Decreto-Lei n.º 46-A/89 — Actualiza os anexos ao Decreto-Lei n.º 280-A/87, de 17 de Julho, relativo à classificação e rotulagem de substâncias…

A recombinação mitótica no Saccharomyces cerevisiae pode ser detectada ao nível intergénico (ou mais generalizadamente entre um gene e o seu centrómero) e ao nível intragénico. O primeiro caso denomina-se crossing-over mitótico e dá origem a trocas recíprocas, enquanto no segundo caso as trocas são não-recíprocas a maior parte das vezes, sendo este denominado conversão génica. O crossing-over é geralmente detectado pela produção de colónias ou de sectores recessivos homozigéticos a partir de uma estirpe hetrozigótica, enquanto a conversão génica é detectada pela produção de prototróficos revertidos duma estirpe auxotrófica heteroalélica contendo dois alelos defeituosos diferentes do mesmo gene. As estirpes mais correntemente utilizadas para detectar uma conversão génica mitótica são as D(índice 4) (heteroalélica para ade 2 e trp 5), D(índice 7) (heteroalélica para trp 5), BZ(índice 34) (heteroalélica para arg 4) e JDI (heteroalélica para his 4 e trp 5). O crossing-over mitótico, produzindo sectores homozigóticos de cor vermelha e rosa pode ser determinado com D(índice 5) ou D(índice 7) (que mede também a convervão génica mitótica e a mutação reversível para ilv 1 - 92), sendo estas duas estirpes heteroalélicas complementares para os alelos ade 2.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método do ensaio

Preparativos

As soluções das substâncias a testar assim como das substâncias de controlo ou de referência deverão ser preparadas imediatamente antes do ensaio, com a ajuda do veículo apropriado. No caso de substâncias orgânicas insolúveis na água deverão utilizar-se solventes orgânicos como o etanol, a acetona e o dimetilsulfóxido (DMSO), em concentrações não ultrapassando 2% v/v. A concentração final do veículo não deverá afectar de maneira significativa a viabilidade das células nem as características de crescimento.

Activação metabólica

As células serão expostas às substâncias a testar na presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica. O método mais frequentemente utilizado consiste na adição da fracção pós-mitocondrial preparada a partir de fígados de roedores tratados previamente com indutores enzimáticos e adicionada de cofactores. Podem também utilizar-se outras espécies, tecidos, fracções pós-mitocondriais ou métodos para activação metabólica.

Condições do ensaio

Estirpes de experiência

As estirpes mais frequentemente utilizadas são as diplóides D(índice 4), D(índice 5), D(índice 7) e JDI. Podem também ser apropriadas outras estirpes.

Meios

Utilizam-se os meios de cultura apropriados para determinar a taxa de sobrevida e a frequência de recombinações mitóticas.

Uso de controlos negativos e positivos

Deverão ser realizados simultaneamente controlos positivos, controlos não tratados e controlos com solvente. Serão utilizadas substâncias químicas apropriadas como controlos positivos para cada tipo específico de recombinação.

Concentrações de exposição

Deverão ser utilizadas pelo menos cinco concentrações convenientemente espaçadas da substância a testar. A citotoxicidade e a solubilidade são alguns dos factores a ter em consideração. A concentração mais fraca não deve ter qualquer efeito na viabilidade das células. No caso de produtos químicos tóxicos, a concentração máxima testada não deve diminuir a taxa de sobrevida abaixo de 5 a 10%. Os produtos químicos relativamente insolúveis na água serão testados até ao seu limite de solubilidade por métodos apropriados. No caso de produtos químicos não tóxicos, francamente solúveis na água, a concentração máxima testada será determinada caso a caso.

As células podem ser expostas às substâncias a testar em fase estacionária ou em fase de crescimento durante períodos de duração até 18 horas. No entanto, no caso de um tratamento de longa duração, as culturas serão examinadas ao microscópio para se detectar a formação de esporos, cuja presença tornará o teste nulo.

Condições de incubação

As placas serão incubadas no escuro a uma temperatura de 28 a 30ºC, durante quatro a sete dias. As placas utilizadas para a determinação dos sectores homozigóticos vermelho e rosa produzidos por crossing-over mitótico serão conservadas num refrigerador a (mais ou menos) 4ºC durante mais um a dois dias antes da contagem, de modo a que a pigmentação das colónias interessadas possa intensificar-se.

Frequência de recombinações mitóticas espontâneas

Deverão utilizar-se subculturas cujas frequências de recombinação mitótica se situarem dentro da gama admitida normalmente.

Número de placas

Deverão ser semeadas pelo menos três placas por concentração a fim de determinar a viabilidade bem como o número de prototróficos produzidos por conversão génica mitótica.

No caso de determinação da homozigotia recessiva produzida por crossing-over mitótico, o número de placas será aumentado para se obter um número de colónias adequado.

Procedimento

As estirpes de S. Cerevisiae são tratadas habitualmente no curso de um ensaio em meio líquido, implicando a utilização de células em fase estacionária ou de crescimento. A experiências iniciais deveriam ser efectuadas com células em crescimento. São expostas 1 - 5 x 10(elevado a 7) células/ml à substância a testar durante um período até 18 horas, à temperatura de 28 a 37ºC, agitando-se a mistura; deve adicionar-se uma quantidade adequada de um sistema de activação metabólica durante o tratamento. No fim do tratamento as células serão centrifugadas, lavadas e semeadas no meio de cultura adequado. Depois da incubação, as placas serão examinadas a fim de determinar a taxa de sobrevida e a indução de recombinação mitótica. Se a primeira experiência der resultados negativos deve realizar-se segunda, utilizando-se células em fase estacionária. Se a primeira experiência der resultados positivos, estes serão confirmados por uma experiência independente apropriada.

RESULTADOS

Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o número de colónias contadas, o número de recombinantes, a taxa de sobrevida e a frequência de recombinantes.

Todos os resultados deverão ser confirmados por uma experiência independente.

Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos adequados.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as informações seguintes:

• estirpe utilizada,

• condições do teste: células em fase estacionária ou em fase de crescimento, composição dos meios, temperatura e duração da incubação, sistema de activação metabólica,

• condições de tratamento: concentração de exposição, procedimento e duração do tratamento, temperatura do tratamento, controlos positivos e negativos,

• número de colónias contadas, número de recombinantes, taxa de sobrevida e frequência de recombinação, relação dose/reposta se possível, avaliação estatística dos resultados,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

CÉLULAS DE MAMÍFERO IN VITRO - TESTE DE MUTAÇÃO GÉNICA

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substância de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

Os sistemas de cultura de células de mamíferos podem ser utilizadas para detectar mutações induzidas por substâncias químicas. Entre as linhas celulares mais utilizadas contam-se as células de linfoma do ratinho L 5178 Y e as linhas celulares CHO e V-79 de hamster chinês.

Nestas linhas celulares os sistemas mais frequentemente utilizados medem as mutações nos loci da rimidinacinase (TK), da hipoxantina guanina-fosforibosil transferase (HPRT) (ver nota 1) e da Na(elevado a +)/k(elevado a +) ATPase. Os sistemas de mutação TK e HPRT detectam mutações de pares de bases, mutações por ultrapassagem do quadro de leitura do código genético (frameshift mutations) bem como pequenas delecções; o sistema Na(elevado a +)/K(elevado a +) detecta unicamente mutações de pares de bases.

As células deficientes em timidina cinase devido à mutação forward (forward mutation) TK(elevado a +) - TK(elevado a -) são resistentes à bromodesoxiuridina (BrdU), à fluorodesoxiuridina (FdU) ou à trifluorotimidina (TFT) uma vez que estes antimetabolitos não são incorporados nos nucleótidos celulares pela timidina cinase do sistema enzimático de «SOS»; os nucleótidos necessários ao metabolismo celular são unicamente obtidos a partir de uma síntese de novo. No entanto, em presença da timidina cinase a BrdU, FdU ou a TFT são incorporados nos nucleótidos, o que provoca uma inibição do metabolismo celular e consequente citotoxicidade. As células mutantes estão portanto aptas a proliferar na presença de BrdU, FdU ou TFT, ao contrário das células normais que possuem a timidina cinase. Do mesmo modo as células deficientes em HPRT são seleccionadas pela resistência à 8-azaguanina (AG) ou à 6-tioguanina (TG). As células que têm uma Na(elevado a +)/K(elevado a +) ATPase alterada são seleccionadas pela resistência à ouabaína.

A citotoxicidade determina-se medindo o efeito da substância a testar sobre a capacidade de formar colónias (eficácia de cloning) ou pela taxa de crescimento das culturas. Determina-se a frequência dos mutantes semeando um número conhecido de células num meio contendo o agente selectivo para se detectar as células mutantes e num meio não contendo o agente selectivo para se determinar as células sobreviventes. Depois de um período de incubação adequado contam-se as colónias. As frequências de mutantes calculam-se a partir do número de colónias mutantes com a correcção relativa à taxa de sobrevida celular.

(nota 1) Anteriormente HGPRT

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Células

Podem ser utilizadas diversas linhas celulares neste ensaio nomeadamente os sub-clones de L 5178Y, células CHO ou V-79 tendo uma sensibilidade demonstrada aos mutagénios químicos, uma grande eficácia de cloning, e uma baixa frequência de mutações espontâneas. As células podem ser examinadas periodicamente para verificar a estabilidade do cariotipo e deverá ser pesquisada a contaminação por Mycoplasma. Podem utilizar-se outros tipos celulares desde que a sua validade como reveladores de mutações génicas por via química seja devidamente comprovada.

Meio

Deverão utilizar-se meios de cultura e condições de incubação adequadas (por exemplo: temperatura, material de cultura de células, concentrações de CO(índice 2) e humidade). Devem escolher-se os meios e os soros em função dos sistemas de selecção e do tipo de células utilizadas no estudo.

