Decreto-Lei n.º 46-A/89 — Actualiza os anexos ao Decreto-Lei n.º 280-A/87, de 17 de Julho, relativo à classificação e rotulagem de substâncias…

de 20 de Fevereiro

O Decreto-Lei n.º 280-A/87, de 17 de Julho, estabeleceu diversas medidas relativas à notificação de substâncias químicas e à classificação, embalagem e rotulagem de substâncias perigosas, bem como à sua listagem.

A evolução técnico-científica entretanto verificada impõe a alteração da referida listagem, no sentido da sua actualização.

Simultaneamente, acolhem-se no nosso ordenamento jurídico as soluções previstas nas Directivas n.os 87/432/CEE, de 11 de Agosto, e 88/302/CEE, de 30 de Maio.

Assim:

Nos termos da alínea a) do n.º 1 do artigo 201.º da Constituição, o Governo decreta o seguinte:

Artigo 1.º - 1 - A designação, número CAS, classificação e rotulagem de algumas substâncias constantes do anexo I ao Decreto-Lei n.º 280-A/87, de 17 de Julho, são alterados de acordo com o especificado no anexo I ao presente diploma, de que faz parte integrante.

2 - As substâncias enumeradas no anexo II ao presente diploma, de que faz parte integrante, são aditadas ao anexo I ao Decreto-Lei n.º 280-A/87, de 17 de Julho.

Art. 2.º É aditado ao anexo V ao Decreto-Lei n.º 280-A/87, de 17 de Julho, o constante do anexo III ao presente diploma, de que faz parte integrante.

Art. 3.º O presente diploma entra em vigor no dia 30 de Junho de 1989.

Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 26 de Janeiro de 1989. - Aníbal António Cavaco Silva - Luís Francisco Valente de Oliveira - Joaquim Fernando Nogueira - João de Deus Rogado Salvador Pinheiro - Luís Fernando Mira Amaral - Maria Leonor Couceiro Pizarro Beleza de Mendonça Tavares - José Albino da Silva Peneda - Joaquim Martins Ferreira do Amaral.

Promulgado em 9 de Fevereiro de 1989.

Publique-se.

O Presidente da República, MÁRIO SOARES.

Referendado em 9 de Fevereiro de 1989.

O Primeiro-Ministro, Aníbal António Cavaco Silva.

ANEXO I — (ARTIGO 1, No. 1)

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

ANEXO II — (Artigo 1, No. 2)

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

ANEXO III — (Artigo 2º)

PARTE B: MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE

INTRODUÇÃO GERAL: PARTE B

ESTUDOS A LONGO PRAZO

Estudos de toxicidade subcrónica, toxicidade crónica e carcinogénese

Caracterização da substância a testar e mistura utilizada no tratamento

Antes de iniciar qualquer estudo de toxicidade deve conhecer-se a composição da substância a testar, incluindo as suas impurezas principais, bem como as suas propriedades físico-químicas essenciais e a sua estabilidade.

As propriedades físico-químicas da substância a testar fornecem informações importantes para a escolha da via de administração, a concepção dos estudos subcrónicos, crónicos ou de carcinogénese, assim como para a manipulação e armazenamento da substância a testar. A informação sobre a estrutura química e as propriedades físico-químicas da substância pode também dar indicações sobre as características de absorção pela via de administração escolhida bem como sobre as possibilidades de distribuição tecidular e de metabolismo. Estudos anteriores de toxicidade e toxicocinética podem também fornecer informações sobre os parâmetros toxicocinéticos. O estudo deve ser precedido pela elaboração dum método analítico para as determinações qualitativa e quantitativa da substância a testar (incluindo as impurezas principais se possível) no veículo de administração e no material biológico.

Animais de experiência: selecção da espécie e estirpe

Uma vez que é necessário tratar os animais durante grande parte da sua vida, há tendência para limitar os estudos a especies fáceis de criar em laboratório e com uma duração de vida relativamente curta. É muito conveniente o conhecimento da incidência das afecções e dos tumores espontâneos nos animais da estirpe utilizada, quando criados em condições semelhantes.

As estirpes devem ser bem caracterizadas e isentas de defeitos congénitos que possam interferir na experiência. O uso de estirpes consanguíneas (inbred) ou de híbridos F(índice 1) apresenta algumas vantagens a esse respeito, mas sempre que se disponha de dados suficientes sobre os antecedentes de estirpes não consanguíneas, usando animais provenientes de colónias fechadas, estas poderão ser utilizadas.

Cuidados com os animais, regime alimentar e de ingestão de água

As experiências e os estudos em animais devem respeitar a legislação nacional e ter em conta princípios humanitários, assim como os últimos progressos internacionais em matéria de protecção dos animais. São imperativos um controlo rigoroso das condições de ambiente e técnicas adequadas ao tratamento dos animais se se quiser obter resultados significativos. Factores como as condições de alojamento, doenças intercorrentes, quimioterapia, presença de impurezas na alimentação, o ar, a água e a «cama», cuidados gerais com os animais e instalações, podem influenciar significativamente o resultado dos estudos de administração repetida. Em geral deve conhecer-se o efeito de produtos químicos esterilizantes sobre o estudo.

A dieta deve satisfazer todas as necessidades de nutrição da espécie testada e deve ser isenta de impurezas susceptíveis de influenciar o resultado do ensaio. A alimentação e a água serão fornecidas ad libitum aos roedores, sendo a alimentação substituída pelo menos semanalmente. Presentemente utilizam-se três tipos de dieta: convencional, sintética e regimes de fórmula livre.

Seja qual for a dieta escolhida os fornecedores devem garantir, com controlos periódicos, o valor nutritivo e o nível de contaminantes da dieta de base; devem também fornecer esta informação ao laboratório em cada lote de alimentação. É muito conveniente conhecer os efeitos do regime alimentar no metabolismo, assim como no desenvolvimento de tumores e na longevidade dos animais.

Além disso, o laboratório que faz os testes pode efectuar uma contra-análise da dieta de base para controlar os componentes alimentares e contaminantes involuntários, incluindo os carcinogéneos. Neste caso, os resultados das análises serão conservados e incluídos no relatório final consagrado a cada substância a testar.

Os constituintes alimentares correntes com influência conhecida na carcinogénese (por exemplo anti-oxidantes, ácidos gordos insaturados, selénio) não devem estar presentes em concentrações passíveis de interferência. Devido ao impacto potencial de vários contaminantes correntes da dieta na avaliação da carcinogénese, torna-se necessário prestar uma atenção especial à presença na alimentação de resíduos de pesticidas, de compostos organoclorados, de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, de estrogénios, de metais pesados, de nitrosaminas e de micotoxinas.

São indispensáveis testes de estabilidade quando a substância a testar é administrada na água ou na alimentação. Devem ser feitos testes de estabilidade e homogeneidade bem conduzidos antes de se iniciar estudos de administração repetida para determinar a frequência necessária de preparação e controlo da dieta.

Se os alimentos forem esterilizados, deverão conhecer-se os efeitos desse procedimento sobre a substância a testar bem como sobre os constituintes da dieta. Deverão efectuar-se os ajustamentos considerados adequados.

Durante os testes de carcinogénese, os investigadores devem ser informados sobre os contaminantes da água utilizada. A água considerada própria para consumo humano é geralmente de qualidade satisfatória, devendo dispôr-se de dados sobre a sua composição.

Pode ser necessário ajustar a concentração da substância testada no regime alimentar à medida que os animais crescem, de forma a manter mais ou menos constante a ingestão da substância testada em função do peso corporal.

O valor nutritivo da dieta de controlo e das dietas testadas deve ser o mais semelhante possível. Deve, assim, ter-se em conta o valor nutritivo da substância testada e incorporada na dieta. A experiência mostra que, se não atingir 5% da dieta, uma substância não nutritiva testada não parece interferir significativamente com o valor nutritivo da dieta.

