Decreto-Lei n.º 249/2007 — Estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Ralstonia solanacearum (Smith)…

Nota. - Pode suspeitar-se de inibição de PCR se o fragmento amplificado esperado for observado na amostra de controlo positivo de uma suspensão aquosa de R. solanacearum, mas se obtenham resultados negativos de controlos positivos de R. Solanacearum em extracto de batata. Nos protocolos PCR multiplex com controlos internos de PCR, a inibição da reacção é indicada sempre que não se obtenha nenhum dos dois fragmentos amplificados esperados.

Pode suspeitar-se de contaminação caso o fragmento amplificado esperado seja obtido em um ou vários dos controlos negativos.

7 - Teste FISH:

Princípio:

Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste FISH como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico.

Nota. - Utilizar sondas validadas específicas para R. solanacearum (apêndice n.º 7). O teste preliminar com este método deveria permitir a detecção reprodutível de, pelo menos, 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que se revelaram negativos.

O procedimento seguinte deve ser realizado, de preferência, com um extracto de amostra preparado na altura da utilização, mas pode também ser realizado com sucesso com um extracto de amostra que tenha sido armazenado em glicerol a uma temperatura compreendida entre -16 e 24ºC ou 68 e 86ºC.

Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum.

Como controlos positivos preparar suspensões contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células de R. solanacearum Biovar 2 por ml (por exemplo, estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver apêndice n.º 3) em tampão fosfato (PB) 0,01 M, a partir de uma cultura com 3 a 5 dias. Preparar lâminas de controlo positivo em separado com a estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice n.º 3.

A utilização de sondas para eubacterias marcadas com FITC oferece um controlo para o processo de hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na amostra ficarão coradas.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste são enumerados na parte A do apêndice n.º 3.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

7.1 - Fixação do extracto de batata:

O protocolo seguinte tem por base Wullings et al.(1998):

7.1.1 - Preparar a solução fixadora (ver apêndice n.º 7).

7.1.2 - Pipetar 100 (mi)l de cada extracto de amostra para um tubo Eppendorf e centrifugar durante 7 minutos a 7000 g.

7.1.3 - Remover o sobrenadante e dissolver o sedimento em 200 (mi)l de fixador preparado há menos de 24 horas. Agitar em vortex e incubar durante 1 hora no frigorífico.

7.1.4 - Centrifugar durante 7 minutos a 7000 g, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 75 (mi)l de PB 0,01M (ver apêndice n.º 7).

7.1.5 - Colocar 16 (mi)l das suspensões fixadas numa lâmina multiteste limpa, tal como demonstrado na figura n.º 3. Aplicar duas amostras não diluídas diferentes por lâmina e utilizar 10 (mi)l para obter uma diluição de 1:100 (em PB 0,01 M). A solução de amostra restante (49 (mi)l) pode ser armazenada a 20ºC após adição de 1 volume de etanol a 96%. Caso o teste FISH exija uma repetição, remover o etanol por centrifugação e adicionar igual volume de PB 0,01 M (agitar em vortex).

FIGURA N.º 3

Configuração para a lâmina FISH

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

7.1.6 - Secar as lâminas ao ar (ou num secador de lâminas a 37ºC) e proceder à sua fixação à chama.

Nesta fase o procedimento pode ser interrompido e a hibridação continuada no dia seguinte. As lâminas devem ser armazenadas em local sem poeiras e seco, à temperatura ambiente.

7.2 - Hibridação:

7.2.1 - Desidratar as células num gradiente de concentrações de etanol de 50%, 80% e 96% durante 1 minuto cada. Secar as lâminas ao ar num porta-lâminas.

7.2.2 - Preparar uma câmara de incubação húmida, cobrindo o fundo de uma caixa hermética com papel absorvente ou de filtro embebido em 1x «hyb-mix» (apêndice n.º 7). Pré-incubar a caixa na estufa de hibridação a 45ºC durante, pelo menos, 10 minutos.

7.2.3 - Juntar 10 (mi)l de solução de hibridação (apêndice n.º 7) a 8 poços (poços 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 e 10; ver figura n.º 3) de cada lâmina, deixando vazios os dois poços centrais (3 e 8).

7.2.4 - Cobrir os primeiros e os últimos 4 poços com lamelas (24 x 24 mm) sem retenção de ar. Colocar as lâminas na câmara húmida pré-aquecida e hibridar durante 5 horas na estufa a 45ºC, no escuro.

7.2.5 - Preparar 3 copos contendo 1 l de água Milli Q (grau molecular), 1 l de 1x «hybmix» (334 ml 3x «hybmix» e 666 ml água Milli Q) e 1 l de 1/8x de «hybmix» (42 ml 3x «hybmix» e 958 ml água Milli Q). Pré-incubar cada um deles em banho-maria a 45ºC.

7.2.6 - Retirar as lamelas das lâminas e colocar estas últimas no porta-lâminas.

7.2.7 - Remover as sondas em excesso por incubação durante 15 minutos no recipiente com 1x «hybmix» a 45ºC.

7.2.8 - Transferir o porta-lâminas para uma solução de lavagem com 1/8 de «hybmix» e incubar durante mais 15 minutos.

7.2.9 - Mergulhar as lâminas brevemente em água Milli Q e colocá-las sobre papel de filtro. Remover o excesso de humidade cobrindo a superfície suavemente com papel de filtro. Pipetar 5-10 (mi)l de solução de montagem que evite uma rápida perda de fluorescência (por exemplo, Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ou equivalente) para cada poço e aplicar uma lamela grande (24 x 60 mm) cobrindo toda a lâmina.

7.3 - Leitura do teste FISH

7.3.1 - Observar imediatamente as lâminas com um microscópio equipado para microscopia de epifluorescência, sob lente de imersão em óleo, a uma ampliação de 630 ou 1000 x. Com um filtro indicado para isotiocianato de fluoresceína (FITC), as células eubacterianas (incluindo a maior parte das células gram-negativas) presentes na amostra mostram uma coloração verde fluorescente. Com um filtro para isotiocianato-5-tetrametilrodamina, as células de R. Solanacearum coradas com Cy3 revelam-se vermelho fluorescente. Comparar a morfologia das células com a dos controlos positivos. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas. O teste FISH (n.º 7 da parte A da secção VI) deve ser repetido se a coloração for aberrante. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.

7.3.2 - Procurar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de R. Solanacearum nos poços das lâminas de teste (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente ou superior à da estirpe do controlo positivo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.

7.3.3 - Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este pode ser o caso quando todas as lâminas de um lote revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora dos poços da lâmina) no revestimento da lâmina.

7.3.4 - Há vários problemas inerentes à especificidade do teste FISH. Em sedimentos de cones de hilo e de segmentos de caule da batateira, é provável a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes às de R. solanacearum, apesar de este fenómeno ser menos frequente do que no teste IF.

7.3.5 - Considerar unicamente as células fluorescentes de dimensões e morfologia típicas.

7.3.6 - Interpretação do resultado do teste FISH:

ii) O teste FISH é negativo se, com um filtro para rodamina, não se observarem células brilhantes com fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum, e sejam observadas células típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas preparações de controlo positivo.

8 - Testes ELISA:

Princípio:

O teste ELISA só pode ser utilizado como teste opcional em complemento de testes IF, PCR ou FISH, devido à sensibilidade relativamente baixa deste teste. Quando se utiliza o teste DAS ELISA, é obrigatório efectuar o enriquecimento e utilizar anticorpos monoclonais (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Pode ser útil efectuar um enriquecimento das amostras antes de utilizar o teste ELISA a fim de aumentar a sensibilidade deste teste, mas esse enriquecimento pode ser infrutífero devido à concorrência de outros organismos presentes na amostra.

