Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Zkoušený roztok (a). 40,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml.

Zkoušený roztok (b). Ke 100 μl zkoušeného roztoku (a) se přidá 900 μl kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a dobře se promíchá.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL nebo hovězího insulinu CRL, dle potřeby, se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml roztoku obsahujícího 4,0 mg lidského insulinu CRL v 1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a 1,0 ml roztoku obsahujícího 4,0 mg parsečího insulinu CRL v 1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS se smíchají.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min, kterou jsou následující roztoky připravené a uchovávané při teplotě nepřevyšující 20 °C:

• mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R, a je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanol-aminem R, zfiltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,

• mobilní fáze B - smíchá se 500 ml mobilní fáze A s 500 ml acetonitrilu R Zfíltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,

• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Zaznamenají se chromatogramy mobilní fáze obsahující směs objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (48 + 52). V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b) a zaznamená se chromatogram. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími lidskému insulinu a prasečímu insulinu není menší než 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi tak, aby bylo dosaženo požadovaného rozlišení.

Nastříkne se porovnávací roztok (a) šestkrát. Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka pro plochu hlavního píku je menší než 2 %.

Nastříkne se 10 μl zkoušeného roztoku (a) a (b) a 10 μl porovnávacího roztoku (a) stejného druhu insulinu jako zkoušená látka.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) je (10 ± 0,5)krát větší než plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b).

Vypočítá se obsah insulinu (C256H381N65O76S6 nebo C254H377N65O75S6) za použití plochy píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), plochy píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) a deklarovaného obsahu C256H381N65O76S6 v prasečím insulinu CRL nebo C254H377N65O75S6 v hovězím insulinu CRL, jak je potřeba.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při -20 °C do uvolnění pro výrobu. Po rozpuštění se insulin uchovává při (5 ± 3) °C po krátkou dobu, než bude použit pro výrobu přípravku.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• zvíře, z kterého byla látka získána,

• zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

† Insulinum humanum[image omitted]

Lidský insulin

C257H383N65O77S6	Mr 5807,60	CAS 11061-68-0

Je to protein se strukturou antidiabetického hormonu produkovaného lidskou slinivkou břišní. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 95,0 % až 105,0 % lidského insulinu C257H383N65O77S6. 1 m.j. insulinu odpovídá 0,035 mg bezvodého insulinu.

Vyrábí se enzymatickou přeměnou a následujícím čištěním insulinu získaného z prasečí slinivky břišní nebo metodou založenou na rekombinantní DNK (rDNK) technologii. Lidský insulin vyráběný rDNK technologií odpovídá článku Producta ab ADN recombinante.

Výroba

Lidský insulin je vyráběn za podmínek minimalizujících mikrobiální znečištění.

Pro lidský insulin vyráběný enzymatickou přeměnou insulinu získaného z prasečí slinivky se ve validovaném výrobním procesu odstraňuje zbytková proteolytická účinnost. Oprávěná autorita může požadovat dodatečné zkoušky.

Pro lidský insulin vyráběný rDNK technologií lze vypustit následující zkoušku u každé šarže konečného výrobku, pokud oprávněná autorita neudělila výjimku.

Bílkoviny hostitelské buňky. Nejvýše 10 μg/g; stanoví se postupem uvedeným v článku Producta ab ADN recombinante.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v ethanolu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a za rozkladu ve zředěných alkalických hydroxidech.

Zkoušky totožnosti

A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) se shoduje s retenčním časem hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.

B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roz-toku se shoduje s retenčním časem hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Absorbance (2.2.25). 5,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml. Specifická absorbance v maximu při 276 nm je 9,6 až 11,2, počítáno na vysušenou látku.

Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí v 1,0 ml mobilní fáze.

Porovnávací roztok (a). 100 μl zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). Rozpustí se obsah lahvičky lidského insulinu CRL v mobilní fázi tak, aby výsledný roztok obsahoval 10 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem pro chromatografii R (10 μm; velikost pórů asi 13 nm),

• mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs připravená takto: 20 objemových dílů kyseliny octové ledové R se smíchá s 50 objemovými díly vody R, upraví se pH na hodnotu 3,0 roztokem amoniaku 17,5% RS 25% (V/V), přidá se 30 objemových dílů acetonitrilu R a promíchá.

Průtoková rychlost je 0,5 ml/min,

• spektrofotometrického detektoru, 276 nm.

Nastříkne se odděleně po 50 μl každého roztoku. Citlivost detektoru se nastaví tak, aby velikost hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) byla 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků eluovaných před hlavním píkem není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1,0 %).

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 40,0 mg se rozpustí v 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky lidského insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Porovnávací roztok (c). 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se smíchá s 1,0 ml porovnávacího roztoku (a).

Porovnávací roztok (d). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se smíchá s 1,0 ml porovnávacího roz-toku (b).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min, kterou jsou následující roztoky připravené a uchovávané při teplotě nižší než 20 °C:

• mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R, a je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanolaminem R Zfiltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,

• mobilní fáze B - smíchá se 500 ml mobilní fáze A s 500 ml acetonitrilu R Zfiltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
0 až 30	48	52	izokraticky
30 až 44	48 až 20	52 až 80	lineární gradient
44 až 50	20	80	izokraticky

• spektrofotometrického detektoru, 214 nm, Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (d) a 20 μl porovnávacího roztoku (b). Zaznamenává se chromatogram porovnávacího roztoku (d), dokud pík odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je zřetelně viditelný. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími lidskému insulinu a prasečímu insulinu není menší než 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi, aby bylo dosaženo požadovaného rozlišení.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a), 20 μl porovnávacího roztoku (c) a 20 μl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je lidský desamidoinsulin jako malý pík za hlavním píkem a jeho relativní retenční čas vzhledem k hlavnímu píku je asi 1,3. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku odpovídajícímu lidskému desamidoinsulinu není větší než 2,0 % celkové plochy všech píků; součet ploch všech píků, kromě píku lidského insulinu a píku lidského desamidoinsulinu, není větší než 2,0 % celkové plochy všech píků; plocha žádného píku odpovídajícího hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) není větší než plocha odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (1,0%).

Imunoreaktivita proinsulinu (PLI). Nejvýše 10 μg/g; počítáno na vysušenou látku. Imunoreaktivita proinsulinu se zkouší vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), jako je radioimunoanalýza. Pro lidský insulin vyrobený enzymatickou přeměnou prasečího insulinu se použije mezinárodní referenční prasečí proinsulin ke kalibraci metody. Pro insulin vyrobený rDNK technologií se použije mezinárodní referenční lidský proinsulin.

Zinek. Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na vhodnou koncentraci (např. 0,4 μg až 1,6 μg Zn/ml).

Porovnávací roztoky. Připraví se roztoky obsahující 0,40 μg, 0,80 μg, 1,00 μg, 1,20 μg, 1,60 μg Zn/ml za použití čerstvě připraveného základního roztoku zinku (5 mg Zn/ml) zředěním kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS.

Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen vhodného složení (např. 2 l acetylenu a 11 l vzduchu/min).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 0,200 g se suší 24 h při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 2,5 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,20 g zkoušené látky.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 10 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografíe (2.2.29).

Zkoušený roztok (a). 40,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml.

Zkoušený roztok (b). Ke 100 μl zkoušeného roztoku (a) se přidá 900 μl kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a dobře se promíchá.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky lidského insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí sejí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) a 1,0 ml roztoku obsahujícího 4,0 mg prasečího insulinu CRL v 1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS se smíchají.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min, kterou jsou následující roztoky připravené a uchovávané při teplotě nižší než 20 °C:

• mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R, a je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanolaminem R. Zfiltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,

• mobilní fáze B - smíchá se 500 ml mobilní fáze A s 500 ml acetonitrilu R. Zfiltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,

• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Zaznamenají se chromatogramy mobilní fáze obsahující 48 objemových dílů mobilní fáze A a 52 objemových dílů mobilní fáze B. V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b) a zaznamená se chromatogram. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími lidskému insulinu a prasečímu insulinu není menší než 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi tak, aby bylo dosaženo požadovaného rozlišení.

Nastříkne se porovnávací roztok (a) šestkrát. Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka pro plochu hlavního píku je menší než 2 %.

Nastříkne se po 10 μl zkoušeného roztoku (a) a (b) a 10 μl porovnávacího roztoku (a).

Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) je (10 ± 0,5)krát větší než plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b).

Vypočítá se obsah insulinu (C257H383N65O77S6) za použití plochy hlavního píku a plochy píku odpovídajícího desamidoinsulinu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) a chromatogramu porovnávacího roztoku (a) a deklarovaného obsahu C257H383N65O77S6 v lidském insulinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při -20 °C do uvolnění pro výrobu. Po rozpuštění se insulin uchovává při (5 ± 3) °C po krátkou dobu, než bude použit pro výrobu přípravku. Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• zda byla látka vyrobena enzymatickou přeměnou prasečího insulinu nebo rDNK technologií,

• zdaje látka prostá bakteriálních endotoxinů.

† Interferoni alfa-2 solutio concentrata[image omitted]

Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2

Je to roztok bílkoviny vytvořené podle informace kódované genem pro alfa-interferon, subtyp alfa-2, která vykazuje alespoň v homologních buňkách nespecifickou protivirovou účinnost v průběhu metabolických buněčných procesů syntézy ribonukleové kyseliny a bílkovin. Interferon alfa-2 vykazuje také antiproliferační účinnost. Různé typy interferonu alfa-2 se liší ve zbytku aminokyseliny v poloze 23 a označují se písmeny.

Označení	Zbytek v poloze 23
alfa-2a	Lys
alfa-2b	Arg

Tento článek se vztahuje na koncentrované roztoky interferonů alfa-2a a -2b.

Účinnost koncentrovaného roztoku interferonu alfa-2 je nejméně 1,4 . 10 ^8m.j. v miligramu bílkoviny. Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2 obsahuje nejméně 2 . 10 ^8m.j. interferonu alfa-2 v mililitru.

Koncentrovaný roztok interferonu alfa-2 vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

Výroba

Vyrábí za podmínek minimalizujících mikrobiální znečištění přípravku.

Vyrábí se metodou založenou na rekombinantní DNK technologii za použití bakterií jako hostitelských buněk. Před uvolněním se na každé šarži konečné várky provedou následující zkoušky, pokud oprávněná autorita neudělila výjimku.

Bílkoviny odvozené z hostitelských buněk. Limity schvaluje oprávněná autorita.

DNK odvozená z hostitelských buněk nebo vektoru. Limity schvaluje oprávněná autorita.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá nebo slabě nažloutlá tekutina.

Zkoušky totožnosti

A. Zkouška Stanovení účinnosti je zároveň zkouškou totožnosti.

B. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Izoelektrická fokusace, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní pás na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídá svojí polohou hlavnímu pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku.

C. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Nečistoty o odlišné molekulové hmotnosti, viz Zkoušky na čistotu, získané za redukujících podmínek. Hlavní pás na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá svojí polohou hlavnímu pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).

D. Provede se peptidové mapování.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1,5 g/l. 25 μl se přenese do 1,5ml polypropylenové nebo skleněné zkumavky. Přidá se 1,6 μl tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 8,0 (1 mol/l), 2,8 μl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1,0 g/l) ve vodě R a 3,6 μl vody R a silně se promíchá. Zkumavka se uzavře a nechá se 18 h ve vodní lázni při 37 °C, pak se přidá 100 μl roztoku guanidiniumchloridu R (573 g/l) a dobře se promíchá. Přidá se 7 μl roztoku dithiothreitolu R (154,2 g/l) a dobře se promíchá. Uzavřená zkumavka se na 1 min ponoří do vroucí vody R, pak se ochladí na pokojovou teplotu.

Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití roztoku příslušného interferonu alfa-2 CRL (1,5 g/l) ve vodě R.

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,10 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm) s širokými póry,

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou jsou následující roztoky:

• mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,

• mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,

Gradientový program:

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
	100	0	ustalování
0 → 8	100	0	izokraticky
8 → 68	100 → 40	0 → 60	lineární gradient
68 → 72	40	60	izokraticky
72 → 75	40 → 100	60 → 0	lineární gradient
75 → 80	100	0	znovuustalování

• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 30 °C.

Kolona se promývá nejméně 15 min mobilní fází A do ustálení rovnováhy. Nastříkne se odděleně po 100 μl aždého roztoku. Chromatogram zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogram každého roztoku je kvalitativně podobný chromatogramu příslušného referenčního interferonu alfa-2 CRL.

Zkoušky na čistotu

Bílkoviny.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na roztok obsahující asi 0,5 mg/ml interferonu alfa-2.

Porovnávací roztok. Připraví se zásobní roztok albuminu hovězího R (0,5 mg/ml) ve vodě R Ředě-ním zásobního roztoku se připraví osm roztoků obsahujících 3 μg/ml až 30 μg/ml albuminu hovězího R.

Zkoušený roztok se zředí třicetkrát a padesátkrát. Přidá se 1,25 ml roztoku připraveného téhož dne smícháním 2,0 ml roztoku síranu měďnatého R (20 g/l) ve vodě R 2,0 ml roztoku vínanu sodného R (40 g/l) ve vodě R a 96,0 ml roztoku uhličitanu sodného R (40 g/l) v hydroxidu sodném 0,2 mol/l RS do zkumavek obsahujících 1,5 ml vody R (slepá zkouška), 1,5 ml různých zředění zkoušeného roztoku nebo 1,5 ml porovnávacích roztoků. Po každém přídavku se promíchá. Asi po 10 min se do každé zkumavky přidá 0,25 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového R připraveného téhož dne a promíchá se. Asi po 30 min se změří absorbance (2.2.25) každého roztoku při 750 nm proti kontrolnímu roztoku získanému při slepé zkoušce. Sestrojí se kalibrační křivka závislosti absorbance osmi porovnávacích roztoků na obsahu bílkovin a z křivky se odečte obsah bílkovin ve zkoušeném roztoku.

Nečistoty o odlišné molekulové hmotností. Provede se polyakrylamidová gelová elektroforéza (2.2.31) za redukujících i neredukujících podmínek.

Separační gel. 9,08 g trometamolu A, 0,2 g laurylsíranu sodného R a 14 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS se rozpustí ve vodě R, je-li třeba, pH se upraví na hodnotu 8,8 a roztok se zředí vodou R na 100 ml (roztok A). 8,22 g akrylamidu R a 0,22 g methylenbisakrylamidu R se rozpustí ve 30 ml vody R a zředí se roztokem A na 60 ml. Roztok se zfiltruje, odplyní a přidá se 0,015 ml tetramethylethylendiaminu R a 0,075 ml roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).

Zaostřovací gel. 3,03 g trometamolu R, 0,2 g laurylsíranu sodného R a 21 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS se rozpustí ve vodě R je-li třeba, pH se upraví na hodnotu 6,8 a zředí se vodou A na 100 ml (roztok B). 1,0 g akrylamidu R a 0,026 g methylenbisakrylamidu R se rozpustí v 10 ml vody A a zředí se roztokem B na 20 ml. Roztok se zfiltruje, odplyní a přidá se 0,010 ml tetramethylethylendiaminu A a 0,1 ml roztoku peroxodisíranu diamonného A (100 g/l). Během polymerizace zaostřovacího gelu se použije vhodný teflonový hřeben, aby se vytvořily jamky pro vzorky.

Elektrodový tlumivý roztok. 24,0 g trometamolu R, 115,2 g glycinu R a 4,0 g laurylsíranu sodného A se rozpustí ve vodě A a zředí se jí na 4000 ml. Je-li třeba, pH se upraví na hodnotu 8,3.

Vzorkový tlumivý roztok. Pro redukující podmínky: 0,75 g trometamolu R, 10 ml glycerolu R, 1 g laurylsíranu sodného R, 1 ml 2-merkaptoethanolu R a 1 mg modři bromfenolové R se rozpustí ve vodě R, přidá se 5 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS a zředí se vodou R na 100 ml. Je-li třeba, pH se upraví na hodnotu 6,8. Pro neredukující podmínky se vynechá 2-merkaptoethanol.

Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí vzorkovým tlumivým roztokem na koncentraci bílkoviny 0,5 g/l.

Zkoušený roztok (b). 0,20 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vzorkovým tlumivým roztokem na 1 ml.

Porovnávací roztok (a). Roztok vhodného interferonu alfa-2 CRL se zředí vzorkovým tlumivým roztokem na koncentraci 0,625 g/l.

Porovnávací roztok (b). 0,20 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí vzorkovým tlumivým roztokem na 1 ml.

Porovnávací roztok (c). 0,20 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí vzorkovým tlumivým roztokem na 1 ml.

Porovnávací roztok (d). 0,20 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí vzorkovým tlumivým roztokem na 1 ml.

Porovnávací roztok (e). 0,20 ml porovnávacího roztoku (d) se zředí vzorkovým tlumivým roztokem na 1 ml.

Zkoušené a porovnávací roztoky v uzavřených zkumavkách se umístí na 2 min do vroucí vodní lázně. Do jamek zaostřovacího gelu se nanese odděleně po 50 μl každého zkoušeného roztoku a po 10 μl standardního roztoku molekulových hmotností. Spustí se elektroforéza při proudu 10 mA na gel. Když čelo zóny barviva dosáhne separačního gelu, přepne se na 20 mA na gel, přístroj se ochlazuje cirkulující vodou o teplotě 10 °C. Gel se ponoří na 16 h do směsi objemových dílů kyseliny octové R, vody R a methanolu R (10 + 40 + 50). Gel se přenese do roztoku glutaraldehydu R (100 g/l) ve vodě R a třepe se asi 30 min. Pak se roztok glutaraldehydu na 20 min nahradí vodou destilovanou R. Promývání se dvakrát opakuje. Gel se přenese do směsi obsahující 0,8 g/l hydroxidu sodného R, roztok amoniaku 32% R 4% (V/V) a 8 g/l dusičnanu stříbrného R. Tento roztok se připravuje těsně před použitím. Třepe se 5 min ve tmě. Gel se promývá třikrát 30 s vodou R a pak se třepe ve směsi obsahující 0,05 g/l kyseliny citronové R, formaldehyd RS 0,14% (V/V) a methanol R 0,005% (V/V) ve vodě R, přičemž se objeví pásy bílkovin. Gel se ponechá v roztoku tak dlouho, dokud se dostatečně neobarví, a pak se opakovaně promyje vodou R. Pak se gel ponoří na 2 h až 3 h do roztoku glycerolu R 20% (V/V) ve vodě R.

Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) za redukujících podmínek mohou, kromě hlavního pásu, být méně intenzivní pásy s nižšími molekulovými hmotnostmi než hlavní pás; žádný takový pás není intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) (1,0 %) a nejvýše tři takové pásy jsou intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) (0,2 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže bílkoviny standardu molekulových hmotností jsou distribuovány na 80 % délky gelu, jestliže na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) je viditelný pás a na elektroforeogramech zkoušených roztoků (a) a (b) a porovnávacích roztoků (a) a (e) je viditelný nárůst intenzity barvení.

Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) za neredukujících podmínek mohou být, kromě hlavního pásu, méně intenzivní pásy s vyšší molekulovou hmotností než hlavní pás. Žádný takový pás není intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) (1,0 %) a nejvýše tři takové pásy jsou intenzivnější než hlavní pás na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) (0,2 %).

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografíe (2.2.29).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1 g/l.

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok vhodného interferonu alfa-2 CRL (1 g/l) ve vodě R

Porovnávací roztok (b). Porovnávací roztok (a) se zředí peroxidem vodíku zředěným RS na konečnou koncentraci 50 mg/l. Nechá se 60 min stát, pak se přidá 12,5 mg methioninu R na mililitr roztoku a nechá se 60 min stát.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm) s širokými póry,

• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou jsou následující směsi:

• mobilní fáze A- k 700 ml vody R se přidají 2 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,

• mobilní fáze B - ke 200 ml vody R se přidají 2 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,

Gradientový program:

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
	72	28	ustalování
0 → 1	72	28	izokraticky
1 → 5	72 → 67	28 → 33	lineární gradient
5 → 20	67 → 63	33 → 37	lineární gradient
20 → 30	63 → 57	37 → 43	lineární gradient
30 → 40	57 → 40	43 → 60	lineární gradient
40 → 42	40	60	izokraticky
42 → 50	40 → 72	60 → 28	lineární gradient
50 → 60	72	28	znovuustalování

• spektrofotometrického detektoru, 210 nm.

Teplota kolony se udržuje na 35 °C.

Kolona se promývá nejméně 15 min mobilní fází o počátečním složení do ustavení rovnováhy. Nastřikuje se po 10 μl každého roztoku.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku retenční čas hlavního píku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je patrný pík oxidovaného interferonu, jehož retenční čas je nepatrně kratší než retenční čas hlavního píku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže oba píky se dělí již na základní linii. Přihlíží se pouze k píkům, jejichž relativní retenční časy vzhledem ke hlavnímu píku jsou 0,7 až 1,4. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku, kromě hlavního píku, větší než 3,0 % celkové plochy všech píků. Součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 5,0 % celkové plochy všech píků.

Izoelektrická fokusace.

Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1 g/l.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok vhodného interferonu alfa-2 CRL (1 g/l) ve vodě R.

Kalibrační roztok izoelektrických bodů v oblasti pH 3,0 až 10,0. Připraví a použije se podle návodu výrobce.

Použije se vhodný přístroj spojený s recirkulační vodní lázní s kontrolovanou teplotou při 10 °C a gely pro izoelektrickou fokusaci s gradientem pH 3,5 až 9,5. S přístrojem se pracuje podle návodu výrobce. Jako anodový roztok se použije kyselina fosforečná 1 mol/l RS a jako katodový roztok hydroxid sodný 1 mol/l RS. Vzorky se nanášejí na gel filtračními papírky. Filtrační papírky pro nanášení vzorku se umístí na gel u katody. Nanáší se odděleně 15 μl zkoušeného roztoku a 15 μl porovnávacího roztoku. Spustí se izoelektrická fokusace při 1500 V a 50 mA. Po 30 min se vypne proud, odstraní se filtrační papírky a znovu se připojí zdroj napětí na 1 h. Během fokusačního procesu se udržuje konstantní napětí. Po fokusaci se gel ponoří do vhodného objemu roztoku kyseliny trichloroctové R (115 g/l) a kyseliny sulfosalicylové R (34,5 g/l) ve vodě R a nádobou se 60 min opatrně třepe. Gel se přenese do směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R, ethanolu R a vody R (32 + 100 + 268) a promývá se 5 min. Pak se gel na 10 min ponoří do barvicího roztoku modři brilantní R (1,2 g/l) ve stejné směsi kyseliny octové ledové, ethanolu a vody předehřátého na 60 °C. Gel se promyje v několika nádobách stejnou směsí kyseliny octové ledové, ethanolu a vody a v této směsi se ponechá, dokud není pozadí bezbarvé (12 h až 24 h). Po odpovídajícím odbarvení se gel ponoří na 1 h do roztoku glycerolu R 10% (V/V) ve směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R, ethanolu R a vody R (32 + 100 + 268).

Hlavní pás na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou hlavnímu pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku. Do grafu se vynese závislost migračních vzdáleností ukazatelů izoelektrických bodů na jejich izoelektrických bodech a určí se izoelektrický bod hlavních složek zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku; neliší se o více než 0,2 hodnoty pH. Zkoušku lze hodnotit, jestliže ukazatele izoelektrických bodů jsou distribuovány po celé délce gelu a izoelektrický bod porovnávacího roztoku leží mezi 5,8 a 6,3.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 100 m.j. endotoxinu v objemu, který obsahuje 1,0 mg bílkoviny.

Stanovení účinnosti

Účinnost interferonu alfa-2 se stanoví porovnáním jeho ochranného působení proti virovému cytopatickému účinku s působením vhodného mezinárodního standardu lidského rekombinantního interferonu alfa-2 nebo referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách. Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství vhodného mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnické organizace.

Zkouška se provádí vhodnou metodou založenou na následujícím uspořádání.

Použije se stanovená buněčná kultura citlivá na cytopatické působení vhodného viru (vhodná je buněčná linie lidských diploidních fibroblastů prostá mikrobiální kontaminace a citlivá na interferon, která je citlivá na virus encefalomyokarditidy) za standardních kultivačních podmínek.

Vhodné jsou následující buněčné kultury a viry: buňky MDBK (ATCC č. CCL22) nebo myší L-buňky (NCTC klon 929; ATCC č. CCL 1) jako buněčná kultura a virus vezikulární stomatitidy VSV, kmen Indiana (ATCC č VR-158) jako infekční agens. Lze použít také buňky lidských diploidních fibroblastů FS-71 odpovídající na působení interferonu jako buněčná kultura a virus encefalomyokarditidy (ATCC č. VR-129B) jako infekční agens.

Použijí se tři nebo více různých zředění zkoušeného přípravku a porovnávacího přípravku v nejméně čtyřech souběžných stanoveních na mikrotitračních destičkách. Každé stanovení obsahuje kontrolní buňky, které nejsou vystaveny působení interferonu. Zvolí se taková ředění přípravku, kde nejnižší ředění již poskytuje ochranu a nejvyšší koncentrace poskytuje menší než maximální ochranu proti cytopatickému účinku viru. Ve vhodném čase se přidá cytopatický virus do všech jamek s výjimkou dostatečného počtu jamek v každém souběžném stanovení s neinfikovanými kontrolními buňkami. Cytopatický účinek viru se určí kvantitativně vhodnou metodou. Účinnost zkoušeného přípravku se vypočítá obvyklými statistickými metodami pro model rovnoběžnosti.

Stanovená účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) je 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě nižší než -20 °C.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• druh interferonu (alfa-2a nebo alfa-2b),

• způsob výroby.

† Iodum[image omitted]

Jod

I2	Mr 253,81	CAS 7553-56-2

Obsahuje 99,5 % až 100,5 % I.

Vlastnosti

Šedofialové křehké destičky nebo malé krystaly s kovovým leskem. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96%, těžce rozpustný v glycerolu, velmi snadno rozpustný v koncentrovaných roztocích jodidů. Jod sublimuje již za pokojové teploty.

Zkoušky totožnosti

A. Několik částic zkoušené látky se zahřívá ve zkumavce; vznikají fialové páry, které sublimují za vzniku modravě černého krystalického sublimátu.

B. K nasycenému roztoku se přidá škrob RS; vznikne modré zbarvení, které zahřátím mizí. Po ochlazení se zbarvení opět objeví.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 3,0 g se rozetřou s 20 ml vody R, směs se zfiltruje, filtr se promyje a filtrát se zředí vodou R na 30 ml. K filtrátu se přidá 1 g zinku práškového R. Po odbarvení se směs zfiltruje, filtr se promyje vodou R a filtrát se zředí vodou R na 40 ml.

Bromidy a chloridy. K 10 ml roztoku S se přidají 3 ml amoniaku 17,5% RS a 6 ml dusičnanu stříbrného RS2. Směs se zfiltruje, filtr se promyje vodou R a filtrát se zředí vodou R na 20 ml. K 10 ml tohoto roztoku se přidá 1,5 ml kyseliny dusičné R; po 1 min roztok neopalizuje intenzivněji než porovnávací roztok připravený současně smícháním 10,75 ml vody R, 0,25 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS, 0,2 ml kyseliny dusičné zředěné RS a 0,3 ml dusičnanu stříbrného RS2 (250 μg/g).

Netěkavé látky. 1,00 g se zahřívá v porcelánové misce na vodní lázni do odpaření jodu. Zbytek sušený při 100 °C až 105 °C váží nejvýše 1 mg (0,1 %).

Stanovení obsahu

0,200 g se přenese do baňky obsahující 1 g jodidu draselného R a 2 ml vody R a přidá se 1 ml kyseliny octové zředěné RS. Po úplném rozpuštění zkoušené látky se přidá 50 ml vody R a titruje se thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití škrobu RS jako indikátoru.

1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 12,69 mg I.

Uchovávání

Ve skleněných obalech se zabroušenou zátkou.

Separandum.

† Iohexolum [image omitted]

Johexol

[image omitted]

C19H26I3N3O9	Mr 821,14	CAS 66108-95-04

Je to 5-[N-(2,3-dihydroxypropylacetamido)]-N,N'-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-trijodbenzen--1,3-dikarboxamid. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C19H26I3N3O9.

Vlastnosti

Bílý nebo šedobílý hygroskopický prášek. Je velmi snadno rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v methanolu, prakticky nerozpustný v etheru a v dichlormethanu. Látka je směsí diastereoizomerů a atropizomerů.

Zkoušky totožnosti

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety iohexolu CRL. Tablety se připraví za použití bromidu draselného R.

B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné látky A, viz Zkoušky na čistotu. Retenční časy a velikosti hlavních píků na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou přibližně stejné jako píků odpovídajících johexolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 5,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž7 (2.2.2, Metoda II).

Příbuzné látky.

A. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

(Vzhledem k endo-exoizomerii jsou na chromatogramu dva nerozdělené píky johexolu. Kromě toho se na počátku prvního hlavního píku obvykle objevuje malý pík náležící rovněž johexolu. Retenční čas tohoto malého píku je asi o 1,2 min menší než retenční čas prvního hlavního píku).

Zkoušený roztok. 0,150 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 15,0 mg johexolu CRL a 15,0 mg johexolu nečistoty A CRL se rozpustí ve směsi jedné až dvou kapek hydroxidu sodného zředěného RS a 10 ml vody R a zředí se vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné vhodným silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

• mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a vody R (1 + 99) na počátku eluce a (13 + 87) na konci eluce, při průtokové rychlosti 1 ml/min a lineární gradientové eluci 60 min,

• spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Kolona se promývá mobilní fází o počátečním složení do ustavení rovnováhy po dobu nejméně 10 min.

Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku po nástřiku 10 μl porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % rozsahu celé stupnice zapisovače.

Odděleně se nastříkne 10 μl vody R jako kontrolního roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy: johexolu nečistoty A asi 17 min a obou píků johexolu (odpovídajích endo/exoizovaerním formám) asi 20 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem odpovídajícím johexolu nečistotě A a druhým větším píkem odpovídajícím johexolu je nejméně 5. V případě potřeby se upraví koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi nebo se upraví program lineární gradientové eluce.

Odděleně se nastříkne po 10 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku, kromě píků náležejících johexolu (viz výše), větší než polovina plochy hlavních píků johexolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %) a součet ploch všech píků, kromě hlavních píků johexolu (viz výše), není větší než 1,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,5 %). Nepřihlíží se k žádnému píku odpovídajícímu kontrolnímu roztoku.

B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu GF254R.

Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 50 mg johexolu nečistoty J CRL a 50 mg johexolu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 50,0 ml.

Vrstva se promyje mobilní fází, která je směsí objemových dílů amoniaku 26% R methanolu R 2-propanolu R a acetonu R (20 + 20 + 35 + 50), suší se 30 min při pokojové teplotě a pak 1 h při 90 °C.

Na vrstvu se odděleně nanese po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se výše uvedenou směsí po dráze 10 cm. Vrstva se pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,2 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) jsou patrny dvě zřetelně oddělené skvrny.

3-Chlorpropan-1,2-diol. Nejvýše 100 μg/g. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28).

Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí ve 2,0 ml vody R. Tento roztok se postupně čtyřikrát protřepe vždy 2 ml methylacetatu R. Spojené horní vrstvy se vysuší síranem sodným bezvodým R, zfiltrují se a zahustí na 2 ml.

Porovnávací roztok. 0,50 g 3-chlorpropan-1,2-diolu R se rozpustí v methylacetatu R a zředí se jím na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 100,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• křemenné kolony délky 25 m a vnitřního průměru 0,33 mm potažené polymethylfenylsiloxanem R o síle filmu 1 μm,

• helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 1 ml/min,

• plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje 2 min na 80 °C, pak se zvyšuje rychlostí 15 °C/min až na 170 °C, při níž se udržuje 2 min. Teplota nástřikového prostoru je 230 °C a detektoru 250 °C.

Odděleně se nastříkne po 2 μl každého roztoku (bez děliče nástřiku 30 s). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek je retenční čas 3-chlorpropan-1,2-diolu asi 8 min. Vy-počte se obsah 3-chlorpropan-1,2-diolu.

Methanol, methoxyethanol a 2-propanol. Nejvýše 50 μg/g methanolu a nejvýše po 100 μg/g methoxyethanolu a 2-propanolu. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) head-space metodou a metodou standardního přídavku za použití 2-butanolu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 0,50 g 2-butanolu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 500,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml.

Zkoušený roztok (a). 6,25 g se rozpustí ve vodě R, přidá se 5,0 ml roztoku vnitřního standardu a zředí se vodou R na 25,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a 1 ml vody R se převedou do 10ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře.

Zkoušený roztok (c). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) se převedou do 10ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře (odpovídá standardnímu přídavku 10 μg methanolu R, 20 μg 2-propanolu R a 20 μg methoxyethanolu R).

Zkoušený roztok (d). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) se převedou do 10ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře (odpovídá standardnímu přídavku 25 μg methanolu R, 50 μg 2-propanolu R a 50 μg methoxyethanolu R).

Zkoušený roztok (e). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a 1,0 ml porovnávacího roztoku (d) se převedou do 10ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře (odpovídá standardnímu přídavku 50 μg methanolu R, 100 μg 2-propanolu R a 100 μg methoxyethanolu R).

Porovnávací roztok (a). 0,625 g methanolu R, 1,250 g 2-propanolu R a 1,250 g methoxyethanolu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. Mezi přídavky jednotlivých složek se vždy směs přiměřeně naředí vodou R.

Porovnávací roztok (b). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí vodou R na 50,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 5,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (e). 10,0 ml porovnávacího roztoku (d) se přidá k 10,0 ml roztoku vnitřního standardu a zředí se vodou R na 50,0 ml. 6,0 ml tohoto roztoku se převede do 10ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře.

Postup head-space metodou se obvykle provádí za podmínek:

• teploty 95 °C v komoře s řízenou teplotou,

• doby rovnováhy 15 min,

• teploty převodníku 140 °C,

• doby tlakování 30 s,

• doby plnění smyčky 10 s,

• doby nástřiku 10 s.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• křemenné kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,54 mm potažené zesítěným poly(kyanopropyl)(methylfenylmethyl)siloxanem R o síle filmu 3 μm,

• helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti asi 14 ml/min,

• plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje 5 min na 40 °C, pak se zvyšuje rychlostí 10 ° C/min na 100 °C, při níž se udržuje 1 min. Teplota nástřikového prostoru je 140 °C a teplota detektoru 250 °C.

Zaznamenají se chromatogramy zkoušených roztoků (b), (c), (d) a (e) a porovnávacího roztoku (e). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy: methanolu asi 1,2 min, 2-propanolu asi 1,8 min, 2-butanolu asi 3,5 min a methoxyethanolu asi 4,5 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky methanolu a 2-propanolu na chromatogramů porovnávacího roztoku (e) je nejméně 2,5. Z chromatogramů zkoušených roztoků se vypočte poměr plochy píku k ploše píku vnitřního standardu pro každou stanovovanou látku, zjištěné hodnoty se zpracují lineární regresní analýzou a vypočtou se koncentrace stanovovaných složek ve zkoušené látce.

Střídavě se poměry ploch píků vynesou proti přidanému množství dané stanovované látky k 1 g zkoušené látky. Křivka spojující jednotlivé body se extrapoluje až k průsečíku s osou koncentrace. Délka mezi tímto průsečíkem a průsečíkem obou os je hledanou koncentrací stanovované látky ve zkoušené látce (v μg/g).

Volné aromatické aminy. Nejvýše 0,05 %; Stanoví se absorpční spektrofotometrií (2.2.25).

Zkoušený roztok. 0,200 g se v 25ml odměrné baňce rozpustí v 15,0 ml vody R.

Porovnávací roztok. 10,0 ml roztoku obsahujícího 10 μg/ml johexolu nečistoty J CRL se převede do 25ml odměrné baňky, přidá se 5,0 ml vody R a promíchá se.

Kontrolní roztok. 15,0 ml vody R se převede do 25ml odměrné baňky.

(V průběhu dalšího postupu jsou baňky umístěny v ledové vodě a pracuje se za ochrany před světlem až do okamžiku, kdy jsou přidána všechna zkoumadla).

Baňky obsahující zkoušený roztok, porovnávací roztok a kontrolní roztok se umístí do ledové vody a ponechají se za ochrany před světlem 5 min. Pak se přidá po 1,5 ml kyseliny chlorovodíkové RS1, promíchá se, přidá se po 1,0 ml roztoku dusitanu sodného R (20 g/l), promíchá se a nechá stát 4 min. Přidá se po 1,0 ml roztoku kyseliny amidosírové R (40 g/l) a mírně se promíchává až do ukončení vývinu plynů a nechá stát 1 min. (Upozornění: v baňkách vzniká přetlak). Pak se přidá 1,0 ml čerstvě připraveného roztoku naftylethylendiamoniumdichloridu R (3 g/l) ve směsi objemových dílů vody R a propylenglykolu R (30 + 70) a promíchá se. Baňky se vyjmou z ledové vody, zředí se vodou R na 25 ml, promíchá se a nechá se stát 5 min. Absorbance zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku se změří souběžně při vlnové délce 495 nm v tlouštce vrstvy 50 mm proti kontrolnímu roztoku a z naměřených hodnot se vypočte obsah volných aromatických aminů.

Jodidy. Nejvýše 20 μg/g. Provede se potenciometrická titrace (2.2.20). 6,000 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml. Přidají se 2,0 ml jodidu draselného 0,001 mol/l VS a titruje se dusičnanem stříbrným 0,001 mol/l VS za použití stříbrné elektrody jako indikační a vhodné referenční elektrody.

Provede se slepá zkouška; 2,0 ml jodidu draselného 0,001 mol/l VS se zředí vodou R na 20 ml. Z rozdílu spotřeb se vypočte obsah jodidů.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,001 mol/l VS odpovídá 126,9 μg jodidu.

Iontové sloučeniny. Nejvýše 0,05 %, počítáno jako chlorid sodný. Provede se stanovení měrné vodivosti (2.2.38). Veškeré potřebné laboratorní sklo se před použitím pětkrát promyje vodou destilovanou R

Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok. 10,0 mg chloridu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml.

Na vhodném konduktometru se změří měrná vodivost zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku. Měrná vodivost zkoušeného roztoku není větší než měrná vodivost porovnávacího roztoku.

Těžké kovy (2.4.8). 12 ml roztoku S vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 4,0 %; stanoví se s 1,000 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,500 g se v 250ml baňce s kulovitým dnem smíchá s 25 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS, 20 ml vody R, 1 g zinku práškového R a přidá se několik skleněných varných kuliček. Vaří se pod zpětným chladičem 30 min. Pak se nechá vychladnout a chladič se promyje 20 ml vody R které se přidají do baňky. Obsah baňky se zfiltruje, filtr se promyje několika podíly vody R, které se spojí s filtrátem. Přidá se 5 ml kyseliny octové ledové R a ihned se titruje dusičnanem stříbrným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace (2.2.20) bodu ekvivalence. Vhodným elektrodovým systémem je použití stříbrné a merkurosulfatové elektrody.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS odpovídá 27,37 mg C19H26I3N3O9.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem a vlhkostí.

Separandum.

Nečistoty

A. 5-acetamido-N,N´-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,

B. N,N´-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-trijod-5-[N-(2,6,7-trihydroxy-4-oxaheptyl)acetamido]benzen-1,3-dikarboxamid,

C. 5-[N-(5,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl-3-oxahexyl)acetamido]-N,N´-bis(2,3-dihydroxypropyl)--2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,

D. N-(2,3-dihydroxypropyl)-5-[N-(2,3-dihydroxypropyl)acetamido]-2,4,6-trijod-N´-(2,6,7-trihydroxy--4-oxaheptyl)benzen-1,3-dikarboxamid,

E. N-(5,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl-3-oxahexyl)-N´-(2,3-dihydroxypropyl)-5-[N-(2,3-dihydroxypropyl)acetamido]-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,

F. 5-amino-N,N´-bis(2,3-dihydroxypropyl)dijodbenzen-1,3-dikarboxamid,

G. 5-acetamido-N,N-bis(2,3-dihydroxypropyl)dijodbenzen-1,3-dikarboxamid,

H. N,N-bis(2,3-dihydroxypropyl)-5-[N-(2,3-dihydroxypropyl)acetamido]dijodbenzen-1,3-dikarboxamid,

I. 6,8-bis(2,3-dihydroxypropylkarbamoyl)-3,4-dihydro-2-hydroxymethyl-5,7-dijod-4H-1,4-benzoxazin,

J. 5-amino-N,N-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid.

† Iopamidolum[image omitted]

Jopamidol

[image omitted]

C17H22I3N3O8	Mr 777,09	CAS 60166-93-0

Je to (S)-N,N-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-(2-hydroxypropionamido)-2,4,6-trijod--benzen-1,3-dikarboxamid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C17H22I3N3O8.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, velmi těžce rozpustný v methanolu, prakticky nerozpustný v lihu 96 % a dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem jopamidolu CRL.

B. Zkouška Ztráta sušením, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

C. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 1 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Kysele nebo zásaditě reagující látky. 10 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 100 ml. K dosažení hodnoty pH 7,0 (2.2.3) se spotřebuje nejvýše 0,75 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS nebo 1,4 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -4,6° až -5,2°, počítáno na vysušenou látku. 10,0 g se rozpustí ve vodě R, je-li zapotřebí za zahřátí, a zředí se jí na 25,0 ml. Otáčivost tohoto roztoku se měří při 436 nm.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,50 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 20,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 25 mg jopamidolu nečistoty B CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100 ml. 0,5 ml tohoto roztoku se zředí porovnávacím roztokem (a) na 5 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

• mobilní fáze, která je směsí vody R (mobilní fáze A) a roztoku methanolu R 25% (V/V) (mobilní fáze B) s gradientovou elucí podle níže uvedené tabulky:

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
0	92,5	7,5
6	92,5	7,5
18	65	35
30	8	92
34	8	92
36	92,5	7,5

• průtokové rychlosti 1,5 ml/min,

• spektrofotometrického detektoru, 240 nm.

Teplota kolony se udržuje na 35 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výšky obou píků na chromatogramu nebyly menší než 50 % celého rozsahu stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na získaném chromatogramu rozlišení mezi píkem jopamidolu nečistoty B a jopamidolu není menší než 5.

Nastříkne se odděleně 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu zkoušeného roztoku není součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, větší, než je plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,25 %). Nepřihlíží se k píku, jehož plocha je menší než 0,02násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Volné aromatické aminy. V průběhu zkoušky jsou roztoky a zkoumadla umístěny v ledové vodě, pracuje se za ochrany před světlem.

Zkoušený roztok. 0,500 g se v 25ml odměrné baňce rozpustí v 20,0 ml vody R.

Porovnávací roztok. 4,0 ml roztoku jopamidolu nečistoty A CRL (25,0 mg/l) se smíchá ve 25ml odměrné baňce se 16,0 ml vody R.

Kontrolní roztok. 20,0 ml vody R se převede do 25ml odměrné baňky.

Všechny tři baňky se umístí do ledové vody a ponechají se 5 min za ochrany před světlem. Pak se přidá po 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové R, obsahy se promíchají a ponechá se stát 5 min. Přidá se po 1,0 ml roztoku dusitanu sodného R (20 g/l) připraveného těsně před použitím, promíchá se a opět se ponechá stát 5 min. Přidá se po 1,0 ml roztoku amidosíranu amonného R (120 g/l), mírně se promíchává, dokud unikají plyny. (Upozornění: v baňkách vzniká přetlak). Po 5 min se přidá po 1,0 ml čerstvě připraveného roztoku naftylethylendiamoniumdichloridu R (1 g/l) a promíchá se. Baňky se vyjmou z ledové vody a nechají se stát 10 min. Pak se obsahy zředí vodou R na 25,0 ml, promíchá se a ihned se měří absorbance (2.2.25) zkoušeného a porovnávacího roztoku proti kontrolnímu roztoku při 500 nm. Absorbance zkoušeného roztoku není větší než absorbance porovnávacího roztoku (200 μg/ml).

Volný jod. Do kyvety pro odstřeďování opatřené zátkou se naváží 2,0 g a rozpustí se v 25 ml vody R. Přidá se 5 ml toluenu R a 5 ml kyseliny sírové zředěné RS. Obsah se protřepe a pak odstředí. V horní vrstvě nevznikne červené zbarvení.

Jodidy. Nejvýše 10 μg/ml. Provede se potenciometrická titrace (2.2.20). 6,000 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml. Přidají se 2,0 ml jodidu draselného 0,001 mol/l VS a titruje se dusičnanem stříbrným 0,001 mol/l VS za použití stříbrné elektrody jako indikační a vhodné referenční elektrody. Provede se slepá zkouška. Kontrolní roztok se připraví z 20 ml vody R a 2,0 ml jodidu draselného 0,001 mol/l VS. Z rozdílu spotřeb se vypočte obsah jodidů.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,001 mol/l VS odpovídá 126,9 μg jodidu.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32).Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 1,4 m.j. endotoxinu v gramu.

Stanovení obsahu

0,300 g v 250ml baňce s kulatým dnem se smíchá s 5 ml hydroxidu sodného koncentrované-ho RS, 20 ml vody R, 1 g zinku práškovaného R a přidá se několik skleněných varných kuliček. Vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Pak se nechá vychladnout, chladič se promyje 20 ml vody R a promývací kapalina se přidá do baňky.

Obsah se zfiltruje a filtr se promyje několika podíly vody R. Filtrát se spojí s promývací tekutinou, přidá se 5 ml kyseliny octové ledové R a ihned se titruje dusičnanenm stříbrným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace (2.2.20) bodu ekvivalence a za použití vhodného elektrodového systému, jakým je stříbrná a merkurosulfatová elektroda.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS odpovídá 25,90 mg C17H22I3N3O8.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obale se uvede:

• zda je látka sterilní,

• zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

Nečistoty

[image omitted]

A. R^1 =NHCH(CH2OH)2; R^2=H:N,N´-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-amino-2,4,6-tri-jodisoftalamid,

B. R^1 = NHCH(CH2OH)2; R^2 = COCH2OH: N,N´-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-(2-hydroxyacetamido)-2,4,6-trijodisoftalamid,

C. R^1 = NHCH(CH2OH)2;^2 R = CO3CH: N,N´-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-acetamido--2,4,6-trijodisoftalamid,

D. R^1 = OH; R^2= COCHOHCH3: kyselina N-[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-(2-hydroxy-propionamido)-2,4,6-trijodisoftalamová,

E. R^1 = NHCH(CH2OH)2; R^2 = COCH(CH3)OCOCH3: N,Nʹ-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-ethyl]-5-(2-acetoxypropionamido)-2,4,6-trijodisoftalamid,

F. R^1 = N(CH3)2; R^2= COCHOHCH3: N-[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-N´-dimethyl-5-(2--hydroxypropionamido)-2,4,6-trijodisoftalamid,

G. R^1 = NHCH2-CHOH-CH2OH; R^2=COCHOHCH3: N-[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-N´--(2,3-dihydroxypropyl-5-(2-hydroxypropionamido)-2,4,6-trijodisoftalamid.

† Ipecacuanhae radix[image omitted]

Hlavěnkový kořen

Synonymum. Radix ipecacuanhae, ipekakuanhový kořen

Jsou to usušené úlomky kořene a oddenku druhu Cephaelis ipecacuanha (BROT.) A. RICH., známého jako Matto Grosso ipecacuanha, nebo druhu Cephaelis acuminata KARSTEN, známého jako Costa Rica ipecacuanha, nebo směs obou druhů. Obsahuje nejméně 2,0 % alkaloidů, počítáno jako emetin (C29H40N2O4; Mr 480,7), vztaženo na vysušenou drogu.

Hlavními alkaloidy jsou emetin a cefaëlin.

Vlastnosti

Droga slabého pachu.

Makroskopický a mikroskopický popis, viz Zkoušky totožnosti A a B.

Zkoušky totožnosti

A. C. ipecacuanha. Kořen zpravidla tvoří zkroucené úlomky, tmavě červenohnědé až silně tmavo-hnědé, zřídka více než 15 cm dlouhé nebo 6 mm silné, zevně hustě prstencovitě zaškrcované. Lom je v kůře krátký, ve dřevě tříštivý. Na příčném řezu je patrna široká našedlá kůra a úzká homogenní hustá vrstva dřeva. Oddenek je zpravidla kratší, většinou spojený s kořeny. Je válcovitý, až 2 mm v průměru, jemně podélně vrásčitý s dření, která zaujímá asi jednu šestinu průměru.

C. acuminata. Kořen podobný jako u C. ipecacuanha, liší se však v následujících znacích: je často až 9 mm silný, na povrchu šedohnědý nebo červenohnědý, příčná zúžení zpravidla ve vzdálenostech 1 mm až 3 mm, jsou asi 0,5 mm až 1 mm široká. Zúžení je patrno přibližně na polovině obvodu, v krajním případě není patrno vůbec.

B. Droga se upráškuje (355). Prášek je světle šedý až žlutohnědý. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: parenchymatické buňky; rafidy šťavelanu vápenatého až 80 μm dlouhé, buď ve svazcích, nebo rozptýlené ve formě písku; úlomky cévic a cév zpravidla 10 μm až 20 μm v průměru, s ohraničenými dvůrky; delší cévy a sklereidy z oddenku.

Pozoruje se pod mikroskopem v roztoku glycerolu R 50% (V/V). V parenchymatických buňkách jsou patrna škrobová zrna buď jednotlivá, nebo složená po dvou až osmi, u C. ipecacuanha až 15 μm v průměru, u C. acuminata až 22 μm v průměru.

C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

Zkoušený roztok. 0,1 g práškované drogy (180) se smíchá ve zkumavce s 0,05 ml amoniaku 26% R a 5 ml etheru R a směs se důkladně promíchá skleněnou tyčinkou. Po 30 min stání se zfiltruje.

Porovnávací roztok. 2,5 mg emetiniumdichloridu CRL a 30 mg cefaëliniumdichloridu RCL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 20 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 10 μl každého roztoku. Vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, methanolu R, ethylacetatu R a toluenu R (2 + 15 + 18 + 65) po dráze 10 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se roztokem jodu R (5 g/l) v lihu 96% R a zahřívá se 10 min při 60 °C. Pozoruje se v denním světle. Na chromatogramech zkoušeného i porovnávacího roztoku je v dolní části žlutá skvrna (emetin) a pod ní světle hnědá (cefaëlin) skvrna. Vrstva se pozoruje v ultrafialovém světle při 365 nm. Skvrna odpovídající emetinu fluoreskuje intenzivně žlutě, skvrna odpovídající cefaëlinu světle modrá. Na chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být další, méně výrazně fluoreskující skvrny.

C. acuminata hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou, zbarvením a velikostí skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku.

C. ipecacuanha liší se od výše uvedeného druhu tím, že skvrna odpovídající cefaëlinu na chromatogramu zkoušeného roztoku je výrazně menší než odpovídající skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Cizí příměsi (2.8.2). Vyhovuje požadavkům zkoušky Cizí příměsi.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 1,000 g práškované drogy (180) se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 5,0 %.

Popel nerozpustný v kyselině chlorovodíkové (2.8.1). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení obsahu

7,50 g práškované drogy (180) se odváží do suché baňky, přidá se 100 ml etheru R a protřepává se 5 min. Pak se přidá 5 ml amoniaku zředěného RS1 a protřepává se 1 h. Přidá se 5 ml vody R a znovu se intenzivně protřepe. Etherová vrstva se po dekantaci zfiltruje chomáčkem vaty. Zbytek v baňce se promyje dvakrát 25 ml etheru R a každý etherový podíl se zfiltruje chomáčkem vaty, použitým k první filtraci. Spojené etherové podíly se oddestilují do sucha. Odparek se rozpustí ve 2 ml lihu R 90% (V/V), odpaří se do sucha a odparek se suší 5 min při 100 °C. Zbytek po odpaření se zahřátím na vodní lázni rozpustí v 5 ml předem zneutralizovaného lihu R 90% (V/V). Přidá se 15,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l VS a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml červeně methylové směsného indikátoru R.

1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l VS odpovídá 24,03 mg alkaloidů, počítáno jako emetin (C29H40N2O4).

Uchovávání

Chráněn před světlem a vlhkostí.

Separandum.

†† Ipratropii bromidum[image omitted]

Ipratropiumbromid

[image omitted]

C20H30BrNO3 . H2O	Mr 430,38	CAS 66985-17-9

Je to monohydrát 3α-(RS)-tropoyloxy-N-isopropyl-lαH,5αH-tropaniumbromid. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 99,0 % až 100,5 % sloučeniny C20H30BrNO3.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je dobře rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v methanolu a těžce rozpustný v lihu 96%.

Taje při asi 230 °C, za rozkladu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a E.

Alternativní sestava zkoušek: B, C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem ipratropiumbromidu CRL.

B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

Zkoušený roztok. 5 mg se rozpustí v 1 ml methanolu R

Porovnávací roztok (a). 10 mg ipratropiumbromidu CRL se rozpustí ve 2 ml methanolu R

Porovnávací roztok (b). 5 mg methylatropiniumbromidu CRL se rozpustí v 1 ml porovnávacího roztoku (a).

Na vrstvu se odděleně nanese po 2 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny mravenčí bezvodé R, vody R lihu 96% R a dichlormethanu R (2,5 + 7,5 + 45 + 45) po dráze 10 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu a potom se postříká jodobismutitanem draselným RS. Pozoruje se v denním světle. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

C. K 5 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se přidají 2 ml hydroxidu sodného zředěného RS; nevznikne sraženina.

D. K asi 1 mg se přidá 0,2 ml kyseliny dusičné R a odpaří se na vodní lázni do sucha. Zbytek se rozpustí ve 2 ml acetonu R, přidá se 0,1 ml roztoku hydroxidu draselného R (30 g/l) v methanolu R; vzniká fialové zbarvení.

E. Vyhovuje zkoušce (a) na bromidy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,50 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí sejí na 50,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok ZŽ7 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 5,0 až 7,5; měří se roztok S.

Optická otáčivost (2.2.7). -0,10° až +0,10°; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 25 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí sejí na 100 ml.

Porovnávací roztok (a). 25 mg 8s-ipratropiumbromidu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 200 ml (roztok A). 1 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 100 ml.

Porovnávací roztok (b). 1 objemový díl zkoušeného roztoku se smíchá s dvěma objemovými díly roztoku A.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,125 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

• mobilní fáze, kterou je roztok obsahující 1,0 g methansulfonatu sodného R ve směsi 120 ml acetonitrilu R a 1000 ml kyseliny fosforečné 0,05 mol/l RS. Průtoková rychlost je 2 ml/min,

• spektrofotometrického detektoru, 210 nm.

Nastříkne se odděleně 20 μl každého roztoku a chromatogramy se zaznamenávají po dobu odpovídající 2násobku retenčního času hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha píku odpovídajícího 8s-ipratropiu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %); plocha žádného píku, kromě hlavního píku a píku odpovídajícího 8s-ipratropiu, není větší než polovina plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,25 %).

Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) rozlišení mezi píkem ipratropia a píkem 8,s-ipratropia je nejméně 1,5, jestliže faktor symetrie hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku je menší než 2,2 a jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) poměr signálu hlavního píku k šumu je nejméně 5.

Apo-ipratropium. Nejvýše 0,5 %. 0,14 g se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 100 ml. Změří se absorbance roztoku (2.2.25) při 246 nm (A 24) a 263 nm (A 26). Obsah apo-ipratropia v procentech se vypočítá podle vzorce:

A246A263 0,863 . 10 .

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 3,9 % až 4,4 %; stanoví se s 0,500 g zkoušené látky.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,350 g se rozpustí v 50 ml vody R, přidají se 3 ml kyseliny dusičné zředěné RS a titruje se dusičnanem stříbrným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS odpovídá 41,24 mg C20H30BrNO3.

Uchovávání

Venenum.

Nečistoty

A. (8s)-ipratropium,

B. apo-ipratropium.

† Isoconazoli nitras[image omitted]

Isokonazoliumnitrat

[image omitted]

C18H15Cl4N3O4	Mr 479,15	CAS 24168-96-5

Je to (RS)-1 -[2-(2,6-dichlorbenzyloxy)-2-(2,4-dichlorfenyl)ethyl]-1H-imidazoliumnitrat. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C18H15Cl4N3O4.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v methanolu, těžce rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

A. Teplota tání (2.2.14). 178 °C až 182 °C.

B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety isokonazoliumnitratu CRL.

C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného oktadecylsilanizovaného silikagelu.

Zkoušený roztok. 30 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

Porovnávací roztok (a). 30 mg isokonazoliumnitratu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

Porovnávací roztok (b). 30 mg isokonazoliumnitratu CRL a 30 mg ekonazoliumnitratu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů octanu amonného RS, dioxanu R a methanolu R (20 + 40 + 40) po dráze 15 cm. Vrstva se suší 15 min v proudu teplého vzduchu a potom se vystaví působení par jodu do vzniku skvrn. Pozoruje se v denním světle. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

D. Vyhovuje zkoušce na dusičnany (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,20 g se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 20,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž7 (2.2.2, Metoda II).

Optická otáčivost (2.2.7). -0,10° až +0,10°; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,100 g se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 2,5 mg isokonazoliumnitratu CRL a 2,5 mg ekonazoliumnitratu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí sejí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (3 μm),

• mobilní fáze, kterou je roztok obsahující 6,0 g octanu amonného R ve směsi 300 ml acetonitrilu R, 320 ml methanolu R a 380 ml vody R. Průtoková rychlost je 2 ml/min,

• spektrofotometrického detektoru, 235 nm.

Kolona sa ustaluje 30 min promýváním mobilní fází při průtokové rychlosti 2 ml/min.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku nebyla menší než 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy: ekonazolu asi 10 min a isokonazolu asi 14 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem ekonazolu a píkem isokonazolu není menší než 5,0. Je-li třeba, upraví se složení mobilní fáze.

Nastříkne se odděleně 10 μl zkoušeného roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku (b) a chromatogramy se zaznamenávají po dobu odpovídající 1,5násobku retenčního času hlavního píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,25 %); součet ploch všech píku, kromě hlavního píku, není větší než 2násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Nepřihlíží se k píkům rozpouštědla, dusičnanového iontu a k píkům s plochou menší než 0,2násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší 2 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,350 g se rozpustí v 75 ml směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R a 2-butanonu R (1 + 7) a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 47,91 mg ClgH15Cl4N3O4.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

[image omitted]