Não se especifica nenhum teste limite por não ter sido possível definir um valor limite de exposição para uma inalação única.

O método de ensaio destina-se essencialmente à via oral. Podem ser utilizadas outras vias em função das propriedades físicas da substância a testar ou da via mais provável de exposição humana. Nestes casos, o método do ensaio deve ser convenientemente adaptado tomando em consideração as informações obtidas no teste de 28 dias.

Os estudos de toxicocinética facilitam a interpretação e a avaliação dos dados toxicológicos. Estes estudos têm por fim elucidar alguns aspectos particulares da toxicidade do produto testado e os resultados obtidos podem ser úteis na concepção de outros estudos de toxicidade. Não é considerado necessário determinar todos os parâmetros para cada caso: isso será apenas necessário nos raros casos de sequência completa do estudo toxicocinético (absorção, excreção, distribuição e metabolismo). Para alguns compostos pode ser aconselhável uma modificação desta sequência ou pode ser suficiente um estudo com uma dose única.

Definições

Toxicocinética: estudo da absorção, distribuição, metabolismo e excreção das substâncias a testar;

Absorção: processo(s) pelo(s) qual(quais) uma substância administrada penetra no organismo;

Excreção: processo(s) pelo(s) qual(quais) a substância administrada e/ou seus metabolitos são eliminados do organismo;

Distribuição: processo(s) pelo(s) qual(quais) a substância absorvida e/ou os seus metabolitos se repartem no organismo;

Metabolismo: processo(s) pelo(s) qual(quais) a substância administrada é estruturalmente modificada no organismo por reacções enzimáticas ou não enzimáticas.

Um estudo numa segunda espécie visa completar as conclusões tiradas do estudo na primeira espécie.

No caso de um estudo numa segunda espécie, o método de ensaio já descrito pode ser utilizado ou adoptado a um menor número de animais.

Quando é necessário um estudo de reprodução até à terceira geração, o método descrito para o ensaio de reprodução em duas gerações pode ser alargado à terceira geração.

Testes complementares de mutagénese, incluindo testes de despiste de carcinogénese

No Anexo VIII da directiva mencionam-se testes complementares destinados ao estudo da mutagénese ou detecção de carcinogénese. Os ensaios descritos nesta parte podem geralmente ser utilizados na investigação de ambas.

Introdução

A avaliação inicial da actividade mutagénica duma substância consiste em ensaios que detectam as mutações génicas (pontuais) em bactérias, assim como as lesões citogenéticas em células de mamífero (in vitro ou in vivo). Os métodos adequados para estes estudos de base foram descritos préviamente. Esta parte trata dos estudos complementares, permitindo verificar e/ou completar os resultados obtidos nos ensaios de base e podendo ser utilizados nomeadamente para:

Para estes efeitos, a gama de testes descritos compreende organismos eucariotas in vitro e in vivo, assim como uma extensa gama de fenómenos biológicos. Os testes permitem obter informações sobre as mutações pontuais que se dão nos organismos mais complexos que as bactérias utilizadas nos ensaios de base, e completam as informações sobre a capacidade duma substância para induzir aberrações cromossómicas.

São também descritos testes que utilizam fenómenos diferentes das mutações pontuais e aberrações cromossómicas. Estes testes fornecem informações complementares e podem ser utilizados em programas de investigação.

Como regra geral, qualquer programa de estudos complementares de mutagénese deveria ser concebido de forma a fornecer informações suplementares relevantes sobre o potencial mutagénico e/ou carcinogénico dessa substância.

A escolha do estudo apropriado em cada caso específico dependerá de múltiplos factores, nomeadamente das características físicas e químicas da substância, dos resultados dos primeiros testes bacteriológicos e citogenéticos, do perfil metabólico da substância, dos resultados de outros escudos de toxicidade e das utilizações conhecidas da substância. Dada a variedade de factores a ter em conta, não é possível o estabelecimento dum programa rígido para a selecção dos testes. No entanto, podem servir de orientação alguns princípios gerais: quando um teste se revelar positivo nos ensaios de base, os estudos complementares deveriam incluir pelo menos um teste capaz de detectar o mesmo fenómeno genético. Quando ambos os testes de base se revelarem negativos, devem normalmente ser efectuados como exames complementares testes para detectar as mutações genéticas e para detectar as aberrações cromossómicas. Pode também tornar-se necessário obter informações complementares de testes indicadores (ver lista abaixo). Os métodos que permitem efectuar estas investigações encontram-se agrupados em baixo, de acordo com a sua principal consequência genética.

Estudos para detecção de mutações génicas (pontuais)

Para investigar mais profundamente a capacidade duma substância induzir mutações génicas (pontuais), pode ser utilizado um dos seguintes testes:

Estudos para detectar aberrações cromossómicas

Para investigar mais profundamente a capacidade duma substância induzir aberrações cromossómicas, pode ser utilizado um dos seguintes testes:

A análise in vivo da metafase das células de medula óssea deve ser considerada se não estiver já incluída na avaliação inicial (testes de base); além disso pode ser estudada a citogenética das células germinais in vivo;

Testes indicadores de efeitos sobre o ADN

Existem alguns métodos que permitem evidenciar certos efeitos sobre o ADN mas cujo fenónemo «final» não é uma manifestação mutagénica. Estes estudos podem dar informações, completando as obtidas com os estudos de mutagénese, e podem revelar-se úteis para a interpretação destes. Se for necessário efectuar estes testes, é possível aplicar um destes três métodos utilizando microorganismo eucariotas ou células de mamíferos:

Outros testes indicadores de potencial carcinogénico

Os ensaios de transformação de células de mamíferos permitem medir a capacidade duma substância induzir, numa cultura celular, alterações morfológicas e de comportamento que se supõe estarem associadas com a transformação maligna in vivo. Podem ser utilizados vários tipos celulares e diferentes critérios de transformação.

Avaliação do risco de efeitos hereditários nos mamíferos

Existem vários métodos permitindo medir, nos mamíferos, os efeitos hereditários induzidos por mutações génicas (pontuais) [por exemplo: a prova do locus específico no ratinho(ver nota 1)] ou por aberrações cromossómicas (por exemplo: a prova de translocação com transmissão hereditária no ratinho). Estes métodos podem ser utilizados para avaliar o risco genético que pode representar uma substância para o homem. No entanto, dada a complexidade destes ensaios e o elevado número de animais que requerem, em particular a prova do locus específico, deve existir uma justificação suficientemente forte para a sua utilização.

(nota 1) O teste do locus específico no ratinho (que não está descrito neste documento) pode ser utilizado para medir a mutação que ocorre nas células germinais após a exposição a uma substância mutagénica, e posta em evidência na primeira geração. É possível detectar e quantificar as alterações génicas que levam a modificações nos produtos génicos traduzindo-se por fenótipos visíveis.

TOXICIDADE ORAL SUBCRÓNICA:

TESTE DE NOVENTA DIAS EM ROEDORES (DOSE ORAL REPETIDA)

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B

1.2. Definições

Ver Introdução geral, Parte B

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma

1.4. Princípio do método de ensaio

A substância a testar é administrada diariamente por via oral em doses graduais à razão de uma dose por grupo por um período de noventa dias. Durante o período de administração, os animais são observados diariamente para se detectarem manifestações de toxicidade. Os animais que morrem durante a experiência são autopsiados e, no fim da experiência, os animais sobreviventes são igualmente autopsiados.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Os animais são mantidos nas condições de alojamento e de alimentação da experiência durante pelo menos cinco dias antes do teste. Antes do teste, os animais jovens e sãos são distribuídos ao acaso pelos grupos de tratamento e de controlo.

A substância a testar pode ser administrada com a comida por gavage, em cápsulas ou na água de beber. As doses devem ser administradas aos animais da mesma maneira durante toda a experiência. No caso de se utilizar um veículo ou outros aditivos, para facilitar a administração, estes devem ser comprovadamente isentos de efeitos tóxicos. Podem ser utilizados dados de experiências anteriores, se necessário.

Condições experimentais

Animais de experiência

Salvo contra-indicação, a espécie preferida é o rato. Devem utilizar-se animais jovens e sãos duma estirpe corrente de laboratório; o ideal seria começar a administração da substância antes dos ratos atingirem a idade de seis semanas sendo forçoso o início antes das oito semanas. No início da experiência, a diferença de peso entre os animais não poderá ultrapassar (mais ou menos) 20% do peso médio. Se um estudo oral subcrónico constituir a fase preliminar dum estudo a longo prazo, deve utilizar-se a mesma espécie e estirpe em ambos os estudos.

Número e sexo

Para cada dose serão utilizados pelos menos vinte animais (dez fêmeas e dez machos). As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a experiência, devem acrescentar-se ao número inicial o número dos animais que se prevê ir sacrificar. Para além destes, poderá haver um grupo satélite de vinte animais (dez animais de cada sexo) tratado com a dose mais elevada durante noventa dias e observado quanto à reversibilidade, persistência ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante vinte e oito dias após o tratamento.

Doses

São utilizadas pelo menos três doses diferentes e um controlo; os animais do grupo de controlo serão tratados da mesma maneira que os animais dos grupos da experiência com excepção do tratamento com a substância a testar. Se se utilizar um veículo para facilitar a administração, este será administrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados e o volume recebido deverá corresponder ao do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada deve produzir efeitos tóxicos mas não provocar nenhuma ou poucas mortes. A dose mais baixa não deverá produzir quaisquer efeitos tóxicos. Se se dispuser de informação sobre a exposição humana, a dose mais baixa deverá ser inferior ao seu valor. O ideal seria a dose intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observável. Se se utilizarem várias doses intermédias, a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos.

Nos grupos das doses mais baixa e intermédia assim como no grupo de controlo, a incidência de mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados.

Quando a substância a testar for incorporada na alimentação pode utilizar-se seja uma concentração alimentar constante (ppm ou mg/kg de alimento) seja uma dose constante em relação com o peso corporal dos animais; deve ser especificado o método escolhido.

No caso de uma substância administrada por gavage, a dose deve ser administrada diariamente sempre à mesma hora. As doses serão modificadas semanalmente ou quinzenalmente a fim de se manter uma dose constante em relação ao peso corporal do animal.

Teste limite

Se já tiver sido efectuado um teste de noventa dias, de acordo com o método a seguir descrito, com uma dose de 1000 mg/kg. peso corporal/dia ou com uma dose mais elevada em função da possibilidade de uma exposição humana - quando conhecida - que não tenham provocado qualquer efeito tóxico, será inútil prosseguir a experiência. Quando se trata de substâncias pouco tóxicas incorporadas na alimentação é importante assegurar-se que as quantidades e outras propriedades da substância a testar não interferem com as exigências normais de nutrição.

Período de observação

Todos os animais devem ser observados diariamente e registados os sinais de toxicidade bem como o momento do seu aparecimento, sua intensidade e duração. Devem ser registados o momento da morte e os momentos de aparecimento e desaparecimento das manifestações de toxicidade.

Procedimento

Nas condições ideais a substância a testar será administrada aos animais sete dias por semana num período de noventa dias. Os animais de todos os grupos satélites que forem objecto de observações complementares serão mantidos vivos durante vinte e oito dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou persistência dos efeitos tóxicos.

Durante o período de observação dos animais em cativeiro convém registar todas as alterações da pele e do pêlo, dos olhos e membranas mucosas, assim como dos aparelhos respiratório e circulatório, dos sistemas nervosos autónomo e central, da actividade somatomotora e do comportamento. Deve determinar-se semanalmente o consumo alimentar (e o consumo de água quando a substância a testar for administrada na água de beber) e também o peso dos animais.

Devem observar-se regularmente os animais para se evitarem perdas, tanto quanto possível, por causas como canibalismo, autólise dos tecidos ou condições impróprias de alojamento. No fim da experiência, todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos serão imediatamente retirados e autopsiados.

Os exames que a seguir se enunciam são normalmente feitos a todos os animais incluindo os controlos:

Se a informação de estudos anteriores não for apropriada deverá considerar-se a necessidade de determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos clínicos antes de começar a experiência.

(nota 1) Conhecida actualmente por transminase da alanina.

(nota 2) Conhecida actualmente por transminase do aspartato.

Autópsia

Todos os animais serão submetidos a uma autópsia geral compreendendo o exame da superfície exterior do corpo, de todos os orifícios, bem como das cavidades craniana, toráxica e abdominal e respectivos conteúdos. O fígado, os rins, as supra-renais e os testículos serão pesados, ainda húmidos, o mais rapidamente possível depois da dissecação para se evitar a perda de líquidos por evaporação. Os seguintes orgãos e tecidos deverão ser conservados num meio adequado na eventualidade de um exame histopatológico ulterior: todas as lesões macroscópicas, encéfalo - incluindo cortes da medula/protuberância, córtex cerebeloso e córtex cerebral, hipófise, tiróideia/paratiróideia, todo o tecido tímico, traqueia e pulmões, coração, aorta (glândulas salivares), fígado, baço, rins supra-renais, pâncreas, gónadas, útero, (orgãos genitais anexos), (pele), esófago, estômago, doudeno, jejuno, íleo, cego, cólon, recto, bexiga, gânglio linfático representativo, (glândula mamária na fêmea), (musculatura da coxa), nervo periférico, esterno com medula óssea, (olhos), (fémur, incluindo superfície articular), (medula espinhal a três níveis - cervical, mediotoráxica e lombar), (glândulas lacrimais). Os tecidos mencionados entre parênteses só serão examinados em caso de aparecimento de sinais de toxicidade ou de compromisso de orgão alvo.

Exame histopatológico

Os dados devem ser resumidos sob a forma de quadros, para cada grupo de experiência, indicando o número de animais no início desta, o número de animais apresentando lesões e a percentagem de animais com cada tipo de lesão. Os resultados deverão ser avaliados com um método estatístico apropriado. Pode utilizar-se qualquer método estatístico reconhecido.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

• espécie, estirpe, origem, condições do ambiente, dieta,

• condições do teste,

• doses (incluindo veículo, se utilizado) e concentrações,

• resposta tóxica, por sexo e por dose,

• dose um efeitos, se possível,

• momento da morte durante o estudo ou indicação dos animais sobreviventes no fim da experiência,

• descrição dos efeitos tóxicos ou outros,

• momento da observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução,

• dados relativos à alimentação e peso corporal,

• observações oftalmológicas,

• testes hematológicos efectuados e seus resultados,

• testes bioqímicos clínicos utilizados e seus resultados (incluindo resultados das análises de urina),

• resultados da autópsia,

• descrição pormenorizada de todas as observações histopatológicas,

• tratamento estatístico dos resultados, se possível,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TOXICIDADE ORAL SUBCRÓNICA:

TESTE DE NOVENTA DIAS EM ESPÉCIES NÃO PERTENCENTES AOS ROEDORES (DOSE ORAL REPETIDA)

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definições

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma

1.4. Princípio do método de ensaio

A substância a testar é administrada diariamente por via oral, a vários grupos de animais de experiência (não roedores) à razão de uma dose por grupo durante um período de noventa dias. Durante o período de administração os animais são observados diariamente para se detectarem manifestações de toxicidade. Os animais que morrem durante a experiência são autopsiados e no fim da experiência os animais sobreviventes são igualmente autopsiados.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Os animais são mantidos nas condições de alojamento e de alimentação da experiência pelo menos durante cinco dias antes do teste. Antes do início do teste os animais jovens e sãos são distribuídos ao acaso pelos grupos submetidos ao tratamento e de controlo.

A substância a testar pode ser administrada na comida ou em cápsulas se for mais conveniente. Podem ser usados outros métodos de administração oral. As doses serão administradas aos animais da mesma forma durante toda a experiência. No caso de se utilizar um veículo ou outros aditivos para facilitar a administração estes devem ser comprovadamente não tóxicos. Podem ser usados dados de experiências anteriores.

Condições experimentais

Animais de experiência

A espécie de não roedores mais utilizada é o cão, de preferência de raça definida. Podem ser utilizadas outras espécies não roedoras. Utilizar-se-ão animais jovens e sãos e, no caso do cão, o teste deverá começar de preferência na idade de quatro a seis meses e nunca depois dos nove meses. Se um estudo subcrónico oral constituir a fase preliminar de um estudo a longo prazo deve utilizar-se a mesma espécie/raça em ambos os estudos.

Número e sexo

Serão utilizados para cada dose pelo menos oito animais (quatro fêmeas e quatro machos); o número de animais sobreviventes no fim da experiência deve ser suficiente para permitir uma avaliação significativa dos efeitos tóxicos.

Doses

São utilizadas pelo menos três doses diferentes e um controlo. Os animais do grupo de controlo são tratados da mesma maneira que os animais do grupo de experiência com excepção do tratamento com a substância a testar. A dose mais elevada deverá produzir efeitos tóxicos mas não a morte do animal; a dose mais baixa não deverá produzir quaisquer efeitos tóxicos. Se se dispuser de informação sobre a exposição humana, a dose mais fraca será superior a este valor. O ideal seria que a dose intermédia produzisse o efeito tóxico mínimo observável. Se se utilizarem várias doses intermédias, a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos.

Nos grupos das doses baixa e intermédia assim como no grupo controlo não deverá haver morte de animais.

Quando se trata de substâncias pouco tóxicas incorporadas na alimentação é importante assegurar-se que as quantidades de substância a testar envolvida não interferem com a alimentação normal.

Quando a substância a testar for incorporada na comida pode utilizar-se seja uma concentração alimentar constante (ppm ou mg/kg de comida) seja uma dose constante em relação com o peso corporal dos animais; deve ser especificado o método escolhido. Quando a substância é administrada directamente, por exemplo numa cápsula, a dose será dada todos os dias à mesma hora; se necessário, será adaptada semanalmente a fim de se manter uma dose constante em relação ao peso corporal do animal. Se um estudo subcrónico constituir uma fase preliminar de um estudo a longo prazo, deve utilizar-se um regime alimentar análogo em ambos os estudos.

Teste Limite

Se já tiver sido efectuado um teste de noventa dias de acordo com o método descrito abaixo, com uma dose de 1000 mg/kg peso corporal/dia ou com uma dose mais elevada em função da possibilidade de uma exposição humana - quando conhecida - que não tenha provocado quaisquer efeitos tóxicos, pode considerar-se inútil prosseguir a experiência. Quando se administram na comida substâncias pouco tóxicas é importante certificar se as suas quantidades ou outras propriedades não interferem com as exigências normais de alimentação.

Período de observação

Todos os animais deverão ser observados diariamente e registadas as manifestações de toxicidade incluindo o momento do seu aparecimento, sua intensidade e duração. Serão registados o momento da morte assim como o do aparecimento e desaparecimento das manifestações de toxicidade.

Procedimento

Nas condições ideais a substância a testar será administrada aos animais sete dias por semana durante um período de noventa dias. Desde que a substância a testar não seja administrada na comida admite-se que por razões essencialmente práticas seja administrada cinco vezes por semana. As observações incluirão, pelo menos, as modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das membranas mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central assim como a actividade somatomotora e do comportamento. O consumo alimentar (e de água quando a substância a testar é administrada na água de beber) assim como o peso dos animais serão determinados semanalmente.

Proceder-se-á diariamente a um exame clínico atento dos animais e tomar-se-ão medidas para reduzir o número de perdas de animais. No termo da experiência todos os animais sobreviventes são autopsiados. Os animais moribundos são retirados imediatamente e autopsiados. Os exames que a seguir se enunciam são normalmente feitos a todos os animais incluindo os controlos:

(nota 1) Conhecida actualmente por transaminase da alanina.

(nota 2) Conhecida actualmente por transaminase do aspartato.

Autópsia

Todos os animais serão submetidos a uma autópsia geral que incluirá o exame da superfície exterior do corpo, de todos os orifícios e das cavidades craniana, toráxica e abdominal e respectivos conteúdos. O fígado, os rins, as glândulas suprarenais, a tiróideia (assim como as paratiróideias) e os testículos serão pesados ainda húmidos o mais rapidamente possível depois da dissecação para se evitar a perda de líquidos por evaporação. Os seguintes orgãos e tecidos deverão ser conservados num meio adequado na eventualidade de um exame histopatológico ulterior: todas as lesões macroscópicas, encéfalo - incluindo cortes da medula/da protuberância, córtex cerebeloso, córtex cerebral, hipófise, tiróideia/paratiróideia, todo o tecido tímico, (traqueia), pulmões, coração, aorta, glândulas salivares, fígado, baço, rins, glândulas supra-renais, pâncreas, gónadas, útero (orgãos genitais anexos), (pele), vesícula biliar, esófago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, cego, cólon, recto, bexiga, gânglio linfático representativo, (glândula mamária na fêmea), musculatura da coxa), nervo periférico, (olhos), esterno com medula óssea, (fémur, incluindo superfície articular) e (medula espinhal a três níveis - cervical, mediotoráxica e lombar). Os tecidos mencionados entre parênteses só serão observados em caso de aparecimento de sinais de toxicidade ou de compromisso do orgão alvo.

Exame histopatológico

Serão objecto de um exame histopatológico completo todos os orgãos e tecidos dos animais do grupo de controlo e do grupo exposto à dose mais elevada. Nos outros grupos tratados faz-se um exame histopatológico de todos os orgãos que apresentam lesões no grupo tratado com a dose mais elevada ou naqueles em que as observações clínicas indiquem a sua necessidade.

Os resultados serão resumidos na forma de quadros indicando, para cada experiência, o número de animais no início do ensaio, o número de animais apresentando lesões, o tipo de lesão e a percentagem de animais com cada tipo de lesão. Os resultados serão avaliados por meio de um método estatístico apropriado. Pode ser utilizado qualquer método estatístico reconhecido.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deve incluir as seguintes informações:

• espécie, raça estirpe, origem, condições do ambiente, dieta,

• condições experimentais,

• doses (incluindo veículo, se utilizado) e concentrações,

• resposta tóxica por sexo e dose,

• dose sem efeito, se possível,

• momento da morte durante a experiência ou indicação dos animais sobreviventes no fim da experiência,

• descrição dos efeitos tóxicos ou outros,

• momento da observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução,

• dados relativos à alimentação e peso corporal,

• observações oftalmológicas,

• exames hematológicos efectuados e resultados,

• provas bioquímicas clínicas utilizadas e seus resultados (incluindo resultado das análises de urina),

• resultados da autópsia,

• tratamento estatístico dos resultados se possível,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados,

• descrição pormenorizada de todas as observações histopatológicas.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TOXICIDADE DÉRMICA SUBCRÓNICA:

TESTE DE NOVENTA DIAS EM ROEDORES

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definições

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

A substância a testar é aplicada diariamente em doses graduais na pele dos animais dos vários grupos, à razão de uma dose por grupo por um período de noventa dias. Durante o período de aplicação, os animais são observados diariamente para se detectarem manifestações de toxicidade. Os animais que morrem durante a experiência são autopsiados e no fim da experiência os animais sobreviventes são igualmente autopsiados.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Os animais são mantidos nas condições de alojamento e de alimentação da experiência, durante pelo menos cinco dias antes do teste. Antes de começar o teste os animais jovens e sãos são distribuídos ao acaso pelos grupos submetidos ao tratamento e de controlo.

Pouco tempo antes de se iniciar o ensaio rapam-se os pêlos da região dorsal dos animais. Se se recorrer à tosquia esta deverá ser efectuada mais ou menos 24 horas antes do teste. Normalmente é necessário repetir estas operações todas as semanas devendo tomar-se muito cuidado para não lesar a pele.

A área destinada à aplicação da substância a testar não poderá ser inferior a 10% da superfície corporal. O peso do animal entrará em linha de conta na decisão da zona a expôr e da dimensão da superfície a tratar. Sempre que se testam substâncias sólidas, que se necessário podem ser pulverizadas, a substância a testar deve ser humedecida com água ou com um veículo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. As substâncias a testar líquidas são geralmente usadas sem ser diluídas. Procede-se a uma aplicação diária durante cinco a sete dias por semana.

Condições experimentais

Animais de experiência

Podem ser utilizados o rato, o coelho ou a cobaia; também podem usar-se outras espécies sendo necessário justificar o seu emprego. No início da experiência a diferença de peso entre os animais não poderá ultrapassar (mais ou menos) 20% do peso médio. Se um estudo dérmico subcrónico constituir a fase preliminar de um estudo a longo prazo, deve utilizar-se a mesma espécie e estirpe em ambos os estudos.

Número e sexo

Para cada dose serão utilizados pelo menos vinte animais (dez fêmeas e dez machos) de pele sã. As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a experiência devem acrescentar-se ao número inicial o número de animais que se prevê ir sacrificar. Para além destes poderá haver um grupo satélite de vinte animais (dez de cada sexo) tratado com a dose mais elevada, durante noventa diase e observado quanto à reversibilidade, à persistência ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante vinte e oito dias após o tratamento.

Doses

São necessárias pelo menos três doses diferentes com um controlo ou um veículo de controlo se for usado um veículo. O período de exposição deverá no mínimo ser de seis horas por dia. A substância a testar será aplicada diariamente à mesma hora e a quantidade a administrar será ajustada regularmente (semanalmente ou bisemanalmente), de modo a manter-se constante relativamente ao peso corporal do animal. Os animais do grupo de controlo serão tratados da mesma maneira que os animais que oscanimais dos grupos de experiência com excepção da aplicação da substância a testar. Se se utilizar um veículo para facilitar a administração, este será administrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados, devendo a dose corresponder à do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada será determinada de forma a produzir efeitos tóxicos mas nunca, ou raramente, a morte do animal; a dose mais baixa não deverá produzir quaisquer efeitos tóxicos. Se se dispuser de informação sobre a exposição humana, a dose mais baixa deverá exceder esse valor. O ideal seria a dose intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observável.

Se se utilizarem várias doses intermédias a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos. Nos grupos das doses mais baixa e intermédia a incidência de mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados.

Se a aplicação da substância a testar provocar uma grave irritação cutânea, deverão reduzir-se as concentrações, o que poderá originar uma diminuição ou até um desaparecimento dos outros efeitos tóxicos da dose mais elevada. Se as lesões cutâneas forem muito graves, pode tomar-se necessário interromper a experiência e recomeçá-la com concentrações mais fracas.

Teste limite

Se já tiver sido efectuada uma experiência preliminar com uma dose de 1000 mg/kg ou com uma dose mais elevada em função da possibilidade de uma exposição humana conhecida, que não tenha provocado quaisquer efeitos tóxicos, será inútil prosseguir a experiência.

Período de observação

Os animais da experiência serão observados diariamente para detectar manifestações de toxicidade. Serão registados o momento da morte e o momento do aparecimento e desaparecimento das manifestações de toxicidade.

Procedimento

Os animais serão colocados em gaiolas individuais. Em condições ideais a substância a testar será administrada aos animais sete dias por semana durante um período de noventa dias.

Os animais de todos os grupos satélites que forem objecto de observações complementares serão mantidos vivos durante mais vinte e oito dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou a persistência dos efeitos tóxicos. O tempo de exposição será de seis horas por dia.

A substância a testar será aplicada uniformemente numa área equivalente a 10% da superfície total do corpo. No caso de substâncias altamente tóxicas, a superfície a utilizar poderá ser menor mas a camada da substância deverá ser o mais fina e uniforme possível.

Durante a exposição a substância a testar é mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e de um adesivo anti-alérgico. A superfície tratada será por sua vez convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substância a testar, e a evitar que os animais ingiram a dica substância. Podem utilizar-se aparelhos de contenção, para evitar a ingestão da substância, mas não se recomenda a imobilização completa.

No fim do tempo de exposição, se possível, é necessário eliminar todos os resíduos da substância com água ou por meio de qualquer outro método adequado de limpeza da pele.

Os animais serão observados diariamente, sendo sempre registadas as manifestações de toxicidade assim como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e duração. Durante o período de cativeiro observar-se-ão as modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central assim como da actividade somatomotora e do comportamento. O consumo alimentar e o peso dos animais serão determinados semanalmente.

Devem observar-se regularmente os animais a fim de se evitarem perdas por canibalismo, por autólise dos tecidos ou por condições impróprias de alojamento. No fim da experiência todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos serão imediatamente retirados e autopsiados.

Os exames que a seguir se enunciam são normalmente feitos a todos os animais incluindo os controlos:

Se a informação de estudos anteriores não for apropriada deverá considerar-se a necessidade de determinação dos parámetros hematológicos e bioquímicos clínicos antes de começar a experiência.

(nota 1) Conhecida actualmente por transaminase da alanina.

(nota 2) Conhecida actualmente por transaminase do aspartato.

Autópsia

Todos os animais serão submetidos a uma autópsia geral que incluirá o exame da superfície exterior do corpo, de todos os orifícios e das cavidades crâniana, toráxica e abdominal e respectivos conteúdos. O fígado, os rins, as glândulas supra-renais e os testículos serão pesados, ainda húmidos, o mais rápidamente possível depois da dissecação, para se evitar a perda de. líquidos por evaporação. Os seguintes orgãos e tecidos deverão ser conservados num meio adequado na eventualidade de um exame histopatológico ulterior: todas as lesões macroscópicas, encéfalo incluindo cortes da medula/protuberância, córtex cerebeloso e córtex cerebral, hipófise, tiróideia, paratiróideia, todo o tecido tímico, (traqueia), pulmões, coração, aorta, glândulas salivares, fígado, baço, rins, supra-renais, pâncreas, gônadas, útero, orgãos genitais anexos, vesícula biliar (quando presente), esófago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, cego, cólon, recto, bexiga, gânglio linfático representativo, (glândula mamária na fêmea), (musculatura da coxa), nervo periférico, (olhos), (esterno com medula óssea), (fémur, incluindo superfície articular), (medula espinhal a três níveis - cervical, mediotoráxica e lombar) e (glândulas lacrimais). Os tecidos mencionados entre parênteses só serão examinados em caso de aparecimento de sinais de toxicidade ou de compromisso do orgão alvo.

Exame histopatológico

Os resultados devem ser resumidos sob a forma de quadros, indicando, para cada grupo de experiência, o número de animais no início desta, o número de animais apresentando lesões, o tipo de lesões e a percentagem de animais apresentando cada tipo de lesão. O resultados serão avaliados por meio dum método estatístico apropriado. Pode utilizar-se qualquer método estatístico reconhecido.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

• espécie, estirpe, origem, condições do meio ambiente, dieta,

• doses (compreendendo veículo, se utilizado) e concentrações,

• resposta tóxica por sexo e por dose,

• dose sem efeitos, se possível,

• momento de morte durante a experiência ou indicação dos animais sobreviventes no fim da experiência,

• descrição dos efeitos tóxicos ou outros,

• momento da observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução,

• dados relativos à alimentação e peso do animal,

• observações oftalmológicas,

• exames hematológicos efectuados e seus resultados,

• testes bioquímicos clínicos utilizados e seus resultados (incluindo resultados das análises de urina),

• resultados da autópsia,

• descrição pormenorizada de todas as observações histopatológicas,

• tratamento estatístico dos resultados, se possível,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados,

• condições experimentais.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TOXICIDADE SUBCRÓNICA POR INALAÇÃO:

TESTE DE NOVENTA DIAS EM ROEDORES

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definições

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

Vários grupos de animais de experiência são expostos diariamente, por um período determinado, a concentrações diferentes de substâncias a testar à razão de uma concentração por grupo durante um período de noventa dias. Quando se utiliza um veículo para ajudár a obter uma concentração apropriada da substância a testar na atmosfera deve usar-se um grupo controlo para o veículo. Durante o período de administração os animais são observados diariamente para se detectarem as manifestações de toxicidade. Os animais que morrem durante a experiência são autopsiados e no fim da experiência os animais sobreviventes são igualmente autopsiados.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Discrição do método de ensaio

Preparativos

Os animais são mantidos nas condições de alojamento e de alimentação da experiência pelo menos durante cinco dias antes do teste. Antes de começar o teste os animais jovens e sãos são distribuídos ao acaso pelos grupos submetidos ao tratamento e de controlo. Se necessário pode adicionar-se um veículo à substância a testar para se conseguir uma concentração apropriada desta na atmosfera; se um veículo ou outros aditivos forem usados para facilitar a administração devem ser comprovadamente não tóxicos. Pode recorrer-se a dados anteriormente publicados se necessário.

Condições experimentais

Animais de experiência

Salvo contra-indicação a espécie preferida é o rato. Devem utilizar-se animais jovens e sãos de uma estirpe corrente de laboratório. No início da experiência a diferença de peso entre os animais não poderá ultrapassar (mais ou menos) 20% do peso médio. Se um estudo subcrónico por inalação constituir a fase preliminar de um estudo a longo prazo, deve utilizar-se a mesma espécie e estirpe em ambos os estudos.

Número e sexo

Para cada concentração de exposição serão utilizados pelo menos vinte animais (dez fêmeas e dez machos). As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a experiência devem acrescentar-se ao número inicial o número de animais que se prevê ir sacrificar. Para além destes um grupo satélite de vinte animais (dez de dada sexo) poderá ser exposto à concentração mais elevada durante noventa dias e ser observado quanto à reversibilidade, à persistência ou ao aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante vinte e oito dias após o tratamento.

Concentração de exposição

São utilizadas pelo menos três concentrações, com um grupo controlo ou, se necessário, um grupo controlo para o veículo quando este for utilizado (correspondendo a concentração do veículo ao nível de exposição mais elevada).

Os animais do grupo de controlo são tratados da mesma forma que os dos grupos da experiência com excepção da inalação da substância a testar. A concentração mais elevada deverá produzir efeitos tóxicos mas nenhuma ou poucas mortes.

Se se dispuser de informação sobre a exposição humana a concentração mais baixa será superior a esse valor. O ideal seria a concentração intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observável. Se se utilizarem várias concentrações intermédias a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos. Nos grupos de concentração baixa e intermédia assim como nos grupos controlo, a incidência de mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados.

Tempo de exposição

A duração diária do tempo de exposição deverá ser de seis horas após se obterem as concentrações dentro da câmara de exposição. Podem utilizar-se outros tempos de exposição para satisfazer outras exigências específicas.

Equipamento

Os animais serão expostos à substância a testar por meio de um dispositivo de inalação concebido de forma a conseguir-se um fluxo de ar contínuo que assegurará pelo menos doze renovações de ar por hora e garanta uma concentração de oxigénio apropriada e uma distribuição uniforme do producto a testar no ar. Se se utilizar uma câmara esta será concebida de maneira a obter-se uma superlotação mínima dos animais e uma exposição máxima à substância a testar.

Como regra geral para se assegurar a estabilidade da atmosfera na câmara o volume total dos animais de experiência não deve ultrapassar 5% do volume da câmara de ensaio. Pode também recorrer-se a um sistema de exposição oro-nasal, de cabeça apenas ou do corpo inteiro em câmara individual; os dois primeiros tipos de exposição permitem reduzir a penetração por outras vias.

Período de observação

Os animais da experiência deverão ser observados diariamente para se detectarem manifestações de toxicidade durante todo o período de exposição e de recuperação. Serão registados o momento da morte assim como o do aparecimento e desaparecimento das manifestações de toxicidade.

Procedimento

Os animais são expostos diariamente à substância a testar à razão de cinco a sete dias por semana, durante um período de noventa dias. Os animais dos grupos satélites destinados às observações complementares serão mantidos vivos durante mais vinte e oito dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou a persistência dos efeitos tóxicos. A temperatura a que se efectua o teste deverá ser mantida a 22 (mais ou menos) 3ºC. Em condições óptimas, a humidade relativa deverá ser mantida entre 30 e 70% mas, nalguns casos, isto pode ser impraticável (por exemplo, testes com aerosol). Durante a exposição, os animais não receberão alimentos nem água. Deverá ser usado um sistema de inalação dinâmico com um dispositivo apropriado de controlo analítico da concentração. Recomenda-se a realização de um teste preliminar para se determinarem as concentrações apropriadas de exposição. O débito de ar deverá assegurar concentrações homogéneas em toda a câmara de exposição. O sistema deverá permitir a obtenção de condições estáveis o mais rapidamente possível.

Deverá ser feita a medição ou monitorização de:

Durante o período de cativeiro é conveniente observar nomeadamente, as modificações da pele e do pêlo, dos olhos, das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, da actividade somatomotora e do comportamento. O consumo alimentar e o peso dos animais serão determinados todas as semanas. É necessário observar regularmente os animais a fim de se assegurar que não há perdas por canibalismo, autólise dos tecidos ou condições impróprias de alojamento. No fim da experiência, todos os animais sobreviventes são autopsiados. Durante a experiência, os animais moribundos serão imediatamente retirados e autopsiados.

Os exames que a seguir se enunciam são normalmente feitos a todos os animais, incluindo os de controlo:

Se a informação de estudos anteriores não for apropriada deverá considerar-se a necessidade de determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos clínicos antes de começar a experiência.

(nota 1) Conhecida actualmente por transaminase da alanina.

(nota 2) Conhecida actualmente por transaminase do aspartato.

Autópsia

Todos os animais são submetidos a uma autópsia geral que incluirá o exame da superfície exterior do corpo, de todos os orifícios e das cavidades cranianas, toráxicas e abdominal e respectivos conteúdos. O fígado, os rins, as glândulas supra-renais e os testículos serão pesados, ainda húmidos, o mais rápidamente possível depois da dissecação para evitar a perda de líquidos por evaporação. Os seguintes orgãos e tecidos deverão ser conservados num meio adequado na eventualidade de exames histopatológicos ulteriores: todas as lesões macroscópicas, pulmões - que devem ser retirados inteiros, pesados e tratados com um fixador apropriado que permita conservar a estrutura pulmonar (considera-se a perfusão com o fixador como um método eficaz), tecidos da naso-faringe, encéfalo - incluindo cortes da medula/da protuberância, córtex cerebeloso e córtex cerebral, hipófise, tiróideia/paratiróideia, todo o tecido tímico, traqueia, pulmões, coração, aorta, glândulas salivares, fígado, baço, rins glândulas supra-renais, pâncreas, gónadas, útero, (orgãos genitais anexos), (pele), vesícula biliar (quando presente), esófago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, cego, cólon, recto, bexiga, gânglio linfático representativo (glândula mamária na fêmea), (musculatura da coxa), nervo periférico, (olhos), esterno com medula óssea, (fémur, incluindo superfície articular), (medula espinhal a três níveis - cervical, mediotorácica e lombar). Os tecidos mencionados entre parentesis só serão observados em caso de aparecimento de sinais de toxicidade ou de compromisso do orgão alvo.

Exame histopatológico

Os resultados serão resumidos sob a forma de quadros indicando, para cada grupo de teste o número de animais no início, o número de animais atingidos por lesões, o tipo de lesões e a percentagem de animais apresentando cada tipo de lesão. Os resultados serão avaliados com um método estatística apropriado. Pode ser utilizado qualquer método estatístico reconhecido.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deve incluir as seguintes informações:

• espécie, estirpe, origem, condições do meio ambiente, dieta,

• condições experimentais:

Descrição do aparelho de exposição: incluindo concepção, tipo, dimensões, fonte de ar, sistema gerador de partículas e de aerossóis, método de condicionamento de ar, tratamento do ar evacuado e, no caso disso, o método de acondicionamento dos animais na câmara de ensaio. O equipamento utilizado para medir a temperatura, a humidade, e se necessário, a estabilidade das concentrações do aerossol ou da granulometria das partículas será descrito.

Dados relativos à exposição: Estes dados serão apresentados sob a forma de um quadro indicando os valores médios assim como uma medida de variação (por exemplo: desvio-padrão) e dirão respeito:

• resposta tóxica por seco e por concentração,

• dose sem efeito, se possível,

• momento da morte durante a experiência ou indicação dos animais sobreviventes,

• descrição dos efeitos tóxicos ou outros,

• momento de observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução,

• dados relativos à alimentação e peso corporal,

• observações oftalmológicas,

• exames hematológicos efectuados e seus resultados,

• testes bioquímicos clínicos utilizados e seus resultados (incluindo análises de urina),

• resultados da autópsia,

• descrição pormenorizada de todas as observações histopatológicas,

• tratamento estatístico dos resultados, se apropriado,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TESTE DE TERATOGÉNESE:

ROEDORES E NÃO ROEDORES

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definições

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método do ensaio

A substância a testar é administrada em diferentes doses ou concentrações a vários grupos de fêmeas grávidas, pelo menos durante a parte da gestação correspondendo à organogénese, à razão de uma dose por grupo. Pouco tempo antes da data esperada do parto a fêmea é sacrificada, removendo-se o útero e examinando-se o seu conteúdo. Este método de ensaio explora a embriotoxicidade e a toxicidade fetal.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Aclimatizam-se às condições de experiência fêmeas adultas jovens e sãs, nunca tendo acasalado, de idade e tamanhos comparáveis, durante pelo menos cinco dias antes da experiência e depois acasaladas com machos de fecundidade comprovada. As femas inseminades são repartidas ao acaso entre os grupos tratados.

A fecundação pode ser feita naturalmente ou por inseminação artificial. A substância a testar é administrada diariamente às fêmeas imediatamente após a implantação e durante todo o período de organogénese. Um dia antes do termo, retiram-se os fetos por histerectomia e examinam-se as alterações viscerais ou do esqueleto, incluindo atrasos de crescimento, ossificação tardia e hemorragias intestinais.

Condições experimentais

Animais de experiência

As espécies habitualmente utilizadas são o rato, o ratinho o hamster e o coelho com preferência para o rato e o coelho. Deverão ser utilizadas as estirpes correntes de laboratório. A estirpe utilizada deverá ter uma fecundidade suficiente e será caracterizada pela sua reacção aos agentes teratogénicos. Os animais deverão ser colocados em gaiolas individuais.

Número e sexo

Serão necessários para cada dose pelo menos vinte ratas, ratinhas ou hamsters grávidas ou doze coelhas grávidas. O objectivo é assegurar um número de ninhadas e de crias suficiente para avaliar o potencial teratogénico da substância.

Doses

Serão utilizadas pelo menos três doses diferentes bem como um grupo de controlo. Se a substância a testar for administrada num veículo, deve utilizar-se igualmente um grupo de controlo para o veiculo. As propriedades toxicológicas do veículo devem ser conhecidas: não deve existir nenhum efeito teratogénico ou sobre a reprodução. Com excepção da substância a testar, o tratamento do(s) grupo(s) de controlo será idêntico ao dos grupos de experiência. A menos que a natureza físico/química ou as propriedades biológicas da substância a isso se oponham, a dose mais elevada deverá pôr em evidência, nas condições ideais, uma certa toxicidade nas mães, por exemplo uma ligeira diminuição de peso, mas não deverá provocar a morte de mais de 10%. A dose mais baixa não deverá produzir efeitos observáveis atribuíveis à substância a testar. A(s) dose(s) intermédia(s) deverão situar-se geometricamente entre as doses mais elevada e mais baixa.

Teste limite

No caso de substâncias pouco tóxicas se uma dose de pelo menos 1000 mg/kg não produzir qualquer efeito tóxico no embrião ou qualquer efeito teratogénico pode considerar-se inútil prosseguir a experiência com outras doses. Se uma dose de menos 1000 mg/kg evidenciar alguma toxicidade na mãe (como especificado a seguir) mas não tiver nenhum efeito nocivo no embrião, pode considerar-se inútil prosseguir a experiência com outras doses.

Tempo de exposição

O dia 0 é aquele em que se observa a presença dum rolhão vaginal ou de esperma (quando possível). O tratamento deverá cobrir o período da organogénese, ou seja seis a quinze dias para o rato e o ratinho, seis a catorze dias para hamster e seis a dezoito dias para o coelho. Se o dia 0 for o de acasalamento ou de inseminação artificial, acrescentar-se-á um dia a cada um dos períodos mencionados. O período de tratamento pode também ser prolongado até cerca de um dia antes da data presumível do parto.

Período de observação

Será efectuado um exame clínico atento pelo menos uma vez por dia. Serão efectuados exames complementares diariamente tomando-se medidas apropriadas a fim de reduzir a perda de animais do estudo.

Procedimento

A substância atestar é administrada oralmente por gavage. Deverá ser administrada sempre à mesma hora todos os dias durante toda a duração do tratamento.

A dose pode ser calculada em função do peso das fêmeas no início do tratamento ou, tendo em conta o rápido aumento de peso durante a gestação, podem ser pesadas periodicamente, adaptando-se a dose ao seu último peso. As manifestações de toxicidade serão registadas à medida que forem surgindo, com indicação da sua intensidade e da sua duração. As fêmeas com sinais de aborto ou de parto prematuro serão sacrificadas e submetidas a um exame macroscópico completo. O período de observação pós-tratamento será prosseguido até cerca de um dia antes do termo. O objectivo é cobrir a maior parte do período de gestação mas evitar as dificuldades duma interpretação dos dados no caso de partos naturais. Durante o período de cativeiro deverão observar-se entre outras as modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, bem como a actividade somato-motora e do comportamento. Deverão determinar-se semanalmente o consumo alimentar bem como o peso dos animais.

Autópsia

No momento da morte, seja no decurso do estudo ou no fim deste, os animais serão objecto dum exame macroscópico a fim de procurar qualquer anomalia estrutural ou quaisquer modificações patológicas susceptíveis de ter influenciado a gestação. Imediatamente após a morte o útero será retirado e o seu conteúdo examinado a fim de revelar o número de embriões ou de fetos mortos bem como o número de fetos vivos. Habitualmente é possível determinar o momento da morte in utero. O número de corpos amarelos pode ser determinado nos ratos e nos coelhos. Serão determinados o sexo e o peso de cada feto; os pesos serão anotados e calculado o peso médio. Depois da extracção cada feto será objecto dum exame exterior. No caso dos ratos, dos ratinhos e dos hamsters, 33 a 50% dos animais de cada ninhada serão processados e examinados do ponto de vista de anomalias do esqueleto, sendo os restantes processados e examinados para se procurar anomalias das partes moles, usando métodos apropriados. No caso dos coelhos, cada feto será dissecado cuidadosamente para se detectar alterações das vísceras sendo em seguida examinado do ponto de vista de alterações do esqueleto.

Os dados serão resumidos sob a forma de quadros, indicando para cada grupo da experiência, o número de animais no início do ensaio, o número de fêmeas grávidas, o número e a percentagem de fetos vivos e de fetos apresentando alterações das partes moles ou do esqueleto bem como a sua relação com ninhadas específicas. Os resultados serão avaliados por meio dum método estatístico apropriado. Pode utilizar-se qualquer método estatístico reconhecido.

3.1. Relatório do teste

O relatório deverá incluir as informações seguintes:

• espécie, estirpe, origem, condições do ambiente, dieta,

• condições experimentais,

• doses (incluindo o veículo, se utilizado) e concentração,

• resposta tóxica por dose,

• dose sem efeitos (se possível),

• momento da morte no decurso da experiência ou indicação dos animais sobreviventes no fim da experiência,

• descrição dos efeitos tóxicos ou outros,

• momento da observação de todas as manifestações anormais e sua evolução,

• dados relativos à alimentação e peso corporal,

• duração da gestação e informações sobre as ninhadas (incluindo dados publicados anteriormente),

• dados relativos ao feto (vivo/morto, sexo, alterações das partes moles e do esqueleto),

• dados sobre a ninhada (vivo/morto, sexo, alterações das partes moles e esqueleto para cada ninhada),

• tratamento estatístico dos resultados,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TESTE DE TOXICIDADE CRÓNICA

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definições

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

A substância a testar é administrada normalmente sete dias por semana, pela via apropriada a vários grupos de animais de experiência à razão de uma dose por cada grupo durante a maior parte da sua vida. Durante e depois da exposição à substância a testar observam-se diariamente os animais de experiência para se detectar manifestações de toxicidade.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Os animais são mantidos nas condições de alojamento e de alimentação da experiência, durante pelos menos cinco dias antes do teste. Antes da começar o teste os animais jovens e sãos são distribuídos ao acaso pelos grupos submetidos ao tratamento e de controlo.

Condições experimentais

Animais de experiência

A espécie preferida é o rato. Podem utilizar-se outras espécies (roedores ou não roedores) de acordo com os resultados de estudos anteriores. Devem utilizar-se animais jovens e sãos de estirpes correntes de laboratório, e o tratamento deve começar o mais cedo possível após o desmame.

No início da experiência a diferença de peso entre os animais não deverá ultrapassar (mais ou menos) 20% do peso médio. Se um estudo subcrónico oral tiver constituído a fase preliminar de um estudo a longo prazo deve utilizar-se a mesma espécie e estirpe em ambos os estudos.

Número e sexo

No caso de roedores serão utilizados pelo menos quarenta animais (vinte fêmeas e vinte machos) para cada dose e grupo de controlo correspondente. As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se estiver previsto o sacrifício de animais no decurso da experiência, os efectivos devem ser aumentados do número de animais cujo sacrifício estiver previsto. Para os não roedores aceita-se um número mais pequeno de animais, pelo menos quatro por sexo e por grupo.

Doses e frequência de exposição

Devem utilizar-se pelo menos três doses além do grupo de controlo correspondente. A dose máxima deverá produzir manifestações nítidas de toxicidade sem causar mortalidade excessiva. A dose mais baixa não produzirá nenhum efeito tóxico.

A(s) dose(s) intermédia(s) terá (terão) um valor próximo da média entre a dose máxima e a dose mínima.

Os níveis de dose deverão ter em conta os dados obtidos nos ensaios e estudos de toxicidade efectuados anteriormente.

Normalmente a frequência de exposição será diária. Se o produto químico for administrado na água de beber ou incorporado na alimentação deve estar constantemente disponível

Controlos

Deverá utilizar-se um grupo de controlo idêntico em todos os aspectos aos grupos tratados com excepção da exposição a substância a testar.

Em condições especiais como em estudos por inalação implicando o emprego de aerossóis ou o uso de um emulsionante com actividade biológica não estudada em ensaios por via oral, deverá utilizar-se um grupo suplementar de controlo negativo correspondente. O grupo de controlo negativo é tratado da mesma maneira que os outros grupos com excepção da exposição à substância a testar ou a qualquer veículo.

Via de administração

As duas vias principais de administração são a oral e a respiratória (por inalação). A escolha de via de administração depende das características físico-químicas da substância a testar e da via mais provável de exposição humana.

A utilização da via cutânea coloca problemas práticos consideráveis. A toxicidade crónica sistémica provocada pela absorção percutânea pode normalmente deduzir-se dos resultados de outros testes orais, e do conhecimento da quantidade de substância absorvida por via percutânea em estudos anteriores de toxicidade, por essa via.

Estudos por via oral

A via oral de administração é preferida, salvo contra-indicações, se a substância a testar for absorvida pelo tubo digestivo e se a ingestão for uma via possível de exposição humana.

Os animais podem receber a substância a testar na alimentação, dissolvida na água de beber, ou numa cápsula. Em condições ideais a dose diária será administrada sete dias por semana visto que a administração em cinco dias por cada sete pode permitir a recuperação do animal ou a diminuição de toxicidade no período em que o tratamento é interrompido e assim afectar os resultados e a avaliação subsequente. No entanto, por razões essencialmente práticas, a administração em cinco dias por cada sete é considerada aceitável.

Estudos por inalação

Um vez que os estudos por inalação colocam problemas técnicos de maior complexidade do que os por outras vias de administração, são dadas aqui recomendações mais pormenorizadas. Deve notar-se que a instilação endotraqueal pode constituir uma alternativa válida em certas situações específicas.

As exposições prolongadas (de longo prazo) são habitualmente calculadas em função da exposição humana prevista: os animais são expostos cinco dias por semana (exposição intermitente) à razão de seis horas por dia depois de se obterem as concentrações na câmara de experiência ou expostos sete dias em cada sete (exposição contínua) à razão de 22 a 24 horas por dia destinando-se uma hora por dia à alimentação dos animais segundo um horário regular e à manutenção das câmaras. Em ambos os casos os animais são habitualmente expostos a uma concentração fixa da substância a testar.

Uma diferença essencial entre a exposição intermitente e a exposição contínua reside no facto de na primeira os animais disporem dum período de 17 a 18 horas para recuperar dos efeitos da exposição diária e mesmo de um período mais longo durante os fins-de-semana. A escolha da exposição intermitente ou contínua será feita em função dos objectivos do estudo e da exposição humana que deve ser simulada. Convém no entanto ter em conta certas dificuldades técnicas: por exemplo as vantagens da exposição contínua na simulação das condições do ambiente podem ser contrariadas pela necessidade de alimentar e dar de beber aos animais durante a exposição e ainda pela necessidade de técnicas mais complicadas de produção de aerossóis e de vapores bem como de monitorização.

Câmaras de exposição

Os animais são expostos à substância a testar em câmaras de inalação concebidas de forma a conseguir-se um fluxo de ar dinâmico de pelo menos doze renovações de ar por hora e uma concentração adequada de oxigénio e uma distribuição uniforme da substância a testar no ar. As câmaras de exposição e as câmaras de controlo serão idênticas quanto à construção e concepção a fim de garantirem condições de exposição comparáveis em todos os aspectos, com excepção da exposição à substância a testar. Geralmente mantém-se uma ligeira pressão negativa no interior da câmara para impedir fugas da substância a testar para a área envolvente. As câmaras deverão ser concebidas de forma a evitar a superlotação com os animais de experiência.

Em geral para assegurar a estabilidade da atmosfera da câmara, o volume total dos animais de experiência não deve ultrapassar 5% do volume da câmara de exposição.

Deverá ser feita a medição ou monitorização de:

ii) Concentração: durante o período de exposição diária a concentração da substância a testar não deve variar mais que (mais ou menos) 15% em redor do valor médio;

iii) Temperatura e humidade: para roedores a temperatura deve ser mantida a 22ºC ((mais ou menos) 2ºC) e a humidade dentro da câmara será de 30 a 70% excepto quando se utilizar água para colocarem suspensão na atmosfera das câmaras a substância a testar. Estes parâmetros serão, de preferência, monitorizados permanentemente;