Nota. - Utilizar anticorpos validados para R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a conjugados de anticorpos secundários adequados, de acordo com as recomendações do fabricante. Durante os testes, os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas ou no título da formulação comercial.

Determinar o título dos anticorpos com uma suspensão de 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum.

Incluir como controlo negativo um extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum e uma suspensão de uma bactéria que não origine reacção cruzada em tampão fosfato salino (PBS).

Como controlo positivo, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo, inoculadas com 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células por ml de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver partes A e B do apêndice n.º 2). Para a comparação dos resultados de cada placa, utilizar uma suspensão padrão de 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células de R. solanacearum por ml em PBS. Assegurar-se de que os controlos positivos estão bem separados da(s) amostra(s) em estudo na microplaca.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são descritos na parte A do apêndice n.º 3.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

Foram validados dois protocolos ELISA.

1) Utilizar alíquotas de 100-200 (mi)l de extracto de amostra. (O aquecimento a 100ºC durante 4 minutos em banho-maria ou num bloco de aquecimento pode, nalguns casos, reduzir os resultados não específicos);

2) Adicionar um volume igual de tampão de revestimento 2 x (apêndice n.º 4) e agitar em vortex;

3) Colocar alíquotas de 100 (mi)l em, pelo menos, dois dos poços de uma microplaca (por exemplo NuncPolysorp ou equivalente) e incubar durante 1 hora a 37ºC ou durante a noite a uma temperatura de 4ºC;

4) Retirar os extractos dos poços. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4), deixando a última solução de lavagem dentro dos poços durante, pelo menos, 5 minutos,

5) Preparar uma diluição adequada de anticorpos contra R. solanacearum em tampão de bloqueio (apêndice n.º 4). Para anticorpos comerciais validados, utilizar as diluições recomendadas (geralmente uma concentração duas vezes superior ao título);

6) Adicionar 100 (mi)l a cada poço e incubar durante 1 hora a 37ºC;

7) Retirar a solução de anticorpos dos poços e lavar como anteriormente (n.º 4);

8) Preparar uma diluição adequada de conjugado anticorpo secundário - fosfatase alcalina em tampão de bloqueio. Adicionar 100 (mi)l a cada poço e incubar durante 1 hora a 37ºC;

9) Retirar o anticorpo conjugado dos poços e lavar como anteriormente (n.º 4);

10) Adicionar 100 (mi)l de solução de substrato de fosfatase alcalina (apêndice n.º 4) a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

1) Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas policlonais anti-R. solanacearum em tampão de revestimento, pH 9,6 (apêndice n.º 4). Adicionar 200 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 4-5 horas ou a 4ºC durante 16 horas;

2) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4);

Nota. - Adicionar 190 (mi)l de extracto de amostra em, pelo menos, dois poços. Adicionar também controlos positivos e negativos em dois poços de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4ºC.

3) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4);

4) Preparar uma diluição adequada de anticorpos monoclonais específicos contra R. solanacearum em PBS (apêndice n.º 4) que contenha também 0,5% de albumina de soro de bovino (BSA) e adicionar 190 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 2 horas;

5) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4);

6) Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas anti-rato conjugadas com fosfatase alcalina em PBS. Adicionar 190 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 2 horas;

7) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4);

8) Preparar uma solução de substrato de fosfatase alcalina que contenha 1 mg de fosfato de p-nitrofenilo por ml de tampão de substrato (apêndice n.º 4). Adicionar 200 (mi)l a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

Interpretação do resultado do teste ELISA:

O teste ELISA é negativo se a média das leituras da densidade óptica (DO) dos poços de amostras duplicadas for (menor que)2 x DO do poço de controlo negativo do extracto de amostra, desde que as DO dos controlos positivos sejam todas superiores a 1,0 (após 90 minutos de incubação com o substrato) e sejam superiores ao dobro da DO obtida para os extractos de amostras negativas.

O teste ELISA é positivo se a DO média dos poços de amostras duplicadas for (maior que) 2 x DO do poço de extracto de amostra negativa, desde que as DO de todos os poços de controlo negativo sejam (menor que) 2 x as DO dos poços de controlo positivo.

Uma leitura ELISA negativa nos poços de controlo positivo indica que o teste não foi efectuado correctamente ou que ocorreram inibições. Uma leitura ELISA positiva nos poços de controlo negativo indica que ocorreu contaminação cruzada ou uma ligação não específica de anticorpos.

9 - Bioensaio:

Nota. - Um ensaio preliminar com este teste deveria permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) unidades formadoras de colónias de R. solanacearum por ml adicionadas a amostras de extractos para as quais se obtiveram anteriormente resultados negativos (para a preparação, ver apêndice n.º 3).

Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada quando se utiliza uma amostra de extracto recentemente preparada e condições de crescimento óptimas. No entanto, o método pode ser aplicado com sucesso a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre 68 e 86ºC.

O protocolo seguinte tem por base Janse (1988):

9.1 - Para cada amostra, utilizar 10 plantas de uma cultivar susceptível de tomateiro (por exemplo «Moneymaker» ou cultivar com susceptibilidade equivalente, determinada pelo laboratório) no estádio de três folhas verdadeiras. Para os pormenores de cultivo, ver apêndice n.º 8. Em alternativa, utilizar beringelas (por exemplo cultivar «Black Beauty» ou cultivares com susceptibilidade equivalente), mas apenas plantas que se encontrem no estádio fenológico de duas a três folhas, até que a terceira folha verdadeira esteja completamente expandida. Tem-se observado que os sintomas são menos graves e se desenvolvem mais lentamente na beringela. Recomenda-se, por conseguinte, a utilização de plântulas de tomateiro, sempre que possível.

9.2 - Distribuir 100 (mi)l de extracto de amostra pelas plantas.

9.2.1 - Inoculação por injecção.

Inocular os caules das plantas imediatamente acima dos cotilédones, utilizando uma seringa com uma agulha hipodérmica (não inferior a 23 G). Distribuir a amostra pelas plantas.

9.2.2 - Inoculação por fenda.

Segurar a planta entre dois dedos, pipetar uma gota (cerca de 5-10 (mi)l) do sedimento ressuspenso no caule, entre os cotilédones e a primeira folha.

Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer uma fenda em diagonal com 1,0 cm de comprimento e com uma profundidade de cerca de 2/3 do diâmetro do caule, começando a incisão a partir da gota de sedimento.

Selar o corte com vaselina esterilizada aplicada com uma seringa.

9.3 - Inocular, através da mesma técnica, 5 plântulas com uma suspensão aquosa de 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml preparada a partir de uma cultura de 48 horas de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2, como controlo positivo, e com tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4) como controlo negativo. Separar as plantas de controlo positivo e negativo das outras plantas, a fim de evitar contaminações cruzadas.

9.4 - Deixar crescer as plantas em instalações de quarentena durante um período de até 4 semanas a uma temperatura de 25-30ºC e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a murchidão por falta de água. Para evitar a contaminação, incubar as plantas de controlo positivo e as de controlo negativo em prateleiras claramente separadas numa estufa ou câmara de crescimento ou, caso existam limitações de espaço, garantir uma separação rigorosa. Se as plantas relativas a amostras diferentes tiverem de ser incubadas perto umas das outras, separá-las com as divisórias adequadas. Evitar contaminações cruzadas ao adubar, regar, inspeccionar ou ao proceder a outras manipulações. É essencial manter as estufas ou as câmaras de crescimento isentas de pragas, visto que estas podem promover a transmissão da bactéria entre amostras.

Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão, epinastia, clorose e/ou nanismo.

9.5 - Fazer isolamentos a partir das plantas infectadas (n.º 3 da secção II) e identificar culturas puras de presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da secção VI).

9.6 - Caso não se observem sintomas após 3 semanas, efectuar um teste IF, PCR ou de isolamento numa amostra composta de secções de 1 cm do caule de cada uma das plantas inoculadas com os extractos das amostras, colhidas acima do local da inoculação. Se o teste for positivo, proceder à diluição em placas (n.º 4.1).

9.7 - Identificar culturas puras de presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da secção VI).

Interpretação dos resultados do bioensaio:

Obtêm-se resultados válidos no bioensaio quando as plantas do controlo positivo revelam sintomas típicos, é possível isolar novamente bactérias a partir destas plantas e não se observam sintomas nos controlos negativos.

O bioensaio é negativo se as plantas inoculadas com os extractos das amostras não estiverem infectadas por R. solanacearum e se for detectada R. Solanacearum nos controlos positivos.

O bioensaio é positivo se as plantas inoculadas com os extractos das amostras estiverem infectadas por R.solanacearum.

PARTE B — Testes de identificação

Identificar culturas puras de presumíveis isolados de R solanacearum, utilizando, pelo menos, dois dos seguintes testes baseados em princípios biológicos diferentes.

Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado (ver apêndice n.º 3).

1 - Testes nutricionais e enzimáticos:

Determinar as seguintes características fenotípicas, que estão universalmente presentes ou ausentes em R. solanacearum, de acordo com os métodos de Lelliotte Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

Testes ... Resultado esperado

Produção de pigmento fluorescente ... -

Grânulos de poli-(Beta)-hidroxibutirato ... +

Teste de oxidação/fermentação (O/F) ... O+F-

Produção da catalase ... +

Teste de oxidase de Kovac ... +

Redução dos nitratos ... +

Utilização de citrato ... +

Crescimento a 40 ºC ... -

Crescimento em NaCl a 1% ... +

Crescimento em NaCl a 2% ... -

Produção de arginina di-hidrolase ... -

Liquefacção da gelatina ... -

Hidrólise do amido ... -

Hidrólise da esculina ... -

Produção de levana ... -

2 - Teste IF:

2.1 - Preparar uma suspensão com cerca de 10(elevado a 6) células por ml em tampão IF (apêndice n.º 4).

2.2 - Preparar uma série de diluições a 1:2 de um anti-soro adequado (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3 - Aplicar o procedimento de IF (n.º 5 da parte A da secção VI).

2.4 - Um resultado positivo no teste IF é alcançado se o título IF para a cultura em estudo for equivalente ao do controlo positivo.

3 - Teste ELISA:

Nota. - Se se realizarem apenas dois testes de identificação, não deve utilizar-se outro teste serológico como complemento deste teste.

3.1 - Preparar uma suspensão com cerca de 10(elevado a 8) células por ml em 1X PBS (apêndice n.º 4).

3.2 - Utilizar um teste ELISA adequado com um anticorpo monoclonal específico para R. solanacearum.

3.3 - Um resultado positivo no teste ELISA é alcançado se a leitura ELISA obtida para a cultura for, pelo menos, igual a metade da obtida para o controlo positivo.

4 - Testes PCR:

4.1 - Preparar uma suspensão com cerca de 10(elevado a 6) células por ml em água esterilizada UPW.

4.2 - Aquecer 100 (mi)l da suspensão de células em tubos fechados num bloco de aquecimento ou em banho-maria em ebulição a 100ºC durante 4 minutos. As amostras podem, então, ser armazenadas a uma temperatura compreendida entre 16 e 24ºC até serem necessárias.

4.3 - Aplicar os procedimentos PCR adequados para amplificar os fragmentos específicos de R. solanacearum [por exemplo Seal et al. (1993), Pastrik e Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al.(1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)].

4.4 - É alcançada uma identificação positiva para R. solanacearum se os fragmentos de amplificação da PCR tiverem a mesma dimensão e os mesmos polimorfismos dos fragmentos de restrição que a estirpe de controlo positivo.

5 - Teste FISH:

5.1 - Preparar uma suspensão de cerca de 10(elevado a 6) células por ml em UPW.

5.2 - Aplicar o procedimento FISH (n.º 7 da parte A da secção VI) com, pelo menos, duas sondas específicas para R. solanacearum (apêndice n.º 7).

5.3 - Um resultado positivo no teste FISH é alcançado se a cultura apresentar as mesmas reacções do controlo positivo.

6 - Perfis de ácidos gordos (FAP):

6.1 - Incubar o isolado em agar de soja e tripticase (Oxoid) durante 48 horas a 28ºC.

6.2 - Utilizar um procedimento FAP adequado (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3 - Um resultado positivo no teste FAP é alcançado se o perfil do presumível isolado for idêntico ao do controlo positivo. A presença de ácidos gordos característicos 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH e a ausência de 16:0 3OH são altamente indicativas de Ralstonia sp.

7 - Métodos para caracterização da estirpe:

A caracterização da estirpe utilizando um dos métodos seguintes é recomendada para cada novo caso de isolamento de R. solanacearum.

Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado (ver apêndice n.º 3).

7.1 - Determinação do biovar:

A espécie R. solanacearum encontra-se dividida em Biovares com base na sua capacidade em utilizar e/ou oxidar três dissacáridos e três álcoois de hexoses (Hayward, 1964 e Hayward et al., 1990). O meio decrescimento para o teste do Biovar é descrito no apêndice n.º 2. O teste pode ser realizado com sucesso mediante a inoculação por picada dos meios de crescimento com culturas puras de isolados de R. solanacearum e incubação a 28ºC. Se os meios forem distribuídos em placas estéreis de cultura de 96 poços (200 (mi)l por poço) pode observar-se uma mudança de cor, de verde azeitona para amarelo, passadas 72 horas, o que indica um resultado positivo.

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

Testes adicionais diferenciam o Biovar 2 em subfenótipos.

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

7.2 - «Genomic fingerprinting»:

A diferenciação molecular das estirpes do complexo R. solanacearum pode ser efectuada através de várias técnicas, entre as quais são de referir:

7.2.1 - Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2 - PCR de sequências repetitivas utilizando iniciadores REP, BOX e ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3 - Análise do polimorfismo dos fragmentos amplificados (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3 - Métodos PCR:

Podem utilizar-se iniciadores específicos para PCR (Pastrik et al., 2002; ver apêndice n.º 6) para diferenciar estirpes pertencentes à Divisão 1 (Biovares 3, 4 e 5) e Divisão 2 (Biovares 1, 2A e 2T) de R. solanacearum, como definidas inicialmente pela análise RFLP (Cook et al., 1989) e a sequenciação de 16S rADN (Taghavi et al., 1996).

PARTE C — Teste de confirmação

O teste de patogenicidade tem de ser efectuado como confirmação final do diagnóstico de R. solanacearum e para avaliar a virulência dos isolados identificados como R. solanacearum:

1) Preparar um inóculo de aproximadamente 10(elevado a 6) células por ml de uma cultura com 24-48 horas do isolado a ser testado e de uma estirpe de R. Solanacearum adequada para controlo positivo (por exemplo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver apêndice n.º 3);

2) Inocular 5-10 plântulas de tomateiro ou beringela susceptíveis no estádio de três folhas verdadeiras (ver n.º 9 da parte A da secção VI);

3) Incubar durante, no máximo, 2 semanas a uma temperatura de 25-28ºC e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a seca. Com culturas puras deve observar-se a murchidão típica no período de 14 dias. Se no final deste período não se observarem quaisquer sintomas, não se pode confirmar que a cultura seja uma forma patogénica de R. Solanacearum;

4) Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão e ou epinastia, clorose e nanismo;

5) Efectuar um isolamento a partir das plantas sintomáticas, retirando-lhes uma secção de cerca de 2 cm de caule acima do ponto de inoculação. Fragmentá-las e suspendê-las num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice n.º 4). Isolar a partir de diluições apropriadas da suspensão por espalhamento ou reticulado num meio adequado, de preferência selectivo (apêndice n.º 2), incubar durante 48-72 horas a 28ºC e observar a formação de colónias típicas de R. solanacearum.