Substâncias a testar

As substâncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura ou dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados antes de proceder ao tratamento das células. A concentração final do veículo no meio de cultura não deverá afectar nem a viabilidade das células nem a taxa de crescimento.

Activação metabólica

As células serão expostas à substância a testar em presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica de mamífero. Se se utilizarem tipos celulares com actividade metabólica intrínseca, a natureza e a taxa dessa actividade devem ser comprovadamente adequadas à classe química da substância testada.

Condições do ensaio

Uso de controlos negativos e positivos

Devem ser incluídos em cada experiência controlos positivos utilizando uma substância com acção directa e uma substância que necessite de uma activação metabólica; deve também ser utilizado um controlo negativo (veículo).

Poderão ser utilizadas como controlos positivos as substâncias abaixo indicadas:

• substâncias com acção directa:

• etilmetanosulfonato,

• hicantona;

• substâncias com acção indirecta:

• 2- acetilaminofluoreno,

• 7,12-dimetil benzantraceno,

• N-nitrosodimetilamina.

Sempre que justificado deve ser incluído um controlo positivo suplementar, pertencendo à mesma classe química da substância a testar.

Concentrações de exposição

Serão utilizadas várias concentrações da substância a testar. Estas concentrações deverão produzir um efeito tóxico dependente da concentração: a máxima provocando uma taxa de sobrevida baixa, a mínima provocando uma taxa de sobrevida semelhante à provocada pelo controlo negativo. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade com métodos apropriados. Para as substâncias não tóxicas francamente solúveis na água a concentração máxima da substância a testar deverá ser determinada caso a caso.

Procedimento

O número de células usadas por cultura deverá estar relacionado com a frequência de mutações espontâneas; a regra geral consiste em utilizar um número de células viáveis igual a dez vezes o inverso da frequência de mutações espontâneas.

As células serão expostas durante um período de tempo adequado, sendo suficiente na maior parte dos casos um período de duas a cinco horas. As células com actividade metabólica intrínseca suficiente deverão ser expostas à substância a testar em presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado. No fim do período de exposição as células serão lavadas de forma a eliminar a substânia a testar e depois cultivadas para determinação da viabilidade e para permitir a expressão do fenótipo mutante.

No fim do período de expressão, que deverá ser suficientemente longo para permitir uma expressão fenotípica quase-óptima dos mutantes induzidos, as células serão cultivadas em meios contendo e não contendo agentes selectivos, para determinação do número de mutantes e da viabilidade.

Todos os resultados serão confirmados por uma experiência independente.

Os resultados deverão ser apresentados em quadros. As contagens de indução de mutações e de sobrevida por placa deverão ser apresentadas relativamente à substância a testar e aos controlos. Devem também ser indicados o número médio de colónias por placa assim como o desvio-padrão. A frequência de mutações deverá ser expressa em número de mutantes por número de células sobreviventes. A taxa de sobrevida e as eficácias de cloning serão expressas em percentagem da taxa de controlo.

Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos apropriados.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deve incluir as informações seguintes:

• linha celular usada, número de culturas de células, métodos de manutenção das culturas,

• condições do teste: composição dos meios, concentração de CO(índice 2), concentração da substância a testar, veículo utilizado, temperatura de incubação, tempo de incubação, duração do período de expressão (incluindo o número de células semeado), subculturas e esquema de nutrição (se necessário), duração do tratamento, densidade celular durante o tratamento, tipo de sistema de activação metabólica utilizado, controlos positivos e negativos, agente selectivo utilizado,

• justificação da escolha das doses,

• método utilizado para a contagem das células viáveis e mutantes,

• avaliação estatística,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

LESÃO E REPARAÇÃO DO ADN - SÍNTESE NÃO PROGRAMADA - CÉLULAS DE MAMÍFERO IN VITRO

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

O Teste de Síntese Não-Programada de ADN (Unscheduled DNA Synthesis-UDS) mede a síntese de ADN para reparação após excisão e remoção de um fragmento de ADN contendo uma região de lesão induzida por agentes químicos e físicos. O teste baseia-se na incorporação da timidina marcada com trítio ((elevado a 3)H-TdR) no ADN de células de mamífero não se encontrando na fase S do ciclo celular. Pode determinar-se a incorporação de (elevado a 3)H-TdR examinando o ADN proveniente das células tratadas por auto-radiografia ou por contagem de cintilação em meio líquido (LSC-Liquid Scintilation Counting).

As células de mamífero em cultura, com a excepção dos hepatócitos primários de rato, são tratadas com a substância a testar em presença e na ausência dum sistema exógeno de activação metabólica. A UDS pode também ser medida por métodos in vivo.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

As substâncias a testar, bem como as de controlo ou de referência serão preparadas no meio de cultura, dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados, sendo depois diluídas em meio de cultura, antes de utilizadas no ensaio. A concentração final não deverá afectar a viabilidade celular.

Podem ser utilizadas neste ensaio culturas primárias de hepatócitos de rato, linfócitos humanos ou linhas celulares estabelecidas (por exemplo: fibrobiastos humanos diplóides).

As células serão expostas à substância a testar em presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado.

Condições experimentais

Número de culturas

São necessárias para cada ponto experimental, pelo menos duas culturas celulares para a auto-radiografia e seis culturas celulares (ou menos se tal se justificar tecnicamente) para a contagem de cintilação em meio líquido.

Uso de controlos negativos e positivos

Deverão ser incluídos em cada experiência controlos simultâneos (não tratados e/ou veículo) com e sem activação metabólica. Para o ensaio com hepatócitos de rato, por exemplo, pode utilizar-se como controlo positivo o 7,12 DMBA (7,12-dimetil benzantraceno) ou o 2-AAF (2-acetilaminofluoreno). No caso de linhas celulares estabelecidas, em ensaios com auto-radiografia ou LSC realizados sem activação metabólica, pode utilizar-se como controlo o 4-NQO (4-nitroquinolina N-óxido); quando se tiver recorrido a sistemas de activação metabólica, a N-dimetil-nitrosamina é um dos compostos utilizáveis como controlo positivo.

Concentrações de exposição

Deverá utilizar-se uma gama de concentrações da substância a testar, para permitir uma boa determinação da resposta. A concentração máxima deverá produzir alguns efeitos citotóxicos. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade. No que respeita às substâncias não tóxicas francamente solúveis na água, a concentração máxima a testar deverá ser determinada caso a caso.

Células

Para a manutenção das culturas recorrer-se-á a meios de cultura, a uma concentração de CO(índice 2), a uma temperatura e humidade apropriados. As linhas celulares estabelecidas deverão ser examinadas periodicamente para detectar uma contaminação por Mycoplasma.

Activação metabólica

Não se utiliza nenhum sistema de activação metabólica nas culturas primárias de hepatócitos.

As linhas celulares estabelecidas e os linfócitos são expostos à substância a testar em presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado.

Procedimentos

Preparação das culturas

As linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas «mãe» (por exemplo: por tripsinização ou por agitação) são semeadas em recipientes de cultura numa densidade adequada e incubada a 37ºC.

As culturas de pouca duração de hepatócitos de rato são estabelecidas permitindo que os hepatócitos recentemente dissociados num meio apropriado possam aderir à superfície de crescimento.

As culturas de linfócitos humanos são realizadas com técnicas apropriadas.

Tratamento das culturas com substância a testar

Hepatócitos primários de rato

Tratam-se hepatócitos primários de rato, isolados recentemente, com a substância a testar no meio contendo (elevado a 3)H-TdR, durante um período de tempo adequado. No fim do período de tratamento o meio será eliminado, as células lavadas, fixadas e secadas. As lâminas são mergulhadas numa emulsão de auto-radiografia [em alternativa pode usar-se uma película fotográfica (stripping film)] passando depois à exposição, revelação, coloração e contagem.

Linhas celulares estabelecidas e linfócitos

Técnicas auto-radiográficas: Expõem-se as culturas celulares à substância a testar durante períodos de tempo adequados, sendo tratadas em seguida com a (elevado a 3)H-TdR. A duração da exposição será função da natureza da substância, da actividade do sistema metabólico e do tipo das células. Para detectar o pico da UDS, deverá acrescentar-se a (elevado a 3)H-TdR, seja ao mesmo tempo que a substância a testar, seja nos minutos que se seguem à exposição à substância a testar. A escolha entre estas duas técnicas será determinada por eventuais interacções entre a substância testada e a (elevado a 3)H-TdR. Para se poder fazer a distinção entre a UDS e a replicação semiconservativa do ADN pode inibir-se esta última utilizando-se, por exemplo, um meio deficiente em arginina, um baixo teor de sódio ou acrescentando-se hidroxiureia ao meio de cultura.

Medição LSC de UDS: Antes de proceder ao tratamento com a substância a testar, bloqueia-se a entrada das células na fase S da forma descrita acima; expõem-se em seguida as células à substância a testar, como descrito para a auto-radiografia. No fim do período de incubação extrai-se o ADN das células e determina-se a quantidade total de ADN bem como a quantidade de (elevado a 3)H-TdR incorporada.

É preciso notar que, se forem utilizados linfócitos humanos, não é necessário suprimir a replicação semiconservativa do ADN nas culturas não estimuladas.

Análise

Determinações auto-radiográficas

Para determinar a UDS nas células em células em cultura não se contam os núcleos em fase -S. Deverão contar-se pelo menos 50 células por concentração. As lâminas serão codificadas antes da contagem. Em cada lâmina serão contados vários campos escolhidos ao acaso, suficientemente afastados uns dos outros. Determinar-se-á a quantidade de (elevado a 3)H-TdR incorporado no citoplasma contando-se três superfícies do tamanho do núcleo no citoplasma de cada célula contada.

Determinação LSC

Nas determinações LSC-UDS deveria utilizar-se um número adequado de culturas para cada concentração e para os controlos.

Todos os resultados serão confirmados por experiências independentes.

