Decreto-Lei n.º 248/2007 — Estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Clavibacter michiganensis (Smith)…

Estão comercialmente disponíveis soluções de montagem para evitar a rápida perda de fluorescência como sejam, por exemplo, Vectashield(R) (Vector Laboratories) ou Citifluor(R) (Leica).

APÊNDICE N.º 4

Determinação do nível de contaminação nos testes IF e FISH

1 - Determinar o número médio de células fluorescentes típicas por campo de observação (c).

2 - Calcular o número de células fluorescentes típicas por poço de lâmina de microscópio (C):

C = c x S/s

Em que:

S = área da superfície de cada poço da lâmina de poços múltiplos, e

s = área da superfície do campo da objectiva

s = (pi)i(elevado a 2)/4G(elevado a 2)K(elevado a 2)

Em que:

i = coeficiente de campo (varia entre 8 e 24, dependendo do tipo de ocular)

K = coeficiente do tubo (1 ou 1,25)

G = ampliação da objectiva (l00x, 40x, etc.)

3 - Calcular o número de células fluorescentes típicas por ml de sedimento ressuspenso (N).

N = C x 1000/y x F

Em que:

y = volume de sedimento ressuspenso em cada poço, e

F = factor de diluição do sedimento ressuspenso

APÊNDICE N.º 5

Meios de isolamento e cultura de C. m. subsp. sepedonicus

Agar nutritivo (NA)

Agar nutritivo (Difco) - 23,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclavea 121°C durante 15 minutos.

Agar nutritivo com dextrose (NDA)

Bacto-Agar nutritivo da Difco com 1% de D(+)glucose mono-hidratada. Esterilizar em autoclave a 115°C durante 20 minutos

Agar com extracto de levedura, peptona e glucose (YPGA)

Extracto de levedura (Difco) - 5,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 5,0 g

D(+)glucose mono-hidratada - 10,0 g

Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Extracto de levedura e sais minerais (YGM)

Bacto extracto de levedura (Difco) - 2,0 g

D(+)glucose mono-hidratada - 2,5 g

K(índice 2)HPO(índice 4) - 0,25 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 0,25 g

MgSO(índice 4).7H(índice 2)O - 0,1 g

MnSO(índice 4).H(índice 2)O - 0,015 g

NaCl - 0,05 g

FeSO(índice 4).7H(índice 2)O - 0,005 g

Bacto-Agar (Difco) - 18,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar volumes de meio litro em autoclave a 115°C durante 20 minutos.

Meio MTNA

Excepto quando assinalado em contrário, todos os componentes do meio são da BDH

Extracto de levedura (Difco) - 2,0 g

Manitol - 2,5 g

K(índice 2)HPO(índice 4) - 0,25 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 0,25 g

NaCl - 0,05 g

MgSO(índice 4).7H(índice 2)O - 0,1 g

MnSO(índice 4).H(índice 2)O - 0,015 g

FeSO(índice 4).7H(índice 2)O - 0,005 g

Agar (Oxoid n.º 1) - 16,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e ajustar o pH a 7,2. Após autoclavagem (a 121°C durante 15 minutos) e arrefecimento a 50°C, adicionar os antibióticos: trimetoprima 0,06 g, ácido nalidíxico 0,002 g e anfotericina B 0,01 g.

Soluções concentradas de antibiótico: trimetoprima (Sigma) e ácido nalidíxico (Sigma) (ambos a 5 mg/ml), em metanol a 96% e anfotericina B (Sigma) (1 mg/ml) em dimetilsulfóxido. As soluções concentradas são esterilizadas por filtração.

Nota. - A durabilidade do meio basal é de 3 meses. Após a adição dos antibióticos, a durabilidade é de 1 mês quando armazenado refrigerado.

Meio NCP-88

Agar nutritivo (Difco) - 23,0 g

Extracto de levedura (Difco) - 2,0 g

D-manitol - 5,0 g

K(índice 2)HPO(índice 4) - 2,0 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 0,5 g

MgSO(índice 4).7H(índice 2)O - 0,25 g

Dissolver os ingredientes e ajustar o pH a 7,2. Após autoclavagem e arrefecimento a 50°C, adicionar os seguintes antibióticos: sulfato de polimixina B (Sigma) 0,003 g, ácido nalidíxico (Sigma) 0,008 g e cicloheximida (Sigma) 0,2 g.

Dissolver os antibióticos em soluções concentradas da seguinte forma: ácido nalidíxico em NaOH 0,01 M, cicloheximida em etanol a 50% e sulfato de polimixina B em água destilada. As soluções concentradas são esterilizadas por filtração.

Nota. - A durabilidade do meio basal é de 3 meses. Após a adição dos antibióticos, a durabilidade é de 1 mês quando armazenado refrigerado.

APÊNDICE N.º 6

Protocolo e reagentes da PCR validados

Nota. - O teste preliminar deve permitir a detecção reprodutível de, pelo menos, 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de C. m. subsp. sepedonicus por ml de amostra de extractos.

O teste preliminar não deve ainda revelar nenhum resultado falso positivo com um painel de estirpes bacterianas seleccionadas.

1 - Protocolo PCR Multiplex com controlo interno da PCR (Pastrik, 2000):

1.1 - Iniciadores:

Iniciador directo PSA-1 - 5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'

Iniciador inverso PSA-R - 5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'

Iniciador directo NS-7-F - 5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'

Iniciador inverso NS-8-R - 5'- tcc gca ggt tca cct acg ga -3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado do ADN-alvo de C. m. subsp. sepedonicus = 502bp (conjunto iniciador PSA).

Tamanho esperado do fragmento amplificado do controlo interno da PCR de 18S rRNA = 377bp (conjunto iniciador NS).

1.2 -Mistura de reacção da PCR:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40694095.pdf))

1.3 - Condições de reacção da PCR:

Correr o seguinte programa:

1 ciclo de:

10 ciclos de:

ii) 1 minuto a uma temperatura de 95°C (desnaturação do ADN-alvo);

iii) 1 minuto a uma temperatura de 64°C (emparelhamento dos iniciadores);

iv) 1 minuto a uma temperatura de 72°C (extensão da cópia).

25 ciclos de:

vi) 30 segundos a uma temperatura de 62°C (emparelhamento dos iniciadores);

vii) 1 minuto a uma temperatura de 72°C (extensão da cópia);

1 ciclo de:

viii) 5 minutos a uma temperatura de 72°C (extensão final);

ix) Manter a uma temperatura de 4°C.

Nota. - Este programa está optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii),iii), iv), v), vi) e vii).

1.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de C. m. subsp. sepedonicus produzem um polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição característico com a enzima Bgl II após incubação a uma temperatura de 37 C durante 30 minutos. Os fragmentos de restrição obtidos de um fragmento específico de C. m. subsp. sepedonicus possuem tamanhos de 282bp e 220bp.

2 - Preparação do tampão de carregamento:

2.1 - Azul de bromofenol (solução concentrada a 10%):

Azul de bromofenol - 5 g

Água destilada (bidest) - 50 ml

2.2 - Tampão de carregamento:

Glicerol (86%) - 3,5 ml

Azul de bromofenol - 300 (mi)l

Água destilada (bidest) - 6,2 ml

3 - Tampão de tris acetato EDTA (TAE) 10X, pH 8,0:

Tampão tris - 48,4 g

Ácido acético glacial - 11,42 ml

EDTA (sal dissódico) - 3,72 g

Água destilada - 1,00 l

Diluir até 1x antes de utilizar.

Também disponível comercialmente (por exemplo, Invitrogen ou equivalente).

APÊNDICE N.º 7

Reagentes validados para o teste FISH

1 - Sondas:

Sonda específica para C. m. subsp. sepedonicus CMS-CY3-01 - 5' - ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'

Sonda para eubactérias não específica EUB-338-FITC - 5' - gct gcc tcc cgt agg agt -3'

2 - Solução fixadora:

Nota. - Atenção! O fixador contém paraformaldeído, um produto tóxico. Utilizar luvas e não inalar. É aconselhável trabalhar em «hotte».

ii) Ajustar o pH a 7,0 mediante adição de 1 ml de tampão fosfato 0,1M (PB; pH 7,0) e 5 gotas de HCl 1N. Verificar o pH com papel indicador e ajustar, se necessário, com HCl ou NaOH.

Nota. - Atenção! Não utilizar um medidor de pH em soluções contendo paraformaldeído.

iii) Filtrar a solução através de um filtro de membrana de 0,22(mi)m e manter ao abrigo da poeira a 4°C até à sua utilização.

iv) Nota:

Solução fixadora alternativa: etanol a 96%.

3 - «Hybmix» 3X:

NaCl - 2,7 M

Tris-HCl - 60mM (pH 7,4)

EDTA esterilizado por filtração e autoclavado - 15mM

Diluir até 1x, conforme necessário.

4 - Solução de hibridação:

«Hybmix» 1X:

Dodecilsulfato de sódio (SDS) - 0,01%

Sonda EUB 338-5 ng/(mi)l

Sonda CMSCY301-5 ng/(mi)l

Preparar quantidades de solução de hibridação, de acordo com os cálculos apresentados seguidamente. Para cada lâmina (contendo 2 amostras diferentes em duplicado) são necessários 90(mi)l de solução de hibridação.

Quantidades sugeridas para a preparação da solução de hibridação

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40694095.pdf))

Nota. - Armazenar todas as soluções contendo sondas fotossensíveis, no escuro, a uma temperatura de 20°C. Proteger da exposição directa à luz solar ou eléctrica durante a utilização.

5 - Tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0:

Na(índice 2)HPO(índice 4) - 8,52 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 5,44 g

Água destilada - 1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121°C durante 15 minutos.

APÊNDICE N.º 8

Condições de cultivo de beringela

Semear beringelas (Solanum melongena) em tabuleiros com substrato pasteurizado apropriado. O transplante das plântulas faz-se quando os cotilédones estão completamente expandidos (10 a 14 dias) para vasos com substrato para cultura igualmente pasteurizado.

As beringelas devem ser cultivadas em estufa, nas seguintes condições ambientais:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40694095.pdf))

Fornecedor: ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

APÊNDICE N.º 9

Coloração de Gram (modificação de Hucker)

(Doetsch, 1981) (ver nota *)

Solução de violeta de cristal:

Dissolver 2 g de violeta de cristal em 20 ml de etanol a 95%.

Dissolver 0,8 g de oxalato de amónio em 80 ml de água destilada.

Misturar as duas soluções.

Solução de Lugol:

Iodo - 1 g

Iodeto de potássio - 2 g

Água destilada - 300 ml

Triturar num almofariz o iodo e o iodeto de potássio. Adicionar à água e agitar num recipiente fechado até dissolução.

Solução de safranina para contraste:

Solução concentrada:

Safranina O - 2,5 g

Etanol a 95% - 100 ml

Misturar e guardar.

Diluir 1:10 para obter uma solução de trabalho.

Procedimento de coloração:

1) Preparar esfregaços em lâminas de vidro, secá-los ao ar e fixá-los pelo calor;

2) Cobrir a lâmina com solução de violeta de cristal durante um minuto;

3) Lavar rapidamente com água corrente;

4) Cobrir com solução de Lugol durante um minuto;

5) Lavar com água corrente e secar com papel absorvente;

6) Descorar com etanol a 95% em gotas até que estas fiquem incolores, ou mergulhar em etanol com agitação suave durante 30 segundos;

7) Lavar em água corrente e secar com papel absorvente;

8) Cobrir com solução de safranina durante 10 segundos;

9) Lavar com água corrente e secar com papel absorvente.

Nota. - As bactérias Gram-positivas coram de azul-violeta e as Gram-negativas de vermelho-rosado.

(nota *) Podem também ser utilizados soluções e kits de coloração disponíveis no mercado.

Referências bibliográficas

1 - Anónimo, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers. Comissão das Comunidades Europeias, Luxemburgo. Publ EUR 11288 EN, 21 pp.

2 - Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218.

3 - Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bol. 14 (2), 147-152.

4 - Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. Em: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21-23.

5 - Hugh, R. e Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-26.

6 - Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

7 - Janse, J. D. e J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bol., N.o 17, 1987, pp. 1-10.

8 - Jansing, H. e K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590-601.

9 - Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.

10 - Klement Z.; Rudolph, K e D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

11 - Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-118.

12 - Lelliott, R. A., E. Billing e A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.

13 - Lelliott, R. A. e P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bol. 6 (2), 101-106.

14 - Li, X. e S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837-842.

15 - Mills, D., Russell, B., W. e J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensisssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phyto-pathology, 87, 8, 853-861.

16 - Pastrik, K. -H. e R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687-693.

17 - Pastrik, K. - H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

18 - Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

19 - Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. e Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095-1100.

20 - Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp.

21 - Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.

22 - Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739-748.

23 - Sneath, P. H. A. e V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527.

24 - Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

25 - Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. e A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546-4554.

ANEXO II — Ocorrência suspeita e confirmação da presença do organismo prejudicial

1 - Para cada ocorrência suspeita relativamente à qual tenha sido identificado um resultado positivo no ou nos testes de rastreio, de acordo com os métodos estabelecidos no anexo I, e na pendência da confirmação ou refutação da presença do organismo prejudicial, através do método referido, deve-se proceder à retenção e conservação adequada, até à conclusão das análises dos métodos referidos, de:

1.1 - Todos os tubérculos e, sempre que possível, todas as plantas sujeitos a amostragem;

1.2 - Qualquer extracto restante e outro material preparado para o ou os testes de rastreio, por exemplo, lâminas de imunofluorescência; e

1.3 - Toda a documentação relevante.

Nota. - A retenção dos tubérculos permite a realização, sempre que necessária, do teste da variedade.

2 - Em caso de confirmação da presença do organismo prejudicial, deve-se proceder à retenção e à conservação adequada, durante pelo menos um mês após a comunicação referida no n.º 2 do artigo 6.º:

2.1 - Do material referido no n.º 1;

2.2 - De uma amostra conservada de material de beringela infectado, inoculado com o extracto do tubérculo ou da planta; e

2.3 - De uma cultura isolada do referido organismo.

ANEXO III — Determinação da extensão da contaminação provável e da possível dispersão do organismo prejudicial

1 - Os elementos a considerar na determinação da extensão da contaminação provável, nos termos da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º, incluem:

1.1 - Tubérculos ou plantas cultivadas no local de produção declarado contaminado, nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º;

1.2 - Local ou locais de produção com alguma relação de produção com os tubérculos ou plantas declarados contaminados nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, incluindo aqueles que partilham equipamento e instalações de produção directamente ou através de um contratante comum;

1.3 - Tubérculos ou plantas produzidos no local ou locais de produção referidos no número anterior ou presentes nesse local de produção durante o período em que os tubérculos ou plantas declarados contaminados, nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, se encontravam no local de produção referido no n.º 1.1;

1.4 - Instalações que manuseiem batatas provenientes dos locais de produção referidos nos números anteriores;

1.5 - Quaisquer máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, que possam ter estado em contacto com os tubérculos ou com as batateiras declarados contaminados ao abrigo da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º;

1.6 - Todos os tubérculos ou plantas armazenado sem, ou em contacto com, quaisquer estruturas ou objectos constantes do número anterior, antes da limpeza e desinfecção dessas estruturas ou objectos;

1.7 - Na sequência dos testes realizados nos termos da alínea c) do n.º 1 do artigo 6.º, os tubérculos ou as batateiras com uma relação clonal colateral ou ascendente com os tubérculos ou as plantas declarados contaminados, nos termos da da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, e para os quais, embora tenham apresentado resultados negativos quanto à presença do organismo prejudicial, pareça existir a probabilidade de contaminação por via clonal, sendo que o teste de variedade pode ser efectuado no sentido de verificar a identidade dos tubérculos ou das batateiras contaminados e com uma relação clonal;

1.8 - Local ou locais de produção de tubérculos e batateiras referidos no número anterior.

2 - Os elementos a considerar na determinação da possível dispersão, nos termos da alínea e) do n.º 1 do artigo 6.º, incluem:

2.1 - A proximidade de outros locais de produção de batatas ou de outras plantas hospedeiras;

2.2 - A produção e utilização comuns de lotes de batata de semente.

3 - A comunicação a que se refere n.º 2 do artigo 6.º, contém os seguintes dados:

3.1 - Imediatamente após a presença do organismo prejudicial ter sido confirmada por testes laboratoriais, com recurso aos métodos estabelecidos no anexo I, pelo menos:

3.1.1 - O nome da variedade do lote de batatas;

3.1.2 - O tipo (de consumo, de semente, etc.) e, sempre que aplicável, a categoria da batata-semente.

3.2 - Sempre que se verificar um risco de contaminação de batatas provenientes ou com destino a qualquer outro Estado membro, a DGPC, após a confirmação da ocorrência, comunica imediatamente os organismos responsáveis dos Estados membros em questão, bem como à Comissão Europeia, com a informação necessária, tal como:

3.2.1- O nome da variedade do lote de batatas;

3.2.2 - O nome e o endereço do expedidor e do destinatário;

3.2.3 - A data da entrega do lote de batatas;

3.2.4 - A dimensão do lote de batatas entregue;

3.2.5 - Uma cópia do passaporte fitossanitário ou, pelo menos, o número do passaporte fitossanitário, quando apropriado, ou sempre que adequado, o número de registo do produtor ou comerciante e uma cópia da nota de entrega.

3.3 - Para cada caso e após a conclusão de todas as investigações:

3.3.1 - A data de confirmação da contaminação;

3.3.2 - Uma descrição sucinta da investigação efectuada para identificar a fonte e a possível dispersão da contaminação, incluindo o nível de amostragem efectuado;

3.3.3 - Informação sobre as fontes de contaminação identificadas ou presumidas;

3.3.4 - Pormenores sobre a dimensão da contaminação declarada, incluindo o número de locais de produção e de lotes com uma indicação da variedade e, caso se trate de batatas para semente, da categoria;

3.3.5 - Pormenores relativos à demarcação da zona, incluindo o número de locais de produção, não declarados como contaminados mas incluídos na zona;

3.3.6 - Quaisquer outras informações relacionadas com o ou os surtos confirmados que a Comissão Europeia venha a solicitar.

ANEXO IV — Aplicação de medidas de protecção fitossanitária sob controlo oficial

1 - As medidas sob controlo oficial a que se refere o n.º 1 do artigo 7.º, consistem:

1.1 - Na utilização para a alimentação animal após tratamento térmico que garanta a impossibilidade de sobrevivência do organismo prejudicial; ou

1.2 - Na eliminação num local adequado e oficialmente aprovado em que não existam riscos identificáveis de fuga do patogéneo para o ambiente, por exemplo, através de escorrência para terras agrícolas; ou

1.3 - Na incineração; ou

1.4 - Na transformação industrial através de entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações de eliminação de resíduos oficialmente aprovadas, relativamente aos quais se tenha concluído pela não existência de qualquer risco identificável de propagação do organismo prejudicial, e com um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade; ou

1.5 - Noutras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de propagação do organismo, sendo essas medidas, bem como a respectiva justificação, comunicadas à Comissão Europeia e aos restantes Estados membros.

1.6 - Em que qualquer resíduo restante associado e com origem nos procedimentos mencionados nos números anteriores são eliminados através de métodos aprovados oficialmente, em conformidade com o disposto no anexo V.

2 - A utilização ou eliminação adequada dos tubérculos ou das batateiras considerados como provavelmente contaminados, ao abrigo da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º, e a que se refere o n.º 2 do artigo 7.º, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente, e se for caso, com a devida comunicação aos serviços de inspecção das outras DRA envolvidas de forma a garantir esse controlo a todo o momento, bem como, se for caso disso, mediante aprovação do organismo oficial responsável do Estado membro a que a batata se destine e no qual irá ser embalada ou transformada, no que diz respeito às instalações de eliminação de resíduos a que se referem os n.os 1.1 e 1.2, é:

2.1 - Para utilização como batata de consumo, embalada para entrega e utilização directa, sem mudança de embalagem num local com instalações de eliminação de resíduos adequadas, sendo que as batatas destinadas à plantação apenas podem ser manuseadas no mesmo local, se tal for feito separadamente ou após limpeza e desinfecção; ou

2.2 - Para utilização como batata de consumo para transformação industrial, destinada a entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações adequadas de eliminação de resíduos e um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte; ou

2.3 - Para qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial e sob reserva de aprovação pelos organismos oficiais responsáveis envolvidos.

3 - Os métodos adequados de limpeza e desinfecção dos objectos referidos no n.º 3 do artigo 7.º, devem ser aqueles relativamente aos quais se concluiu que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial, devendo ser utilizados sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente.

4 - A série de medidas a aplicar pelos serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente na zona demarcada, estabelecida nos termos da alínea e) do n.º 1 do artigo 6.º, e a que se refere o n.º 4 do artigo 7.º, inclui as seguintes acções:

4.1 - Nos locais de produção declarados contaminados nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º:

4.1.1 - Num campo declarado contaminado nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, quer:

ii) Proibição de plantar tubérculos, plantas ou sementes verdadeiras de batateira, ou outras plantas que possam ser um hospedeiro natural do organismo prejudicial, ou culturas relativamente às quais exista um risco identificado de dispersão do organismo prejudicial;

iii) Na primeira época de colheita de batata subsequente ao período especificado na subalínea anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de batateiras espontâneas e de outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial durante inspecções oficiais, pelo menos, nos dois anos de cultura consecutivos antes da plantação, apenas é permitida a produção de batata de consumo e os tubérculos colhidos devem ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo I;

iv) No período de colheita de batata seguinte ao referido na subalínea anterior e após um ciclo de rotação adequado, que é de no mínimo dois anos caso se cultivem batatas, podem ser plantadas batatas, tanto para a produção de batata de semente como de batata de consumo, e é efectuada uma prospecção oficial nos termos do artigo 3.º

ii) Colocação e manutenção do campo em pousio ou em pastagem permanente com pastoreio intensivo ou com cortes curtos frequentes;

iii) Na primeira época de colheita de batata subsequente ao período especificado na subalínea anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de batateiras espontâneas e de outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial durante inspecções oficiais, pelo menos, nos dois anos de cultura consecutivos antes da plantação, é permitida a produção de batata de consumo ou de semente e os tubérculos colhidos devem ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo I;

4.1.2 - Em todos os restantes campos do local de produção contaminado e sob condição que os organismos oficiais responsáveis obtenham a garantia de que foi eliminado o risco de aparecimento de batateiras espontâneas e de outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial:

4.1.3 - Imediatamente após a declaração de contaminação, nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, e após o primeiro ano de cultura seguinte, toda a maquinaria e instalações de armazenamento existentes no local de produção e ligadas à produção de batata são limpas e desinfectadas, de modo adequado utilizando métodos apropriados, nos termos do n.º 3;

4.1.4 - Numa unidade de produção de culturas protegidas em que seja possível a substituição completado meio de cultura:

4.2 - Na zona demarcada, sem prejuízo das medidas a que se refere o n.º 4.1, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente:

4.2.1 - Exigem, imediatamente após a declaração de contaminação, a limpeza e desinfecção de toda a maquinaria e dos armazéns das referidas instalações envolvidas na produção da batata, consoante for apropriado, utilizando métodos adequados, tal como disposto no n.º 3;

4.2.2 - Imediatamente após a declaração de contaminação e durante, pelo menos, três anos de cultura:

ii) Exigem, para todas as culturas de batata da zona, que só sejam plantadas batatas de semente certificadas ou sementes cultivadas sob controlo oficial e que sejam analisadas após colheita as culturas de batata de semente efectuadas em locais de produção declarados como provavelmente contaminados nos termos da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º;

iii) Exigem que os lotes de batata de semente e de batata de consumo colhidos na zona sejam manuseadas separadamente ou um sistema de limpeza e desinfecção entre o manuseamento de lotes para semente e para consumo;

iv) Realizam uma prospecção oficial nos termos do artigo 3.º;

4.2.3 - Estabelecem, quando adequado, um programa de substituição de todos os lotes de batata semente ao longo de um período adequado.

ANEXO V — Eliminação de resíduos associáveis ao organismo prejudicial

1 - Os métodos de eliminação de resíduos oficialmente aprovados referidos no n.º 1 do anexo IV devem cumprir as seguintes disposições de forma a prevenir qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial:

1.1 - Os resíduos de batata (incluindo batatas rejeitadas e cascas de batata) e quaisquer outros resíduos sólidos associados às batatas (incluindo terra, pedras e outro detritos) são eliminados:

1.1.1 - Num local de eliminação adequado e oficialmente aprovado em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo prejudicial para o ambiente, por exemplo, através de escorrência para terras agrícolas, sendo os resíduos enviados directamente para o local em condições de confinamento de forma a que não exista risco de perda de resíduos; ou

1.1.2 - Por incineração; ou

1.1.3 - Por outras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de propagação do organismo prejudicial, sendo essas medidas comunicadas à Comissão Europeia e aos outros Estados membros.

1.2 - Antes da eliminação, os resíduos líquidos contendo sólidos em suspensão são sujeitos a filtração ou processos de decantação para remover tais sólidos, os quais são eliminados em conformidade com o referido no n.º 1.1.

1.2.1 - Os resíduos líquidos são, então:

2 - As opções descritas no presente anexo também se aplicam aos resíduos associados ao manuseamento, à eliminação e à transformação de lotes contaminados.