APÊNDICE N.º 1

Laboratórios envolvidos na validação e optimização de protocolos

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

APÊNDICE N.º 2

Meios para isolamento e cultura de R. Solanacearum

Agar nutritivo (NA)

Agar nutritivo (Difco) - 23,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Agar com extracto de levedura, peptona e glucose (YPGA)

Extracto de levedura (Difco) - 5,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 5,0 g

D(+)glucose mono-hidratada - 10,0 g

Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Agar de sacarose e peptona (SPA)

Sacarose - 20,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 5,0 g

K(índice 2)HPO(índice 4) - 0,5 g

MgSO(índice 4) . 7H(índice 2)O - 0,25 g

Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

pH 7,2-7,4

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Meio de tetrazólio de Kelman

Casaminoácidos (Difco) - 1,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 10,0 g

Dextrose - 5,0 g

Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Arrefecer até 50ºC e adicionar o volume necessário de solução de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (Sigma), esterilizada por filtração, para obter uma concentração final de 50 mg por l.

Meio SMSA (Englebrecht, 1994 modificado por Elphinstone et al., 1996)

Meio basal

Casaminoácidos (Difco) - 1,0 g

Bacto-Peptona (Difco) - 10,0 g

Glicerol - 5,0 ml

Bacto-Agar (Difco), ver Nota 2. - 15,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Arrefecer até 50ºC e adicionar o volume necessário de soluções aquosas concentradas, esterilizadas por filtração, dos seguintes ingredientes para obter as concentrações finais especificadas:

Violeta cristal (Sigma C-0775) - 5 mg por l

Sulfato de polimixina B (Sigma P-1004) 600000 U (aproximadamente 100 mg) por l

Bacitracina (Sigma B-0125) - 1250 U (aproximadamente 25 mg) por l

Cloranfenicol (Sigma C-3175) - 5 mg por l

Penicilina-G (Sigma P-3032) - 825 U (aproximadamente 0,5 mg) por l

Cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (Sigma T-8877) - 50 mg por l

Nota. - A utilização de reagentes diferentes dos acima especificados pode afectar o crescimento de R. solanacearum.

Pode utilizar-se agar Oxoid #1 em vez de Bacto-agar (Difco). Neste caso, o crescimento de R. solanacearum será mais lento, embora o crescimento dos saprófitas competidores possa também ser reduzido. A formação de colónias típicas de R. solanacearum pode demorar mais 1-2 dias e a coloração vermelha pode ser mais clara e mais difusa do que em Bacto-agar.

O aumento da concentração de bacitracina para 2500 U por l pode reduzir as populações de bactérias competidoras sem afectar o crescimento de R. solanacearum.

Armazenar os meios e as soluções concentradas de antibióticos a 4ºC, no escuro, e utilizar no prazo de um mês.

As placas devem estar livres de condensação superficial antes da utilização.

Evitar a secagem excessiva das placas.

Após a preparação de cada novo lote de meio deve efectuar-se um controlo de qualidade mediante o espalhamento de uma suspensão de uma cultura de referência de R. solanacearum (ver apêndice n.º 3), observando a formação de colónias típicas após incubação a 28ºC durante 2-5 dias.

Meio líquido SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Preparar de forma idêntica à do meio selectivo SMSA contendo agar, mas excluindo o Bacto-agar e o cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio.

Meio líquido de Wilbrink modificado (Caruso et al., 2002)

Sacarose - 10 g

Proteose peptona - 5 g

K(índice 2)HPO(índice 4) - 0,5 g

MgSO(índice 4) - 0,25 g

NANO(índice 3) - 0,25 g

Água destilada - 1 l

Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos e arrefecer até 50ºC

Adicionar soluções concentradas de antibióticos como para o meio líquido SMSA.

APÊNDICE N.º 3

Parte A

Material de controlo normalizado disponível no mercado

Recomenda-se a utilização dos seguintes isolados bacterianos como material de referência normalizado, quer como controlos positivos (quadro I) quer durante a optimização de testes para evitar reacções cruzadas (quadro II). Todas as estirpes são comercializadas por:

1) National Collection of Plant Pathogenic Bactéria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Reino Unido;

2) Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Países Baixos;

3) Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, França.

QUADRO I

Tabela de referência SMT de isolados de R. solanacearum

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

Nota. - A autenticidade das estirpes acima indicadas só pode ser garantida se estas forem obtidas a partir de uma colecção de culturas autênticas.

QUADRO II

Tabela de referência SMT de bactérias serológica ou geneticamente relacionadas para utilização na optimização de testes de detecção

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

O material de controlo seguidamente indicado está disponível na colecção de culturas NCPPB.

Sedimento liofilizado de extracto de batata proveniente de 200 tubérculos de batateira sãos como controlo negativo para todos os testes.

Sedimento liofilizado de extracto de batata proveniente de 200 tubérculos de batateira sãos com 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) e 10(elevado a 4) a 10(elevado a 6) células de R. solanacearum Biovar 2 (estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como controlo positivo para testes serológicos e PCR. Visto que a viabilidade das células é afectada durante a liofilização, estes controlos não são adequados como controlos normalizados para testes de isolamento ou bioensaio.

Suspensões fixadas em formalina de R. solanacearum Biovar 2 (estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) com 10(elevado a 6) células por ml como controlos positivos para testes serológicos.

PARTE B — Preparação de controlos positivos e negativos para os testes essenciais de rastreio PCR/IF e FISH

Preparar uma suspensão a partir do crescimento de uma cultura com 48 horas em meio basal SMSA de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2/raça 3 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) em tampão fosfato 10 mM, de modo a obter uma concentração de, aproximadamente, 2 x 10(elevado a 8) ufc por ml. Esta é obtida, normalmente, com uma suspensão ligeiramente turva equivalente a uma densidade óptica de 0,15 a 600 nm.

Remover os cones dos hilos de 200 tubérculos colhidos de uma variedade de epiderme branca, isenta de R. solanacearum.

Processar os hilos como habitualmente e ressuspender o sedimento em 10 ml.

Preparar 10 microtubos esterilizados de 1,5 ml com 900 (mi)l de sedimento ressuspenso.

Transferir 100 (mi)l da suspensão de R. Solanacearum para o primeiro microtubo. Agitar em vortex.

Utilizar os cinco microtubos seguintes para efectuar uma série de cinco diluições decimais.

Os seis microtubos contaminados serão utilizados como controlos positivos. Os quatro microtubos não contaminados serão utilizados como controlos negativos. Rotular os microtubos em conformidade.

Preparar alíquotas de 100 (mi)l em microtubos esterilizados de 1,5 ml, obtendo assim nove réplicas de cada amostra de controlo. Armazenar a uma temperatura compreendida entre 16 e 24ºC até à sua utilização.

A presença e a quantificação de R. Solanacearum nas amostras de controlo devem ser primeiro confirmadas por IF.

Para o teste PCR efectuar a extracção de ADN das amostras de controlo positivo e negativo para cada série de amostras a testar.

Para os testes IF e FISH efectuar ensaios nas amostras de controlo positivo e negativo para cada série de amostras a testar.

Para os testes IF, FISH e PCR, deve detectar-se R. solanacearum, pelo menos, nas amostras de controlo positivo com 10(elevado a 6) e 10(elevado a 4) células por ml e não deve ser detectada em nenhum controlo negativo.