O resultados deverão ser apresentados sob a forma de quadros.

2.1. Determinações auto-radiográficas

A quantidade de (elevado a 3)H-TdR incorporada no citoplasma, bem como o número de grãos contados por núcleo celular, serão registados separadamente.

A média, a mediana e a moda podem ser utilizadas para descrever a distribuição da quantidade de (elevado a 3)H-TdR incorporado no citoplasma, bem como o número de grãos por núcleo.

2.2. Determinação LSC

Para as determinações LSC a incorporação de (elevado a 3)H-TdR deverá ser indicada sob a forma dpm/ug do ADN. Pode utilizar-se a média dos dpm/ug do ADN com o seu desvio-padrão para descrever a distribuição da incorporação.

Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos apropriados.

3.1. Relatório

O relatório deverá conter as seguintes informações:

• células utilizadas, densidade e número de passagens na ocasião do tratamento, número de culturas celulares,

• métodos utilizados na manutenção das culturas, incluindo o meio, a temperatura e a concentração de CO(índice 2),

• substância a testar, veículo, concentrações e justificação da escolha das concentrações usadas no teste,

• pormenores relativos aos sistemas da activação metabólica,

• esquema do tratamento,

• controlos positivos e negativos,

• técnica de auto-radiografia utilizada,

• métodos utilizados para bloquear a entrada das células na fase 5,

• técnicas utilizadas para extracção do ADN e determinação da quantidade total de ADN nas determinações LSC,

• relação dose/resposta, se possível,

• avaliação estatística,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TESTE IN VITRO DE TROCA ENTRE CROMÁTIDES DO MESMO CROMOSSOMA

(Sister Chromatid Exchange - SCE)

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

O ensaio de troca entre cromátides do mesmo cromossoma (SCE) constitui um teste de curto prazo, que se destina a detectar as trocas recíprocas de ADN entre as cromátides de um mesmo cromossoma em duplicação. As SCEs representam a troca recíproca de produtos de replicação do ADN em loci aparentemente homólogos. O processo de troca implica provavelmente uma cisão e uma fusão do ADN, apesar de sabermos pouco acerca da sua base molecular. Para detectar as SCEs é necessário poder marcar separadamente as cromátides do mesmo cromossoma; isto é possível pela incorporação da bromodesoxiuridina (BrdU) no ADN cromossómico durante dois ciclos celulares.

As células de mamífero in vitro são expostas à substância a testar na presença e na ausência dum sistema exógeno de activação metabólica de mamífero, se for caso disso, e colocadas num meio de cultura contendo (BrdU) durante dois ciclos de replicação. Após tratamento com um inibidor do fuso (por exemplo: colchicina) a fim de acumular as células numa fase da mitose metafase-like (c-metafase) recolhem-se as células e fazem-se preparações de cromossomas.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

• podem ser utilizadas no ensaio culturas primárias.(linfócitos humanos) ou linhas celulares estabelecidas (por exemplo: células de ovário de hamster chinês). As linhas celulares deverão ser examinadas para detectar uma eventual contaminação por Mycoplasma,

• serão utilizados meios de cultura e condições de incubação adequados (por exemplo: temperatura, recipientes de cultura, concentração em CO(índice 2) e humidade),

• as substâncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados antes de proceder ao tratamento das células. A concentração final do veículo no meio de cultura não deverá afectar nem a viabilidade das células nem a taxa de crescimento, e os efeitos sobre a frequência de SCEs serão verificados por meio de um solvente de controlo,

• as células serão expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica de mamífero. Quando se utilizarem tipos celulares com actividade metabólica intrínseca, a taxa e a natureza dessa actividade deverão ser adequadas à classe química testada.

Condições experimentais

Número de culturas

Serão utilizadas pelo menos duas culturas separadas para cada ponto experimental.

Utilização de controlos negativos e positivos

Deverão ser incluídos em cada experiência controlos positivos utilizando uma substância com acção directa e uma substância necessitando de activação metabólica; deverá também utilizar-se um controlo para o veículo.

As substâncias seguintes podem, por exemplo, ser utilizadas como controlos positivos:

• substância com acção directa:

• etilmetanosulfonato de etilo,

• substância com acção indirecta:

• ciclofosfamida.

Se for caso disso, pode incluir-se um controlo positivo suplementar pertencendo à mesma classe química da substância a testar.

Concentração de exposição

Deveriam ser utilizadas pelo menos três concentrações da substância a testar, convenientemente espaçadas. A concentração máxima deverá produzir um efeito tóxico significativo mas permitindo ainda uma replicação celular adequada. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade com métodos apropriados. No caso de substâncias não tóxicas francamente solúveis na água a concentração máxima da substância a testar deverá ser determinada caso a caso.

Procedimento

Preparação das culturas

Utilizam-se linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas «mãe» (por exemplo, por tripsinização ou por agitação), semeadas em recipientes de cultura, numa densidade adequada e incubadas a 37ºC. No caso de culturas em monocamada, o número de células por recipiente deveria ser ajustado de forma a que as culturas não estejam confluentes a mais de 50% no momento da colheita. As células podem também ser utilizadas na forma de cultura em suspensão. As culturas de linfócitos humanos são preparadas a partir de sangue heparinizado utilizando técnicas apropriadas e incubadas a 37ºC.

Tratamento

São expostas à substância a testar células em fase exponencial de crescimento, durante um lapso de tempo adequado; na maior parte dos casos uma a duas horas podem ser suficientes, mas, nalguns casos, o tratamento pode ser prolongado para cobrir até dois ciclos celulares completos.

As células que não tiverem actividade metabólica intrínseca suficiente deverão ser expostas à substância a testar na presença e na ausência dum sistema de activação metabólica apropriado. No fim do período de exposição, as células são lavadas de forma a eliminar a substância testada, e depois cultivadas na presença de BrdU durante dois ciclos de replicação. Um outro método consiste na exposição simultânea das células à substância testada e à BrdU durante dois ciclos celulares completos.

As culturas de linfócitos humanos são tratados enquanto se encontrarem num estado de semi-sincronização.

As células são analisadas no decurso da segunda divisão após tratamento, garantindo assim a exposição das fases mais sensíveis de ciclo celular à substância a testar. Todas as culturas a que se adicionou BrdU serão manipuladas na obscuridade ou com pouca iluminação proveniente de lâmpadas incandescentes até ao momento da colheita das células, para reduzir a fotólise do ADN contendo BrdU.

Colheita das células

As culturas de células são tratadas com um inibidor do fuso (por exemplo: colchicina) uma a quatro horas antes da colheita. Cada cultura é colhida e processada separadamente para a preparação dos cromossomas.

Preparação dos cromossomas e coloração

As preparações de cromossomas são feitas com métodos standard de citogenética. Podem utilizar-se várias técnicas para corar as lâminas de forma a pôr em evidência as SCEs (por exemplo: o método por fluorescência mais Giemsa).

Análise

O número de células analisado será em função da frequência espontânea controlo de SCE. Habitualmente analisam-se pelo menos 25 metafases de boa qualidade, por cultura, para contar as SCEs. As lâminas são codificadas antes da análise. Para os linfócitos humanos apenas são analisadas as metafases contendo 46 centrómeros. Para as linhas celulares estabelecidas, apenas são analisadas as metafases com (mais ou menos) 2 centrómeros que o número modal. Deverá ser precisado se uma inversão de coloração ao nível do centrómero é ou não considerada como SCE. Os resultados serão confirmados por uma experiência independente.

Os resultados deverão ser apresentados em quadros. O número de SCEs por metafase e o número de SCEs por cromossoma são dados separadamente para todas as culturas, tratadas e controlos.

Os resultados serão analisados com métodos estatísticos adequados.

3.1. Relatório do teste

O relatório deveria conter as informações seguintes:

• células utilizadas, métodos de manutenção da cultura celular,

• condições experimentais: composição de meios, concentração de CO(índice 2), concentração da substância a testar, veículo utilizado, temperatura de incubação, tempo de tratamento, inibidor do fuso utilizado, concentração e duração do tratamento com este, tipo de sistema de activação de mamífero utilizado, controlos positivos e negativos,

• número de culturas celulares por ponto experimental,

• pormenores relativos à técnica utilizada na preparação das lâminas,

• número de metafases analisadas (resultados indicados separadamente para cada cultura),

• número médio de SCEs por célula e por cromossoma (resultados indicados separadamente para cada cultura),

• critério de contagem de SCEs,

• justificação, da escolha das doses,

• relação dose/resposta, se possível,

• avaliação estatística,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TESTE DE LETALIDADE RECESSIVA LIGADA AO SEXO NA DROSOPHILA MELANOGASTER

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

O teste de letalidade recessiva ligada ao sexo (SLRL - Sex Linked Recessive Letal Test) utilizando a Drosophila melanogaster detecta a ocorrência de mutações - mutações pontuais bem como pequenas delecções - na linha germinal do insecto. Esta prova é um ensaio de mutação forward capaz de detectar mutações em cerca de 800 loci do cromossoma X, o que representa cerca de 80% de todos os loci deste cromossoma. O cromossoma X representa cerca de um quinto do genoma haplóide completo.

As mutações do cromossoma X de Drosophila melanogaster são expressas fenotipicamente nos machos portadores do gene mutante. Quando a mutação é letal no estado hemizigótico, a sua presença é deduzida a partir da ausência de um dos grupos de descendência masculina, em vez dos dois habitualmente produzidos por uma fêmea heterozigótica. O SLRL baseia-se nestes factos, utilizando cromossomas especificamente marcados e com rearranjos da sua estrutura.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Stocks

Podem ser utilizados machos dum stock de tipo selvagem bem definido e fêmeas do stock Muller-5. Podem também ser utilizados outros stocks de fêmeas marcadas adequadamente, com cromossomas X invertidos de forma múltipla.

Substância a testar

As substâncias a testar devem ser dissolvidas em água. As substâncias insolúveis na água podem ser dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados (por exemplo: uma mistura de etanol com Tween-60 ou 80) sendo depois diluídas em água ou numa solução salina antes da administração. Deve evitar-se como veículo o dimetilsulfóxido (DMSO).

Número de animais

O teste deve ser concebido com uma sensibilidade e grau de significância pré-estabelecido. A frequência de mutantes espontâneos observada no grupo de controlo irá influenciar fortemente o número de cromossomas tratados que devem ser analisados.

Via de administração

A administração pode ser oral, por injecção ou por exposição a gases ou vapores. A ingestão da substância testada pode ser feita por intermédio duma solução açucarada. Se necessário as substâncias podem ser dissolvidas numa solução de NaCL a 0,7% e injectadas no tórax ou no abdómen.

Uso de controlos negativos e positivos

Devem ser incluídos controlos negativos (veículo) e positivos. No entanto, se existirem dados apropriados de experiências anteriores, não são necessários controlos simultâneos.

Níveis de exposição

Devem utilizar-se três níveis de exposição. Para uma avaliação preliminar pode utilizar-se apenas uma única concentração da substância testada, podendo essa ser a concentração máxima tolerada ou a concentração produzindo alguns sinais de toxicidade. No caso de substâncias não tóxicas deverá utilizar-se a concentração máxima praticável.

Procedimento

Tratam-se com a substância a testar machos de fenótipo selvagem (com três a cinco dias de idade) sendo acasalados individualmente a um maior número de fêmeas virgens do stock Muller-5 ou outro stock marcado de forma apropriada (com cromossomas X invertidos de forma múltipla). Estas fêmeas serão substituídas de dois em dois ou de três em três dias por outras fêmeas virgens para se cobrir o ciclo germinal completo. A descendência destas fêmeas é examinada para detectar os efeitos sobre o esperma maduro, as espermátides em estádios precoces, intermédios ou tardios, os espermatócitos e as espermatogónias na ocasião do tratamento.

As fêmeas F(índice 1) heterozigóticas provenientes dos cruzamentos mencionados acima são acasaladas individualmente (isto é, um fêmea por frasco de experiência) com os seus irmãos. Na geração F(índice 2) examina-se cada cultura para detectar a ausência de machos do tipo selvagem. Se uma cultura revelar ser proveniente de uma fêmea F(índice 1) portadora de um gene letal no cromossoma X paterno (isto é, quando não se observar nenhum macho portador do cromossoma tratado) devem testar-se as filhas dessa fêmea com o mesmo genótipo, para verificar se a letalidade se repete na geração seguinte.

Os resultados devem ser apresentados em quadros indicando o número de cromossomas X tratados, o número de machos não férteis e o número de cromossomas letais poer cada concentração de exposição e por cada período de acasalamento para cada macho tratado. O número de agregados de diferentes dimensões deverá ser indicado. Estes resultados deverão ser confirmados por uma experiência separada.

Deverão ser utilizados métodos estatísticos apropriados na avaliação dos testes de letalidade recessiva ligada ao sexo. O reagrupamento de genes letais recessivos provenientes dum único macho deverá ser considerado e avaliado com um método estatístico apropriado.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

• stock: stocks ou estirpes de Drosophila utilizados, idade dos insectos, número de machos tratados, número de machos estéreis, número de culturas F(índice 2) estabelecidas, número de cromossomas portadores dum gene letal detectado em cada estádio das células germinais,

• critérios aplicados para determinar as dimensões dos grupos tratados,

• condições experimentais: descrição pormenorizada do esquema de tratamento e de amostragem, níveis de exposição, dados sobre a toxicidade, controlos negativos (solvente) e positivos se necessário,

• critérios aplicados na contagem das mutações letais,

• relação exposição/efeito, se possível, e avaliação estatística dos resultados,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TESTES DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS DE MAMÍFERO IN VITRO

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

Podem utilizar-se sistemas de cultura de células de mamífero para detectar in vitro alterações do fenótipo induzidas por substâncias químicas associadas com uma transformação maligna in vivo. Entre as culturas mais frequentemente utilizadas contam-se as C3H1OT 1/2, 3T3, SHE, rato Fischer; os testes baseiam-se nas alterações da morfologia celular, formação de ninhos celulares ou alterações ligadas à necessidade de ancoragem a um agar semi-sólido. Existem outros sistemas menos frequentemente utilizados que detectam outras alterações fisiológicas ou morfológicas nas células depois de uma exposição a carcinogénios químicos. Nenhum dos fenómenos finais destes testes in vitro apresenta uma relação mecanicista estabelecida com o cancro. Alguns dos sistemas de testes são capazes de detectar promotores de tumores. Pode determinar-se a citotoxicidade medindo o efeito da substância a testar sobre a capacidade para formar uma colónia (eficácia de cloning) ou ainda sobre as taxas de crescimento das culturas. A medição da citotoxicidade tem por fim determinar se a exposição da substância testada foi toxicologicamente significativa mas não pode servir para calcular a frequência das transformações em todas as provas uma vez que algumas destas podem implicar uma incubação prolongada e/ou uma nova passagem.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Células

Podem ser utilizadas várias linhas celulares ou células primárias, dependendo do teste de transformação utilizado. O investigador deve assegurar-se de que as células do teste efectuado apresentam a alteração fenotípica adequada depois da exposição a carcinogénios conhecidos e que a validade e fiabilidade do teste efectuado no seu laboratório sejam comprovadas e documentadas.

Meio

Deverão utilizar-se meios e condições de ensaio adequados ao teste de transformação utilizado.

Substância a testar

As substâncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, e dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados antes do tratamento das células. A concentração final do veículo no sistema de cultura não deve afectar a viabilidade celular nem a taxa de crescimento, nem a incidência de transformações.

Activação metabólica

As células deverão ser expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica adequado. Alternativamente, quando se utilizar tipos de células com actividade metabólica intrínseca, a natureza dessa actividade será comprovadamente apropriada à classe química testada.

Condições do ensaio

Utilização de controlos positivos e negativos

Serão incluídos em cada experiência controlos positivos utilizando uma substância com acção directa e uma substância necessitando de activação metabólica; utilizar-se-á igualmente um controlo negativo (veículo).

Podem ser utilizadas como controlos positivos as seguintes substâncias:

• substâncias químicas com acção directa.

• etilmetanosulfonato,

• (beta) - propiolactona,

• substâncias necessitando de activação metabólica:

• 2 - acetilaminofluoreno,

• 4 - dimetilaminobenzeno,

• 7,12 - dimetilbenzantraceno.

Deverá ser incluído, quando justificado, um controlo positivo suplementar pertencendo à mesma classe química que a substância testada.

Concentrações de exposição

Deverão ser utilizadas várias concentrações das substâncias a testar. Estas concentrações deverão produzir um efeito tóxico dependente da concentração; a concentração máxima deverá produzir uma baixa taxa de sobrevivência, a concentração mínima uma taxa de sobrevivência próxima da observada nos controlos negativos. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade com métodos apropriados. No caso de substâncias não tóxicas, francamente solúveis na água, a concentração máxima deverá ser determinada caso a caso.

Procedimento

As células serão expostas durante um período de tempo dependente do sistema celular utilizado, que pode implicar um novo tratamento acompanhado de mudança de meio (e se necessário uma nova mistura de activação metabólica) se a exposição for prolongada. As células que não tenham actividade metabólica intrínseca suficiente deverão ser expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado. No fim do período de exposição, as células são lavadas de forma a eliminar a substância testada e cultivadas em condições que permitam o aparecimento do fenótipo transformado em estudo sendo então determinada a incidência desta transformação. Todos os resultados deverão ser confirmados por uma experiência independente.

Os resultados deverão ser apresentados em quadros e podem ser apresentados de várias formas consoante o método utilizado, por exemplo, contagem por placa, placas positivas ou número de células transformadas. Quando apropriado, a sobrevivência será expressa em percentagem das taxas de controlo e a frequência de transformação corresponderá ao número de células transformadas por número de sobreviventes. Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos apropriados.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

• tipo de célula utilizada, número de culturas de células, métodos de manutenção das culturas de células,

• condições do teste: concentração da substância a testar, veículo usado, tempo de incubação, duração e frequência do tratamento, densidade celular durante o tratamento, tipo de sistema exógeno de activação metabólica utilizado, controlos positivos e negativos, especificação do fenótipo estudado, sistema selectivo usado (se apropriado); justificação da escolha das doses,

• método utilizado para contar as células viáveis e as transformadas;

• avaliação estatística,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TESTE DE LETALIDADE DOMINANTE NO ROEDOR

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

A letalidade dominante provoca a morte do embrião ou do feto. A indução de letalidade dominante por exposição a uma substância química indica que a substância afectou o tecido germinal da espécie estudada. Admite-se geralmente que a letalidade dominante é devida a uma lesão cromossómica (alterações estruturais e numéricas). No caso dos animais tratados serem fêmeas a morte do embrião pode também ser devida a efeitos tóxicos.

Em geral, os machos são expostos à substância a testar e acasalados com fémeas virgens não tratadas. Os diferentes estádios das células germinais podem ser testados separadamente utilizando-se períodos de acasalamento sequenciais. O aumento do número de implantes mortos por fêmea no grupo tratado em relação ao número de implantes mortos por fêmea no grupo de controlo reflecte as perdas após a implantação. As perdas antes da implantação podem ser calculadas por contagem dos corpos amarelos ou comparando o número total de implantes por fêmea no grupo tratado e no grupo de controlo. O efeito total de letalidade dominante é igual à soma das perdas antes e depois da implantação. O cálculo do efeito total da letalidade dominante baseia-se na comparação entre o número de implantes vivos por fêmea no grupo tratado e o registado no grupo de controlo. Uma diminuição do número dos implantes em determinados intervalos pode ser devida à destruição das células (isto é, de espermatócitos e/ou espermatogónias).

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Quando for possível, as substâncias a testar serão dissolvidas ou colocadas em suspensão numa solução salina isotónica. As substâncias químicas insolúveis na água podem ser dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados. O veículo utilizado não deverá interferir com a substância a testar nem deverá produzir efeitos tóxicos. Serão utilizadas preparações frescas da substância a testar.

Condições experimentais

Via de administração

A substância a testar deverá ser administrada uma única vez. Pode ser utilizado um programa de tratamento repetido em função das informações toxicológicas disponíveis. As vias de administração habituais são a intubação oral ou a injecção interperitoneal. Podem ser adequadas outras vias de administração.

Animais de experiência

Recomenda-se a utilização de ratos ou ratinhos. Repartem-se ao acaso entre os grupos tratados e de controlo animais jovens e sãos tendo atingido a plena maturidade sexual.

Número e sexo

Utiliza-se um número adequado de machos tratados, tendo em conta a frequência espontânea da característica biológica que está a ser avaliada. O número escolhido deverá basear-se numa sensibilidade de detecção e grau de significação pré-estabelecidos. Por exemplo, num teste típico, o número de machos escolhido para cada grupo de dose deverá ser suficientemente grande para obter 30 a 50 fêmeas grávidas por período de acasalamento.

Utilização de controlos negativos e positivos

Deverão ser incluídos em cada experiência controlos positivos e negativos (veículos) sendo geralmente simultâneos. Se experiências recentes efectuadas no mesmo laboratório tiverem dado resultados aceitáveis com os controlos positivos, estes resultados poderão ser utilizados em vez dum controlo positivo simultâneo. No que respeita às substâncias de controlo positivo deverá utilizar-se uma dose baixa apropriada (por exemplo MMS, intraperitonealmente, 10 mg/kg) para demonstrar a sensibilidade do teste.

Doses

Normalmente usam-se três níveis de dose diferentes. A dose máxima deverá produzir sinais de toxicidade ou reduzir a fecundidade dos animais tratados. Em alguns casos pode ser suficiente uma única dose elevada.

Ensaio limite

As substâncias não tóxicas são testadas à razão de 5 g/kg no caso de administração única e de 1 g/kg/dia no caso de administração repetida.

Procedimento

Vários esquemas de tratamento são possíveis. O método mais frequente é o da administração única. Podem utilizar-se outros esquemas de tratamento.

Cada macho é acasalado sequencialmente com uma ou duas fêmeas virgens não tratadas, a intervalos de tempo apropriados após o tratamento. As fêmeas deverão ser deixadas com os machos durante pelo menos um ciclo completo do estro, ou até que o acasalamento seja comprovado pela presença de esperma na vagina ou pela presença de um rolhão vaginal.

O número de acasalamentos após tratamento é determinado pelo esquema de tratamento e deverá assegurar que sejam testados todos os estádios das células germinais tratadas.

As fêmeas são sacrificadas durante a segunda metade da gestação e o conteúdo do útero é examinado para determinação do número de implantes vivos e mortos. Os ovários podem ser examinados para determinar o número de corpos amarelos.

Os resultados deverão ser apresentados em quadros, indicando o número de machos, o número de fêmeas grávidas bem como o número de fêmeas não grávidas. Os resultados de cada acasalamento incluindo a identidade de cada macho e de cada fêmea são apresentados separadamente. Serão descritos para cada fêmea a semana de acasalamento e a dose recebida pelos machos, bem como a frequência dos implantes vivos e mortos.

O cálculo do efeito total de letalidade dominante baseia-se numa comparação do número de implantes vivos por fêmea no grupo tratado com o número de implantes vivos por fêmea no grupo de controlo. Compara-se a relação implantes vivos/ mortos no grupo tratado com a mesma relação no grupo de controlo para indicação das perdas pós-implantação.

Se os resultados forem registados sob a forma de mortalidades precoces e mortalidades tardias, os quadros deverão tornar clara essa diferença. Se for avaliada a perda anterior à implantação, devem apresentar-se os resultados. Esta perda pode ser calculada como a discrepância entre o número de corpos amarelos e o número de implantes ou como a diminuição do número médio de implantes por fêmea em relação ao dos acasalamentos de controlo. Os resultados serão avaliados com métodos estatísticos apropriados.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as informações seguintes:

• espécies, estirpe, idade e peso dos animais utilizados, número de animais de cada sexo nos grupos tratados e de controlo,

• substância a testar, veículo, doses testadas e justificação da escolha das doses, controlos negativos e positivos, dados relativos à toxicidade,

• via de administração e esquema do tratamento,

• esquema de acasalamento,

• método utilizado para comprovar o acasalamento,

• momento do sacrifício,

• critérios de contagem dos efeitos de letalidade dominante,

• relação dose/resposta, se possível,

• avaliação estatística,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

CITOGENÉTICA DE CÉLULAS GERMINAIS DE MAMÍFERO - IN VIVO

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

Este teste citogenético in vivo detecta aberrações cromossómicas estruturais em espermatogónias. Consiste na análise de mitoses de espermatogónias para detecção de aberrações de tipo cromatídico e cromossómico.

O método utiliza preparações de testículo de mamíferos expostos aos produtos químicos a testar, pelas vias apropriadas, e sacrificados a intervalos de tempo diversos. Os animais são ainda tratados antes de serem sacrificados com inibidores do fuso como a colchicina para acumular células num estádio da mitose metafase-like (c-metafase). Efectuam-se preparações de cromossomas com secagem ao ar, sendo depois coradas e analisadas ao microscópio.

A análise de espermatócitos na diacinese-metafase I para a detecção de multivalentes de translocação, após tratamento das stem-cells das espermatogónias, pode fornecer informações complementares úteis.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Os produtos químicos a testar são dissolvidos numa solução salina isotónica. As substâncias insolúveis são dissolvidas ou colocadas em suspensão num veículo apropriado. São utilizadas soluções preparadas de fresco da substância a testar. Se for utilizado um veículo para facilitar a administração este não deve interferir com o produto químico a testar ou produzir efeitos tóxicos.

Via de administração

Os produtos químicos a testar devem, de um modo geral, ser administrados uma única vez. Pode utilizar-se um esquema de administração repetida, se tal for baseado em informações toxicológicas. No entanto o tratamento repetido pode apenas ser aplicado se a substância a testar não apresentar efeitos citotóxicos maiores sobre espermatogónias em diferenciação.

As vias habituais de administração são a oral e a injecção intraperitoneal. Podem ser adequadas outras vias de administração.

Animais de experiência

Utilizam-se mais frequentemente o ratinho e o hamster chinês. Pode ser utilizada qualquer outra espécie de mamífero.

Usam-se machos sexualmente maduros, sendo repartidos ao acaso pelos grupos de experiência e de controlo.

Número de animais

São utilizados pelo menos cinco machos por grupo de experiência e de controlo.

Uso de controlos negativos e positivos

Deverão ser incluídos controlos positivos e negativos (veículo) simultâneos, em cada experiência.

As substâncias de controlo positivo deverão ser utilizadas numa dose mínima adequada para demonstrar a sensibilidade do teste (por exemplo: mitomicina C, intraperitonealmente, à razão de 0,3 mg/kg).

Doses

Utiliza-se uma única dose da substância a testar, sendo essa a dose máxima tolerada ou então produzindo alguns sinais de toxicidade. Se esta dose provocar a destruição de um grande número de células deverá utilizar-se uma dose mais baixa produzindo citotoxicidade. Se for necessário determinar uma relação dose/resposta serão utilizadas pelo menos três doses (por exemplo: para confirmar uma resposta ligeiramente positiva). As substâncias não tóxicas são testadas com a dose máxima praticável, tanto no caso da administração única como no da repetida.

Procedimento

Em geral, a substância a testar é administrada aos animais apenas uma vez. No grupo exposto à dose máxima recolhem-se amostras em três ocasiões após o tratamento. A colheita central é feita após 24 horas. Como a cinética do ciclo celular pode ser influenciada pela substância testada, a primeira colheita e a última têm lugar, com intervalos apropriados, num prazo de 6 a 48 horas depois da administração da substância. Quando se utilizarem doses suplementares, recolhem-se amostras durante a fase particularmente sensível ou, quando esta não for conhecida, 24 horas depois do tratamento.

Em alternativa pode aplicar-se um esquema de administração repetida. Neste caso os animais são sacrificados 24 horas depois do último tratamento. Podem recolher-se amostras adicionais entre 6 e 24 depois do último tratamento.

Preparação dos testículos

Para analisar as mitoses das espermatogónias injecta-se nos animais por via intraperitoneal uma dose apropriada de um inibidor do fuso como a colchicina. Os animais são sacrificados em seguida após um intervalo apropriado. No caso do ratinho este varia entre três a cinco horas; para o hamster chinês pode ser superior a cinco horas.

O método utilizado é o da secagem ao ar. Consoante a espécie pode tomar-se necessário modificar o método standard. Obtêm-se as suspensões celulares, tratam-se com uma solução hipotónica, sendo depois fixadas. As células são estendidas em lâminas e coradas. As lâminas são codificadas antes de serem analisadas ao microscópio.

Análise

São analisadas pelo menos 100 metafases mitóticas de boa qualidade e com o número completo de centrómeros para se detectarem aberrações cromossómicas estruturais. Além disso, pode determinar-se a taxa de mitoses das espermatogónias em relação à primeira e à segunda metafase meióticas numa amostra total de 100 células em divisão por animal, com o fim de evidenciar um eventual efeito citotóxico.

Os resultados deverão ser apresentados em quadros. Registar-se-ão separadamente todos os tipos de aberração para cada animal tratado e de controlo. Serão incluídos o número total de células analisadas e o número total de células aberrantes por grupo. Serão indicados a média e o desvio padrão para todos os parâmetros. No caso de terem sido determinadas a taxa média das mitoses das espermatogónias em relação à primeira e à segunda metafase meiótica, estas serão apresentadas num quadro para cada grupo de experiência e de controlo.

Os resultados são avaliados com métodos estatísticos apropriados.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

• espécie e estirpe dos machos, idade e peso dos machos,

• número de animais de cada grupo de experiência e de cada grupo de controlo,

• condições experimentais, descrição pormenorizada do tratamento, doses, solventes, inibidor do fuso utilizado,

• número de células analisadas por animal em cada grupo,

• tipo e número de aberrações para cada animal tratado e de controlo indicadas separadamente,

• avaliação estatística,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TESTE DAS MALHAS (SPOT-TEST) NO RATINHO

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

Este teste é uma prova in vivo efectuada no ratinho, cujos embriões em desenvolvimento são expostos à substância a testar. As células visadas dos embriões em desenvolvimento são os melanoblastos e os genes alvo são os responsáveis pela pigmentação do pêlo. Os embriões em desenvolvimento são heterozigóticos para alguns desses genes. Uma mutação ao nível do alelo dominante ou a perda do alelo dominante de um desses genes num melanoblasto (na sequência de vários fenómenos genéticos) traduz-se pela expressão do fenótipo recessivo nas células que dele descendem, do que resulta o aparecimento de uma malha de cor diferente no pêlo do ratinho. Conta-se assim o número de descendentes portadores de malhas (mutações) e a sua frequência é comparada com a frequência observada na descendência resultante do desenvolvimento de embriões tratados apenas com o solvente. O teste das malhas no ratinho (spot test) detecta as mutações somáticas presumíveis nas células fetais.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

Quando for possível as substâncias a testar são dissolvidas ou col(elevado a 3)ocadas em suspensão numa solução salina isotónica. As substâncias insolúveis na água serão dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados. O veículo utilizado não deverá interferir com a substância a testar nem produzir efeitos tóxicos. Deverão utilizar-se soluções preparadas de fresco da substância a testar.

Animais de experiência

Ratinhos da estirpe T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c(elevado a ch)p/c(elevado a ch)p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) são acasalados seja com a estirpe HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe) ou com a C57 BL, (nonagouti, a/a). Podem utilizar-se outros cruzamentos apropriados como entre a NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) e a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute, d/d) na condição de produzirem uma descendência nonagouti.

Número e sexo

Deve tratar-se um número suficiente de fêmeas grávidas de forma a obter um número adequado de descendentes vivos para cada dose utilizada. A dimensão da amostra depende do número de malhas observadas nos ratinhos tratados bem como da importância dos dados dos controlos. Só se aceitará um resultado negativo se forem examinados pelo menos 300 descendentes das fêmeas tratadas com a dose máxima.

Controlos negativos e positivos

Deverá dispor-se de dados de controlo simultâneos respeitantes aos ratinhos tratados apenas com o veículo (controlos negativos). Dados de controlo de experiências anteriores provenientes do mesmo laboratório podem ser-lhes reunidos para se aumentar a sensibilidade do teste, no caso destes serem homogéneos. Se a substância testada não se revelar mutagénica, deveriam estar disponíveis os dados obtidos recentemente pelo mesmo laboratório para um controlo positivo cuja acção mutagénica nesta prova seja conhecida.

Via de administração

As vias de administração habituais nas fêmeas grávidas são a intubação oral e a injecção intraperitoneal. Tratamentos por inalação ou outras vias de administração serão usados quando tal for apropriado.

Doses

Utilizam-se pelo menos dois níveis de dose, um dos quais provocando sinais de toxicidade ou reduzindo o tamanho das ninhadas. No caso de substâncias não tóxicas, recorrer-se-á a um tratamento com a dose máxima praticável.

Procedimento

Administra-se normalmente um tratamento único no dia 8, 9 ou 10 de gestação, sendo o dia 1 aquele em que se observe pela primeira vez a presença de um rolhão vaginal. Estes dias correspondem 7,25, 8,25 e 9,25 dias após a concepção. Podem ser efectuados tratamentos sucessivos durante esses dias.

Análise

Três a quatro semanas após o nascimento a descendência é codificada e examinada para se detectar a presença de malhas. Distinguem-se três classes de malhas:

Contam-se as três classes mas apenas a última, isto é, a RS, tem relevância genética. Os problemas postos pela distinção entre as classes MDS e RS podem ser resolvidos examinando-se amostras de pêlos ao microscópio de fluorescência.

Serão anotadas as alterações macroscópicas evidentes observadas na descendência.

Os resultados são apresentados indicando o número total de crias examinadas e o número de crias apresentando uma ou várias malhas que se presuma serem devidas a uma mutação somática. Os resultados relativos aos animais tratados e aos controlos negativos são comparados por métodos apropriados. Os resultados são apresentados igualmente referindo-se a ninhada como unidade.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

• as estirpes utilizadas no cruzamento,

• o número de fêmeas grávidas nos grupos tratados e de controlo,

• o tamanho médio das ninhadas nos grupos tratados e de controlo na ocasião do nascimento e do desmame,

• as doses da substância a testar,

• o solvente utilizado,

• o dia da gestação em que se administrou o tratamento,

• a via de administração,

• o número total de crias observadas bem como o número das que apresentavam malhas WMVS, MDS e RS nos grupos tratados e de controlo,

• alterações morfológicas macroscópicas,

• relação dose/efeito se possível,

• avaliação estatística,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

TRANSLOCAÇÃO HEREDITÁRIA NO RATINHO

1.1. Introdução

Ver Introdução geral, Parte B.

1.2. Definição

Ver Introdução geral, Parte B.

1.3. Substâncias de referência

Nenhuma.

1.4. Princípio do método de ensaio

O teste de translocação hereditária no ratinho detecta alterações cromossómicas estruturais e numéricas nas células germinais de mamífero que são postas em evidência na descendência da primeira geração. Os tipos de alterações cromossómicas detectadas são as translocações recíprocas e, se for incluída a descendência do sexo feminino, a perda do cromossoma X. Os portadores de translocações e as fêmeas XO apresentam uma fertilidade reduzida, permitindo a selecção de uma descendência F(índice 1) para análise citogenética. Alguns tipos de translocação provocam esterilidade total (X-autossoma e tipo c-t). As translocações são observadas por métodos citogenéticos nas células meióticas na diacinese-metafase I de indíviduos do sexo masculino, sejam machos F(índice 1) ou filhos de fêmeas F(índice 1). As fêmeas XO são identificadas citogeneticamente pela presença de apenas 39 cromossomas nas mitoses da medula óssea.

1.5. Critérios qualitativos

Nenhum.

1.6. Descrição do método de ensaio

Preparativos

As substâncias a testar são dissolvidas numa solução salina isotónica. Se forem insolúveis na água serão dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados. Utilizam-se soluções preparadas de fresco da substância a testar. Se se utilizar um veículo para facilitar a administração este não deve interferir com a substância a testar nem produzir efeitos tóxicos.

Via de administração

As vias de administração são habitualmente a intubação oral ou a injecção intraperitoneal. Podem ser adequadas outras vias de administração.

Animais de experiência

Estas experiências são efectuadas em ratinhos para facilitar a reprodução e a verificação citológica. Não é requerida nenhuma estirpe específica. No entanto, o número médio de crias por ninhada da estirpe utilizada deverá ser superior a oito e ser relativamente constante. Serão utilizados animais sãos tendo já atingido a maturidade sexual.

Número de animais

O número de animais necessários depende da frequência de translocações espontâneas bem como da taxa de indução nínima requerida para um resultado positivo.

O teste consiste habitualmente na análise da descendência masculina F(índice 1). Serão testados pelo menos 500 descendentes masculinos F(índice 1) por cada dose. Se se incluir a descendência feminina F(índice 1) serão necessários 300 machos e 300 fêmeas.

Controlos negativos e positivos

Devem estar disponíveis dados de controlo adequados provenientes de provas realizadas simultâneamente ou de experiências anteriores. Quando existirem dados aceitáveis de controlos positivos provenientes de experiências efectuadas recentemente no mesmo laboratório, estes podem ser utilizados em vez de controlos positivos simultâneos.

Doses

É testada apenas uma dose, tratando-se habitualmente da dose máxima associada à produção de efeitos tóxicos mínimos mas não afectanto o comportamento reprodutor nem a sobrevivência. Para estabelecer uma relação dose/resposta são necessárias duas doses adicionais, mais baixas. No caso de substâncias não tóxicas, deverá recorrer-se a uma exposição à dose máxima praticável.

Procedimento

Tratamento e acasalamento

São possíveis dois esquemas de tratamento. A administração única da substância a testar é o método mais frequente. A substância a testar pode também ser administrada sete dias por semana durante 35 dias. O número de acasalamentos depois do tratamento é determinado pelo esquema de tratamento e será tal que todos os estádios de células germinais sejam implicados. No fim do período de acasalamento as fêmeas são colocadas em gaiolas individuais. Quando as fêmeas parirem registar-se-ão a data, o número de crias da ninhada e o sexo das crias. Toda a descendência do sexo masculino é desmamada e toda a do sexo feminino afastada a não ser que esteja incluída na experiência.

Pesquisa dos heterozigóticos de translocação

É utilizado um de dois métodos disponíveis:

• análise da fertilidade da descendência F(índice 1) e verificação ulterior de eventuais portadores de translocações por análise citogenética,

• análise citogenética de todos os machos F(índice 1) sem selecção prévia por verificação da fertilidade.

A diminuição de fertilidade de um indivíduo F(índice 1) pode ser determinada observando-se o número de crias da ninhada e/ou analisando o conteúdo uterino das fêmeas com que acasalou.

Deverão estabelecer-se critérios para determinação da fertilidade normal e diminuída da estirpe de ratinhos utilizada.

Observação do número de animais por ninhada: os machos F(índice 1) a testar são colocados em gaiolas individuais com fêmeas provenientes da mesma experiência ou da colónia. As gaiolas são inspeccionadas diariamente a partir do dia 18 após o acasalamento. O número de crias da ninhada e o sexo da descendência F(índice 2) são registados na ocasião do nascimento, sendo as crias eliminadas em seguida. Se se testar a descendência do sexo feminino F(índice 1) então os descendentes F(índice 2) provenientes de ninhadas pequenas são conservados com vista a uma análise mais profunda. As fêmeas portadoras de uma translocação serão objecto de uma verificação por análise citogenética de uma translocação em qualquer dos seus descendentes machos. As fêmeas XO são identificadas pela alteração da razão macho/fêmea na sua descendência que passa de 1/1, para 1/2 machos/fémeas. Num método sequencial os animais F(índice 1) normais não serão objecto de outra verificação se a primeira ninhada F(índice 2) atingir ou ultrapassar um valor normal pré-estabelecido, senão observar-se-á uma segunda ou uma terceria ninhadas F(índice 2).

Os animais F(índice 1) que não puderem ser classificados como normais após uma observação de até três ninhadas F(índice 2) no máximo, serão submetidos seja a um novo controlo por análise do conteúdo uterino das fêmeas com que acasalaram, seja submetidos directamente a uma análise citogenética.

Análise do Conteúdo Uterino: a redução do número de crias por ninhada nos portadores de translocação é devida à morte de embriões, de modo que um grande número de implantes mortos indica a presença de uma translocação no animal submetido ao teste. Cada macho F(índice 1) a testar é acasalado com duas ou três fêmeas. A concepção é confirmada pela inspecção matinal diária das fêmeas para detectar a presença de rolhão vaginal. As fêmeas são sacrificadas 14 a 16 dias mais tarde registando-se o número de implantes vivos e mortos presentes nos seus úteros.

As preparações de testículo são efectuadas pelo método de secagem ao ar. Os portadoras de translocações são identificados pela presença de configurações multivalentes na diacinese-metafase I nos espermatócitos primários. A observação de pelo menos duas células apresentando uma associação multivalente constitui a prova necessária de que o animal testado é portador de uma translocação.

Se não tiver sido efectuada nenhuma selecção por análise de fertilidade, todos os machos F(índice 1) são submetidos a um exame citogenético. Devem ser analisadas ao microscópio um mínimo de 25 células em diacinese-metafase I por macho. É necessário o exame das metafases mitóticas nas espermatogónias ou na medula óssea, no caso dos machos tendo testículos pequenos ou apresentando uma paragem meiótica antes da diacinese ou no caso das fêmeas F(índice 1) suspeitas de serem XO. A presença de um cromossoma anormalmente longo e/ou curto em alguma de 10 células é a prova duma translocação particular acarretando a esterilidade do macho (tipo c-t). Algumas translocações X-autossoma provocando a esterilidade do macho podem apenas ser identificadas por uma análise de bandas de cromossomas mitóticos. A presença de 39 cromossomas em 10 mitoses por cada 10 é a prova de um estado XO numa fêmea.

Os resultados são apresentados sob a forma de quadros.

O número médio de crias por ninhada e a razão entre os sexos são registados à nascença e no desmame para cada período de acasalamento.

Quando da avaliação da fertilidade dos animais F(índice 1) deverão apresentar-se o número médio de crias por ninhada das ninhadas resultantes de todos os acasalamentos normais bem como o número de crias individual das ninhadas provenientes de animais F(índice 1) portadores de translocação. No que respeita à análise do conteúdo uterino serão anotados o número médio de implantes vivos e mortos resultantes de acasalamentos normais e o número de implantes vivos e mortos para cada acasalamento de animais portadores de translocação.

Quando da análise citogenética da diacinese-metafase I, serão registados os diferentes tipos de configurações multivalentes e o número total de células para cada portador de translocação.

Para os indivíduos F(índice 1) estéreis serão indicados o número total de acasalamentos e a duração do período de acasalamento. Serão indicados o peso dos testículos bem como os pormenores da análise citogenética.

Para as fêmeas XO indicar-se-á o número de crias médio por ninhada, a razão entre os sexos na descendência F(índice 2), bem como os resultados da análise citogenética.

Se forem seleccionados eventuais portadores de translocação F(índice 1) por testes de fertilidade os quadros deverão mencionar quantos deles foram confirmados como sendo heterozigóticos de translocação.

Serão apresentados os dados relativos aos controlos negativos bem como as experiências de controlo positivo.

3.1. Relatório do teste

O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:

• estirpe de ratinho utilizada, idade dos animais, peso dos animais tratados,

• número de animais progenitores de cada sexo nos grupos tratados e de controlo,

• condições experimentais, descrição pormenorizada do tratamento, doses, solventes, esquema de acasalamento,

• número e sexo de crias por fêmea, número e sexo das crias mantidas para uma análise de translocação,

• momento e critérios da análise de translocação,

• número e descrição pormenorizada dos portadores de translocação, incluindo dados relativos à reprodução e ao conteúdo uterino, se possível,

• métodos citogenéticos e pormenores da análise microscópica, de preferência com fotografias,

• avaliação estatística,

• discussão dos resultados,

• interpretação dos resultados.

3.2. Avaliação e interpretação

Ver Introdução geral, Parte B.

Ver Introdução geral, Parte B.

PARTE C: MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA ECOTOXICIDADE

INTRODUÇÃO GERAL: PARTE C

Os métodos de ensaio a seguir descritos destinam-se à determinação de algumas das propriedades ecotoxicológicas enumerados no Anexo VIII da Directiva 79/831/CEE. Os notificadores devem ter conhecimento de que não se encontram incluídos no texto os métodos para a determinação das seguintes propriedades previstas no Nível 1 do Anexo VIII:

• estudo de toxicidade prolongada com Daphnia magna,

• ensaio numa planta superior,

• estudo de toxicidade prolongada com peixes,

• ensaios de acumulação numa espécie.

Logo que sejam incluídos os métodos de ensaio adequados para a determinação destas propriedades, não publicados sob a forma de uma nova adaptação ao progresso técnico. Entretanto, os notificadores devem utilizar métodos adequados, internacionalmente reconhecidos, que devem ser nomeados à autoridade competente.

ENSAIO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DAS ALGAS

1.1. Introdução

O objectivo do presente ensaio é determinar os efeitos de uma dada substância no crescimento de espécies de algas verdes unicelulares. Ensaios relativamente curtos permitem avaliar efeitos ao longo de várias gerações. O presente método pode ser adaptado a diferentes espécies de algas unicelulares, e, neste caso, deve ser fornecida uma descrição do método utilizado com o relatório do ensaio.

O presente método aplica-se mais facilmente a substâncias solúveis em água que, nas condições do ensaio, são susceptíveis de permanecerem na água.

Para as substâncias com uma solubilidade limitada no meio do ensaio pode não ser possível determinar quantitativamente a CE(índice 50) (ver definição abaixo).

O presente método pode ser utilizado para substâncias que não interfiram directamente com a medição do crescimento das algas.

Quando se efectua este ensaio, podem ser úteis as seguintes informações:

• solubilidade na água,

• pressão de vapor,

• fórmula de estrutura,

• pureza da substância,

• estabilidade química na água e à luz,

• métodos de análise quantitativa da substância na água,

• valor pka,

• coeficiente de partição n-Octanol/água,

• resultados de um ensaio preliminar de biodegradação.

1.2. Definições e unidades

Concentração celular: o número de células por mi; crescimento: o aumento da concentração celular ao longo do período de ensaio; taxa de crescimento: o aumento da concentração celular por unidade de tempo.

CE (índice 50): no presente método, a concentração da substância de ensaio que provoca uma redução de 50% quer no crescimento quer na taxa de crescimento em relação ao controlo.

CSEO (concentração sem efeito observável): no presente método, a mais elevada concentração ensaiada com a qual, para o(s) parâmetro(s) medido(s) não se verificou qualquer inibição significativa do crescimento em relação aos valores do controlo.

1.3. Substâncias de referência

Uma substância de referência pode ser utilizada para detectar condições de ensaio não satisfatórias. Se se utilizar uma substância de referência, os resultados devem ser apresentados no relatório do ensaio. Como substância de referência, pode-se utilizar o dicromato de potássio.

1.4. Princípio do método de ensaio

Culturas de algas verdes seleccionadas, em fase de crescimento exponencial, são expostas em condições definidas, a diferentes concentrações da substância de ensaio, durante diversas gerações. Ao longo de um período fixado, determina-se a inibição do crescimento em relação à cultura controlo.

1.5. Critérios de qualidade

Condições de validade do ensaio

A concentração celular nas culturas controlo deverá aumentar pelo menos 16 vezes no espaço de três dias.

O desaparecimento da substância de ensaio da água devido à sua fixação na biomassa não invalida necessariamente o ensaio.

1.6. Descrição do método de ensaio

1.6.1. Preparações

1.6.1.1. Equipamento e materiais

• equipamento normal de laboratório,

• frascos de ensaio de volume adequado (por exemplo, são adequados Erlenmeyers de 250 ml quando o volume da solução de ensaio é de 100 ml),

• aparelhagem destinada à cultura: estufa ou câmara em que pode ser mantido o intervalo de temperatura de 21 a 25ºC (mais ou menos)2ºC e fornecida uma iluminação uniforme contínua de comprimento de onda de 400 a 700 nm (recomenda-se um fluxo quântico de 0,72 x 10(índice 20) fotões/m2.s (mais ou menos)20%. Este fluxo quântico é equivalente a 120 (mi)E/m2.s e pode ser obtido com lâmpadas universais fluorescentes brancas (temperatura da luz de cerca de 4200 K), produzindo aproximadamente 8000 Lux, medidos com um colector esférico,

• aparelhagem para a determinação das concentrações celulares, por exemplo um contador de partículas electrónico, microscópio com uma câmara de contagem, fluorímetro, espectrofotómetro, colorímetro (nota: para que se possam obter medições úteis para baixas concentrações celulares quando se utiliza um espectrofotómetro, pode ser necessário usar cuvettes com uma espessura de pelo menos 4 cm).

1.6.1.2. Meio de cultura para as algas

Recomenda-se o seguinte meio:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

Quando o meio entra em equilíbrio com o ar, o seu pH é aproximadamente 8.

A recomendação anterior não obsta à utilização de outros meios de cultura que respeitem, contudo, os seguintes limita para os constituintes essenciais:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

O meio de cultura recomendado e o meio indicado na referência (1) satisfazem esta exigência.

1.6.1.3. Organismos utilizados no ensaio

Selecção das espécies

Sugere-se que se utilizem espécies de algas verdes de crescimento rápido, adequadas para o processo de cultura e ensaio. Consideram-se adequadas as seguintes espécies:

• Selenastrum capricornutum ATCC 22662,

• Scenedesmus subspicatus 86.81 SAG,

• Chlorella vulgaris CCAP 211/11 b.

Se se utilizarem outras espécies, deve ser referida a variedade.

1.6.1.4. Protocolo experimental

Concentração celular inicial

Recomenda-se que a concentração celular inicial nas culturas de ensaio seja aproximadamente de 10(índice 4) células/ml relativamente à Selenastrum capricornutum e Scenedesmus subspicatus. Quando se utilizam outras espécies a biomassa deve ser equivalente.

Concentrações da substância de ensaio

A gama de concentrações em que é provável que se produzam efeitos, é determinada com base nos resultados provenientes dos ensaios de determinação das ordens de grandeza de concentrações.

Para tal ensaio, devem ser seleccionadas pelo menos cinco concentrações segundo uma série geométrica. A mais baixa concentração ensaiada não deve provocar qualquer efeito observável no crescimento das algas. A mais elevada concentração ensaiada deve inibir pelo menos 50% o crescimento em relação à cultura de controlo e de preferência, provocar a paragem completa do crescimento.

Repetições e controlos

O protocolo do ensaio deve incluir, de preferência, três repetições de cada concentração ensaiada e, no ideal o dobro do número de controlos. Se tal se justificar, o protocolo experimental pode ser alterado no sentido de aumentar o número de concentrações e reduzir o número de repetições por concentração.

Quando se. utiliza um veículo para solubilizar a substância de ensaio, devem ser incluídas no protocolo experimental controlos suplementares contendo o veículo nas mais elevadas concentrações utilizadas nas culturas de ensaio.

1.6.2. Execução do ensaio

A presente secção inclui indicações para o estudo de substâncias facilmente solúveis, substâncias dificilmente solúveis e substâncias voláteis.

1.6.2.1. Ensaio de substâncias facilmente solúveis em água

Para preparar as culturas de ensaio contendo as concentrações desejadas da substância de ensaio e a quantidade desejada de inóculo de algas diluem-se as alíquotas da solução-mãe da substância de ensaio e a suspensão de algas com o meio de algas filtrado.

Os frascos de cultura são agitados e colocados no aparelho destinado à cultura. No decurso de ensaio é necessário manter as algas em suspensão e facilitar a transferência de CO(índice 2). Com esse objectivo pode-se proceder ao agitamento ou arejamento do meio. As culturas devem ser mantidas a uma temperatura entre 21 a 25ºC, controlada a (mais ou menos) 2ºC.

Determina-se a concentração celular em cada frasco pelo menos 24, 48 e 72 horas após o início do ensaio. Utiliza-se o meio de algas filtrado na determinação do branco quando se utilizam contadores de partículas ou quando se utilizam espectrofetómetros.

O pH é medido no início do ensaio e após 72 horas. O pH das soluções não deve variar, normalmente, de mais de uma unidade durante o ensaio.

1.6.2.2. Ensaio de substâncias com solubilidade limitada em água

Quando a solubilidade da substância de ensaio é da ordem de grandeza da maior concentração utilizada no ensaio apenas são necessários ligeiros desvios relativamente ao procedimento acima descrito na preparação das soluções de ensaio. Uma solução saturada pode servir como solução-mãe da substância de ensaio. Um outro método pode consistir em dissolver a substância de ensaio na concentração desejada no meio de algas, antes de adicionar a suspensão destas.

As soluções-mãe de substância com baixa solubilidade em água podem ser preparadas através de dispersão mecânica ou utilizando veículos de baixa toxicidade para as algas, tais como solventes orgânicos, emulsionantes ou dispersantes. Sempre que se utilizar um veículo a sua concentração não deve ultrapassar 100 mg/l e no protocolo de ensaio devem ser incluídos controlos adicionais nos quais se adiciona o veículo na mais elevada concentração presente nas soluções de ensaio.

1.6.2.3. Ensaio de substâncias voláteis

Até ao presente, não existe qualquer método genericamente aceite para ensaiar substâncias voláteis. Quando se sabe que uma substância tem tendência para se vaporizar, podem utilizar-se frascos de ensaio fechados, com maior espaço vazio. Foram propostas variantes ao presente método [ver referência (1)].

Deve-se procurar determinar a quantidade de substância que permanece nas soluções e aconselha-se extrema precaução na interpretação dos resultados dos ensaios com produtos químicos voláteis quando se usam sistemas fechados.

As concentrações celulares medidas nas culturas do ensaio e controlo são apresentadas em quadros conjuntamente com as concentrações da substância de ensaio e os tempos de medição. O valor médio da concentração celular para cada uma das concentrações da substância de ensaio e para os controlos é representado graficamente em função do tempo, obtendo-se deste modo curvas de crescimento.

Para determinar a relação concentração/efeito devem ser utilizados os dois métodos seguintes:

2.1. Comparação das áreas abaixo das curvas de crescimento

A área existente abaixo das curvas de crescimento pode ser calculada de acordo com a seguinte fórmula:

A = (N(índice 1) - N(índice 0))/2 x t(índice 1) + (N(índice 1) + N(índice 2) - 2N(índice 0))/2 x (t(índice 2) - t(índice 1)) + (N(índice n - 1) + N(índice n) - 2N(índice 0))/2 x (t(índice n) - t(índice n - 1))

em que:

A = área,

N(índice 0) = número nominal de células/ml no instante t(índice 0),

N(índice 1) = número de células/ml contadas no instante t(índice 1),

N(índice n) = número de células/ml contadas no instante t(índice n),

t(índice 1) = tempo da primeira medição após o início do ensaio,

t(índice n) = tempo de medição n após o início do ensaio.

A percentagem de inibição do crescimento celular para cada uma das concentrações da substância de ensaio (I(índice A)) calcula-se como a diferença entre a área situada abaixo da curva de crescimento do ensaio de controlo (A(índice c)) e a área abaixo da curva de crescimento verificada para cada uma das concentrações da substância de ensaio (A(índice t)) segundo a fórmula:

I(índice A) = (A(índice c) - A(índice t)) /A(índice c) x 100

OS Valores I(índice A) representam-se graficamente em papel semilogarítmico ou em papel semilogarítmico probit em função das correspondentes concentrações. Se os pontos são representados graficamente em papel probit traça-se uma recta por estimativa, ou quando se pode considerar que existe uma distribuição log-normal do valores pode-se calcular a recta de regressão.

O valor CE(índice 50) resulta da intersecção da recta (de regressão) com a paralela ao eixo das abcissas no ponto I(índice A) = 50%. Para designar o valor obtido por este método de cálculo sem ambiguidade, propõe-se a utilização do símbolo C(índice b)E(índice 50). Em relação ao presente método de ensaio que determina medições às 24, 48 e 72 horas, o símbolo passa a ser C(índice b),E(índice 50) (0 - 72h).

A representação gráfica de I(índice A) em função do logarítmo das concentrações pode igualmente permitir a obtenção de outros valores de CE, tal como C(índice b)E(índice 10).

2.2. Comparação das taxas de crescimento

A taxa de crescimento específica média (mi) para culturas em crescimento exponencial pode ser calculada do seguinte modo:

(mi) = l(índice n)N(índice n) - l(índice n)N(índice 1)/t(índice n) - t(índice 1)

Outro método para calcular a taxa de crescimento específica média consiste em determinar o declive da recta de regressão resultante da representação gráfica de ln N em função do tempo.

A percentagem de redução da taxa de crescimento média para cada uma das concentrações da substância de ensaio comparada com o valor do controlo é representada graficamente em função do logaritmo da concentração. As respectivas CE(índice 50) podem ser ligadas no gráfico que so obtém deste modo. Para designar sem ambiguidades a CE(índice 50) obtida por este método, propõe-se a utilização do símbolo C(índice 1)E(índice 50). Devem ser indicados os tempos de medição, por exemplo, se o valor disser respeito a tempos de observação de 24 a 48 horas, o símbolo será C(índice 1) E(índice 50) (24-48h).

Nota: a taxa de crescimento é um valor logarítmico e pequenas alterações na taxa de crescimento podem conduzir a grandes alterações na biomassa. Os valores da C(índice b)E e C(índice 1) E não são, por conseguinte, numericamente comparáveis.

O relatório do ensaio, deve incluir, se possível, as seguintes informações:

• substâncias de ensaio: dados relativos à identificação química.

• organismos utilizados no ensaio: origem, cultura de laboratório, número de variedade, método de cultura.

• Condições do ensaio:

• data do início e do termo do ensaio e respectiva duração,

• temperatura,

• composição do meio,

• aparelho para a cultura,

• pH das soluções no início e no termo de ensaio (deve ser fornecida um explicação, se se observarem desvios de pH superiores a uma unidade,

• veículo e método utilizados para solubilizar a substância de ensaio e concentração do veículo nas soluções de ensaio,

• intensidade e natureza da luz,

• concentrações ensaiadas (medidas ou nominais).

• Resultados: