkouškám na obsah fenolu a na sterilitu a požadavku na účinnost, které jsou uvedeny dále.

Zkouška totožnosti

Zdravým bílým nebo světle zbarveným morčatům specificky senzibilizovaným se intradermálně vstříknou odstupňované dávky zkoušeného přípravku. V místě podání vznikne reakce přecházející z erytému až do nekrózy. U nesenzibilizovaných morčat podobné injekce nevyvolají žádnou reakci.

Zkoušky na čistotu

Fenol (2.5.15). Nejvýše 5 g/l, pokud byl použit při přípravě.

Živá mykobakteria. Třem morčatům o hmotnosti 300 g až 400 g se intraperitoneálně nebo subkutánně vstříkne 1,0 ml. Zvířata se pozorují nejméně 42 dnů, potom se usmrtí a pitvají. Žádné ze zvířat nemá známky infekce mykobakteriemi.

Na vhodných živných půdách se provede zkouška na přítomnost živých mykobakterií ve zkoušeném přípravku. Výsledek zkoušky je negativní.

Senzibilizace. Použijí se tři morčata, která nebyla podrobena žádnému léčení, jež by mohlo ovlivnit tuto zkoušku. V pětidenních intervalech se třikrát intradermálně vstříkne asi 500 m.j. zkoušeného přípravku v objemu 0,1 ml. Za dva až tři týdny po třetím podání se intradermálně vstříkne stejná dávka stejným morčatům a kontrolní skupině tří morčat stejné hmotnosti, kterým tuberkulin nebyl dříve podán. Za 48 h až 72 h nejsou reakce u těchto 2 skupin zvířat výrazně odlišné.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Toxicita. 0,5 ml se subkutánně vstříkne dvěma zdravým morčatům o hmotnosti 250 g až 350 g, která nebyla podrobena žádnému léčení, jež by mohlo ovlivnit tuto zkoušku. Zvířata se pozorují 7 dnů; není vyvolán žádný nežádoucí účinek.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním reakcí vyvolaných intradermálním podáním stoupajících dávek zkoušeného přípravku senzibilizovaným morčatům s reakcemi vyvolanými podáním známých koncentrací vhodného referenčního přípravku starého tuberkulinu stejného původu kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, jejichž účinnost u člověka je klinicky prokázána.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

V minerálním oleji s emulgátorem nebo bez něho se připraví suspenze, která v mililitru obsahuje 0,1 mg teplem inaktivovaných, vysušených mykobakterií kmene stejného typu jako ve zkoušeném přípravku. Senzibilizuje se nejméně šest světle zbarvených morčat vážících nejméně 400 g intramuskulárním nebo intradermálním podáním celkově asi 0,5 ml suspenze rozdělené, pokud je to nutné, i do několika míst. Zkouška se provádí nejdříve za jeden měsíc a nejdéle za šest měsíců po senzibilizaci. Depilují se boky morčat tak, aby se mohly podat nejméně tři injekce na každou stranu, ale nejvýše dvanáct injekcí jednomu zvířeti. Použijí se nejméně tři dávky referenčního přípravku a nejméně tři dávky zkoušeného přípravku. Nejvyšší dávka u obou přípravků je asi desetinásobkem nejnižší dávky. Vyberou se takové dávky, aby reakce po podání měly průměr nejméně 8 mm a nejvýše 25 mm. U jakékoliv zkoušky se pořadí podávaných koncentrací vybírá náhodně podle latinského čtverce. Každá dávka se vstříkne intradermálně v konstantním objemu 0,1 ml nebo 0,2 ml. Průměr lézí se měří za 24 h až 48 h a výsledek zkoušky se počítá obvyklými statistickými metodami za předpokladu, že průměry lézí jsou přímo úměrné logaritmu koncentrace zkoušeného přípravku.

Stanovená hodnota účinnosti je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) je nejméně 64 % a nejvýše 156 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Při teplotě (5 ± 3) °C, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet mezinárodních jednotek v mililitru,

• typ mykobakteria použitého při přípravě přípravku,

• název a množství protimikrobních konzervačních látek a jiných látek přidaných k přípravku.

Výstraha: Starý tuberkulin nesmí být vstříknut v koncentrované formě, ale zředěný tak, aby se podala 1 m.j. až 100 m.j. v jedné dávce.

Vaccinum anthracis vivum ad usum veterinarium [image omitted]

Živá vakcína proti snětí slezinné pro veterinární použití

Je to suspenze živých spor oslabeného neopouzdřeného kmene Bacillus anthracis.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Použitý kmen buď není letální ani pro morčata ani pro myši, nebo je letální pro morčata, ale není letální pro králíky, nebo je letální jen pro některé králíky.

B. anthracis se kultivuje ve vhodné živné půdě. Na konci růstu se spory suspendují ve stabilizačním roztoku a spočítají se. Do přípravku se může přidávat adjuvans.

Zkoušky totožnosti

B. anthracis přítomný ve zkoušeném přípravku se identifikuje morfologicky, sérologicky, kultivačně a biochemickými zkouškami.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Zkouška se provádí na jednom z druhů zvířat, pro který je zkoušený přípravek určen. Pokud je určen pro několik druhů zvířat, včetně koz, provede se zkouška na kozách. Dvěma vnímavým zvířatům se subkutánně nebo intradermálně vstříkne dvojnásobek dávky uvedené pro použitý druh v označení a zvířata se pozorují 14 dní. Neprojeví se výrazná systémová reakce, ale v místě podání se může objevit lokální reakce. Závažnost lokální reakce se různí podle kmene spor a adjuvancia použitého ve zkoušeném přípravku, ale neprojeví se nekróza.

Počet spor. Počet živých spor stanovený kultivací na pevných půdách je nejméně 80 % počtu uvedeného v označení.

Bakterie a houby. Provede se mikroskopické vyšetření a vyočkování na vhodné živné půdy. Zkoušený přípravek neobsahuje kontaminující bakterie ani houby.

Stanovení účinnosti

Jestliže kmen B. anthracis není letální pro morčata ani pro myši, může se stanovení provést na morčatech. U kmene, který je letální pro morčata, ale ne pro králíky, se stanovení může provést na králících. U kmene, který je letální pro některé králíky, se stanovení provede na ovcích.

Provádí-li se stanovení na morčatech nebo králících, použije se deset zdravých zvířat (skupina a). Každému zvířeti se subkutánně nebo intradermálně vstříkne 1/10 nejnižší dávky vakcíny uvedené v označení pro ovce. Zvířata se pozorují 21 dní. Pokud uhyne z nespecifických příčin větší počet než dvě zvířata, stanovení se opakuje. Jako kontrola se použijí tři zvířata stejného druhu i původu.

Provádí-li se stanovení na ovcích, použije se pět zdravých zvířat (skupina b). Každému zvířeti se subkutánně nebo intradermálně vstříkne 1/10 nejnižší dávky vakcíny uvedené v označení pro ovce. Zvířata se pozorují 21 dní. Jako kontrola se použijí tři ovce stejného původu. Každému zvířeti z vakcinované skupiny (a) či (b) se vstříkne subkutánně nejméně 100 MLD, kontrolním zvířatům 10 MLD kmene B. anthracis, který je patogenní pro druh zvířat použitých ke stanovení. Zvířata se pozorují 10 dní, během nichž všechna vakcinovaná zvířata přežijí a všechna kontrolní zvířata uhynou na sněť slezinnou. Uhynou-li vakcinovaná zvířata po čelenži, stanovení se opakuje. Pokud vakcinovaná zvířata uhynou i při opakované zkoušce, zkoušený přípravek nevyhovuje.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

• kmen použitý k výrobě,

• počet živých spor v mililitru.

Vaccinum aphtharum epizooticarum inactivatum ad ruminantes [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti slintavce a kulhavce pro přežvýkavce

Je to tekutý přípravek obsahující jeden nebo více typů nebo subtypů slintavkových virů inaktivovaných bez poškození jejich imunogenity.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží buď v epitelové suspenzi z hovězích jazyků, získaných bezprostředně po porážce zdravých zvířat, nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Virus se oddělí z buněčného materiálu filtrací nebo jinou vhodnou metodou a za vhodných podmínek se inaktivuje.

Z inaktivovaného antigenu se připraví vakcína smícháním s jedním nebo s více adjuvancii. Antigen může být koncentrován a purifikován různými způsoby. Koncentrovaný antigen se používá k výrobě vakcíny buď bezprostředně, nebo po uchovávání při teplotě nepřesahující -90 °C, pokud nebyla prokázána stabilita antigenu při vyšší teplotě.

Validace procesu inaktivace. V průběhu inaktivace se titr viru monitoruje citlivou a reprodukovatelnou metodou. Postup inaktivace je vhodný, pokud logaritmicky vyjádřený pokles titru viru je lineární a extrapolace prokazuje, že na konci inaktivace je počet infekčních virových částic v 10 000 litrech tekutého přípravku menší než jedna.

Várka inaktivovaného antigenu

Inaktivace. Poměrná část každé šarže zásobní várky inaktivovaného antigenu, představující nejméně 200 dávek, se zkouší na nepřítomnost infekčního viru inokulací do citlivých buněčných kultur. Aby se umožnilo zkoušení tak velkých vzorků v buněčných kulturách, je vzorek inaktivovaného antigenu pro tento účel koncentrován. Prokáže se však, že zvolená koncentrace a metoda zkoušky neruší detekci infekčního viru ve zkoušeném vzorku a že koncentrovaný inaktivovaný antigen nebrání pomnožení viru, ani není příčinou toxických změn.

Antigenita. Obsah antigenu v každé várce inaktivovaného antigenu se stanoví metodou in vitro (na příklad: měření 146S-částic na základě odstřeďování v gradientu sacharosy a spektrofotometrického stanovení v ultrafialové oblasti při 251 nm).

Bezpečnost. Pro zkoušku bezpečnosti u skotu, jak je popsána níže, může být reprezentativní vzorek várky inaktivovaného antigenu ředěn a smíchán s adjuvans.

Sterilita. Várka inaktivovaného antigenu, adjuvans a všechny ředicí tlumivé roztoky vyhovují zkoušce na sterilitu, předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Účinnost. Reprezentativní vzorek várky inaktivovaného antigenu se může pro zkoušku účinnosti na skotu ředit a smíchat s adjuvans, jak je uvedeno níže.

V případě krajní naléhavosti a za souhlasu oprávněné autority může být šarže vakcíny uvolněna před ukončením zkoušek na čistotu a stanovením účinnosti za předpokladu, že byla provedena zkouška na sterilitu u zásobní várky inaktivovaného antigenu a u všech dalších složek vakcíny a že zkouška bezpečnosti a stanovení účinnosti byly provedeny u reprezentativní šarže vakcíny připravené z téže várky inaktivovaného antigenu. V této souvislosti není šarže považována za reprezentativní, pokud nebyla připravena ze stejného množství antigenu a ve stejném složení jako šarže, která se má uvolnit.

Zkouška totožnosti

Sérum vnímavého zvířete, které bylo imunizováno vakcínou, zkoušené přiměřeně citlivou metodou neutralizuje typy nebo subtypy virů použitých k výrobě zkoušeného přípravku.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se tři kusy nevakcinovaného skotu, nejméně šest měsíců starého, jejichž sérum je prosté protilátek proti slintavce a kulhavce a které pocházejí z oblasti prosté onemocnění slintavkou a kulhavkou. Každému zvířeti se intradermálně vstříkne do jazyka, nejméně na dvacet míst, po 0,1 ml zkoušené vakcíny do každého místa. Zvířata se pozorují nejméně 4 dny. U zvířat se neobjeví léze ani příznaky onemocnění slintavkou a kulhavkou. Na konci pozorovací doby se těmto zvířatům vstříkne předepsaným způsobem trojnásobná dávka vakcíny uvedená v označení na obale. Potom se zvířata pozorují dalších 6 dnů. U zvířat se neobjeví žádné léze ani klinické příznaky onemocnění slintavkou a kulhavkou na paznehtech nebo na jazyku a také reakce v místě podání vakcíny je bezvýznamná.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost se vyjadřuje jako počet 50% ochranných dávek pro skot (PD50) obsažených v 1 dávce vakcíny uvedené v označení. PD50 se stanoví za podmínek níže uvedených na zvířatech po primární vakcinaci a následné čelenži 10 000 ID50 virulentního bovinního viru stejného typu nebo subtypu jako ten, který byl použit pro výrobu zkoušeného přípravku.

Jedna dávka vakcíny pro skot obsahuje minimálně 3 PD50.

Zkouška účinnosti se provádí pro každý typ a subtyp viru slintavky a kulhavky obsažený ve vakcíně.

Použije se skot ve stáří nejméně 6 měsíců pocházející z oblasti prosté onemocnění slintavkou a kulhavkou, který nebyl nikdy vakcinován proti slintavce a kulhavce a je bez protilátek neutralizujících různé typy viru slintavky a kulhavky. Vakcinují se nejméně tři skupiny po nejméně 5 kusech skotu ve skupině způsobem uvedeným v označení na obale. Pro každou skupinu se použije jiná dávka vakcíny. Různé dávky vakcíny se podávají spíše vstříknutím různých objemů vakcíny než různých ředění vakcíny. Na příklad, jestliže se v označení uvádí, že podání 2 ml odpovídá jedné dávce vakcíny, pak by se čtvrtina dávky vakcíny dosáhla podání 0,5 ml přípravku a desetina dávky podáním 0,2 ml přípravku. Za tři týdny po vakcinaci se provede čelenž vakcinovaných zvířat včetně dvou nevakcinovaných kontrolních zvířat suspenzí viru získaného od skotu, která je plně virulentní, a stejného typu nebo subtypu jako virus, který byl použit pro výrobu vakcíny. K infekci se použije 10 000 ID50 vstříknutých intradermálně na dvě místa (vždy po 0,1 ml) na horní plochu jazyka. Zvířata se pozorují 8 dní a potom se porazí. Nechráněná zvířata mají léze na jiných místech než na jazyku, chráněná zvířata mohou mít léze na jazyku. Zkoušku lze hodnotit jedině tehdy, jestliže každé kontrolní zvíře má léze nejméně na třech končetinách. Z počtu chráněných zvířat v každé skupině se vypočítá množství PD50 obsažených v jedné dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Vakcína se ochrání před zmrznutím.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

• metoda přípravy,

• typy a subtypy virů, použitých k přípravě vakcíny.

Vaccinum bronchitidis infectivae aviariae inactivatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti ptačí infekční bronchitidě

Je to emulze nebo suspenze jednoho nebo více sérotypů viru infekční ptačí bronchitidy, který byl inaktivován takovým způsobem, že je zachována imunogenní účinnost. Tento článek popisuje vakcíny určené k ochraně proti poklesu snášky nebo kvality vajec. U vakcín určených také k ochraně proti respiratorním příznakům se kromě uvedené zkoušky účinnosti požaduje též provedení dodatečné zkoušky prokazující tento účinek.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus je pomnožován v kuřecích embryích pocházejících ze zdravých chovů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4).

Pro zjištění reziduálního živého viru ptačí infekční bronchitidy se provádí pomnožovací zkouška u každé šarže antigenu bezprostředně po inaktivaci a u konečné várky vakcíny nebo, jestliže vakcína obsahuje adjuvans, u nerozplněné várky antigenu nebo směsi nerozplněných antigenů bezprostředně před přidáním adjuvans; zkouška se provádí na kuřecích embryích z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo na vhodných buněčných kulturách. Použité množství inaktivovaného viru odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Nezjistí se živý virus.

Vakcína může obsahovat jedno nebo více vhodných adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Vakcína vyhovuje ve zkoušce bezpečnosti a imunogenity pro každou kategorii zvířat, pro niž je určena. Následující zkouška může být použita k prokázání účinnosti (5.2.7).

Imunogenita. Zkouška popisovaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k důkazu imunogenity.

Zkouška účinnosti šarže

Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti se neprovádí rutinně u každé šarže. Pro danou vakcínu se provádí jednou nebo vícekrát podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Není-li zkouška prováděna, je provedena vhodná validovaná zkouška pro porovnání se šarží, která zkoušce Stanovení účinnosti vyhověla. Následující zkouška se může použít, když byla dostatečně statisticky zhodnocena její korelace se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Jedna očkovací dávka se intramuskulárně vstříkne každému z deseti kuřat pocházejícímu z chovu prostého specifikovaných patogenů ve věku mezi dvěma týdny a nejnižším stářím stanoveným pro očkování. Pět kuřat ze stejného líhnutí slouží jako neočkovaná kontrola. Vzorky séra od každého kuřete se odeberou těsně před podáním zkoušené vakcíny a po období vymezeném zkoušením porovnávací vakcíny. Vhodnou sérologickou metodou, např. neutralizací séra, se v každém séru stanoví titr protilátek pro každý sérotyp obsažený ve vakcíně. Hladina protilátek není významně nižší než hladina, která byla získána u šarže dávající vyhovující výsledek ve zkoušce popsané ve stati Stanovení účinnosti (referenční vakcína). Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže séra odebraná od neočkovaných kontrol a od kuřat před podáním vakcíny neobsahují zjistitelné specifické protilátky.

Zkoušky totožnosti

U vnímavých zvířat vyvolává vakcína tvorbu specifických protilátek proti každému sérotyp u viru obsaženému ve vakcíně prokazatelných neutralizační zkouškou.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvojitá očkovací dávka se vstříkne doporučeným způsobem každému z deseti 14 až 28 dnů starých kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Kuřata se sledují 21 dnů. Neprojeví se abnormální místní nebo celková reakce.

Inaktivace.

A. U vakcíny připravené z kmenů viru adaptovaných na kuřecí embrya se vstříknou dvě pětiny dávky do alantoidní dutiny deseti 9 až 11 dnů starých kuřecích embryí z chovu prostého specifikovaných patogenů a inkubují se. Sledují se 5 až 6 dnů, odděleně se připraví směsné vzorky alantoidních tekutin z živých embryí a z vajec obsahujících uhynulá embrya, kromě těch, která uhynula v průběhu prvních 24 h po injekci. Všechna embrya uhynulá po 24 h a ta, která přežívají 5 až 6 dnů po injekci, se vyšetří na přítomnost abnormalit. Nezjistí se úhyny ani abnormality přisuzovatelné vakcinačnímu viru.

Do alantoidní dutiny každého z deseti 9 až 11 dnů starých SPF kuřecích embryí se vstříkne 0,2 ml směsné alantoidní tekutiny z živých embryí a do deseti obdobných kuřecích embryí 0,2 ml směsné tekutiny z uhynulých embryí a inkubují se 5 až 6 dnů. Všechna embrya uhynulá po 24 h a ta, která přežívají 5 až 6 dnů po injekci, se vyšetří na přítomnost abnormalit. Nezjistí se úhyny ani abnormality přisuzovatelné vakcinačnímu viru.

Jestliže v jedné z etap uhyne více než 20 % embryí, zkouška se od této etapy opakuje.

Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se nevyskytne úhyn nebo abnormality přisuzovatelné vakcinačnímu viru.

B. U vakcíny připravené z kmenů viru adaptovaných na buněčné kultury se inokuluje deset dávek na vhodné buněčné kultury. Pokud vakcína obsahuje olejové adjuvans, odstraní se vhodným způsobem. Inkubuje se 7 dnů při (38 ± 1) °C. Provádí se pasáž na další sadu buněčných kultur a inkubuje se 7 dnů při (38 ±1) °C. Žádná z kultur nevykazuje příznaky infekce.

Cizí agens. Provádí se na kuřatech ze zkoušky bezpečnosti. Každému kuřeti se za 21 dnů po injekci dvojité dávky vakcíny vstříkne stejným způsobem jedna dávka. Po dvou týdnech se odeberou vzorky séra od každého kuřete a provedou se zkoušky na protilátky proti následujícím agens metodami předepsanými pro drůbeží chovy prosté specifikovaných patogenů, které jsou určeny pro výrobu a kontrolu kvality vakcín (5.2.2): virus ptačí encefalomyelitidy, viry ptačí leukózy, hemaglutinující ptačí adenovirus, virus infekční burzitidy, virus infekční laryngotracheitidy, virus influenzy A, virus Markovy choroby, virus newcastleské choroby. Vakcína nevyvolává tvorbu protilátek proti těmto agens.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Zkouška účinnosti se provádí pro každý sérotyp použitý ve vakcíně. Použijí se čtyři skupiny nejméně po třiceti kuřatech z chovu prostého specifikovaných patogenů a ošetří se následovně:

• skupina A: neočkovaná kontrola,

• skupina B: očkovaná inaktivovanou vakcínou proti ptačí bronchitidě,

• skupina C: očkovaná živou vakcínou proti ptačí infekční bronchitidě a inaktivovanou vakcínou proti ptačí infekční bronchitidě podle doporučovaného schématu,

• skupina D: očkovaná živou vakcínou proti ptačí infekční bronchitidě.

U všech kuřic se zaznamenává snáška a kvalita vajec od počátku snášky až do nejméně čtyř týdnů po infekční zátěži. Na vrcholu snášky se infikují všechny skupiny takovým množstvím virulentního viru ptačí infekční bronchitidy, které je schopno způsobit pokles snášky nebo kvality vajec po tři po sobě jdoucí týdny v průběhu čtyř týdnů po čelenži. Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže je snáška a kvalita vajec významně lepší u skupiny C než u skupiny D a významně lepší u skupiny B než u skupiny A. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, pokud není pokles snášky ve skupině A, porovnávaný s normální úrovní před čelenži, nejméně 35%, v případě, že se infekční zátěž provádí kmenem Massachusetts. Jestliže je nezbytné provést čelenž jiným sérotypem, u něhož je doloženo, že nezpůsobuje 35% pokles snášky, musí čelenž vyvolat pokles snášky úměrný tomu, který je doložen, v jakémkoliv případě však nejméně 15%.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium

V označení na obalu se uvede:

• pro kterou kategorii a stáří kuřat je vakcína určena,

• návod k použití,

• kmeny a sérotypy virů použitých pro přípravu vakcíny a sérotypy, proti kterým má vakcína chránit,

• zda je kmen ve vakcíně adaptován na embrya nebo na buněčné kultury.

Vaccinum bronchitidis infectivae aviariae vivum cryodesiccatum [image omitted]

Živá vakcína proti ptačí infekční bronchitidě lyofilizovaná

Je to přípravek z jednoho nebo z více oslabených kmenů viru ptačí infekční bronchitidy.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Každý kmen vím se pomnoží buďto v alantoidní dutině kuřecích embryí z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2), nebo ve vhodné buněčné kultuře (5.2.4). Jsou-li buněčné kultury ptačího původu, získají se z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2). Virové suspenze se sklidí, smíchají se s vhodnou stabilizující tekutinou a lyofilizují.

Výběr vakcinačního kmene

Pro přípravu může být použit pouze takový kmen viru, který je prokazatelně uspokojivě imunogenní. Následující zkoušky se mohou použít k průkazu účinnosti (5.2.7).

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity.

Zkoušení šarže

Pokud byly zkoušky na viry ptačí leukózy a na cizí viry na buněčných kulturách a na kuřecích embryích provedeny s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, mohou být tyto zkoušky při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěny, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno s uspokojivým výsledkem na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěna, jestliže k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Rekonstituovaná vakcína se smíchá s monospecifickým sérem proti použitému kmenu viru nebo s monospecifickými séry proti každému z kmenů ve vakcíně. Takto upravený přípravek již neinfikuje vnímavá devítidenní až jedenáctidenní kuřecí embrya nebo vnímavé buněčné kultury, do nichž je inokulován.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) se použije nejméně deset kuřat v nejnižším stáří uvedeném v označení. Každému kuřeti se nakape do oka deset dávek vakcíny rozpuštěné tak, aby se získala koncentrace vhodná pro zkoušku. Kuřata se pozorují 21 dní. Pro přípravky určené k vakcinaci kuřat starých dva nebo více týdnů se použijí kuřata naočkovaná ve zkoušce na cizí antigeny na kuřatech. Jestliže v době pozorování uhynou více než dvě kuřata z příčin, které nelze připsat vakcíně, zkouška se opakuje. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže žádné z kuřat nemá vážné klinické příznaky, zvláště příznaky respirační, a jestliže žádné z kuřat neuhyne z příčin, které je možné připsat zkoušenému přípravku.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na viry ptačí leukózy.

Důkaz cizích virů zkouškou na buněčných kulturách (2.6.5). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry provedené na buněčných kulturách.

Důkaz cizích virů zkouškou na kuřecích embryích (2.6.3). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry provedené na kuřecích embryích.

Důkaz cizích antigenů zkouškou na kuřatech (2.6.6). Vyhovuje zkoušce na cizí antigeny provedené na kuřatech.

Bakterie a houby. Provede se kvantitativní stanovení na bakteriální a houbové kontaminace. Zkoušený přípravek obsahuje nejvýše jeden saprofytický mikroorganismus na dávku a je prostý patogenních mikroorganismů. Přípravky určené pro parenterální použití a tekutiny dodávané s nimi vyhovují zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Zkouška na mykoplazmata (2.6.7). Vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Stanoví se na buněčných kulturách nebo inokulací do alantoidní dutiny devíti- až jedenáctidenních kuřecích embryí. Jedna dávka zkoušeného přípravku obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá nejnižšímu deklarovanému titru.

Stanovení účinnosti

Stanovení účinnosti se provede pro každý kmen viru použitý k přípravě vakcíny.

Použijí se vnímavá kuřata z jednoho chovu prostého specifikovaných patogenů a nejnižšího stáří uvedeného pro vakcínu. Každému z nejméně dvaceti kuřat se pro každý z udávaných způsobů podání aplikuje takový objem rozpuštěné vakcíny, který obsahuje množství viru, jež odpovídá nejnižšímu titru uvedenému v označení. Pro kontrolu se použije deset kuřat. Nejméně po 21 dnech se infikuje každé kuře intratracheálně 10^3 EID50 virulentního kmene ptačí infekční bronchitidy téhož sérotypu, jako je kmen, pro který se stanovení účinnosti provádí. Mezi čtvrtým a sedmým dnem po infekci se kuřata usmrtí a seškrábe se sliznice průdušnice. Seškrabaná tkáň z každého kuřete se dá samostatně do sterilní zkumavky se 3 ml tryptózové půdy obsahující antibiotikum. Z každé zkumavky se vstříkne 0,2 ml půdy do alantoidní dutiny každému z pěti devíti- až jedenáctidenních kuřecích embryí. Embrya, která uhynou v prvních 24 h, se odstraní jako nespecifické úhyny. Nejméně čtyři z každých pěti embryí musí toto období přežít. Po sedmi dnech se zbývající embrya vyšetří. Jestliže jedno embryo ze skupiny uhynulo nebo vykazuje charakteristické změny, usuzuje se, že je nosičem viru. Výsledek zkoušky se považuje za zcela negativní pouze tehdy, když byly provedeny tři postupné pasáže na kuřecích embryích. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže může být čelenžní virus reizolován z nejvýše 20 % očkovaných a nejméně 80 % kontrolních zvířat.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede stáří, v němž mají být zvířata vakcinována.

Vaccinum brucellosis (Brucella melitensis stirpe rev. 1) vivum cryodesiccatum ad usum veterinarium [image omitted]

Živá vakcína proti brucelóze (Brucella melitensis kmen Rev. 1) lyofilizovaná, pro veterinární použití

Je to lyofilizovaná suspenze živého kmene Brucella melitensis Rev. 1; v jedné dávce obsahuje 0,5 . 10^9 až 4 . 10^9 živých bakterií.

Výroba

Viz Vaccina ad usum veterinarium. Brucella melitensis kmen Rev. 1 se kultivuje ve vhodné živné půdě. Metoda kultivace je taková, aby se předešlo bakteriální disociaci, a tak se udržela hladká (S) fáze kultury. Bakterie se suspendují v tlumivém roztoku, který může obsahovat vhodné stabilizátory. Suspenze se plní do obalů a lyofilizuje se.

Výběr vakcinačního kmene

Pro přípravu vakcíny se smí použít jenom takový kmen, který je prokazatelně vyhovující z hlediska bezpečnosti a imunogenity. Účinnost se může prokázat následující zkouškou (5.2.7).

Imunogenita. Z neočkovaného ovčího stáda prostého brucelózy se vybere 40 ovcí (samic), starých 4 až 5 měsíců. Jako čelenžní kmen se použije 24hodinová kultura kmene Brucella melitensis H38 v tryptózovém agaru. Ke stanovení infekční dávky se provede předběžná zkouška, ve které se použijí zvířata stejného plemene a věku, jako v hlavní zkoušce. Infekční dávka, která je mezi 10^7 až 10^8 jednotek tvořících kolonie, se vybírá tak, aby způsobila aborty u všech neočkovaných zvířat. Polovina zvířat se očkuje ve 4. až 6. měsíci věku v souladu s doporučeným programem a za použití minimální doporučené dávky. Synchronizuje se říje čtyřiceti zvířat, která se ve věku 10 až 12 měsíců inseminují. Dva až tři měsíce po inseminaci se zjišťuje březost a všechna zvířata, jež nejsou březí, se ze zkoušky vyloučí. Všem březím zvířatům se do spojivkového vaku nakape infekční dávka kmene Brucella melitensis H38. Výskyt abortů se zaznamená a jeho původ se ověří zkouškou na přítomnost použitého infekčního kmene u potratů a u bahnic (použijí se selektivní půdy podle Kuzdase a Morse nebo podle Farrella). Zkoušky na přítomnost použitého čelenžního kmene se u každého zvířete provedou v době porodu. Zkoušky na přítomnost použitého kmene v preskapulárních a retromamárních lymfatických uzlinách se provedou při porážce zvířat 4 až 6 týdnů po bahnění. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže se u nejméně 70 % nevakcinovaných zvířat:

• prokáží aborty vyvolané použitým infekčním kmenem,

• prokáže infekce jehňat použitým infekčním kmenem,

• prokáže infekce preskapulárních a retromamárních lymfatických uzlin po porážce.

Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže:

• nejvýše u 30 % očkovaných zvířat se zjistí aborty vyvolané použitým čelenžním kmenem,

• použitý čelenžní kmen se prokáže u jehňat nejvýše u 50 % očkovaných zvířat,

• použitý čelenžní kmen se prokáže v době porážky nejvýše u 40 % očkovaných zvířat.

Zkouška totožnosti

Brucella melitensis přítomná ve vakcíně se prokáže vhodnými morfologickými, sérologickými a biochemickými zkouškami a kultivací. Kmen Rev. 1 je inhibován přidáním 3 μg sodné soli benzyl penicilinu k mililitru vhodné živné půdy; kmen roste na agaru obsahujícím v mililitru 2,5 μg streptomycinu.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma ovcím stáří 4 až 6 měsíců se doporučeným způsobem vstříkne po jedné dávce vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní a nezjistí se žádné významné místní nebo celkové reakce.

Určení disociační fáze. Vhodnou technikou se prověří nejméně 200 kolonií. Vakcinační kmen při kultivaci roste v hladké (S) fázi. Nejméně 95 % kolonií je hladkého typu.

Cizí mikroorganismy. Vakcína rozpuštěná předepsaným způsobem neobsahuje cizí mikroorganismy. Nepřítomnost jiných mikroorganismů než kmen Brucella melitensis Rev. 1 se ověří tak, jak je popsáno ve zkoušce na sterilitu, uvedené v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Živé bakterie. Na pevné půdě vhodné pro kultivaci kmene Brucella melitensis Rev. 1 se provede stanovení počtu živých bakterií. Vakcína obsahuje 0,5. 10^9 až 4.10^9 živých bakterií v jedné dávce.

Doba 50% perzistence. Každé z třiceti dvou myší kmene CD 1 samičího pohlaví ve věku 5 až 6 týdnů se subkutánně vstříkne suspenze vakcíny obsahující 10^8 živých bakterií. Vytvoří se náhodné skupiny po osmi zvířatech a v údobích 3, 6, 9 a 12 týdnů se vždy jedna skupina utratí. Vyjmou se sleziny a individuálně se asepticky homogenizují v deseti objemových dílech tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 6,8. Tato suspenze se naočkuje po 0,4 ml na misky obsahující vhodnou živnou půdu. Na jednu slezinu se použijí nejméně 3 misky (dolní hranice detekce je pět bakterií na slezinu). Současně se provede stejná zkouška s referenčním kmenem, kterým je Brucella melitensis Rev. 1 BRP. Pomocí Bonet-Mauryho probitového transformačního postupu (osm myší ve skupině, celkový počet, následná grafická analýza na semilogaritmickém papíru s aritmetickou časovou stupnicí) se vypočítá doba 50% perzistence. Doba 50% perzistence pro vakcinační kmen se významně neliší od doby 50% perzistence referenčního kmene. Pro kmen Rev. 1 bývá obvykle doba 50% perzistence (7,9 ± 1,2) týdne při intervalu spolehlivosti (P = 0,05).

Uchovávání

Při teplotě 2 °C až 8 °C.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium

Na štítku obalu se uvede:

• množství bakterií Brucella melitensis kmen Rev. 1 v jedné dávce,

• že vakcína je určena pro ovce a kozy staré 4 až 6 měsíců,

• že vakcína může být pro člověka nebezpečná,

• že vakcína se nepodává zvířatům v období březosti a laktace,

• že vakcína může být nebezpečná pro hovězí dobytek, a že proto nemá být chován ve styku s očkovanými zvířaty.

Vaccinum bursitidis infectivae aviariae inactivatum [image omitted]

Inaktivovaná vakcína proti infekční ptačí burzitidě

Je to emulze nebo suspenze vhodného kmene viru infekční ptačí burzitidy typu 1, který byl inaktivován takovým způsobem, že je zachována imunogenní účinnost. Je určena pro chovnou drůbež k ochraně jejího potomstva před infekční ptačí burzitidou.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Virus je pomnožován v kuřecích embryích pocházejících ze zdravého chovu, ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4) nebo v kuřatech z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2).