APÊNDICE N.º 4

Tampões para a realização dos testes

Geral:

Os tampões esterilizados não abertos podem ser armazenados durante 1 ano.

1 - Tampões para extracção:

1.1 - Tampão de extracção (tampão fosfato 50 mM, pH 7,0):

Este tampão é utilizado para a extracção da bactéria dos tecidos vegetais por homogeneização ou agitação.

Na(índice 2)HPO(índice 4) (anidro) - 4,26 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 2,72 g

Água destilada - 1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Os seguintes componentes adicionais podem também ser úteis:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

1.2 - Tampão de ressuspensão (tampão fosfato 10 mM, pH 7,2):

Este tampão é utilizado para a ressuspensão e diluição dos extractos dos hilos do tubérculo da batateira após a sua concentração por centrifugação.

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 2,7 g

NaH(índice 2)PO(índice 4) . 2H(índice 2)O - 0,4 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2 - Tampões para o teste IF:

2.1 - Tampão IF (tampão fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2):

Este tampão é utilizado para a diluição dos anticorpos.

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 2,7 g

NaH(índice 2)PO(índice 4) . 2H(índice 2)O - 0,4 g

NaCl - 8,0 g

Água destilada - 1,0 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2.2 - Tampão IF-Tween:

Este tampão é utilizado para lavagem das lâminas.

Adicionar 0,1% de Tween 20 ao tampão IF.

2.3 - Tampão fosfato com glicerol, pH 7,6:

Este tampão é utilizado como líquido de montagem nos poços das lâminas de IF para aumentar a fluorescência.

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 3,2 g

NaH(índice 2)PO(índice 4) . 2H(índice 2)O - 0,15 g

Glicerol - 50 ml

Água destilada - 100 ml

Estão disponíveis no mercado soluções de montagem para evitar a rápida perda de fluorescência, como sejam, por exemplo, Vectashield(R) (Vector Laboratories) ou Citifluor(R) (Leica).

3 - Tampões para o teste ELISA indirecto:

3.1 - Tampão de revestimento de dupla concentração, pH 9,6:

Na(índice 2)CO(índice 3) - 6,36 g

NaHCO(índice 3) - 11,72 g

Água destilada - 1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Pode ser acrescentado sulfito de sódio (0,2%) como antioxidante, se for necessário para evitar a acumulação de compostos aromáticos oxidados.

3.2 - Tampão fosfato salino (PBS) 10x, pH 7,4:

NaCl - 80,0 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 2,0 g

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 29,0 g

KCl - 2,0 g

Água destilada - 1,0 l

3.3 - PBS-Tween:

PBS 10x - 100 ml

Tween 20 a 10% - 5 ml

Água destilada - 895 ml

3.4 - Tampão de bloqueio (anticorpo) - deve ser preparado na altura da utilização:

PBS 10x - 10,0 ml

Polivinilpirrolidona-44000 (PVP-44) - 2,0 g

Tween 20 a 10% - 0,5 ml

Leite em pó - 0,5 g

Água destilada - Perfazer 100 ml

3.5 - Solução de substrato de fosfatase alcalina, pH 9,8:

Dietanolamina - 97 ml

Água destilada - 800 ml

Misturar e acertar a pH 9,8 com HCl concentrado.

Perfazer o volume até 1l com água destilada.

Juntar 0,2 g de MgCl(índice 2).

Dissolver duas pastilhas de 5 mg cada de substrato de fosfatase alcalina (Sigma) por cada 15 ml de solução.

4 - Tampões para o teste DASI ELISA:

4.1 - Tampão de revestimento, pH 9,6:

Na(índice 2)CO(índice 3) - 1,59 g

NaHCO(índice 3) - 2,93 g

Água destilada - 1000 ml

Dissolver os ingredientes e verificar o pH 9,6.

4.2 - Tampão fosfato salino (PBS) 10x, pH 7,2-7,4:

NaCl - 80,0 g

NaH(índice 2)PO(índice 4) . 2H(índice 2)O - 4,0 g

Na(índice 2)HPO(índice 4) . 12H(índice 2)O - 27,0 g

Água destilada - 1000 ml

4.3 - PBS-Tween:

PBS 10x - 50 ml

Tween 20 a 10% - 5 ml

Água destilada - 950 ml

4.4 - Tampão de substrato, pH 9,8:

Dietanolamina - 100 ml

Água destilada - 900 ml

Misturar e acertar a pH 9,8 com HCl concentrado.

APÊNDICE N.º 5

Determinação do nível de contaminação em testes IF e FISH

1 - Determinar o número médio de células fluorescentes típicas por campo de observação (c).

2 - Calcular o número de células fluorescentes típicas por poço de lâmina de microscópio (C).

C = c x S/s

Em que:

S = área da superfície de cada poço da lâmina multiteste, e

s = área da superfície do campo da objectiva

s = (pi)i(elevado a 2)/4G(elevado a 2)K(elevado a 2)

Em que:

i = coeficiente de campo (varia entre 8 e 24, dependendo do tipo de ocular)

K = coeficiente do tubo (1 ou 1,25)

G = ampliação da objectiva (l00x, 40x, etc.)

3 - Calcular o número de células fluorescentes típicas por ml de sedimento ressuspenso (N).

N = C x 1000/y x F

Em que:

y = volume de sedimento ressuspenso em cada poço, e

F = factor de diluição do sedimento ressuspenso

APÊNDICE N.º 6

Protocolos e reagentes validados para PCR

Nota. - Os testes preliminares deveriam permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de R. solanacearum por ml de extracto de amostra.

Os testes preliminares não deveriam ainda revelar nenhum resultado falso positivo com um painel de estirpes bacterianas seleccionadas (ver apêndice n.º 3).

1 - Protocolo PCR de Seal et al. (1993):

1.1 - Iniciadores:

Iniciador directo OLI-1 - 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'

Iniciador inverso Y-2 - 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado do ADN-alvo de R. solanacearum = 288 bp.

1.2 - Mistura de reacção da PCR:

1.3 - Condições de reacção da PCR:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

Correr o seguinte programa:

1 ciclo de:

35 ciclos de:

ii) 20 segundos a 94ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii) 20 segundos a 68ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv) 30 segundos a 72ºC (extensão da cópia)

1 ciclo de:

vi) Manter a uma temperatura de 4ºC

Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador Perkin Elmer 9600. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

1.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo dos fragmentos de restrição característico com a enzima Ava II após incubação a 37ºC.

2 - Protocolo PCR de Pastrik e Maiss (2000):

2.1 - Iniciadores:

Iniciador directo Ps-1 - 5'-AGT CGA ACG GCA GCG GGG G-3

Iniciador inverso Ps-2 - 5'-GGG GAT TTC ACA TCG GTC TTG CA-3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum = 553 bp.

2.2 - Mistura de reacção da PCR:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

2.3 - Condições de reacção da PCR:

Correr o seguinte programa:

1 ciclo de:

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii) 30 segundos a 68ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv) 45 segundos a 72ºC (extensão da cópia)

1 ciclo de:

vi) Manter a uma temperatura de 4ºC

Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

2.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo do fragmento de restrição característico com a enzima Taq I após incubação a 65ºC durante 30 minutos. Os fragmentos de restrição obtidos de um fragmento específico de R. solanacearum têm tamanhos de 457 bp e 96 bp.

3 - Protocolo PCR Multiplex com controlo interno (Pastrik et al., 2002):

3.1 - Iniciadores:

Iniciador directo RS-1-F - 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Iniciador inverso RS-1-R - 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Iniciador directo NS-5-F - 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'

Iniciador inverso NS-6-R - 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum = 718 bp (conjunto iniciador RS).

Tamanho esperado do fragmento amplificado do controlo interno da PCR de 18S rARN = 310 bp (conjunto iniciador NS).

3.2 - Mistura de reacção da PCR:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

3.3 - Condições de reacção da PCR:

Correr o seguinte programa:

1 ciclo de:

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii) 30 segundos a 58ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv) 45 segundos a 72ºC (extensão da cópia)

1 ciclo de:

vi) Manter a uma temperatura de 4ºC

Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

3.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição característico com a enzima Bsm I ou um isosquizómero (e.g. Mva 1269 I) após incubação a 65ºC durante 30 minutos.

4 - Protocolo PCR específico para os Biovares de R. solanacearum (Pastrik et al, 2001):

4.1 - Iniciadores:

Iniciador directo Rs-1-F - 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Iniciador inverso Rs-1-R - 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Iniciador inverso Rs-3-R - 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum:

Com Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp;

Com Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2 - Mistura de reacção da PCR:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

4.3 - Condições de reacção da PCR:

Correr o seguinte programa para as reacções específicas dos Biovares 1/2 e 3/4/5:

1 ciclo de:

35 ciclos de:

ii) 30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii) 30 segundos a 58ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv) 45 segundos a 72ºC (extensão da cópia)

1 ciclo de:

vi) Manter a uma temperatura de 4ºC

Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

4.4 - Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado:

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando os iniciadores Rs-1-F e Rs-1-R produzem um polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição característico com a enzima Bsm I ou um isosquizómero (por exemplo Mva 1269 I) após incubação a 65ºC durante 30 minutos. Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando os iniciadores Rs-1-F e Rs-3-R não apresentam locais de restrição.

5 - Preparação do tampão de carregamento:

5.1 - Azul de bromofenol (solução concentrada a 10%):

Azul de bromofenol - 5 g

Água destilada (bidest) - 50 ml

5.2 - Tampão de carregamento:

Glicerol (86%) - 3,5 ml

Azul de bromofenol (5.l) - 300 (mi)l

Água destilada (bidest) - 6,2 ml

6 - Tampão de tris acetato EDTA (TAE) 10X, pH 8,0:

Tampão tris - 48,40 g

Ácido acético glacial - 11,42 ml

EDTA (sal dissódico) - 3,72 g

Água destilada - 1,00 l

Diluir até 1x antes de utilizar.

Também disponível comercialmente (por exemplo, Invitrogen ou equivalente).

APÊNDICE N.º 7

Reagentes validados para o teste FISH

1 - Sondas:

Sonda específica para R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3';

Sonda para eubactérias (não específica) EUB-338-FITC: 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'.

2 - Solução fixadora:

Nota. - Atenção! O fixador contém paraformaldeído, um produto tóxico. Utilizar luvas e não inalar. É aconselhável trabalhar em «hotte».

ii) Ajustar o pH a 7,0 mediante adição de 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,0) e 5 gotas de HCl 1N. Verificar o pH com papel indicador e ajustar, se necessário, com HCl ou NaOH;

Nota. - Atenção! Não utilizar um medidor de PH em soluções contendo paraformaldeído.

iii) Filtrar a solução através de um filtro de membrana de 0,22 (mi)m e manter ao abrigo de poeiras a 4ºC até à sua utilização.

3 - «Hybmix» 3x:

NaCl - 2,7 M

Tris-HCl - 60 mM (pH 7,4)

EDTA (esterilizado por filtração e autoclavado) - 15 mM

Diluir até 1x, conforme necessário.

4 - Solução de hibridação:

«Hybmix» 1x

Dodecilsulfato de sódio (SDS) - 0,01%

Formamida - 30%

Sonda EUB 338 - 5 ng/(mi)l

Sonda OLI-1 ou OLI-2 - 5 ng/(mi)l

Preparar quantidades de solução de hibridação de acordo com os cálculos do quadro I. Para cada lâmina (contendo 2 amostras diferentes em duplicado) são necessários 90 (mi)l de solução de hibridação.

Nota. - Atenção! A formamida é muito tóxica. Utilizar luvas e tomar as medidas de segurança necessárias!

QUADRO I

Quantidades sugeridas para a preparação da solução de hibridação

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

5 - Tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0:

Na(índice 2)HPO(índice 4) - 8,52 g

KH(índice 2)PO(índice 4) - 5,44 g

Água destilada - 1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

APÊNDICE N.º 8

Condições de cultivo de beringela e tomateiro

Semear tomateiros (Lycopersicon esculentum) ou beringelas (Solanum melongena) em tabuleiros com substrato pasteurizado. O transplante das plântulas faz-se quando os cotilédones estão completamente expandidos (10 a 14 dias), para substrato de cultura pasteurizado.

As beringelas ou os tomateiros devem ser cultivados em estufa nas seguintes condições ambientais antes da inoculação:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/2007/06/12200/40954133.pdf))

Fornecedores:

ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Referências bibliográficas

1 - Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl.1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

2 Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

3 - Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

4 - Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

5 - Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphismswith DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

6 - Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

7 - Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

8 - Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

9 - Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

10 - Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

11 - Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

12 - Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

13 - Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

14 - Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

15 - Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

16 - Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

17 - Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic finger-prints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

18 - Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

19 - Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

20 - Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

21 - Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

22 - Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

23 - Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

24 - Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

25 - Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

26 - Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

27 - Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

28 - Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

29 - Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

30 - Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

ANEXO III — Ocorrência suspeita e confirmação da presença do organismo prejudicial

1 - Sempre que, em caso de ocorrência suspeita, para os materiais vegetais da lista e para todos os outros casos, surja um resultado positivo no ou nos testes de rastreio efectuados em conformidade com os métodos pertinentes constantes do anexo II, e se aguarde a confirmação ou refutação através da conclusão dos referidos métodos, deve proceder-se à retenção e conservação adequada, até à conclusão dos referidos métodos, de:

1.1 - Todos os tubérculos e, sempre que possível, todas as plantas sujeitas a amostragem;

1.2 - Qualquer extracto restante e outro material preparado para o(s) teste(s) de rastreio, por exemplo, lâminas de imunofluorescência; e

1.3 - Toda a documentação relevante.

Nota. - A retenção dos tubérculos permite a realização, sempre que necessária, do teste de variedade.

2 - Em caso de confirmação da presença do organismo prejudicial, deve-se proceder à retenção e conservação adequada, durante pelo menos um mês após a comunicação referida no n.º 2 do artigo 6.º:

2.1 - Do material referido no n.º 1;

2.2 - De uma amostra de material infectado de tomateiro ou de beringela inoculada com o extracto do tubérculo ou da planta, se for caso disso; e

2.3 - De uma cultura isolada do organismo prejudicial.

ANEXO IV — Elementos da investigação para a determinação da extensão e da fonte primária da contaminação

1 - Os elementos da investigação referida na subalínea i) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, devem incluir, sempre que relevante:

1.1 - Locais de produção que:

1.1.1 - Em que se cultive ou tenha cultivado batata que tenha uma relação clonal com batata que se verificou estar contaminada pelo organismo prejudicial;

1.1.2 - Em que se cultive ou tenha cultivado tomate da mesma origem que o tomate que se verificou estar contaminado pelo organismo prejudicial;

1.1.3 - Em que se cultive ou se tenha cultivado batata ou tomate que tenham sido colocados sob controlo oficial por se suspeitar da ocorrência do organismo prejudicial;

1.1.4 - Em que se cultive ou tenha cultivado batata que tenha uma relação clonal com batata cultivada em locais de produção que se verificou estarem contaminados pelo organismo prejudicial;

1.1.5 - Em que se cultive batata ou tomate e que estejam localizados na vizinhança de locais de produção contaminados pelo organismo prejudicial, incluindo os locais de produção que partilhem entre si equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum;

1.1.6 - Em que se utilizem, para irrigação ou aspersão, águas superficiais provenientes de qualquer ponto de que água de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial;

1.1.7 - Em que se utilizem, para irrigação ou aspersão, águas superficiais provenientes de um ponto de água partilhado com locais de produção de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial;

1.1.8 - Que estejam ou tenham sido inundados por águas superficiais de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial; e

1.2 - Águas superficiais utilizadas para irrigação ou aspersão do ou dos campos ou locais de produção que esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial, ou que tenham inundado os mesmos.

ANEXO V — Determinação da extensão da contaminação provável e da possível dispersão do organismo prejudicial

1 - Os elementos a considerar na determinação da extensão da contaminação provável nos termos da subalínea iii) da alínea b) e da subalínea iii) da alínea d)do n.º 1 do artigo 6.º, devem incluir:

1.1 - Os materiais vegetais cultivados num local de produção que tenha sido declarado contaminado ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º;

1.2 - Os locais de produção com alguma relação de produção com os materiais vegetais declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, incluindo os que partilham equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum;

1.3 - Os materiais vegetais produzidos nos locais de produção referidos no número anterior, ou que tenham estado presentes nesses locais durante o período em que os materiais vegetais declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º se encontravam no local de produção referido no n.º 1.1;

1.4 - Instalações nas quais se manuseiem os materiais vegetais provenientes dos locais de produção referidos nos números anteriores,

1.5 - Quaisquer máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, que possam ter estado em contacto com os materiais vegetais declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º;

1.6 - Quaisquer materiais vegetais que tenham estado armazenados em, ou em contacto com, qualquer das estruturas ou objectos referidos no número anterior, antes da limpeza e desinfecção dessas estruturas e objectos;

1.7 - Em resultado das investigações e testes referidos na subalínea i) da alínea b) do nn.º 1 do artigo 6.º, no caso da batata, os tubérculos ou plantas que tenham uma relação clonal colateral ou parental e, no caso do tomate, as plantas que tenham a mesma origem que os materiais vegetais declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º e em relação aos quais, embora os testes se tenham revelado negativos no que diz respeito ao organismo prejudicial, a contaminação se afigure provável através de uma ligação clonal, sendo que o teste de variedade pode ser efectuado no sentido de verificar a identidade dos tubérculos ou plantas contaminados que tenham uma relação clonal;

1.8 - Locais de produção dos materiais vegetais referidos no número anterior;

1.9 - Locais de produção dos materiais vegetais que tenham usado, para irrigação ou aspersão, águas declaradas contaminadas ao abrigo da subalínea ii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º;

1.10 - Materiais vegetais produzidos em campos inundados por águas superficiais de que esteja confirmada a contaminação.

2 - Os elementos a considerar para determinar a possível dispersão ao abrigo da subalínea iv) da alínea b) e da subalínea iii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º, devem incluir:

2.1 - Nos casos abrangidos pela subalínea iv) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º:

2.1.1 - A proximidade de outros locais de produção que cultivem materiais vegetais;

2.1.2 - A produção ou utilização comuns de lotes de batata-semente;

2.1.3 - Os locais de produção que utilizam águas superficiais para irrigação ou aspersão dos materiais vegetais, nos casos em que haja ou tenha havido risco de escorrência ou de inundação por essas águas a partir de locais de produção declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º,

2.2 - Nos casos em que as águas superficiais tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo da subalínea ii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º:

2.2.1 - Os locais de produção em que sejam produzidos materiais vegetais adjacentes a, ou que estejam em perigo de ser inundados por águas superficiais declaradas contaminadas;

2.2.2 - Qualquer bacia de irrigação distinta que esteja associada às águas superficiais declaradas contaminadas;

2.2.3 - Massas de água ligadas às águas superficiais declaradas contaminadas tendo em conta:

3 - A comunicação a que se refere o n.º 2 do artigo 6.º contém os seguintes dados:

3.1 - Imediatamente após a presença do organismo prejudicial ter sido confirmada por testes laboratoriais, com recurso aos métodos estabelecidos no anexo II, pelo menos:

3.1.1 - No caso da batata:

3.1.2 - No caso das plantas de tomateiro, o nome da variedade do lote e, sempre que aplicável, a categoria.

3.2 - Sem prejuízo da exigência de comunicação dos casos de ocorrência suspeita prevista no n.º 3 do artigo 5.º, após uma ocorrência confirmada e sempre que exista um risco de contaminação dos materiais vegetais provenientes ou com destino a outros Estados membros deve ser comunicada de imediato à Comissão Europeia e aos organismos responsáveis dos Estados membros em questão, a seguinte informação:

3.2.1 - O nome da variedade do lote de batata ou de tomate;

3.2.2 - O nome e endereço do expedidor e do destinatário;

3.2.3 - A data da entrega do lote de batata ou de tomate;

3.2.4 - A dimensão do lote de batata ou de tomate entregue;

3.2.5 - Uma cópia do passaporte fitossanitário ou, pelo menos, o número do passaporte fitossanitário, sempre que adequado, ou se for o caso, o número do registo do produtor ou comerciante e uma cópia da nota de entrega.

4 - A comunicação adicional a que se refere o n.º 3 do artigo 6.º contém os seguintes dados:

4.1 - Para cada caso e após a conclusão de todas as investigações:

4.1.1 - A data de confirmação da contaminação;

4.1.2 - Uma descrição sucinta da investigação efectuada para identificar a fonte e a possível dispersão da contaminação, incluindo o nível de amostragem efectuado;

4.1.3 - Informação sobre as fontes de contaminação identificadas ou presumidas;

4.1.4 - Pormenores sobre a extensão da contaminação declarada, incluindo o número de locais de produção e, no caso da batata, o número de lotes, com a indicação da variedade e, caso se trate de batata-semente, da categoria;

4.1.5 - Pormenores relativos à demarcação da zona, incluindo o número de locais de produção, não declarados como contaminados mas incluídos na zona;

4.1.6 - Pormenores relativos às águas declaradas, incluindo o nome e a localização da massa de água e a extensão das águas declaradas proibidas para irrigação;

4.1.7 - Para qualquer remessa ou lote de plantas de tomateiro declarado contaminado, o número de passaporte fitossanitário e os certificados fitossanitários ou certificado fitossanitário de reexportação, em conformidade, respectivamente com o disposto no n.º 2.2 da secção I da parte A e na secção I da parte B do anexo V do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro;

4.1.8 - Quaisquer outras informações relacionadas com o ou os surtos confirmados que a Comissão Europeia venha a solicitar.

ANEXO VI — Aplicação de medidas de protecção fitossanitária sob controlo oficial

1 - As medidas sob controlo oficial a que se refere a que se refere o n.º 1 do artigo 7.º, consistem:

1.1 - Na utilização para a alimentação animal após tratamento térmico que garanta a impossibilidade de sobrevivência do organismo prejudicial; ou

1.2 - Na eliminação num local de eliminação de resíduos destinado especificamente a esse efeito e oficialmente aprovado em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo prejudicial para o meio ambiente, por exemplo, através de escorrência para terras agrícolas, ou do contacto com pontos de água que possam ser utilizados para irrigação de terras agrícolas; ou

1.3 - Na incineração; ou

1.4 - Na transformação industrial através de entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações de eliminação de resíduos oficialmente aprovadas, relativamente aos quais se tenha concluído pela não existência de qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial, e dotadas de um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade; ou

1.5 - Noutras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial, sendo essas medidas, bem como a respectiva justificação, comunicadas à Comissão Europeia e aos restantes Estados membros.

1.6 - Em que quaisquer resíduos remanescentes associados às opções indicadas nos números anteriores, e que resultem das mesmas, são eliminados por métodos oficialmente aprovados em conformidade como disposto no anexo VII.

2 - A utilização ou eliminação adequada dos materiais vegetais a que se refere o n.º 2 do artigo 7.º, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, e se for o caso, com a devida comunicação aos serviços de inspecção das outras DRAP envolvidas de forma a garantir esse controlo a todo o momento, bem como, se for caso disso, mediante aprovação pelo organismo oficial responsável do Estado membro a que batata se destine e no qual irá ser embalada ou transformada, no que diz respeito às instalações de eliminação de resíduos a que se referem os n.os 1.1 e 1.2, é:

2.2 - Quanto aos tubérculos de batata:

2.1.2 - Para utilização como batata consumo, embalada para entrega e utilização directa, sem mudança de embalagem, num local com instalações de eliminação de resíduos adequadas, sendo que as batatas destinadas à plantação apenas podem ser manuseadas no mesmo local, se tal for feito separadamente ou após limpeza e desinfecção; ou

2.1.2 - Para utilização como batata consumo para transformação industrial e destinada a entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações adequadas de eliminação de resíduos e um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade; ou

2.1.3 - Para qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial e sob reserva de aprovação pelos serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente.

2.2 - Quanto a outras partes das plantas, incluindo resíduos de caules e folhas:

2.2.1 - Para destruição; ou

2.2.2 - Para qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial, e sob reserva de aprovação pelos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente.

3 - Os métodos adequados para descontaminação dos objectos referidos no n.º 3 do artigo 7.º são a limpeza e, quando necessário, desinfecção, de forma a garantir que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial, devendo a sua aplicação ter lugar sob supervisão dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente.

4 - A série de medidas a aplicar pelos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente nas zonas demarcadas, estabelecidas ao abrigo da subalínea iv) da alínea b) e da subalínea iii) da alínea d)do n.º 1 do artigo 6.º, e a que se refere o n.º 4 do artigo 7.º, inclui as seguintes acções:

4.1 - Nos casos em que os locais de produção tenham sido declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º:

4.1.1 - Nos campos ou unidades de produção de culturas protegidas declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, é aplicada uma das seguintes opções:

4.1.1.1 - Durante, pelo menos, os quatro períodos de cultura subsequentes à declaração de contaminação:

ii) Sementes nem plantas de tomateiro;

iii) Outras plantas hospedeiras;

iv) Plantas de espécies do género Brassica para as quais exista um risco reconhecido de sobrevivência do organismo prejudicial;

ii) No caso da batata e do tomate, os tubérculos colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequado, devem ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo II.

4.1.2.2 - Durante os cinco anos de cultura subsequentes ao da declaração de contaminação:

ii) Os tubérculos colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequado, devem ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo II.

4.1.2 - Em todos os restantes campos do local de produção contaminado e sob condição de os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente obterem a garantia de que foi eliminado o risco de aparecimento de plantas espontâneas de batateira e de tomateiro e de outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial, incluindo solanáceas infestantes, quando apropriado:

4.1.2.1 - No ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação:

4.1.2.2 - No segundo ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação:

4.1.2.3 - Pelo menos no terceiro ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação:

4.1.2.4 - Em cada um dos anos de cultivo referidos nos números anteriores, são tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira e outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial, caso estejam presentes, e proceder-se-á, em alturas apropriadas, a uma inspecção oficial da cultura em desenvolvimento e, em cada campo de cultivo de batata, ao teste oficial das batatas colhidas, em conformidade com o procedimento estabelecido no anexo II.

4.1.3 - Imediatamente após a declaração de contaminação ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, e após o primeiro ano de cultura subsequente:

4.1.3.1 - Todas as máquinas e instalações de armazenamento do local de produção que estejam envolvidas na produção de batata ou tomate devem ser limpas e, quando necessário, desinfectadas através de métodos apropriados conforme especificado no n.º 3;

4.1.3.2 - São estabelecidos, quando necessário, controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, os quais podem conduzir à sua proibição, para evitar a dispersão do organismo prejudicial.

4.1.4 - Numa unidade de produção de culturas protegidas declarada contaminada ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, nos caso sem que seja possível a total substituição do meio de cultura:

4.1.4.1 - Não são plantados tubérculos nem plantas ou sementes verdadeiras de batateira, nem nenhuma outra planta hospedeira do organismo prejudicial, incluindo plantas e sementes de tomateiro, a não ser quando a unidade de produção tiver sido sujeita, sob supervisão oficial, a medidas destinadas a eliminar o organismo prejudicial e a remover todo o material vegetal hospedeiro, incluindo, no mínimo, a remoção completa do meio de cultura e a limpeza e, quando necessário, desinfecção da unidade e de todo o equipamento, e quando os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente tiverem concedido a sua aprovação para fins de produção de batata ou de tomate; e

4.1.4.2 - Para a produção de batata, apenas são utilizadas batatas-semente certificadas ou mini-tubérculos ou micro-plantas provenientes de origens testadas;

4.1.4.3 - Para a produção de tomate, apenas são utilizadas sementes que cumpram as exigências do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou, no caso de propagação vegetativa, plantas de tomateiro obtidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial;

4.1.4.4 - São estabelecidos, quando necessário, controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, os quais podem conduzir à sua proibição, para evitar a dispersão do organismo prejudicial.

4.2 - Dentro da zona demarcada, sem prejuízo das medidas definidas no n.º 4.1, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, devem:

4.2.1 - Imediatamente após a declaração de contaminação, assegurar a limpeza e desinfecção, consoante for apropriado, de toda a maquinaria e armazéns das referidas instalações que estejam envolvidos na produção de batata ou de tomate, utilizando métodos adequados, tal como disposto no n.º 3.

4.2.2 - Imediatamente, e pelo menos durante os três anos de cultura subsequentes à declaração de contaminação:

4.2.2.1 - Nos casos em que a zona tenha sido demarcada ao abrigo da subalínea iv) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º:

4.2.2.2 - Nos casos em que as águas superficiais tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo da subalínea ii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º, ou incluídas entre os elementos que eventualmente possam contribuir para a dispersão do organismo prejudicial, nos termos do n.º 2 do anexo V:

4.2.3 - Estabelecer, quando necessário, um programa de substituição de todos os lotes de batata-semente ao longo de um período de tempo adequado.

ANEXO VII — Eliminação de resíduos associáveis ao organismo prejudicial

1 - Os métodos de eliminação de resíduos oficialmente aprovados a que se refere o n.º 1 do anexo VI devem obedecer às seguintes disposições, por forma a obviar quaisquer riscos identificáveis de dispersão do organismo prejudicial:

1.1 - Os resíduos de batata e tomate (incluindo cascas de batata e batatas e tomates rejeitados) e qualquer outro resíduo sólido associado à batata e ao tomate (incluindo terra, pedras e outro detritos) são sujeitos ao seguinte:

1.1.2 - Eliminação, num local de eliminação de resíduos destinado especificamente a esse efeito e aprovado oficialmente em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo prejudicial para o meio ambiente, por exemplo, através da escorrência para terras agrícolas ou de contacto com pontos de água que possam ser utilizados para irrigação de terras agrícolas, sendo os resíduos directamente transportados para esses locais em condições de confinamento de forma a que não exista risco de perda de resíduos, ou

1.1.2 - Incineração; ou

1.1.3 - Outras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial, sendo essas medidas comunicadas à Comissão Europeia e aos restantes Estados membros.

1.2 - Os resíduos líquidos, antes de serem eliminados, que contenham sólidos em suspensão são sujeitos a processos de filtração ou decantação para remoção dos mesmos, os quais após serem removidos, são eliminados em conformidade com o referido no n.º 1.1.

1.2.1 - Os resíduos líquidos são, depois: